clonacion de genes

8/18/2019 Clonacion de Genes

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ADN RECOMBINANTE

CLONACION DE GENES

Msc. Gabriela AlviteSección Bioqu!ica " #aculta$ $e Ciencias

A%osto &''(


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ETA)AS B*SICAS )ARA LA OBTENCI+N DE ADNRECOMBINANTE

• )re,aración $el inserto $e ADN a clonar

• )re,aración $el vector

• -nión $el ra%!ento $e ADN al vector

• Intro$ucción $el ADN reco!binante en una c/lulaanitriona

•)ro,a%ación celular 0 selección $el clon con el%en $e inter/s

• An1lisis $el %en clona$o


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2ERRAMIENTAS DE LA TECNOLOG3A DEL ADNRECOMBINANTE

• EN4IMAS

– En5i!as $e restricción

– Taq ADN ,oli!erasa

– Li%asas

• 6ECTORES

– )l1s!i$os

– 6irus


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• Re,etición $e tres eta,as

– Desnaturali5ación $el ADN 79:;C8

– -nión es,ecica $e los ceba$ores 7


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)CR

•

ADN !ol$e

• ADN ,oli!erasa ter!oestable – Taq ,oli!erasa $e Thermus aquaticus

• Ceba$ores@ Oli%onucleóti$os '=&' ,b

• Deso?irribonucleóti$os triosato 7$AT)$TT)$CT)$GT)8

• Ma%nesio

• Ter!ocicla$or


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-

+

Electrooresis

Gel

Bro!uro $e eti$io

Tinción

Transilu!ina$or $e lu5 -6

300pb

AN*LISIS DEL ,)CR


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CARACTER3STICAS 6ARIANTES

• Ren$i!iento

• Duración

• Es,eciici$a$

• Sensibili$a$

• #i$eli$a$

• ot start )CR

• )CR lar%a

• )CR ani$a$a

• RT=)CR

• )CR en tie!,o real


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ARN!Ceba$or Transcri,tasa inversa

ADNc)CR

ADNcTaq=,olCeba$oresNucleóti$os

RT= )CR

ARN!ARN!


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A)LICACIONES DE LA )CR

• Dia%nóstico ,reco5 $e ener!e$a$es %en/ticas

• Detección $e ener!e$a$es vricas

•

Me$icina orense 0 cri!inolo%a• Estu$ios evolutivos 0 Arqueolo%a !olecular

• An1lisis $e ali!entos – Detección $e ,ató%enos

– I$entiicación $e es,ecies – Detección $e trans%/nicos


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II. AISLAMIENTO DE ADN% A )ARTIR DEEFTRACTO CEL-LAR

• Lisis celular 7SDS EDTA ARNasa8

• E?tracción $e ,rotenas 0 l,i$os – Trata!iento con enol=cloroor!o

• Recu,eración $el ADN – )reci,itación con etanol en ,resencia $e sales


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Extracto celular

Fenol-Cloroformo

Centrifugación

Fase acuosa: ADN y ARN

Interfase: Proteínas

Fase orgánica:

líi!os y

roteínas

Etanol " sales

Centrifugación

DNA reciita!oDNA uro

)-RI#ICACI+N DEL ADN% A )ARTIR DELEFTRACTO CEL-LAR


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6ECTORES

• CARACTERISTICAS

– Ca,aces $e re,licar en la c/lula anitriona

– De ,equeo ta!ao – De clonación o $e e?,resión

• TI)OS – )L*SMIDOS

– BACTERI+#AGOS

– C+SMIDOS


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)L*SMIDOS

• CARACTERISTICAS

– ADN $e ca$ena $oble circular cerra$a 7=&'' Hb8

– Alto n!ero $e co,ias – Tienen ori%en $e re,licación 0 sitio $e ,oliclona$o

7secuencias nicas ,ara sitios $e restricción8

– Llevan %enes !arca$ores@ resistencia a antibióticos

%enes que co$iican una ,rotena $etectable 7eJ. en5i!a=%alactosi$asa8 %enes que co!,le!entan $eectosnutricionales.


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EKEM)LOS DE )L*SMIDOS

lac#$

olylin%er

amp

&C'()*(*+

ori

EcoRI

SacI

KpnI

SmaI

Bam,I XbaI

Sal I

Pst I

SphI

Hind III


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)-RI#ICACI+N DE )L*SMIDOS

• Obtención $e un e?tracto bacteriano

= Lisis celular 0 $esnaturali5ación – Liso5i!a EDTA SDS

– NaO2 o calor • ADN cro!osó!ico 0 ,las!$ico se $esnaturali5an

= Neutrali5ación• ADN cro!osó!ico ,er!anece $esnaturali5a$o 0 ,reci,ita• ADN ,las!$ico se renaturali5a 7en solución8


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EN4IMAS DE RESTRICCI+N

EcoRI

Escherichia coli

Hin!III

Hemophilus

influenzae

......G-A-A-T-T-C......

......C-T-T-A-A-G......

A-A-T-T-C......

G......

......G

......C-T-T-A-A

......A-A-G-C-T-T......

......T-T-C-G-A-A......

A-G-C-T-T...... A......

......A

......T-T-C-G-A-A

Sma I

Serratia

marcescens

......C-C-C-G-G-G......

......G-G-G-C-C-C...... G-G-G......

C-C-C......

......C-C-C

......G-G-G


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#RAGMENTAR EL ADN

itio !e corte

6ector ADN con el %en $e inter/s

itio !e corte

.nico

Enzima

de restricción

Enzima

de restricción


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-NI+N DEL ADN AL 6ECTOR@ LIGACI+N

• ADN $i%eri$o con en5i!a F o ,ro$ucto $e )CR

• vector $i%eri$o con en5i!a F o vector T

• Li%asa


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LIGASAS


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RES-LTADO DE LA LIGACI+N

Fragmentos !e ADN

no liga!o

/ol0culas !el 1ector

no liga!o/ol0culas !el 1ector

religa!o

ADN recom+inante 2ue no

contiene el gen !e inter0s

ADN recom+inante con

el gen !e inter0s


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INTROD-CCI+N DEL ADN RECOMBINANTEEN CL-LAS AN#ITRIONAS@

TRANS#ORMACI+N

• Alteración transitoria $e la ,er!eabili$a$ celular@ células competentes

– Trata!ientos qu!icos• Cloruro $e calcio cloruro $e rubi$io

• Aa$ir la !e5cla $e li%ación• Trata!iento t/r!ico

Otros ,roce$i!ientos $e transor!ación• Electro,oración• Biovalstica• Microin0ección


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TRANS#ORMACI+N EN BACTERIAS

C0lula +acteriana

normal

C0lula +acteriana

cometente

C0lula transforma!a

CaCl)

Plásmi!o

3)4C5 )min


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OBTENCI+N DE CLONES

• Las c/lulas se cultivan en un !e$io sóli$oselectivo 7,lacas con antibiótico sustrato8

• Ca$a c/lula se !ulti,lica 0 or!a una colonia o clonclon

• To$as las c/lulas $e un clon son i$/nticas

• En el interior $e ca$a c/lula el vector con elra%!ento $e ADN e?ó%eno se re,lica


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RES-LTADO DE LA TRANS#ORMACI+N

C0lulas con el 1ector

religa!o

C0lulas con ADN recom+inante

2ue no contiene el gen !e inter0s

C0lulas con ADN recom+inante

con el gen !e inter0s


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BIBLIOTECA DE ADN%

• ConJunto $e clones reco!binantes en el que est1re,resenta$o to$o el ADN $e un or%anis!o

BIBLIOTECA DE ADNc

• ConJunto $e clones reco!binantes obteni$os a ,artir $elos ARNs !ensaJeros $e un or%anis!o o teJi$o$eter!ina$o

• #acilita la clonación $e %enes $e or%anis!os su,eriores

• #acilita la e?,resión $e %enes $e or%anis!os su,eriores en,rocariotas ,orque eli!ina los intrones


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