03/07/2012

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cromatografía

Curso: Química Analítica II

Loreto Ascar

2012

CROMATOGRAFIA

GAS - SOLIDO

CROMATOGRAFIA

GAS - LIQUIDO

GASES FLUIDO

SUPERCRITICO

LSC

BPC - RP BPC - NP

BPC IEC

GPC GFC

SEC

COLUMNA

TLC PC

PLANAR

LIQUIDO

Tipos de cromatografía en columnas

LSC : Cromatografía sólido-líquido o de adsorción

� BPC : Cromatografía de fase enlazada

IEC : Cromatografía de intercambio iónico

� SEC : Cromatografía de exclusión por tamaños

� BPC-RP : Cromatografía de reparto de fase inversa

� BPC-NP : Cromatografía de reparto de fase normal

� GPC : Cromatografía de permeación en gel

� GFC : Cromatografía de filtración en gel

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CLASIFICACIÓN DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

Superficie Plana Columna

En papel (PC)Capa Fina (TLC)

Electrocromatografía (EC)

De gasesLíquida

Fluidos supercríticos

De acuerdo al tipo de contacto existente entre las 2 fasesinvolucradas

Cromatografía en papel

Técnica de mediana resolución en el cual una mezcla de solutos sembrada sobre un papelde filtro logra separarse entre si basándose en:

Los diferentes coeficientes de partición de los solutos entre la fase estacionaria (fibra decelulosa del papel) y la fase líquida orgánica móvil, subiendo a través del papel porcapilaridad.

Diferencias en la adsorción del soluto a las fibras de celulosa y disolución en la fase móvil.

Cromatografía en Capa fina (TLC)

Soporte del adsorbente, láminas de:

VidrioPlástico (ej: acetato)Metal (ej: aluminio)

Fases Estacionarias:

Gel de Sílica (Se utiliza en el 80% de las separaciones)Alúmina (Óxido de Aluminio)Celulosa (Nativa o microcristalina)Poliamidas

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Cromatografía en Capa fina (TLC)

Fase Móvil

Ácidos CarboxílicosAlcoholesAminasTiolesAldehidosCetonasEsteresÉteresHidrocarburos no saturadosHidrocarburos Saturados

Polar

Apolar

Cromatografía en Capa fina (TLC)

Fase Móvil

Éter de petróleoToluenoDietil-éter, t-butil-éterDiclorometanoAcetato de etilon-pentano, n-hexanoCiclohexanoTetracloruro de carbonoCloroformoAcetonaIso-propanolEtanolMetanolÁcido acético

El índice de retención Rf (Ratio of Front): Distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación / distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente

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Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Muestras: líquidas (no volátiles) sólidas disueltas en un solvente adecuadotermolábiles

• Fase móvil: líquido

• Fase EstacionariaOrigen: columnas de vidrio

Diámetro: 1 a 5 cmLongitudes: 50 a 500 cmDiámetro partículas: 150 a 200 µmTiempos de análisis largos (varias horas)

Altura de plato teórico (H)

dp: Diámetro de las partículas de relleno, cm

λ : Factor de empaque

Rellenos de 3 a 10 um ���� HPLC

Tipos de cromatografía líquida de alta resolución

• Cromatografía de reparto

• Cromatografía de adsorción o líquido-sólido

• Cromatografía iónica

• Cromatografía de exclusión por tamaños o de geles

Permite la determinación de:

Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos,cabohidratos, fármacos, plaguicidas, antibióticos, esteroides,especies organometálicas y especies inorgánicas

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Instrumentación para HPLC

Instrumentación para HPLC

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Recipientes para la fase móvil

•Filtrar la fase móvil•Desgasificar•Un solo disolvente o una mezcla

Desgasificación de la fase móvil

Bombeo de vacíoDestilaciónReflujoAgitaciónPurga con gas inerte (He)Desgasificador en línea

Características de la Fase móvil

�Componentes de la muestra deben ser solubles en ella

�No degradar ni disolver la fase estacionaria

�Tener baja viscosidad

�Compatible con el detector

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Tipos de elución

Isocrática

Composición de la fase móvil constante en el tiempo

En Gradiente

Composición de fase móvil variable en el tiempo

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Elución Isocrática

(1) Alcohol bencílico(2) Fenol(3) 3´,4´-dimetoxiacetofenona(4) Benzoína(5) Benzoato de etilo(6) Tolueno(7) 2,6 dimetoxitolueno(8) o-metoxibifenilo

A: Tampón acuoso (KH2PO4 25mM a pH 3,5)

B: Acetonitrilo

(1) Alcohol bencílico(2) Fenol(3) 3´,4´-dimetoxiacetofenona(4) Benzoína(5) Benzoato de etilo(6) Tolueno(7) 2,6 dimetoxitolueno(8) o-metoxibifenilo

Elución en Gradiente

Sistemas de Bombeo

• La bomba debe proporcionar un flujo continuo yreproducible en el tiempo

• Debe ser capaz de entregar presiones de trabajoaltas, debido al pequeño tamaño de las partículas derelleno

• Libre de pulsaciones

• Intervalo de caudal 0,1 a 10 mL/min

• Componentes resistentes a la corrosión

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Tipos de bombas

• De desplazamiento

• Neumáticas

• Recíprocas

Bombas Recíprocas

Sistema de inyección de muestra

• Precisión en la medición de la muestra, es un factor limitante en HPLC

• Se debe introducir la muestra como un tampón

• No se debe despresurizar el sistema

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Válvulas Inyectoras, válvulas de loop o bucles

Columnas y Fases Estacionarias

• La columna consiste en un segmento de tubode algún material inerte, de diámetrouniforme y capaz de resistir altas presiones.

• Existen de vidrio de paredes resistentes y deacero inoxidable (mas utilizado)

• Existen de diferentes tamaños y rellenos

• Existen columnas analíticas y preparativas

Columnas para HPLC

Diámetro interno: 4 a 10 mm

Longitudes: 10 a 30 cm

Diámetro partículas: 5 a 10 µm

40000 a 60000 platos/metro

Actualmente se están elaborando columnas maspequeñas , de hasta 7,5cm de largo y con rellenosmenores a 2 µm, logrando obtener del orden de100000 platos /metro

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Precolumnas o columnas de resguardo

• Son de relleno similar al de la columna analítica

• Tamaño de partícula mayor, para evitar caídas de presión

Tipos de relleno

�Pelicular, bolas de vidrio o polímeroEn la superficie de las bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina, resina sintética (poliestireno-divinilbenceno) o de una resina de intercambio iónico. Estos rellenos se suelen utilizar en las precolumnas

�Partícula porosa, micropartículas porosas con diámetros de 3 a 10 µmSobre las partículas también se deposita una capa delgada de sílice, alúmina, resina sintética (poliestireno-divinilbenceno) o de una resina de intercambio iónico, siendo la sílice la mas común en HPLC

Detectores

• Adecuada sensibilidad

• Estabilidad y Reproducibilidad

• Respuesta lineal en un rango amplio

• Tiempo de respuesta corto

• Fiabilidad y manejo sencillo

• Respuesta semejante para todos los solutos e idealmente selectiva

• No destructivo

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Detectores

• Basados en propiedad del soluto

– Absorbancia UV

– Fluorescencia

– Corriente límite

• Basados en propiedad de la disolución (fase móvil)

– Índice de refracción

– Constante dieléctrica

– Densidad

Detectores de Absorbancia

A = log P0 / P = abC

0P

PT =

P

PA 0log=

TA log−=

�Filtros, aisla una línea intensa por medio de filtros: 254, 250, 313,334 y 365 nm

�Monocromadores, se puede hacer un barrido de longitudes de onda (detectores de arreglo de diodos)

Detectores de AbsorbanciaExisten los de Filtros y los Monocromadores

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Esquema de una celda de flujo en forma de Z

DETECTOR DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN

Un detector de índice de refracción (IR) es eldetector de uso más universal.

El índice de refracción de un compuesto es funciónde su densidad molecular.

Una variación de la densidad se traduce en uncambio en el índice de refracción.Un refractómetro es sensible a:

- Cambios en la concentración de la muestra odel disolvente- Cambios de presión y temperatura.

Detectores de Fluorescencia

Estado SingleteFundamental

Estado SingleteExcitado

Estado TripleteExcitado

F = K C solo cuando εεεεbc ≤≤≤≤ 10-2

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Detectores Electroquímicos

�Se basan en la oxidación o reducción de loscompuestos eluídos frente a un electrodo

�Alta sensibilidad, sencillez, selectividad yextensa aplicabilidad

Grupos funcionales orgánicos detectables potencialm ente por medidas amperométricas

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Detectores de conductividad

Se mide continuamente la conductividad específicadel eluyente, por lo tanto la presencia de muestraprovoca un cambio en la conductividad de la fasemóvil.

Con este detector sólo se puede trabajar ensistema isocrático.

Una de las desventajas de este detector es lainestabilidad de la celda.

DETECTORES APLICACIÓN

Absorbancia Cromóforos, compuestos que absorben luz

Fluorescencia Fluoróforos, selectivo

Electroquímico Selectivo para compuestos electroactivos

Índice de Refracción Universal, mide cambios en el IR

Conductividad Específico para todos los iones

DETECTORES HPLC LÍMITES DE DETECCIÓN

Absorbancia 10 pg

Fluorescencia 10 fg

Electroquímico 100 pg

Índice de Refracción 1 ng

conductividad 100 Pg - 1 ng