Mendeliane (mutazione di singoli geni con ampio effetto) Multifattoriali (genetici e ambientali) Malattie da singolo gene con trasmissione non mendeliana (ex. espansione da triplette, malattie mitocondriali)

Classificazione delle malattie ereditarie

Mendeliane (mutazione di singoli geni con ampio effetto)

Autosomiche domaninanti (ex. Ipercolesterolemia Familiare)

Autosomiche recessive (ex. Fibrosi cistica)

Sex-Linked (ex. Emofilia A, Distrofia Muscolare)

Autosomiche Dominanti (I)

- Manifeste clinicamente allo stato eterozigote (maschi e femmine

affetti in egual misura)

- Fenotipo influenzato da:

penetranza (% di individui che, avendo il gene malato, manifesta il

fenotipo)

espressivit (livello di fenotipo)

Dovute alla presenza di geni modificanti

Autosomiche Dominanti (II)

-Normalmente coinvolgono DUE TIPI DI MUTAZIONI:

- Mutazione per Perdita di funzione

- Mutazione per Guadagno di funzione

-E DUE CATEGORIE DI PROTEINE

- Proteine regolatorie (ex. LDLr Familial Hypercholesterolemia),

- Proteine strutturali (ex. Collagene in Osteogenisis Imperfecta )

Pedigree di una Malattia Autosomica Dominante

Autosomiche domaninanti (ex. Familial Hypercholesterolemia)

E una malattia recettoriale causata da una mutazione nel gene codificante: Il recettore per Low-density lipoprotein (LDL) coinvolto nel trasporto e metabolismo del colesterolo che causa un elevato livello di colesterolo nel plasma (2-3 volte rispetto alla media) Caratteristiche soggetti affetti (1/500): - precoci lesioni aterosclerotiche - infarto e/o ictus cerebrale con insorgenza giovanile - Xantomi (accumuli di grasso) tendinei e cutanei

STRUTTURA DELLE LIPOPROTEINE

FOSFOLIPIDI

TRIGLICERIDI

COLESTEROLO ESTERIFICATO

1st

Ricche in trigliceridi Adipociti e muscoli

Estrazione trigliceridi (Lipoprotein Lipasi)

2nd

3rd

4th

Metabolismo delle LDL

5th

Tramite LDLr 70% dal fegato Restante da Fibroblasti, linfociti, muscolatura liscia Aumentata nei malati

perche IDL non assorbiti

Il metabolismo del colesterolo

3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme E reductase

CLASSIFICAZIONE DELLE MUATAZIONI LDLr BASATE SULLE FUNZIONI DELLE PROTEINE MUTATE

Il gene per LDLr situato sul cromosoma 19, comprende 18 esoni e 5 domini. Sono state mappate almeno 150 mutazioni Che differentemente modificano la proteina

Entrambi i geni devono essere mutati Lespressione e piu uniforme rispetto alle malattie autosomiche dominanti Penetranza completa e comune In molti casi proteine enzimatiche sono affette da perdita di funzione

Autosomiche Recessive (I)

Pedigree di un carattere recessivo

Consanguinei

Autosomiche Recessive (III) (ex. FIBROSI CISTICA)

Difetto del trasporto del cloro a livello epiteliale causato da mutazioni nel gene CFTR (codificante per il canale dello ione cloro) Codifica una proteina di 1480 aminoacidi situata sulla membrana cellulare delle cellule epiteliali, la cui funzione, normalmente, quella di trasportare il cloro attraverso le membrane cellulari a livello della membrana apicale delle cellule epiteliali delle cellule di vie aeree, del pancreas, dell'intestino, delle ghiandole sudoripare, delle ghiandole salivari e dei vasi defereni Insorgenza 1/1500-4000. E la piu importante delle malattie genetiche infantili Rara in popolazione asiatica e africana

Negli organi interessati, le secrezioni mucose, essendo anormalmente viscide, determinano un'ostruzione dei dotti principali, provocando l'insorgenza di gran parte delle manifestazioni cliniche tipiche della malattia

Coinvolge: ghiandole esocrine, epiteli respiratori, intestinali e riproduttivi produzione di secrezioni mucose viscose che causano: Infezioni polmonari Insufficienza pancreatica Cirrosi epatica Infertilit maschile Occlusioni intestinali Mal nutrizione

CARATTERISTICHE

Polmoni: Il quadro clinico dominato da un lento processo distruttivo polmonare. Nella maggior parte dei casi si manifesta nel primo anno di vita con tosse persistente. L'esame obbiettivo pu subito dimostrare segni indiretti di ostruzione bronchiale. L'infezione bronchiale cronica determina una progressiva distruzione del parenchima polmonare. La risposta immunitaria dell'ospite e i fattori propri dei patogeni contribuiscono quindi insieme ad innescare un processo patogenetico che alla base del processo distruttivo polmonare.

Pancreas: colpito nell'80% dei casi con un ristagno dei succhi pancreatici nei dotti con formazione di cisti con una fibrosi che si va a creare attorno a questi (da qui fibrosi cistica). La carenza di succhi pancreatici nel canale intestinale porta a malassorbimento di grassi (con conseguente steatorrea), e di conseguenza delle vitamine liposolubili, delle proteine e, in minima parte, degli zuccheri. Con il passare del tempo il pancreas, sempre pi colpito, secerne una minor quantit di insulina portando a una forma di diabete di solito insulino-dipendente.

Pancreas Esocrino: I principali enzimi presenti nel succo pancreatico sono: tripsinogeno, chimotripsinogeno, elastasi, lipasi pancreatiche, amilasi pancreatiche, fosfolipasi pancreatica, nucleasi pancreatiche.

Endocrino (Isole di Langerhans) Cellule A (15%): glucagone Cellule B (80%). Insulina Cellule D (3-5%): somatostatina Cellule F (3-5%): polipeptide pancreatico

This higher-power photomicrograph of the pancreas shows interstitial tissue and the presence of small cystic spaces (1) within the acinar lobules. These spaces are filled with an eosinophilic proteinaceous material. The islets of Langerhans (2) are unaffected.

CANALE DEL CLORO

2 Domini trasmembrana 2 NBD Regulatory domain 550 mutazioni diverse La piu comune una delezione di tripletta codificante per phe508 (folding non corretto)

Ex. Acetilcolina

Classe I: non c' produzione di proteina Classe II: si ha produzione di un corto peptide non funzionante Classe III: si produce un polipetide non funzionante Classe IV: si produce una proteina difettosa ma in minima parte funzionante Classe V: si produce una proteina normale ma in minime quantit Classe WT: la proteina normale prodotta nelle giuste quantit (soggetto sano)

FIBROSI CISTICA ESPRESSIVITA

Disfunzione Ghiandole Sudoripare

Ridotto assorbimento Na+ Cl-

Metodo di Gibson e Cooke - si misura la concentrazione di Cloro in almeno 75 mg di sudore Valori sono superiori alla norma (60mEq/L) il test sicuramente positivo Valori sotto i 30mEq/L sicuramente negativo

Low salt levels in the body lead to fatigue, weakness, fever, muscle cramps, stomach pain, vomiting, dehydration, and heatstroke.

Disfunzione Vie Aeree Superiori

Aumento assorbimento Na+/H2O

RelatoreNote di presentazioneLepitelio respiratorio un epitelio cilindricopseudostratificato ciliato composto da sei tipi dicellule; cellule caliciformi, cellule cilindriche ciliate ecellule basali costituiscono il 90% della popolazioneCellulare

Le cellule caliciformicostituiscono circa il 30%della popolazione cellulare dellepitelio respiratorio.Producono mucinogeno che, una volta rilasciato in unambiente acquoso, si idrata e diviene mucina

Sono tutti X-Linked e per la maggior parte recessivi

Modalit di trasmissione caratteristica:

- I maschi non trasmettono la malattia ai figli maschi

(ma le figlie femmine sono portatrici)

- Le femmine a causa dell inattivazione casuale del

cromosoma x hanno un fenotipo variabile

Sex-Linked

Le distrofie muscolari di Duchenne (Dmd) e di Becker (Dmb) sono due varianti, rispettivamente pi e meno grave, della stessa malattia neuromuscolare caratterizzata dallassenza, carenza o alterazione di una proteina chiamata distrofina. Queste condizioni, definite in generale distrofinopatie, portano a degenerazione del tessuto muscolare e quindi alla progressiva perdita di forza e riduzione delle abilit motorie.

Nella Dmd la distrofina del tutto assente e i primi sintomi si manifestano, generalmente, tra i 2 e i 6 anni. I bambini affetti spesso imparano a camminare in ritardo, mostrano unandatura particolare (anserina), tendono a camminare sulle punte, hanno difficolt a rialzarsi da terra, a saltare, a fare le scale. Tipicamente presente un ingrossamento (ipertrofia) dei polpacci. La malattia progredisce causando grave scoliosi, perdita della deambulazione entro i 12 anni, quindi perdita della funzione degli arti superiori. Anche i muscoli respiratori e il cuore sono coinvolti e sono proprio le complicanze cardiache e respiratorie a ridurre laspettativa di vita di questi pazienti. In alcuni casi ci pu essere un deficit cognitivo, di entit molto variabile. Nella Dmb, la distrofina ridotta o alterata, ma mai assente. A livello motorio, le manifestazioni di questa forma ricalcano quelle della Dmd, ma in forma pi lieve e con esordio pi tardivo. Le complicazioni cardiache costituiscono il problema principale: se vengono riconosciute e curate in tempo, laspettativa di vita di questi pazienti pu essere del tutto normale.

Distrofia Muscolare

Duchenne muscular dystrophy

La malattia si trasmette con modalit legata allX: in genere solo i maschi (che hanno un solo cromosoma X) presentano i sintomi, mentre le femmine, a parte alcune eccezioni, risultano essere delle portatrici sane (perch possiedono un altro cromosoma X oltre a quello mutato, che pu quindi compensarne le funzioni).

Dystrophin is a rod-shaped cytoplasmic protein, and a vital part of a protein complex that connects the cytoskeleton of a muscle fiber to the surrounding extracellular matrix through the cell membrane

The dystrophin gene is one of the longest human genes known, covering 2.5 megabases (0.08% of the human genome) at locus Xp21. The primary transcript measures about 2,400 kilobases and takes 16 hours to transcribe; the mature mRNA measures 14.0 kilobases. The 79 exons code for a protein of over 3500 amino acid residues

Dystrophin supports muscle fiber strength, and the absence of dystrophin reduces muscle stiffness, increases sarcolemmal deformability, and compromises the mechanical stability. increase in intracellular calcium, reactive oxygen species (ROS) and activation of a protease cascade

Al momento non esiste una terapia risolutiva per la malattia. La qualit di vita dei pazienti pu notevolmente migliorare con trattamenti sintomatici e pluridisciplinari (fisioterapia, valutazione della funzionalit cardiaca e respiratoria ecc.) che gestiscano i vari aspetti della malattia: motorio, respiratorio e cardiaco. La somministrazione di steroidi pu aiutare a stabilizzare le abilit motorie. Attualmente sono in corso di sperimentazione diversi approcci terapeutici, tra cui la terapia cellulare e la terapia molecolare con exon-skipping.

Sia per la Dmd sia per la Dmb, la diagnosi si basa innanzitutto sullosservazione clinica ed esami di laboratorio mettono in evidenza il danno muscolare. In particolare un valore importante quello della creatinchinasi un enzima che viene rilasciato nel circolo ematico quando esiste un danno muscolare. La diagnosi viene poi confermata attraverso la biopsia muscolare (per verificare la quantit di distrofina presente nel muscolo) e lanalisi molecolare del gene della distrofina. In situazione a rischio (donna portatrice sana di distrofinopatia) si pu effettuare la diagnosi prenatale mediante villocentesi o amniocentesi.

Genome engineering using programmable nucleases

Genome engineering (editing)

Modification of the genome at a precise, predetermined locus. Gene disruption (Knock-out): Non Homologous End Joining (NHEJ);

Gene insertion (Knock-in): Homologous Recombination (HR);

Gene correction and point mutagenesis: Homologous Recombination (HR);

Programmable nucleases produce site-specific DSBs, which enhance the efficency of homologous recombination and/or trigger error-prone NHEJ, which leads to targeted mutagenesis.

*indel: insertion/deletion

*

RelatoreNote di presentazione

Outcome of genome editing using programmable nucleases.Nuclease-induced double-strand breaks (DSBs) can lead to sequence insertion, nucleotide correction or change (red box) through homology-directed repair (HDR) in the presence of a donor DNA or a single-strand oligodeoxynucleotide (ssODN), both of which contain homology arms. DSBs can also be repaired through error-prone non-homologous end-joining (NHEJ), which does not require donor DNA or ssODN and consequently often leads to small insertions and deletions (indels). Typical indel sequences and the number of inserted (+3 and +1) or deleted (2, 4 and 10) bases are shown. also be repaired through error-prone non-homologous end-joining (NHEJ), which does not require donor DNA or ssODN and consequently often leads to small insertions and deletions (indels). Typical indel sequences and the number of inserted (+3 and +1) or deleted (2, 4 and 10) bases are shown.

Three type of nucleases are used for genome editing:

Zinc Finger Nucleases (ZFNs);

Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs);

RNA-Guided Engineered Nucleases (RGENs): CRISPR-Cas9 system

Zinc-Finger Nucleases

Composed of two domains: a DNA-binding zinc-finger protein (ZFP) domain and the nuclease domain derived from the FokI restriction enzyme. The sequence specificity of ZFNs is determined by ZFPs, each of which recognizes a 3-bp DNA sequence.

There is no open-source collection of 64 zinc-fingers that covers all possible combinations of triplet sites!

RelatoreNote di presentazioneStructure of ZFNs. a | A schematic representation of a zinc-finger nuclease (ZFN) pair is shown. Each ZFN is composed of a zinc-finger protein (ZFP) at the amino terminus and the FokI nuclease domain at the carboxyl terminus. In the zinc-finger motif consensus, X represents any amino acid. Target sequences of ZFN pairs are typically 1836 bp in length, excluding spacers. b | A computer model structure of a ZFN pair bound to DNA is shown. Each zinc-finger is shown in shades of pink in ribbon (left) and space-filling (right) representations. The grey region represents the linker between the DNA-binding and catalytic domains. The FokI catalytic domains are shown in blue and purple at the centre using space-filling representations. Part b is modified, with permission, from REF. 191 ?(2011) Genetics Society of America

Transciption Activator-Like Effector Nucleases

Composed of two domains: a FokI nuclease domain (like ZFNs) and a TALE DNA-binding domain; TALEs are composed of tandem arrays of 33-35 aa repeats, each of which recognizes a single base-pair in the major groove (specificity determined by the Repeat Variable Diresidues). Easy to design due to the one-to-one correspondence between RVDs and the 4 bases.

RelatoreNote di presentazioneStructure of TALENs. a | A schematic representation of a transcription activator-like effector nuclease (TALEN) pair is shown. Each TALEN is composed of transcription activator-like effectors (TALEs) at the amino terminus and the FokI nuclease domain at the carboxyl terminus. Each TALE repeat is comprised of 3335 amino acids and recognizes a single base pair through the amino acids at positions 12 and 13, which is called the repeat variable diresidue (RVD; shown in red). Target sequences of TALEN pairs are typically 3040 bp in length, excluding spacers. b | In the TALEDNA co-crystal structure, the RVDs in TALE interact with DNA in the major groove. The aminoterminal repeats (designated as 0 and 1 in the box) contact 5 ?thymine. Part b is modified, with permission, from REF. 73 ?(2012) American Association for the Advancement of Science.

Phase 1: the CRISPR system stores the molecular signature of a previous infection by integrating fragments of invading phage or plasmid DNA into the CRISPR locus as 'spacers'. Phase 2: in the immunity phase, the bacterium uses this stored information to defend against invading pathogens by transcribing the locus and processing the resulting transcript to produce CRISPR RNAs (crRNAs) that guide effector nucleases to locate and cleave nucleic acids complementary to the spacer.

CRISPR: Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats trans-activating crRNA CRISPR-Associated Protein 9 (Cas9) CRISPR RNAs (crRNAs)

Functioning of the CRISPR-Cas9 in bacteria

CRISPR: Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats trans-activating crRNA CRISPR-Associated Protein 9 (Cas9) CRISPR RNAs (crRNAs) Protospacer adjacent motif (PAM)

RNA-Guided Engineered Nucleases: CRISPR-Cas9

In the presence of single guide RNAs (sgRNAs), Cas9 is directed to specific sites in the genome adjacent to a protospacer adjacent motif (PAM), causing a double strand break (DSB).

Composition: Target specific crRNA; Invariable target-independent trans-activating crRNA (tracrRNA); CRISPR-Associated Protein 9 (Cas9). crRNA and tracrRNA can be linked to form a single-chain guided RNA (sgRNA), which simplifies the components of RGENs. RGENs target sites are limited by the requirment for the PAM sequence, which is recognized by Cas9. Thus, the targetable sequences are 5-X20NGG-3 (where X20 corresponds to the 20bp crRNA sequence, called protospacer, and NGG is the Protospacer Adiacent Motif). This CRISPR/Cas9 system is derived from S. pyogenes; there are some other CRISPR/Cas9 system derived from different Bacteria, as N. meningitis or S. thermophilus, that work in the same way, but with different PAM sequences (and different efficiencies).

Delivery of programmable nucleases (CRISPR-Cas9)

Programmable nucleases are delivered into cultured cells, embyos or whole organisms in various forms: Transient transfection of plasmid DNA through electroporation or liposome transfection (gold standard for ES and iPS);

Protein delivery (or mRNA direct injection);

Integrating vectors, such as Lentivirus, have been used for continuos expression of Cas9 and sgRNAs in mammalian cells.

Adeno-Associated Virus (AAV)

Permanent exon skipping in postnatal mdx mice by AAV-mediated Myoediting

RelatoreNote di presentazioneFig. 1. Permanent exon skipping in postnatal mdx mice by AAV-mediated Myoediting. (A) Strategy for bypassing exon 23 of the mdx locus by NHEJ. (B) AAV vectors for expression of Cas9 (AAV-Cas9, upper), guide RNAs and GFP (AAV-sgRNA, lower). ITR, inverted terminal repeat. RSV, Rous sarcoma virus promoter. U6, human U6 promoter (C) Different modes of AAV9 delivery. Black arrows indicate the post-injection time points for tissue collection. (D) Rescue of dystrophin expression in mdx mouse by IM injection of Myoediting components. Green fluorescent protein (GFP) and dystrophin immunostaining from serial sections of mdx mouse TA muscle is shown 3- and 6-weeks post-IM-AAV of AAV-Cas9/sgRNAs at P12 (three male mdx mice in each group). Asterisks indicate serial section myofiber alignment. Scale bar, 40 m. (E) RT-PCR of RNA from Myoedited mdx mice indicates deletion of exon 23 (termed Ex23, lower band) and shows increase in intensity of Ex23 bands from 4 to 12 weeks post-RO injection (four male mdx mice in each group). Asterisk indicates the RT-PCR products with small deletions. M denotes size marker lane. bp indicates the length of the marker bands. (F) Sequence of the RT-PCR products of Ex23 band confirmed that exon 22 spliced directly to exon 24, excluding exon 23.

intra-muscular retro-orbital intra-peritoneal

Rescue of dystrophin expression in postnatal mdx mice by retro-orbital injection of AAV-Cas9/sgRNAs.

RelatoreNote di presentazioneFig. 2. Rescue of dystrophin expression in postnatal mdx mice by retro-orbital injection of AAV-Cas9/sgRNAs. (A) Dystrophin immunostaining of TA muscle is shown for WT, mdx and RO-AAV treated mdx mice at 4-, 8- and 12-weeks post-injection (RO-AAV at P18, four male mdx mice in each group). TA muscle of unedited mdx control mice exhibits myonecrosis, indicated by cytoplasm-filling autofluorescence (highlighted with white asterisks). (B) Dystrophin immunostaining of the heart is illustrated for WT, mdx, and RO-AAV treated mdx mice at 4-, 8- and 12-weeks post-injection (RO-AAV at P18, four male mdx mice in each group). Arrowheads indicate dystrophin positive cardiomyocytes in 4-weeks post-RO-AAV treated mdx mouse heart. Scale bar, 40 m.

Fig. 3. Forelimb grip strength of mdx, mdx-AAV-IP and WT mice at 4 weeks post-injection. mdx, mdx-AAV-IP and WT mice were subjected to grip strength testing to measure muscle performance (grams of force), and the mdx-AAV-IP mice showed enhanced muscle performance compared to mdx mice at 4 weeks of age. (mdx male control 34.7 1.8%; mdx-AAV-injected male mice 48.4 2.5%, WT male 71.8 1.9% and mdx female control 29.7 1.4%; mdx-AAV-injected female mice 45.5 1.4%, WT female 75 2.4%). Numbers of mice in each group are labeled in the bar, 6 trials for each mouse. Data are represented as mean SEM. Significant differences between conditions are indicated by asterisk (***P

DMD is a chronic and progressive disorder affecting all muscles in the body. intramuscular injections have been repeatedly proved to ensure a good uptake of satellite cell- derived myoblasts in skeletal muscles. This approach helps to preserve autonomy and life quality in DMD patients by slow- ing down or stopping muscle degeneration and increasing force in wasted muscles, but not for a respiratory muscle such as the diaphragm. Eficient systemic delivery of adult stem cells to the whole-body muscles will undoubtedly advance stem cell-based therapy for muscular disease.

Risultanti dallinterazione fra le condizioni ambientali e un numero di geni >1 partecipanti alla determinazione del fenotipo

Il rischio di presentare un fenotipo malattia proporzionale al numero di geni mutati ereditato

Molte delle pi comuni malattie (diabete, ipertensione, celiachia) hanno origine multifattoriale

Malattie genetiche multifattoriali

type 1 diabetesan autoimmune disease in which the body's own immune system attacks the pancreas, rendering it unable to produce insulin

Compartecipazione genetica : frequente familiarita, associazione aplotipo HLA DR3/4. Anticorpi e CD8 citotossici Compartecipazione ambientale: gemelli omozigotici malatta

type 2 diabetesin which a resistance to the effects of insulin or a defect in insulin secretion may be seen

Rappresenta l85% di tutte le forme di diabete, esordio tardivo Compartecipazione genetica : frequente familiarita, forse recettori insulinici Compartecipazione ambientale: iperalimentazione/obesita

Diapositiva numero 1Diapositiva numero 2Diapositiva numero 3Diapositiva numero 4Diapositiva numero 5Diapositiva numero 6Diapositiva numero 7Diapositiva numero 8Diapositiva numero 9Il metabolismo del colesteroloDiapositiva numero 11Diapositiva numero 12Diapositiva numero 13Diapositiva numero 14Diapositiva numero 15Diapositiva numero 16Diapositiva numero 17Diapositiva numero 18Diapositiva numero 19Diapositiva numero 20Diapositiva numero 21Diapositiva numero 22Diapositiva numero 23Diapositiva numero 24Diapositiva numero 25Diapositiva numero 26Diapositiva numero 27Diapositiva numero 28Genome engineering using programmable nucleasesGenome engineering (editing)Diapositiva numero 31Diapositiva numero 32Zinc-Finger NucleasesTransciption Activator-Like Effector NucleasesDiapositiva numero 35Diapositiva numero 36RNA-Guided Engineered Nucleases: CRISPR-Cas9Diapositiva numero 38Delivery of programmable nucleases (CRISPR-Cas9)Diapositiva numero 40Diapositiva numero 41Diapositiva numero 42Diapositiva numero 43Diapositiva numero 44Diapositiva numero 45Diapositiva numero 46Diapositiva numero 47Diapositiva numero 48