Ciclo dell’acido citrico

Il metabolismo Il metabolismo ossidativoossidativo dei dei

carburanti metabolicicarburanti metabolici

I gruppi acetili derivati da carboidrati, I gruppi acetili derivati da carboidrati,

amminoacidi e acidi grassi entrano nel amminoacidi e acidi grassi entrano nel

ciclo dellciclo dell’’acido citrico dove vengono acido citrico dove vengono

ossidati a COossidati a CO22

Il Il piruvatopiruvato, derivato dal glucosio ad opera della , derivato dal glucosio ad opera della

glicolisiglicolisi

viene ossidato formando viene ossidato formando acetilacetil CoACoA ee COCO22 per per

azione di azione di 3 enzimi3 enzimi organizzati nelorganizzati nel

complesso della complesso della piruvatopiruvato deidrogenasideidrogenasi, localizzato , localizzato

nei mitocondri delle cellule nei mitocondri delle cellule eucarioticheeucariotiche..

Reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi.In questa reazione sono coinvolti cinque coenzimi e tre enzimi.

•Reazione complessiva catalizzata dal complesso della

piruvatopiruvato deidrogenasideidrogenasi::

••La decarbossilazione La decarbossilazione ossidativaossidativa

•Processo di ossidazione irreversibile:

•il gruppo carbossilico viene rimosso dal piruvato sotto

forma di una molecola di CO2

•i 2 atomi di carbonio che restano diventano il gruppo

acetilico legato al CoA.

La La deidrogenazionedeidrogenazione e la e la decarbossilazionedecarbossilazione del del piruvatopiruvato ad ad AcetilAcetil CoACoAcoinvolgono lcoinvolgono l’’azione sequenziale di azione sequenziale di

Ben 4 vitamine sono elementi essenziali di questo sistema: Ben 4 vitamine sono elementi essenziali di questo sistema:

••lala tiaminatiamina per la TPPper la TPP

••lala riboflavinariboflavina per il FAD,per il FAD,

••lala niacinaniacina per il NAD per il NAD

••ilil pantotenatopantotenato per il per il CoACoA

3 enzimi diversi:3 enzimi diversi:piruvatopiruvato deidrogenasideidrogenasi (E1), (E1),

diidrolipoildiidrolipoil transacetilasitransacetilasi (E2) (E2)

diidrolipoildiidrolipoil deidrogenasideidrogenasi (E3).(E3).

e di 5 gruppi e di 5 gruppi prosteticiprostetici o o coenzimicoenzimi:: tiaminatiamina pirofosfatopirofosfato (TPP) (TPP)

FAD FAD

CoACoA

NAD NAD

lipoatolipoato..

Organizzazione strutturale del complesso multienzimatico dellapiruvato deidrogenasi

E2= diidrolipoiltransacetilasi(24)

E1= piruvatodeidrogenasi

(24)

E3= diidrolipoilDeidrogenasi

(12)

Intero complesso(60 subunità)

Regolazione del complesso multienzimatico

• l’attivazione avviene ad opera di una

fosfoproteina fosfatasi che defosforila il

cmplesso attraverso una reazione Mg2+

e Ca 2+ dipendente

•L’inattivazione del complesso si realizza

per azione di una proteina chinasiproteina chinasi Mg 2+-

ATP-dipendente strettamente legata al

complesso multienzimatico

• l’acetil CoA e il NADH prodotti nella

reazione inibiscono la forma defosforilata

(attiva) dell’enzima, ma stimolano la

proteina chinasi, promuovendo

l’interconversione del complesso nella sua

forma inattiva

• il CoA libero inibisce la proteina chinasi e il NAD

• quando aumenta il rapporto NADH/NAD+mitocondriale o il rapporto acetil-CoA/CoA come avviene durante la ββββ-ossidazione degli acidi grassi, il complesso della piruvatodeidrogenasi è inattivato per azione della chinasi

• il piruvato è un potente inibitore della proteina chinasi, quindi alti livelli di piruvato inibiscono la chinasi e attivano il complesso

Modificazione covalente della piruvato deidrogenasinegli eucarioti.

Funzione principale del Ciclo è quella

di generare equivalenti riducenti che

sono utilizzati per produrre energia,

cioè ATP, nel processo di trasporto

degli elettroni-fosforilazione

ossidativa

CICLO DELL’ACIDO CITRICOIl ciclo dell’acido citirco ossida l’acetil CoA, il prodotto

comune della degradazione di:

• glucosio

• acidi grassi

• amminoacidi chetogenici

a CO2 e H2O con produzione di NADH e FADH2

• molti amminoacidi glucogenici possono essere ossidati attraverso

il ciclo dell’acido citrico grazie alla loro demolizione in uno dei suoi

intermedi

L’attività degli enzimi dell’acido citrico:

• citrato sintasi

• isocitrato deidrogenasi

• αααα-chetoglutarato deidrogenasi

• è controllata dalla disponibilità di substrato e dall’inibizione a

feedback da parte degli intermedi del ciclo

1a reazione: formazione di citrato

• l’enzima citrato sintasi è inibito da elevate concentrazioni di NADH(H), ATP di succinil CoA e di acil-CoA che agiscono come effettori negativi

• il citrato a sua volta agisce come effettore negativo della fosfofruttochinasi-1

L’intermedio citril-CoA non viene rilasciato dall’enzima durante la reazionee si ritiene che rimanga legato al sito catalitico della citrato sintasi• la citrato sintasi è presente nella matrice mitocondriale ed ha un peso molecolare di 100.000

2a reazione: formazione di isocitrato

• la reazione aconitasica è fortemente inibita da fluoroacetato ( CH2-F-COO- ) un composto presente in certe piante del Sud Africa

Centro ferro-zolfo dell’aconotasi

La reazione dell’aconitasinon richiede cofattori , essa richiede la partecipazione di ioni ferroso che gli vengono forniti dal centro ferro-zolfo che è un componente essenziale dell ’attivitàidratasica dell’enzima

3a reazione:decarbossilazionedecarbossilazione ssidativassidativa delldell’’isocitrato per formare isocitrato per formare aa--chetoglutaratochetoglutarato. .

Isocitrato deidrogenasi: NAD+ dip. (matrice mitocondriale, ciclo di Krebs)NADP+ dip.(citosol, reazioni anaboliche)

• peso molecolare di 380.000

• è costituita da 8 sub unità identiche

• è stimolata da ADP e in alcuni casi da AMP

• è inibita da ATPe NADH+

4a reazione:4a reazione:decarbossilazionedecarbossilazione ossidativaossidativa delldell’’ aa--chetoglutaratochetoglutarato in in succinilsuccinil--CoACoA e COe CO2

• questo complesso è identico a quello della piruvato deidrogenasi ma non è regolato da reazioni di fosforilazione e defosforilazione

• il complesso è inibito da ATP, GTP da NADH e succinil CoA

• sembra attivato da ioni calcio

Conversione del succinil-CoA a succinato5a reazione:

•• fase intermedia in cui la molecola dellfase intermedia in cui la molecola dell’’enzima diventa enzima diventa fosforilatafosforilata a livello di a livello di

un suo residuo di un suo residuo di HisHis presente nel sito attivo presente nel sito attivo

•• Il gruppo fosforico viene quindi trasferito allIl gruppo fosforico viene quindi trasferito all’’ADP o al GTP per formare ADP o al GTP per formare

ATP e GTP ATP e GTP

E E ‘‘ questa lquesta l’’unica reazione metabolica in cui il GTP unica reazione metabolica in cui il GTP èè preferito allpreferito all’’ ATP ATP

•• le cellule animali hanno 2 le cellule animali hanno 2 isozimiisozimi, uno per l, uno per l’’ADP e un altro per il GDP. ADP e un altro per il GDP.

Reazione della succinil CoA sintetasi

Un gruppo fosforico sostituisce il CoA legato

all’enzima

formando un fosfato ad alta energia

Il succinil fosfato dona il gruppo fosforico a un

residuodi His dell’enzima formando un fosfoenzima

ad alta energia

Il gruppo fosforico viene trasferito dal residuo di His

al gruppo fosforico terminale del GDP

•La formazione di ATP o GTP a spese dell’energia rilasciata dalla decarbossilazione ossidativa dell’ a-chetoglutarato è un esempio di fosforilazione a livello del substrato

• Il GTP formato dalla succinil-CoA sintetasi può donare il suo gruppo fosforico terminale all’ADP per formare ATP, mediante l’azione reversibile della nucleoside difosfato chinasi.

6a reazione: sintesi di fumarato

• la succinato deidrogenasi è fortementainibita da malonato e ossalacetato

• è attivata da ATP, fosfato inorganico e succinato

• il malonato inibisce l’enzima in modo competitivo, dovuto alla notevole somiglianza strutturale col succinato

• è una flavoproteina che è inserita a differenza degli altri enzimi, nelle membrana mitocondriale interna favorendo il trasferimento diretto degli elettroni alla catena respiratoria

• è’ costituito da due subunità di 70.000 e 30.000 m.w. rispettivamente

La succinato deidrogenasi

• la prima contiene il sito di legame per il substrato, il FAD legato alla lisina e 4 atomi di ferro + 4 atomi di zolfo

• la seconda contiene solo ferro e zolfo

7a reazione: idratazione del fumarato per produrremalato

• la fumarasi è un tetramero con M.W. Di 200.000

Ultima reazione: ossidazione del malato a ossalacetato

• in questa reazione con l’ossidazione del malato ad ossalacetato si rigenera il prodotto di partenza che così può riprendere il ciclo

• l’ossalacetato può essere convertito anche in fosfoenol-piruvatoo transaminato ad aspartato

Le reazioni Le reazioni anapleroticheanaplerotiche riforniscono il ciclo di riforniscono il ciclo di KrebsKrebs di intermedi.di intermedi.

In condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto trIn condizioni normali, esiste un bilanciamento quasi perfetto tra le reazioni che a le reazioni che

rimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo rifornisconrimuovono intermedi dal ciclo e quelle che invece lo riforniscono, e quindi la o, e quindi la

concentrazione di questi composti resta costante.concentrazione di questi composti resta costante.

CARENZA DI PIRUVATO DEIDROGENASICARENZA DI PIRUVATO DEIDROGENASI• Deficienze dei differenti componenti catalitici o subunitàregolatrici

• I bambini con questo deficit presentano alti livelli di lattatolattato, , piruvatopiruvato e e alaninaalanina che causano acidosi lattica cronica . . Presentano inoltre gravi danni neurologicigravi danni neurologici. In molti casi questa carenza comporta la morte dell’individuo

• La diagnosi viene fatta saggiando il complesso enzimatico e/o le sue subunità enzimatiche in colture di fibroblastifibroblasti di pelle prelevata dal paziente

•In alcuni casi i pazienti rispondono a un regime dieteticoregime dietetico di tipo chetogenico con bassi livelli di carboidrati

DEFICIT DI FUMARASIDEFICIT DI FUMARASI

• Il deficit di enzimi del ciclo degli acidi ticarbossilici è raro, tuttavia sono stati riportati alcuni casi in cui è presente un grave deficit di fumarasifumarasi sia a livello mitocondrialemitocondriale che citosolicocitosolico

• È presente un grave danno neurologicodanno neurologico con encefalopatiaencefalopatia e distoniadistonia che si manifestano precocementa dopo la nascita

• Le urine contengono quantità anomale di fumaratofumarato e di una o più delle seguenti sostanze : succinatosuccinato,, αααααααα--chetoglutaratochetoglutarato, citratocitrato e malatomalato

• Entrambi i genitori presentano livelli di attivitlivelli di attivitàà enzimaticaenzimaticadimezzatidimezzati rispetto al normale come si verifica nei disordini su base autosomicaautosomica recessivarecessiva

Una molecola di glucosio

può potenzialmente

promuovere la sintesi di

circa 38 ATP in condizioni

di aerobiosi, cioè quando

funziona il ciclo dell' acido

citrico.

Il ciclo dellIl ciclo dell’’acido citrico acido citrico èè regolato a livello regolato a livello delle sue tre tappe delle sue tre tappe esoergonicheesoergoniche

Il flusso dei Il flusso dei metabolitimetaboliti attraverso il ciclo dellattraverso il ciclo dell’’acido citrico acido citrico èè sotto sotto stretto controllo. Tre fattori governano la velocitstretto controllo. Tre fattori governano la velocitàà del flusso del flusso attraverso il ciclo: attraverso il ciclo:

1.1. LaLa disponibilitdisponibilitàà di substratodi substrato2.2. ll’’inibizioneinibizione da accumulo di prodotti da accumulo di prodotti 3.3. ll’’inibizione inibizione allostericaallosterica retroattiva (a feedback) dei primi enzimi del retroattiva (a feedback) dei primi enzimi del

ciclo da parte degli ultimi intermediciclo da parte degli ultimi intermedi..

Vi sonoVi sono 3 tappe3 tappe fortementefortemente esoergonicheesoergoniche nel ciclo:nel ciclo:

1.1. reaz. catalizzatareaz. catalizzata dalla dalla citrato citrato sintasisintasi

2.2. reazreaz. . catalizzatacatalizzata dalladalla isocitrato deidrogenasiisocitrato deidrogenasi

3.3. reazreaz.. catalizzatacatalizzata dalladalla aa--chetoglutarato chetoglutarato deidrogenasideidrogenasi

In condizioni normali la velocitIn condizioni normali la velocitàà della della glicolisiglicolisi e del acido e del acido citrico sono coordinate in modo che la quantitcitrico sono coordinate in modo che la quantitàà di di glucosio metabolizzato a glucosio metabolizzato a piruvatopiruvato sia soltanto quella che sia soltanto quella che poi entra nel ciclo dellpoi entra nel ciclo dell’’acido citrico sotto forma di acido citrico sotto forma di AcetilAcetil--CoACoA. .

PiruvatoPiruvato, , lattatolattato e e AcetilAcetil--CoACoA sono mantenuti a concentrazioni sono mantenuti a concentrazioni

stazionarie. stazionarie.

La velocitLa velocitàà della della glicolisiglicolisi viene quindi adeguata a quella del ciclo viene quindi adeguata a quella del ciclo

delldell’’acido citrico non soltanto dai livelli di acido citrico non soltanto dai livelli di ATP ATP e di e di NADHNADH, che sono , che sono

componenti della fase sia componenti della fase sia glicoliticaglicolitica sia respiratoria dellsia respiratoria dell’’ossidazione ossidazione

del glucosio, ma anche daldel glucosio, ma anche dal citrato. citrato.

Il Il CitratoCitrato, prodotto della prima tappa del ciclo, , prodotto della prima tappa del ciclo, èè ancheancheunun inibitore inibitore allostericoallosterico della della fosforilazionefosforilazione del fruttosiodel fruttosio66--fosfato da parte dellafosfato da parte della fosfofruttofosfofrutto chinasichinasi--1 della via 1 della via glicoliticaglicolitica..

L‘ aconitasi funziona in condizioni vicine all' equilibrio, funziona in condizioni vicine all' equilibrio,

per cui la velocitper cui la velocitàà didi consumo del consumo del citratocitrato dipendedipende

dall'attivitdall'attivitàà::

1.1.dell'isocitrato dell'isocitrato deidrogenasideidrogenasi NAD+NAD+--dipendente,dipendente, che in vitro che in vitro viene fortemente inibita dal suo prodottoviene fortemente inibita dal suo prodotto NADH.NADH.

2.2. La citrato La citrato sintasisintasi viene ancheviene anche inibita dal NADHinibita dal NADH, , ma ma èè meno meno sensibile dell'isocitrato sensibile dell'isocitrato deidrogenasideidrogenasi alle variazioni dellaalle variazioni della [NADH].[NADH].La citrato La citrato sintasisintasi èè anche inibita e dal citrato che compete con anche inibita e dal citrato che compete con l'l'ossalacetatoossalacetato))

3.3. l'inibizionel'inibizione delldell‘‘aa--chetogluraratochetoglurarato deidrogenasideidrogenasi da parte del da parte del NADH e del NADH e del succinilsuccinil--CoACoA.. Il Il succinilsuccinil--CoACoA compete anche concompete anche conl'l'acetilacetil--CoACoA nella reazione della citrato nella reazione della citrato sintasisintasi ((inibizione inibizione retroattiva competitivaretroattiva competitiva). ).

Questo sistema di inibizioni combinate aiuta a mantenere Questo sistema di inibizioni combinate aiuta a mantenere regolato il ciclo dell' acido citrico in modo coordinato.regolato il ciclo dell' acido citrico in modo coordinato.

Altri meccanismi regolatoriAltri meccanismi regolatori

��Studi in vitro riguardanti gli enzimi del ciclo dell'acido citriStudi in vitro riguardanti gli enzimi del ciclo dell'acido citrico co hanno permesso di identificare alcuni inibitori e hanno permesso di identificare alcuni inibitori e attivatoriattivatoriallostericiallosterici..

��LL’’ADP ADP èè un un attivatoreattivatore allostericoallosterico dell'isocitrato dell'isocitrato deidrogenasideidrogenasi, , mentre l'ATP inibisce questo enzima.mentre l'ATP inibisce questo enzima.

��Il Ca2+Il Ca2+ oltre alle sue altre numerose funzioni cellulari, regola il oltre alle sue altre numerose funzioni cellulari, regola il ciclo dell' acido citrico in diversi punti: ciclo dell' acido citrico in diversi punti:

��attivaattiva la la piruvatopiruvato deidrogenasideidrogenasi fosfatasifosfatasi, che a sua volta attiva , che a sua volta attiva il complesso dellail complesso della piruvatopiruvato deidrogenasideidrogenasi per la produzione diper la produzione di acetilacetil--CoACoA..

�� Il Ca2+,Il Ca2+, attiva ancheattiva anche l'isocitrato l'isocitrato deidrogenasideidrogenasi e le l‘‘a a chetoglutaratochetoglutarato deidrogenasideidrogenasi

••CosCosìì il Ca2+,il Ca2+, il segnale che stimola la contrazione muscolare, il segnale che stimola la contrazione muscolare,

stimola anche la produzione dell'ATP che andrstimola anche la produzione dell'ATP che andràà a supportarlaa supportarla

••Nel muscolo cardiacoNel muscolo cardiaco, dove il ciclo dell' acido citrico , dove il ciclo dell' acido citrico èèattivo, il flusso dei attivo, il flusso dei metabolitimetaboliti lungo il ciclo lungo il ciclo èè proporzionale alla proporzionale alla velocitvelocitàà del consumo cellulare di ossigenodel consumo cellulare di ossigeno

PoichPoichéé il consumo di ossigeno, la il consumo di ossigeno, la riossidazioneriossidazione del NADH e la del NADH e la

produzione di ATP sono saldamente accoppiatiproduzione di ATP sono saldamente accoppiati, , il ciclo dell'acido il ciclo dell'acido

citrico deve essere regolato da meccanismi retroattivi che citrico deve essere regolato da meccanismi retroattivi che

coordinino la produzione di NADH con il consumo di energia.coordinino la produzione di NADH con il consumo di energia.

K = [ossalacetato][NADH][malato] [NAD+]

I più importanti regolatori del ciclo dell'acido citrico sono i suoi substrati

�l'acetil-CoA

�l'ossalacetato

�il suo prodotto, NADH.

��SiaSia l'l'acetilacetil--CoACoA sia lsia l’’ ossalacetatoossalacetato sono presenti nei mitocondri a sono presenti nei mitocondri a

una concentrazione che non una concentrazione che non èè in grado di saturare la citrato in grado di saturare la citrato sintasisintasi. .

��Il flusso metabolico lungo questo enzima varia quindi in funzionIl flusso metabolico lungo questo enzima varia quindi in funzione e

della concentrazione di substrato e viene controllato dalla della concentrazione di substrato e viene controllato dalla

disponibilitdisponibilitàà di di quest'quest'ultimo. ultimo.

�� La produzione di La produzione di acetilacetil--CoACoA a partire da piruvato viene regolata a partire da piruvato viene regolata

dall' attivitdall' attivitàà della della piruvatopiruvato deidrogenasideidrogenasi. .

��La concentrazione di La concentrazione di ossalacetatoossalacetato, che , che èè in equilibrio con il in equilibrio con il

malato, fluttua a seconda del rapporto [NADH]/[malato, fluttua a seconda del rapporto [NADH]/[NAD+NAD+] seguendo ] seguendo

l'espressione all'equilibriol'espressione all'equilibrio

K K = = [[ossalacetatoossalacetato][NADH]][NADH]

[malato] [[malato] [NAD+NAD+]]

Se aumenta il carico di lavoro del muscolo e la respirazione, neSe aumenta il carico di lavoro del muscolo e la respirazione, nei i

mitocondri la [NADH] diminuisce.mitocondri la [NADH] diminuisce.

Il conseguente aumento della [Il conseguente aumento della [ossalacetatoossalacetato] stimola l'attivit] stimola l'attivitàà delladella

citrato citrato sintasisintasi, che controlla la velocit, che controlla la velocitàà di formazione del citrato.di formazione del citrato.

Il ciclo del citrato come piattaforma girevole del metabolismo.

fine