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. 2013-2014
Prof. Antonio Prof. Antonio Toffoletti Toffoletti
CHIMICAVenVen 15 novembre 201315 novembre 2013
Lezioni di Chimica FisicaLezioni di Chimica Fisica•• Spettroscopia Spettroscopia UUltraltra VViolettaioletta--VisVisibile (ibile (UVUV--visvis))
•• 2^ parte 2^ parte –– Fluorescenza e FosforescenzaFluorescenza e Fosforescenza
Laurea triennale in BIOLOGIALaurea triennale in BIOLOGIAA. A. 2013A. A. 2013--1414
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Principali cromofori biologici e caratteristiche di assorbimentoC
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3
Esempio di spettro di assorbimento UV di una proteina
240nm<λ<300nmAssorbimento π-π* degli amminoacidi aromatici
190nm<λ<240nmAssorbimento π-π* dei legami peptidici
λ<190nmσ-σ* di tutti i
legami
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4
Spettri di assorbimento UV dei principali amminoacidi aromatici
Triptofano (Trp)
Fenilalanina (Phe)
Tirosina (Tyr)
Assorbimento π-π* aromatico
L’assorbimento a λ=280 nm viene talvolta usato per misurare la concentrazione di proteine
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Spettri di assorbimento UV dei principali amminoacidi aromatici
Triptofano (Trp)
Fenilalanina (Phe)
Tirosina (Tyr)ε280 (Trp) = 5690 l mol-1 cm-1
ε280 (Tyr) = 1280 l mol-1 cm-1
ε280 (Phe) = 160 l mol-1 cm-1
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6
Esempio di spettri di assorbimento UV delle basi del DNA, RNA
N N
N N
NH2
N N
N NH
O
N
N
NH
O
O
N
N
O
NH2
Adenina (A)
Guanina (G)
Timina (T)
Citosina (C)
N
N
O
O
Uracile (U)
Assorbimento π−π* tra 260-270 nm
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L’incolonnamento delle basi nella struttura del DNA induce una diminuzione di assorbimento (effetto “ipocromico”).Si utilizza questo effetto per misurare la denaturazione del DNA (“curva di fusione” del DNA)
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8
Fluorescenza
A
S0
S1
S2
S3
La fluorescenza avviene sempre a lunghezze d’onda uguali o maggiori dell’assorbimento.Si può osservare struttura vibronica anche nella fluorescenza
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Si definisce la resa quantica di fluorescenza come il rapporto tra il numero di fotoni emessi ed il numero di fotoni assorbiti
è un numero compreso tra 0 e 1assorbiti fotoni .
emessi fotoni .
nr
nrfl =Φ
H2O, pH = 7
I principali fluorofori biologici intrinseci sono gli amminoacidi aromatici, in particolare tirosina e triptofano. Le basi degli acidi nucleici sono pochissimo fluorescenti. Sono fluorescenti alcuni coenzimi come NADH, FAD e FMN.
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Schema semplificato della strumentazione per assorbimento / fluorescenza UV-VIS
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Sorgente
Campione
Riferimento
Schema di una spettrometro di assorbimento UV-VIS “a doppio raggio”
Monocromatore(prisma, reticolo)
Rivelatori di intensitàluminosa
(fotodiodi o tubi fotomoltiplicatori)
fenditura
specchi
I0(λλλλ)
I(λλλλ)
( ) ( )( )
( ) ( )λλ
λλλ
TLogA
I
IT
110
0
=
=
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Sorgente
Campione
Schema di una spettrometro di fluorescenza UV-VIS (fluorimetro)
Monocromatore di eccitazione (prisma, reticolo)
Rivelatore di intensitàluminosa (tubo fotomoltiplicatore)
Monocromatore di emissione(prisma, reticolo)
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Esercizi di spettroscopia
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1) La radiazione elettromagnetica con numero d’onda 20000 cm-1 appartieneal campo a) dell’infrarossob) del visibilec) dell’ultravioletto
2) Se una radiazione elettromagnetica ha una frequenza ν = 1014 Hz, quant’è il periodo dell’oscillazione del campo elettrico?
a) T=1014 secondib) T=10-2 millisecondic) T=10-2 picosecondi
3) Il coefficiente di assorbimento (o estinzione) molare (εεεε) nella legge di Lambert-Beer dipende : a) dalla lunghezza d’ondab) dalla concentrazionec) dal percorso ottico
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4) Quale delle seguenti componenti di un spettrofotometro sono utilizzate per separare le diverse componenti in frequenza della radiazione
a) la lampadab) prisma o reticolo di diffrazionec) rivelatore
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7) Se una soluzione di triptofano a concentrazione 2×10-4 M ha assorbanza 1.1 a λ=280nm in una cella con cammino ottico di 1 cm , quanto vale εεεε (λ=280) ?
1-1-14
cm moli l 5500cm1lmoli102
1.1 =
⋅×==⇒= −−cl
AεclA εεεε
6) Il fenomeno della fluorescenza si riferisce a: a) assorbimento di un fotone da parte di un cromoforob) emissione di un fotone da parte di un cromoforo dopo l’eccitazionec) assenza di eccitazioni elettroniche in un cromoforo
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