Cisplatin AML Hücrelerinde URG4/URGCP Üzerinden DNA Tamir Mekanizmasını 

Düzenler Mi?

Doç. Dr. Yavuz Dodurga

Yavuz Dodurga1, Mücahit Seçme1, Levent Elmas1, Nazlı Şirin1, Yasemin Işık Balcı2

1Pamukkale Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji ve Genetik AD., Denizli, Türkiye2Pamukkale Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Pediatrik Hematoloji BD., Denizli, Türkiye

Lökomogenez; Tüm kanserlerde olduğu gibi lösemilerde tek bir

mutant hücreden köken alan kemik iliği öncül hücrelerinin klonal bir

bozukluğu olarak tanımlanır.Lösemiye Eğilim Yaratan Durumlar

Çevresel Faktörler Hastalıklar Genetik İyonize Radyasyon Kimyasal etmenler (pestisid, herbisid, petrol ürünleri, benzen, hidrokinon...) Hamilelikte alkol kullanımı Hamilelikte sigara, mariuana kullanımı Beslenme Enfeksiyonlar (Onkogenik retrovirüsler) 

Primer Trombositopeni  Klonal Sitopeniler  Aplastik Anemi MDS/Refrakter sitopeni Akkiz AA 

Bloom Sendromu  Ataksi‐pansitopeni  Down Sendromu Kostmann Sendromu Diskeratozis konjenita Fankomi anemisi Naksoz Sendromu Nörofibromatöz Noonan Sendromu Poland Sendromu Rothmund‐Thomson Sendromu Seckel Sendromu Shwachman Sendromu Werner Sendromu 

Akut myeloblastik lösemi (AML), hematopoetik malignitelerin heterojen bir grubu olup anormal lösemikblastların ve normal kan hücrelerinin bozulmuş üretimi ile karakterizedir.

Cisplatin, kemoterapide kanseri tedavi etmek için kullanılan

bir ilaçtır (solid tümörlerde).

Cisplatin, genomik DNA'ya bağlanarak yapısını bozan böylece

DNA'da hasar oluşturarak DNA replikasyonunu veya transkripsiyonu

engelleyerek kanser hücresinin ölümüne neden olan, sitotoksik

süreçleri tetikleyen bir bileşiktir.

Up-regulated Gene 4 (URG4)/Upregulator of cell proliferation

(URGCP)• Şatıroğlu-Tufan ve arkadaşları tarafından,

– Hepatit B Virus aracılı Hepatosellüler kanser gelişiminde rol alan bir gen olarak tanımlanmış,

– “Up-Regulated-Gene-4 (URG4)” olarak isimlendirilmiş

– Amerika’daki National Center for Biotechnology Information-Gen Bankasına (NCBI-GenBank, Entrez GeneID: 55665 ve Entrez Nükleotid ID NM_017920) kayıt edilmiştir.

ATP / GTP bağlanma bölgesi(690 ‐ 697 aa)

~3600 bç8 ekzon922 aa104 kD

7. kromozomun kısa kolunda lokalizedir (7p13)ve daha önce tanımlanan genler ile herhangi bir homoloji Ø.

Özgün ‐ Yeni bir gen

URG4/URGCP

• Feitelson ve arkadaşları, URG4’ün hepatoselüler karsinoma olgularının ön taramasında kullanılabilecek güçlü bir preneoplastik marker olabileceğini göstermiştir.

• Ekibimiz ve diğer araştırmacılar tarafından,

– Lösemi,– Mide kanseri,– Osteosarkom,– Prostat kanseri,– Nöroblastom,– Akciğer kanseri, – Gliom,– Medullar tiroid kanseri…

• Bu yeni çalışmalar ışığında URG4’ün lökomogenezde rol alabileceğini ve aynı zamanda kanser tedavisinde de umut verici bir terapötik hedef olabileceğini düşündürmüştür.

Amaç• Bu çalışmamızda amaç, cisplatinin Kasumi‐1 (AML hücre

hattı) hücre hatlarında,– hücre proliferasyonuna etkisi,– DNA tamiri ve hücre döngüsü ile ilişki genlerin ve özgün bir

onkogen olan URG4/URGCP geninin ekspresyon değişimlerineetkisini

– DNA hasarı oluşumuna etkisini belirlemektir.

• Leukemogenesis as a new approach to investigate the correlation between up regulated gene4/upregulator of cell proliferation (URG4/URGCP) and signal transduction genes in leukemia. DodurgaY, Oymak Y, Gündüz C, Satıroglu‐Tufan NL, Vergin C, Cetingül N, Biray Avci C, Topçuoğlu N. Mol BiolRep. 2013 Apr;40(4):3043‐8. doi: 10.1007/s11033‐012‐2378‐1. Epub 2012 Dec 25.

• Higher expression of the novel gene upregulated gene 4 in two acute lymphoblastic leukemiapatients with poor prednisolone response. Oymak Y, Dodurga Y, Turedi A, Yaman Y, Ozek G,Carti O, Gunes BT, Erbudak E, Berber E, Avci CB, Vergin C. Acta Haematol. 2012;128(2):73‐6. doi:10.1159/000338220. Epub 2012 Jun 6.

Materyal-Metod• Kasumi‐1 hücre hattı çoğaltılması

• Sitotoksisite testleri

• Total RNA eldesi ve cDNA sentesi

• Real Time PCR ile analiz

• Komet assay yöntemi

• İstatistiksel analiz

Materyal-Metod• Kasumi‐1 hücre hattı RPMI1640 besi ortamında üretildi. (% 10 fötal sığır serumu

100IU/ml penisilin ve 100mg/ml streptomisin 25 mM L‐glutamin) (370C’de, %95nemli ortamda % 5 CO2 ‘li etüvde inkübasyon)

Cisplatinin 2,5 – 160 µM

aralığındaki dozları Kasumi‐1 lösemi

hücre hattına uygulanmış ve hücre

canlılığına olan etkisi, doz ve

zamana bağlı olarak, canlı

hücrelerden ATP ölçümüne dayalı

hassas bir lüminometrik bir yöntem

olan Celltiter‐ Glo yöntemi ile

belirlenmiş (24, 48, 72 saat).

Sitotoksisite Testleri

Total RNA İzolasyonu/cDNA Sentezi

Genlerin ekspresyon düzeylerinin

tespiti için kontrol ve doz olmak

üzere her bir hücre gurubu

süspansiyonundan total RNA

izolasyonu Trizol ile

gerçekleştirilmiştir.

cDNA sentezi için revers

transkripsiyon prosedürü,

Transcriptor First Strand cDNA

Synthesis Kit kullanılarak

gerçekleştirilmiştir.

p53, ATM, ATR, CHECK1, CHECK2, CDC25A, CDC25C, ERCC1,

GADD45A, GADD45G, CCND1, CDK6, BAX, BCL‐2 ve

URG4/URGCP genlerinin mRNA düzeyindeki ekspresyon

değişimleri RT‐PCR yöntemiyle belirlenmiştir.

Real‐Time PCR ile mRNA Ekspresyon Değişimlerinin Belirlenmesi

Komet Assay Analizi ile DNA Hasarının Belirlenmesi

Cisplatinin Kasumi‐1 hücrelerinde DNA hasarına olan etkisi

belirlenmiştir.

Verilerin analizi ∆∆CT metodu kullanılarak bilgisayar programı ile kantitasyonu

yapıldı. Web tabanlı “RT² Profiler™ PCR Array Data Analysis“ programında bulunan,

Volcano Plot analizleri kullanıldı.

Metodun amacı, iki ekspresyon sonucunun ±3SD karşılaştırılması esasına

dayanmaktadır. Böylelikle, gen ekspresyonunun karşılaştırılması yapılan durumlarda

kontrol ve doz grubu ilgili genlerin ekspresyon değerleri rölatif olarak belirlendi.

Grupların karşılaştırılması “RT² Profiler™ PCR Array Data Analysis” programında

bulunan “Student t‐testi” analizi ile istatistiksel olarak değerlendirildi.

İstatiksel Analiz

Bulgular/SonuçlarSitotoksisite Testleri

Cisplatinin IC50 dozu; Kasumi‐1 lösemi hücre hattı için 48. saatte 160 µM

olarak hesaplanmıştır.

Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında,

cisplatin uygulanan Kasumi‐1 hücrelerinde

ATM, CHECK 1, CDC25C, GADD45A,

GADD45G, CCND1, CDK 6, BCL‐2 ve

URG4/URGCP genlerinin ekspresyonları

istatistiksel olarak anlamlı şekilde

azalmışken, p53 geninin ekspresyonunda

ise istatistiksel olarak anlamlı şekilde artış

gözlenmiştir (p<0,05).

Bulgular/SonuçlarRT‐PCR 

Kontrol grubuna göre KASUMİ-1 hücrelerindeki ekspresyon değişimleri

Bulgular/SonuçlarKomet Assay

Kuyruk uzunluğu ve kuyruktaki DNA yüzdesi doz grubunda anlamlı olarak

arttığı analiz edildi (p<0,05)

Sonuç olarak; Yeni tanı AML hastaları (farklı kurumlarla işbirliği ile) ve farklı gen

profilleri değerlendirmek böylelikle ALL/AML olguların ayırıcı

tanısında ya da olguların tanı alabilmesinde kullanılabilecek aday

moleküler genetik belirteç olabileceğini düşünmekteyiz

Yeni onkogen olan URG4’ ün lökomogenez’deki olası etki

mekanizmasını aydınlatması ile yeni gen profil modelleri ile

tedavinin takibi ve yeni tedavi protokollerinin etkinliğinin erken

dönemlerde anlaşılabilmesine katkıda bulunulabilecektir ve

kesin tanı almamış olgularda da tanıya moleküler genetik bir

yaklaşım getirilebilecektir

Çocukluk çağı lösemilerde hücre sinyal ileti yolaklarında

görülen gen etkileşimlerindeki bozuklukların tanımlanması

için yapılan genetik çalışmalar;

Lökomogeneze ışık tutabilmesi ve prognoza yönelik yeni

hedef sağaltım modellerinin geliştirilmesi için

gerekmektedir.