CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS

Exógenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales....

Complejas o multifactoriales: en parte exógenas y en parte genéticas

Genéticas

Según el tipo de célula GerminalesSomáticas (cáncer)

Según el tipo de alteración

Génicas

Cromosómicas numéricasestructurales

Mutaciones puntualesInserciones y deleciones

Según el genoma y cromosoma afectados

nucleares autosómicasLigadas al sexo

mitocondrial

Archibald Garrod

Orina negra ocronosis

ALCAPTONURIA

Proyecto Genoma HumanoProyecto HapMap

Proyecto 1000 Genomes (next-generation sequencing)

1990-20042002-2008-

técnica de PCRMullis1985

técnicas de secuenciación del DNAMaxam y Gilbert/Sanger1977/1980

técnicas de DNA recombinantevarios1960-80

estructura de doble hélice del DNAWatson y Crick1953

bases moleculares de la anemia falciforme

Pauling e Ingram1949

Hipótesis "un gen-un enzima"Beadle y Tatum1945

estudios sobre la alcaptonuriaA. Garrod1902

Tipos de enfermedades genéticas. Patrones de herencia.

Cromosomopatías

Enfermedades monogénicas o de herencia mendeliana

autosómicas recesivas

autosómicas dominantes

ligadas al sexo.

Enfermedades complejas o multifactoriales

Enfermedades producidas por mutaciones inestables (expansión de tripletes)

Genes con impronta genética y disomías uniparentales

Enfermedades de DNA mitocondrial

Cáncer hereditario

CROMOSOMOPATIAS

Se definen como cambios que resultan en una alteración visiblede los cromosomas

Son muy frecuentes (1% de recién nacidos, principal causa deabortos espontáneos, recién nacidos muertos...)

Se producen por una mala reparación de cromosomas rotos o dañados opor fallos en la recombinación o en la segregación de los cromosomasdurante mitosis o meiosis

Se clasifican en :alteraciones numéricasalteraciones estructurales

Se identifican por observación de los cromosomas del paciente mediante distintas técnicas: bandeo cromosómico con distintos colorantes, FISH, CGH...

Preparación de los cromosomas y análisis

Obtención de muestra (eg: sangre)

Tratamiento de las células con mitógenos (eg: PHA) mínimo 3 días

Adición de colchicina para arrestar a las células en metafase

Fijar las células

Tratamiento con tripsina y Giemsa u otros colorantes

Caracterización de los cromosomas

Técnicas citogenéticasG bands (Giemsa)C bands (centrómero)Q bands (quinacrina, fluorescenteequivalente a G)R bands (patrón opuesto a G y Q)Bandeo de alta resolución (>400 bands)FISH (fluorescent in situ hybridization)

CROMOSOMOPATÍAS

• ALTERACIONES NUMÉRICAS

– POLIPLOIDIA (triploidia: 69XXX, XXY ó XYY) LETAL(Causa: dos espermatozoides o fallo en la 1ª división cigótica)

– ANEUPLOIDIA• AUTOSÓMICAS• CROMOSOMAS SEXUALES(Causas: edad avanzada, mala segregación en meiosis o mitosis)

Alteraciones numéricas autosomicas

Características generales:

Retraso mentalRetraso en el crecimientoAnomalías congénitas múltiplesViabilidad baja, alta letalidadAsociadas a abortos espontáneosdiagnóstico prenatal posible

Monosomía: letal

Trisomía:usualmente letal (dosis génica)Excepciones:

Trisomía 21 - Down Syndrome (1:1000)

Trisomía 13 - Patau Syndrome (1:20.000)

Trisomía 18 - Edward Syndrome (1: 8.000)

Alteraciones numéricas autosómicas

Alteraciones numéricas de loscromosomas sexuales

Características generales:Retraso en el crecimientoproblemas reproducciónviabilidad altaAsociadas a abortos espontáneosdiagnóstico prenatal posible

Ejemplos: Monosomía X: Síndrome de Turner (45, X)

Trisomía (47, XXY): S. de KlinefelterTrisomía (47, XYY)

QUANTITATIVE FLUORESCENT PCR (QF-PCR)

CUANTIFICACIÓN RELATIVA MICROSATÉLITES PARA DETERMINAR DOSIS GÉNICA

• amplificación microsatélites seleccionados con primers fluorescentes • separación por tamaños mediante electroforesis capilar • cuantificación relativa del área de los picos

APLICACIONES:Diagnóstico prenatal de aneuploidias más comunes en 24 h: trisomia 21 (Down), trisomia 13 (Patau), trisomia 18 (Edwards),S. Turner (X), S. Klinefelter (XXY)

QF-PCR chr. 18:detección de una trisomia

Chromosomopatías

Alteraciones estructuralesDeleciones e.g.46,XY, del(4) (p16.3)Translocaciones e.g.46,XX, t(2;6) (q35;p21.3)Inversiones e.g.46,XY, inv(11) (p11p15)Duplicaciones e.g.46,XX, dup(1) (q22q25)Cromosomas en anillo e.g.46,XY, r(7) (p22q36)Isocromosomas (se pierde 1 brazo, crom. Simétricos)

Causas: reparación defectuosa de roturas en el DNA, o fallosen la recombinación)

Efectos: variables, según punto de ruptura y pérdida o ganancia de material genético)

break break

21 2114 14

14 21 14/21

Translocación Robertsoniana(se fusionan dos cromosomas)

ENFERMEDADES GENÓMICAS (GENOMIC DISORDERS)

-Producidas por reordenamientos genómicos

-Se caracterizan por la presencia de duplicaciones segmentarias flanqueantes(>1kb, >90% identidad)que son sustrato de recombinación homóloga no alélica(NAHR) lo que origina deleciones, duplicaciones e inversiones

-Pueden dar lugar a enfermedades mendelianas, predisponer a enfermedades complejas o ser polimorfismos neutros (CNV)

-Patogénesis: dosis génicainterrupción génicafusión de genesefecto posicionalmanifestación de mutaciones recesivas (para deleciones)

SINDROMES DE MICRODELECIÓN

Cri du chat 5p14

Williams-Beuren 7q11.23 (elastina)

Prader-Willi/Angelman 15q11-q13

Rubinstein-Taybi 16p13.3

DiGeorge 22q11.21-q11.23

DUPLICACION

Charcot-Marie-Tooth 17p12 (mielina)

INVERSION

Hemofilia A Factor VIII

FISH:FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION

mFISH: multiplex FISHOtra técnica: Spectral karyotyping (SKY)

COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION (CGH)

ARRAY CGH

COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION

region A

region A

region B

region B

HIBRIDACION

LIGACION

PCR

SONDAS

MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION: MLPA

•Análisis y cuantificación por electroforesis capilar

•Cuantificación relativa a una muestra control

•Areas de los picos normalizadas con la suma de todas las areas de esamuestra

Fragment Analysis

Sample

Control

MLPAwww.mlpa.com

deletion

EJEMPLO:

DETECCION DE TRISOMIAS

Current applications of MLPA:

• Detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X and Y

• Detection of large chromosomal deletions or duplications: DiGeorgesyndrome, Williams syndrome, CMT1 / HNPP, Pelizaeus-Merzbacherdisease, Spinal Muscular Atrophy (SMA), subtelomeric regions etc

• Detection of gains and losses of genes in cancer tissues: Her2-neu (ERBB2), TP53, MYC etc.

• Detection of deletions / duplications of single exons: BRCA1 and 2, MSH2, MLH1, VHL, SHOX, MECP2, APC and NF2, PAH.

MLPAwww.mlpa.com

ENFERMEDADES MONOGÉNICAS

frecuencia estimada de 10:1000

Defecto en un único gen

Se clasifican según el patrón de herencia en :autosómicas recesivasautosómicas dominantesligadas al sexo

Enfermedad autosómica recesiva(el individuo heterocigoto o portador no se distingue del homocigoto normal)

Padres portadores con fenotipo normal75% probabilidad de hijos normales25% probabilidad de hijos afectados50% de probabilidad de hijos portadoresHombres y mujeres afectados en igualproporciónGeneralmente enzimasA veces asociadas con regionesgeográficas o grupos étnicosConsanguinidad entre los padres

Enfermedades AR en grupos étnicosy geográficos

fibrosis císticaTay-SachsAnemia falciformeThalasemias

CaucasianosJudíos Ashkenazi AfricanosMediterraneo

SIMBOLOS MAS COMUNES EMPLEADOS EN LOS PEDIGREES

VARÓN

HEMBRA

SEXO DESCONOCIDO

AFECTADOS (ENFERMOS)

NO AFECTADOS

PORTADORES (Enf. AR o XR)

Matrimonio consanguineo

Muerto

Pedigree ARPATRON HORIZONTAL

EJEMPLOS: ENF. AR

Autosómica Dominante (AD)(el individuo heterocigoto es enfermo)

Un progenitor afectado y el otronormal50% probabilidad de hijosnormales50% de probabilidad de hijosafectadosHombres y mujeres afectados en igual proporción

PenetranciaExpresividad o variabilidadfenotípica

Pedigree ADPATRON VERTICAL

EJEMPLOS: ENF. AD

Enfermedades AD: ejemplos

Marfan’s SyndromeOsteogenesis imperfectaNeurofibromatosisBraquidactilia

RetinoblastomaTuberous sclerosisMultiple polyposis of colon

ENFERMEDADES LIGADAS AL SEXO(AL CROMOSOMA X)

riesgo distinto según el sexo

Las mujeres pueden ser homocigotas o heterocigotas para el alelo mutantey pueden tener una expresión recesiva o dominante (aunque variable por la inactivación del cromosoma X)

Los hombres muestran el fenotipo completo

Ausencia de herencia de hombres a hijos varones

Todas las hijas de un hombre afectado heredan el alelo mutante

Hombres no afectados no transmiten al enfermedad

Enf. Ligada al X recesiva (XR)

Madre portadora normal

Padre normal

50% probabilidad de varones afectados

50% probabilidad de varones normales

100% probabilidad de niñas normales

50% portadora

50% homocigotas normales

Hombre y mujeres TIENEN DISTINTO RIESGO

Padre afectado y madre normal: 100% hijas portadoras

100% varones normales

Pedigree XRPATRON OBLICUO

EJEMPLOS: ENF. XR : Hemofilia, Lesh-Nyhan, def. piruvato DH…)

Enf. Ligada al X dominante (XD)

Padres afectados:100% probabilidad de hijas afectadas0% riesgo de varones afectados

Madres heterocigotas afectadas:50% probabilidad de varonesafectados50% probabilidad de hijas afectadas

EJEMPLOS: ENF. XD • Raquitismo resistente a Vitamina D• Albright’s hereditary osteodystrophy

FACTORES QUE PUEDEN COMPLICAR LOS PATRONES DE HERENCIA

• MUTACIONES NUEVAS

• MOSAICISMO DE LINEA GERMINAL

• RETRASO EN LA EDAD DE APARICION

• NO PENETRANCIA

• EXPRESIVIDAD VARIABLE

• PLEIOTROPIA DE EFECTOS

• HETEROGENEIDAD DE LOCUS

• NMD (nonsense mediated mRNA decay)

NMD : nonsense mediated mRNA decay

PTC:premature termination codonEJC:exon junction complex

Enfermedades complejas o multifactoriales:

-Causadas por >1 gen

-Influencia de factores ambientales

-Cada gen implicado puede tener un efecto pequeño

-No hay una herencia clara en familias

-Posibles interacciones entre los genes implicados (epistasis)

-Posibles interacciones ambiente-genes

-“medida” de la enfermedad (fenotipo) a veces dificil

Efecto acumulativo: los alelos de varios loci interaccionan de manera que el efecto de la combinación de alelos es la suma de los efectosindividuales.

epistasis: interaccion entre genes en la que un gen interfiere con al expresión del otro. En general, el efecto combinado de alelos en másde un locus es diferente de lo esperado segúnsus efectos

Evidencias de que hay un componente genéticoen una enfermedad compleja:

• estudios familiares• estudios de concordancia en gemelos• estudios en hijos adoptados

Enfermedad G.Monocigoticos G. DicigóticosConcordancia %

Cleft lip 35 5Type I diabetes 50 5Type II diabetes 100 10Multiple sclerosis 20 6Rheumatoid arthritis 50 8Tuberculosis 51 22Alcoholism 40 20Autism 60 7Schizophrenia 44 16

Estudios en gemelos:

% de hijos adoptadosPadres biológicos muestra (n) alcohólicos

Padre alcohólico 89 39,4Madre alcohólica 42 28,6

Padre no-alcohólico 723 13,6Madre no alcohólica 1029 15,5

34,0%

14,6%

Bonham 1978

Estudios en hijos adoptados:

Riesgo relativo: el cociente entre la frecuencia de una enfermedad compleja para un familiar de unapersona afectada y la frecuencia de la poblacióngeneral

λr = frecuencia de los familiares del enfermofrecuencia en la población

r = el grado de parentesco

(λr =5-10% para familia directa)

Es un riesgo empírico

Enfermedad RIESGO (según grado de parentesco)Población 1º 2º 3º

Cleft lip/palate 1/1000 35x 7x 3xCongenital dislocation/hip 1/1000 40x 4x 1.5xPyloric stenosis 1/1000 20x 5x 2xClubfoot 1/1000 20x 5x 2xAnencephaly/spina bifida 1/500 8x 2x

Riesgo relativo en familiares. Ejemplos:

Enfermedades producidas por expansión de tripletes(mutaciones inestables)

• Descubierto en 1991• Causadas por expansión de trinucleótidos por encima de un

número• Por encima de ese numero los tripletes son inestables y se

expanden (aumenta el nº de copias o repeticiones)• No se transmite el mismo nº de repeticiones a los hijos sino un

nº mayor (mutaciones dinámicas)• El nº de repeticiones está relacionado con la severidad y edad

de aparición de los síntomas: anticipación

La edad de aparición de la enfermedad es menor y la severidad de la enfermedad peor en generaciones sucesivas, lo que se correlacionacon el aumento del nº de tripletes

ANTICIPACION

Nº repeticiones

Eda

d ap

aric

ión

sínt

omas severidad

Gatchel JR, Zoghbi HY (2005) Nature Reviews Genetics 6: 743-754.

Disomía uniparental

ambos cromosomas homólogos provienen del mismo progenitor

Usualmente el origen está en una recuperación o compensación de una trisomía que sería letal

Disomia uniparental

modificaciones del material genético(silenciamiento génico) que ocurren dependiendo de si el alelo proviene del padre o de la madre

Resultan en una expresión diferencial según sea la copia materna o paterna

identificados en mamiferos y plantas superiores

Mutaciones en los genes con impronta genetica danun patron inusual de herencia

Puede deberse a presión evolutiva en genes implicados en crecimiento y desarrollo????

IMPRONTA GENETICA

deleción 15q11-13 :PWS resulta de unadeleción en el cromosomapaterno

AS resulta de una deleciónen el cromosoma materno

CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN

•Pérdida de función de genes en el cromosoma 15 que sólo se expresan del cromosoma paterno (PW) o materno (Angelman)•La pérdida de función puede deberse a deleciones, disomias uniparentales, mutaciones o errores en la impronta.

CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN

disomia uniparental :

PWS resulta de dos crom. 15 maternos

AS resulta de dos crom. 15 paternos

El genoma mitocondrial no es autónomo

OTRAS PROTEÍNAS NUCLEARES: LAS IMPLICADAS EN REPLICACIÓN, TRANSCRIPCION Y TRADUCCIÓN

mtDNA

DNA nuclear

- En el la matriz mitocondrial

- cada mitocondria puede contener 2-10 copias de mtDNA

- Hay miles de copias de mtDNA por célula

Genoma mitocondrial

37 genes:

22 tRNAs2 mt rRNA

13 mRNAs

Enfermedades del DNA mitocondrial

Herencia maternaHeteroplasmia = diferente % de mitocondrias normales y mutantes en cada célulao tejido. Las células reciben diferentes poblaciones de mitocondrias normales y mutantes

~ 1/15000 adultos

•Los síntomas se manifiestan sobre todo a nivel de tejidos muydependientes de energía en forma de ATP - cerebro, corazón, músculo, oído…

•Muy variables genética y clínicamente (el mismo síndrome pudedeberse a diferentes mutaciones o el mismo defecto genéticotener una presentación clínica diferente)

•el fenotipo dependerá de:gen(es) implicadostipo de mutación (missense/nonsense/deleción)% mitocondrias normales vs anormalestejido implicado

CaracterCaracteríísticassticas de de laslas enfermedadesenfermedades mitocondrialesmitocondriales

SOLO 20% DE LOS PACIENTES DEFICIENTES EN OXPHOS TIENEN MUTACIONES EN mtDNA

El resto de pacientes tienen defectos en genes nucleares:

Defectos en genes estructurales de los complejos

Defectos en la comunicación entre genomas nuclear y mt

Defectos en ensamblaje, homeostasis o importe de las proteínas de loscomplejos

The genetics and pathology of oxidative phosphorylation. Smeitink et al (2001) Nat Rev Genet 2: 342-352

Mitochondrial disease-its impact, etiology and pathology. McFarland et al (2007) Curr Topics in Dev Biol77: 113-143.