centro universitÁrio das faculdades …
TRANSCRIPT
CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS
FMU
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
ESTUDO DA COLETA E PROCESSAMENTO DE SÊMEN BOVINO
LAILA VICENTE TEIXEIRA
São Paulo
2009
LAILA VICENTE TEIXEIRA
ESTUDO DA COLETA E PROCESSAMENTO DE SÊMEN BOVINO
Monografia apresentada como trabalho de
conclusão de curso de Medicina Veterinária
do Centro Universitário das Faculdades
Metropolitanas Unidas - FMU, sob
orientação da Profa. Dra. Carolina Amália
de Souza Dantas Muniz.
São Paulo
2009
Laila Vicente Teixeira
Estudo da Coleta e processamento de sêmen bovino
Trabalho apresentado para conclusão do curso
de Medicina Veterinária da FMU, sob
orientação do Profa. Dra. Carolina Amália de
Souza Dantas Muniz. Defendido e aprovado
em 17 de Dezembro de 2009, pela banca
examinadora, constituída pelos professores:
_____________________________
Profa. Dra. Carolina Amália de Souza Dantas Muniz
FMU- Orientadora
_____________________________
Profa. Dra. Maria Carolina Guido
Banca Examinadora
_______________________________
Profa. Dra. Andréa Roberto Bueno Ribeiro
FMU- Banca Examinadora
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, por estar comigo em todos os lugares onde vou,
me ajudando e me mostrando o caminho que devo seguir, e também pelo dom da vida.
Agradeço aos meus Pais, Edson Falchi Teixeira e Maria Lúcia Vicente Teixeira, a
vocês, que estiveram ao meu lado nas horas que chorei e nas horas que sorri nas horas que
me lamentei e nas horas e que de uma forma ou de outras demonstrei total alegria.
Agradecer pelo sorriso diário, sem mágoas nem rancores, agradecer de peito aberto, de
alma explosiva. Hoje quero parar de agradecer, porque vocês fazem, farão sempre parte da
minha história.
Agradeço a minha orientadora nesse trabalho, a Profa. Dra. Carolina Amália de
Souza Dantas Muniz, pela atenção e dedicação dispensada em todos os momentos.
Agradeço também D. Nadir de Achiles, Antônio de Achilles Filho e Dr.
Marcos Antônio de Achilles, pois são pessoas importantes para eu, pois me acolheram em
sua casa e lá fui recebida com todo carinho e atenção, melhor dizendo como filha durante o
meu estágio obrigatório, eles me apoiaram nessa etapa da minha vida e da qual pude criar
uma grande amizade e que posso falar com toda certeza que irá me acompanhar sempre.
Amo vocês
Agradeço também o Eduardo Parisi que foi muito importante nesta jornada
acadêmica, onde sempre me ajudou nos momentos de desespero.
Jamais esqueceria de agradecer as pessoas que me acompanharam ao longo desses
anos e das quais hoje posso falar que são minhas amigas e as considero muito e espero que
me acompanhem para sempre em minha vida.
Faço um especial agradecimento a Dra. Andréa Roberto Bueno Ribeiro e a Dra.
Maria Carolina Guido, por aceitar o convite honrando- nos com sua presença, também
pelas suas importantes contribuições para os encaminhamentos finais do trabalho aqui
proposto.
E finalmente agradeço a todos os animais que por alguns momentos, contribuíram
para que meus ensinamentos tenham sido colocados em prática.
Dedico este trabalho aos meus pais, por
seu apoio contínuo e incondicional
durante toda minha vida, aos meus
amigos, que estiveram sempre ao meu
lado em momentos bons e ruins, aos
meus professores, que participaram
ativamente da minha formação
intelectual, moral e profissional durante
estes anos de graduação.
"É menor pecado elogiar um mau livro sem o
ler, do que depois de o ter lido. Por isso,
agradeço imediatamente depois de receber o
volume.
“Não há vida literária plenamente virtuosa.”
(Carlos Drummond de Andrade)
RESUMO
Este trabalho tem como objetivo verificar a importância da tecnologia empregada no
processamento e congelamento de sêmen bovino, onde a idéia é mostrar a aplicabilidade de
cada técnica, com a utilização da coleta e seu processamento que, proporciona a
disseminação de genes de animais superiores, assim a possibilidade da aplicação da
inseminação artificial, permitindo maximizar genéticas superiores para obtenção de
produtos de elevado ganho de peso e boa qualidade de carcaça. Iniciando pelo processo de
coleta de sêmen, tendo como vagina artificial um dos métodos mais utilizados nas centrais,
pois evita alterações comportamentais e é o que mais se aproxima de uma monta natural, o
eletroejaculador já é mais utilizado quando há presença de algum problema de articulação
dificultando a monta do touro tendo como desvantagem ser um método estressor para o
animal, o método da massagem das ampolas do ducto deferente apesar de ser o método
mais simples para coleta do sêmen não é muito utilizada pelo fato de se obter baixa
qualidade, baixa concentração espermática e alto índice de contaminação, apenas utilizada
para uma avaliação espermática. A análise do sêmen é a parte mais importante na
avaliação da fertilidade do macho, verificando o volume, coloração, odor, movimento de
massa, pH, densidade, concentração, motilidade, turbilhonamento, vigor e onde se observa
se há presença de patologias espermáticas. Os diluidores potencializam a capacidade de
fecundação e preservam a capacidade fecundante do espermatozóide. A diluição tem como
objetivo aumentar o ejaculado potencializando, permitindo que um grande número de
fêmeas sejam inseminadas a partir de uma pequena quantidade. O envasamento sofreu
muitas modificações nos últimos anos, desde pellets para ampolas, palhetas grossas e por
último a palheta fina sendo a mais utilizada por apresentar maior facilidade no
armazenamento e menor perda espermática. O congelamento é um processo lento, onde
inicialmente ele passa por um resfriamento para -150o
C por quinze minutos e em seguida
para o congelamento em -196o C.
Palavra- chave: anormalidades espermáticas, características morfológicas, diluentes.
ABSTRACT
This study aims to verify the importance of technology used in processing and freezing of
bull semen, where the idea is to show the applicability of each technique, using the
collection and processing that provides the spread of genes from higher animals, as well
the possibility of application of artificial insemination, allowing maximize superior genetic
products to obtain high gain and good quality housing. Starting the process of semen
collection, with the artificial vagina one of the most widely used in power because it
prevents behavioral changes and is the closest to a natural mating, the electroejaculation is
already widely used when there is presence of a problem of articulation making it difficult
to mount the bull has the disadvantage of being a method stressor for the animal, the
method of massage of the ampulla of the vas deferens despite being the simplest method
for collecting semen is not used much because of getting low quality, low concentration
sperm and high level of contamination was only used for an assessment of sperm. The
semen analysis is the most important in the evaluation of male fertility by checking the
volume, color, odor, mass movement, pH, density, concentration, motility, turbulence, and
where force can be observed if there is presence of sperm pathologies. Extenders potentiate
the ability of fertilization and preserve the fertilizing ability of sperm. Dilution aims to
increase the ejaculate empowering, allowing a large number of females to be inseminated
from a small amount. The potting underwent many changes in recent years, since pellets
for light bulbs, thick reeds and finally a thin pick is the most widely used due to its greater
ease of storage and decrease sperm. Freezing is a slow process, which once it passes
through a cooling-150th C for fifteen minutes and then to the freeze-196th C.
Keyword: sperm abnormalities, morphological, thinners.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................12
2 REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................................13
2.1 Aparelho genital masculino........................................................................................13
2.2 Coleta do sêmen nos bovinos.....................................................................................14
2.2.1 Vagina artificial...............................................................................................14
2.2.2 Eletroejaculação...............................................................................................17
2.2.3 Método da massagem das ampolas dos ductos deferentes..............................19
2.3 Análise do sêmen.......................................................................................................19
2.3.1 Análise macroscópica......................................................................................19
2.3.1.1 Volume.............................................................................................19
2.3.1.2 Coloração..........................................................................................20
2.3.1.3 Odor..................................................................................................20
2.3.1.4 Movimento de massa........................................................................20
2.3.1.5 pH.....................................................................................................21
2.3.1.6 Densidade.........................................................................................21
2.3.2 Análise microscópica.......................................................................................21
2.3.2.1 Concentração....................................................................................21
2.3.2.2 Motilidade........................................................................................22
2.3.2.3 Turbilhonamento...............................................................................23
2.3.2.4 Vigor.................................................................................................24
2.3.3 Análise das patologias espermáticas................................................................24
2.4 Diluidores...................................................................................................................25
2.4.1 Tipos de diluidores..........................................................................................26
2.4.1.1 Citrato gema do ovo..........................................................................26
2.4.1.2 Meios à base de leite.........................................................................27
2.4.1.3 Tris- gema de ovo.............................................................................28
2.5 Diluição......................................................................................................................29
2.6 Substâncias crioprotetoras ........................................................................................30
2.7 Envasamento..............................................................................................................30
2.8 Congelamento............................................................................................................32
3. CONCLUSÕES .........................................................................................................34
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... .35
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Trato reprodutor masculino bovino......................................................................13
Figura 2-Vagina artificial.....................................................................................................15
Figura 3- Pré-aquecimento da vagina artificial....................................................................15
Figura 4- Insuflando ar na válvula da vagina artificial........................................................16
Figura 5 - Aplicação da vagina artificial..............................................................................17
Figura 6- Monta Falsa (frustrada)........................................................................................17
Figura 7- Eletroejaculador para bovinos..............................................................................18
Figura 8- Brete de contenção...............................................................................................18
Figura 9-Espectrofotômetro.................................................................................................22
Figura 10- Representação do espermatozóide.....................................................................25
Figura 11- Equipamento automático de identificação de palhetas.....................................30
Figura 12- Equipamento automático de envase..................................................................32
Figura 13- Envase manual do sêmen ...................................................................................32
Figura 14- Câmara de resfriamento do sêmen......................................................................33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Classificação do ejaculado, de acordo com a sua motilidade....................................23
Tabela 2- Classificação da propulsão e velocidade dos espermatozóides.................................24
Tabela 3- Composição do diluidor gema citrato........................................................................26
Tabela 4- Composição do diluidor meios à base de leite...........................................................27
Tabela 5- Composição do diluidor TRIS- gema de ovo............................................................28
12
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui o maior rebanho comercial do mundo com 19% da população bovina,
com grande expressão no cenário mundial da pecuária bovina e mercado de carne, ficando
somente atrás da Índia, com rebanho total de mais de 336 milhões de cabeças (BEEF POINT,
2009).
A inseminação artificial em bovinos é a biotecnologia reprodutiva de custo mais
acessível e que serve como uma ferramenta para o melhoramento genético dos rebanhos. A
inseminação artificial é a deposição mecânica do sêmen no aparelho reprodutivo da fêmea
ocorre à deposição do sêmen no aparelho reprodutivo da fêmea; a fecundação, ou seja, a união
do espermatozóide com o óvulo e a formação de um novo ser ocorrem naturalmente (ASBIA,
2009). Para a sua ampla aplicação é indispensável o uso do sêmen congelado. A tecnologia
empregada no processamento e congelamento de sêmen bovino encontra-se atualmente muito
bem desenvolvida, representando o fator que promoveu de maneira mais intensa o processo de
melhoramento genético do gado de corte e leite em todo mundo (MEDEIROS et al., 2002).
O processo tecnológico de criopreservação do sêmen de animais de alta qualidade
permite a maximização de seu material genético, pelo aumento do número de fêmeas que
podem ser inseminadas com um único ejaculado permitindo o armazenamento deste material
por tempo indeterminado (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
O principal objetivo da preservação do sêmen é obter gestações por inseminação
artificial tão eficazmente quanto por monta natural, sendo que depende de vários fatores além
da qualidade do sêmen. O sêmen de animais domésticos foi criopreservado com sucesso há
mais de 30 anos, onde se utilizava dióxido de carbono sólido (gelo seco a -70oC), que foi
substituída pelo nitrogênio líquido (-196oC) com a vantagem de apresentar um condição mais
estável do sêmen criopreservado (HAFEZ; HAFEZ, 2004).
No entanto a criopreservação do sêmen tomou um impulso muito grande no final da
década de 40, após a descoberta da função crioprotetora do glicerol pelo cientista Polge, que
permitiu o congelamento, com sucesso do sêmen bovino. Entretanto, mesmo as melhores
técnicas atuais de preservação, alcançam em média, cerca de 50% de viabilidade da população
espermática (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
13
Este trabalho teve como objetivo abordar, por meio da revisão de literatura, os vários
fatores relacionados à coleta, armazenamento e congelamento do sêmen bovino.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 APARELHO GENITAL MASCULINO
O sistema reprodutivo masculino é constituído de diversos órgãos peculiares que atuam
em conjunto para produzir espermatozóides e liberá- los no sistema reprodutor da fêmea
(HAFEZ; HAFEZ, 2004). Na Figura1 está representado o trato reprodutor masculino.
r- reto; a- ampola; gv- glândula vesicular; p- próstata; bu- glândula bulbouretral; cp- crus
esquerda do pênis; rp- músculo retrator do pênis; fs- flexura sigmóide; dd- Ducto deferente;
cab. e- Cabeça do epidídimo; t- Testículo; e- Escroto; caud. e- Cauda do epidídimo; pl- Pênis.
Figura 1- Trato reprodutor masculino bovino.
Fonte- Hafez e Hafez (2004)
14
2.2 Coleta do sêmen nos bovinos
Para a coleta de sêmen são adotados métodos diferentes para cada objetivo, mas todos
os métodos devem considerar o bem estar dos animais, um bom manejo e pessoas bem
preparadas, pois é a partir de uma coleta de sêmen adequada que se dá início a um bom
programa de melhoramento genético, garantindo espermatozóides viáveis para a disseminação
do material genético superior (BERBER, 2009).
Para iniciar a coleta de sêmen alguns cuidados devem ser tomados relativos ao touro
doador, para que se obtenham bons ejaculados que permitam seu congelamento. Deve-se dar
um banho completo no touro antes da coleta; fazer a tricotomia prepucial; lavagem da região
abdominal; lavagem do prepúcio e pênis com solução anti-séptica através de sonda, seguido
por enxágüe com solução salina morna para retirada dos resíduos do anti-séptico. Todas essas
medidas são vitais para assegurar a qualidade do material coletado. Além dos cuidados com o
touro doador, deve-se atentar para os cuidados com instalações onde se realiza a coleta e
também com a limpeza do material utilizado na coleta (BERBER, 2009).
Para realizar a coleta de sêmen podem ser utilizados diferentes métodos, entre eles, a
eletroejaculação, a vagina artificial e a massagem transretal das ampolas dos ductos deferentes
(VASCONCELLOS, 1983; HAFEZ; HAFEZ, 2004). Em função das vantagens e
desvantagens das diversas metodologias, os dois primeiros são os mais aplicáveis,
respectivamente, à realidade diária do manejo em campo e nas centrais de inseminação
(MARQUES FILHO et al., 2009).
2.2.1 Vagina artificial
A vagina artificial é o método mais usado em central de inseminação artificial (MIES
FILHO, 1987; CARDOSO et al., 2004), consistindo essencialmente em se fazer com que o
animal realize a cópula em um aparelho adaptado para este fim, simulando as condições da
vagina natural, e assemelhando-se à monta natural permitindo que o animal ejacule naturalmente
(HAFEZ; HAFEZ, 2004). É o método mais indicado para evitar alterações comportamentais
(BARTH, 1997).
15
O sêmen é colhido em condições próximas da ideal para posterior análise com
finalidade de exame espermático e emprego para processamento. Esta técnica pode ser realizada
com a utilização de manequins ou fêmea (FEITOSA, 2004).
A vagina artificial (Figura 2), consiste em um tubo de borracha, com o diâmetro de mais
ou menos 10 cm e comprimento de 40 cm, possuindo um pequeno orifício lateral que possui uma
válvula de metal para vedá-la. Este tubo é revestido por uma borracha de látex do mesmo diâmetro
para formar pregas sendo mais comprido 20 cm, para serem viradas as pontas vedando as
extremidades do tubo externo, em uma das extremidades, na parte interna, passa-se vaselina ou
glicerina líquida, usando-se um bastão maciço de vidro e na outra extremidade é colocado um
cone de plástico ou borracha contendo um tubo de ensaio onde será envolto em pano escuro, para
proteção dos espermatozóides, da temperatura e da luz. Esta operação é precedida pela colocação
de água quente à temperatura de 40° C a 43°C (Figura 3), pelo orifício externo do tubo, devendo a
água ficar entre os tubos (VASCONCELLOS, 1983). Após colocar a água pode-se, também,
insuflar ar pela válvula existente na parte externa (Figura 4), fazendo com que a parede interna da
vagina artificial comprima ainda mais a base do pênis, estimulando os músculos deste (FEITOSA,
2004).
Figura 2- Vagina artificial. Figura 3- Pré-aquecimento da vagina artificial Fonte: MUCCIOLO (2003) Fonte: MUCCIOLO (2003)
16
Figura 4- Insuflando ar na válvula da vagina artificial.
Fonte: MUCCIOLO (2003)
A temperatura da vagina artificial deve ser mantida em temperatura adequada, pois se
estiver abaixo de 40oC pode prejudicar a ejaculação do touro e também não pode estar acima
de 43oC, pois pode afetar o pênis e provocar estresse ao animal (SILVA et al., 1993).
Para fazer a coleta o operador deve posicionar-se ao lado direito do macho. Quando o
animal saltar sobre o manequim, o pênis deve ser desviado lateralmente, deixando com que o
animal faça a introdução do membro (pênis) na vagina artificial. A vagina artificial deve ser
mantida em um ângulo de aproximadamente 45o, facilitando assim a introdução do pênis
(Figura 5). Logo após o animal ejacular, a vagina deve ser posicionada na vertical para se
evitar a perda de sêmen (FEITOSA, 2004).
Em touros é aconselhável executar duas ou três montas falsas (frustradas), onde o
animal salta sobre o manequim ou fêmea (Figura 6) e tem seu pênis desviado lateralmente,
mas não faz a introdução da vagina artificial, esta conduta excita o animal e faz com que a
amostra seminal fique mais concentrada, pois o touro eliminará considerável volume de
líquido seminal. O intervalo entre uma coleta e outra varia de 20 a 30 minutos (FEITOSA,
2004).
17
Figura 5- Aplicação da vagina artificial.
Fonte: MUCCIOLO (2003)
Figura 6- Monta falsa (frustrada).
Fonte: arquivo pessoal (2009).
2.2.2 Eletroejaculação
A técnica da eletroejaculação pode ser usada em touros que apresentem lesões
articulares, idade avançada ou que recusam a vagina artificial (VALE FILHO, 2001). O
eletroejaculador (figura 7), foi descrito pela em 1945 este método além de dispensar a fêmea
ou o manequim, conserva o sêmen em estado de pureza, sendo o método eletivo para a
realização de exames andrológicos (MIES FILHO, 1987).
Segundo Marques Filho et. al., (2008), para a realização da coleta o touro deve ser
colocado em um brete de contenção adequado (Figura 8), para evitar lesões ao animal e ao
operador. A coleta de sêmen com finalidade de exame andrológico não necessita de rigorosa
18
higienização, o mesmo não ocorrendo quando se deseja colher a amostra para processamento,
ou seja, utilização de sêmen fresco diluído ou não, sêmen refrigerado ou congelado. Da
mesma maneira, como descrito anteriormente por Berber (2009), para a coleta de sêmen a
higiene do animal deve ser realizada.
A coleta é feita com o auxílio de um aparelho que consiste em um eletrodo com mais
ou menos 6 cm de diâmetro e 35 a 40 cm de comprimento, possuindo uma extremidade polida,
onde se passa vaselina, para introduzir no reto do touro; na outra extremidade possui um fio
que está ligado ao eletroestimulador e um botão regulador de intensidade de corrente. Logo
após a contensão do touro coloca-se o eletrodo no ânus do animal, e em seguida, liga-se a
corrente, que produz estímulos a cada 3 segundos que atuam nas glândulas seminais
(VASCONCELLOS, 1983).
Figura 7- Eletroejaculador para bovinos. Figura 8- Brete de contenção.
Fonte: RURAL BAN (2009). Fonte: MUCCIOLO(2003).
Este método baseia-se na estimulação elétrica (bifásica, entre 16 e 25 volts) dos centros
eretores e ejaculador, promovendo a contração dos músculos uretrais e provocando a liberação
do sêmen e do plasma seminal (GROVE, 1975; DERIVAUX, 1980; SILVA; DODE, 1993).
19
2.2.3 Método da massagem das ampolas dos ductos deferentes
A massagem das ampolas dos ductos deferentes é um dos métodos mais simples de
coleta de sêmen em bovinos, mas a obtenção de sêmen por este método requer prática e
muitos animais não respondem aos estímulos. Este método de coleta tem baixa qualidade,
baixa concentração espermática e alta contaminação, servindo apenas para avaliação rápida,
quando não se tem outra opção e se quer ter uma idéia da qualidade espermática do
reprodutor, não devendo ser aproveitado para o processo de congelamento quando o uso é
destinado para programas de inseminação artificial (GONÇALVES; FIGUEIREDO;
FREITAS, 2008).
2.3 Análises do sêmen
A análise do sêmen é a parte mais importante na avaliação da fertilidade do macho, e
compreende a avaliação macroscópica e microscópica e análise das patologias espermáticas
(CARDOSO et al., 2004).
2.3.1 Análise Macroscópica
O exame macroscópico inclue a valoração do ejaculado com relação ao seu volume,
coloração, odor, movimento de massa, densidade e pH (CARDOSO et al., 2004).
2.3.1.1 volume
O volume não é avaliado pela quantidade de sêmen, mas pela sua qualidade
espermática. Esta característica indica o número de doses seminais que devem ser preparadas
(RODRIGUEZ, 2002).
O volume é representado em mililitros (mL) e lido na graduação do copo coletor ou
constatado com uma pipeta graduada. O parâmetro mínimo para touros com idade superior a
dois anos é de 4 mL, enquanto para touros jovens é de 2 mL. O volume de sêmen obtido na
20
espécie bovina vária de 0,5 – 20 mL, sendo que a média do ejaculado bovino é 5 mL
(FEITOSA, 2004).
2.3.1.2 coloração
Naturalmente, o sêmen do touro é de coloração branca ou branco- pérola, podendo
variar a coloração quando ocorrer presença de alterações no ejaculado. Quando o ejaculado
apresentar a coloração avermelhada é devido à presença de sangue, neste caso o touro
apresenta algum ferimento na uretra, glande ou nas glândulas anexas. Se o ejaculado
apresentar coloração amarela, podendo ser mais forte, quando o ejaculado estiver menos
concentrado, devido à presença da riboflavina e também pode ser pela presença de urina. A
coloração esverdeada no ejaculado é devido à presença de secreção purulenta, neste caso o
animal apresenta alguma infecção. Se o ejaculado apresentar um coloração amarronzada é
devido a lesões antigas onde já possui degradação celular (CARDOSO et al., 2004).
2.3.1.3 odor
O odor na maioria das vezes é imperceptível (sui generis) que provém do fosfato de
espermina. Quando apresentar um odor urinoso ou cítrico ocorreu à presença de urina no
ejaculado e odor pútrido quando houver presença de bactérias (CARDOSO et al., 2004).
2.3.1.4 movimento de massa
O movimento de massa consiste em uma análise macroscópica, onde pode-se visualizar
a movimentação do ejaculado. Em touros este movimento é difícil observação, sendo mais
fácil sua visualização em ovinos pois a concentração de espermatozóide é maior quando
comparada com o bovino, e pode ser classificado em movimento ativo, médio ou lento
(MARQUES FILHO, 2008).
21
2.3.1.5 pH
O pH do sêmen no touro pode variar de (6,5 a 6,9) tornando-se mais ou menos alcalino
com a quantidade da secreção das glândulas acessórias; o segundo ejaculado numa seqüência
de coletas é mais ácido (pH mais baixo) e associado a uma melhor concentração e motilidade
(CARDOSO et al., 2004).
2.3.1.6 Densidade
A densidade do sêmen é dependente da quantidade de células espermáticas, podendo
variar de um animal para outro e entre os ejaculados sucessivos do mesmo animal. A
densidade é uma característica macroscópica, quando se coloca na câmara para realizar a
contagem de espermatozóide é considerada concentração que é uma característica
microscópica (CARDOSO et al., 2004). A densidade é classificada em muito densa; densa;
pouco densa; aquosa (MC GUIDO, 2009).
2.3.2 Análise Microscópica
O exame microscópico inclue a valoração do ejaculado com relação ao sua
concentração, motilidade, turbilhonamento e vigor (CARDOSO et al., 2004).
2.3.2.1 Concentração
A concentração refere-se ao número de espermatozóides por centímetro cúbico e oscila
entre 700 e 1.200 milhões (CARDOSO et al., 2004).
Nos zebuínos a concentração normal é de 200 mil a 1,2 milhões de espermatozóide
/mL através do eletroejaculador e 800 mil a 1,2 milhões de espermatozóide/mL na vagina
artificial (CARDOSO et al., 2004).
22
É utilizado dois tipos de aparelhos para se obter a concentração câmara de Newbawer e
o espectrofotômetro (SILVA et al., 1993).
Na Figura 9, pode se verificar o aparelho de espectrofotômetro responsável pela
avaliação da concentração espermática.
Figura 9- Espectrofotômetro.
Fonte: Arquivo pessoal (2009)
2.3.2.2 Motilidade
A motilidade é porcentagem de espermatozóides vivos e móveis, deve ser avaliada
imediatamente após a coleta de sêmen (FEITOSA, 2004).
A porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva é melhor apreciada em
sêmen diluído, pois, a alta concentração pode prejudicar a avaliação. Nesses casos, a diluição
pode ser realizada, imediatamente, colocando-se em um tubo de ensaio um mL de diluidor ou
solução fisiológica aquecida a 37oC, adiciona 2 gotas de sêmen no tubo, homogenizar e
colocar na lâmina aquecida com lamínula deve ser visualizada em aumento de 200 vezes.
Assim se observa a porcentagem de espermatozóides que apresentam movimento (SILVA et
al., 1993).
A motilidade do espermatozóide é dada em graus que correspondem a porcentagem de
espermatozóides em movimento, indicando a intensidade de deslocamento da célula no campo
do microscópio, que pode ser verificado na Tabela 1.
23
Tabela 1- Classificação do ejaculado, de acordo com a sua motilidade.
Grau Porcentagem de espermatozóides em movimento
5 100-80%
4 80-60%
3 60-40%
2 40-20%
1 20-10%
Fonte: Adaptado BERBER (2009)
Como este tipo de análise é considerado impreciso, mesmo quando executado por
técnicos experientes. Uma vez que depende, da variabilidade entre técnicos e das diferenças na
implementação de padrões para a avaliação (PERES et AL., 2008).
Para diminuir esta imprecisão, estão sendo utilizados para avaliação espermática,
sistema de avaliação computadorizada CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) sendo um
sistema automático utilizado para visualizar, digitalizar e analisar imagens sucessivas,
fornecendo informações precisas e significativas do movimento e morfologia espermática.
O sistema é adequado para quantificar um grande número de células com padrão de
motilidade heterogêneo em um curto período de tempo (TONIOLLI; ARAUJO; MATOS,
2008), fornecendo dados de concentração de espermatozóides/mL, morfologia, motilidade e
velocidade.
2.3.2.3 Turbilhonamento
O turbilhonamento é o movimento dos espermatozóides, percebido através de ondas
quando da observação de uma pequena gota de sêmen no microscópio, ou quando se observa
o ejaculado contra a luz. É semelhante ao movimento de massa, porém é observado ao
microscópio. Pega-se uma lâmina aquecida a 37oC, pinga-se uma gota do ejaculado, observa-
se em aumento de 100 vezes, então se observa a borda da gota e verifica de há
movimentação do sêmen. O movimento de onda é classificado em escala de 0 a 5 (SILVA et
al., 1993).
24
2.3.2.4 Vigor
Deve ser avaliado na mesma lâmina da motilidade. Onde se observa a propulsão e a
velocidade dos espermatozóides (Tabela 2) na lâmina. Ele deve ser observado em aumento de
200 vezes e classificado em graus de 0-5 (SILVA et al., 1993).
Tabela 2- Classificação da propulsão e velocidade dos espermatozóides.
Grau Propulsão e velocidade dos espermatozóides
0 Estático- morto
1 Moribundos- péssimos
2 Lento – ruim
3,4 e 5 Bons
Fonte: Adaptado BERBER (2009)
2.3.3 Análise das patologias espermáticas
A patologia espermática verifica alteração na cabeça, peça intermediária e cauda do
espermatozóide (Figura 10) (CHACUR et al.,2004).
Se ocorrer alteração na cabeça a técnica mais utilizada a campo é método de Willians
modificado, onde se avalia alterações da cabeça. O exame é realizado em esfregaço de sêmen
fresco corado por diferentes técnicas de coloração, conforme a disponibilidade de corante.
Essa técnica é especialmente importante na determinação de sua motilidade e na determinação
da quantidade de espermatozóides vivos e mortos no ejaculado. O corante utilizado difunde-se
na célula morta enquanto a viva permanece incolor. A lâmina é examinada sob imersão, onde
são contadas, no mínimo, 200 células (SILVA et al., 1993).
Outro tipo de corante é o Panótico Rápido, demonstrou ser eficiente para a coloração
de esfregaços de sêmen, possibilitando a identificação de alterações morfológicas nos
25
espermatozóides, sendo uma técnica rápida e prática. Nele se utiliza três tipos de corantes, e à
lâmina ficará por 10 segundos em cada tipo de corante (CHACUR et al., 2004).
Se a alteração for à peça intermediária e cauda, usa-se o método de câmara úmida,
onde irá avalia as alterações da peça intermediária e cauda. Em uma lâmina coloca-se uma
gota de sêmen em formol/salina, coloca-se lamínula e realiza a vedação com esmalte, sendo
contados 200 espermatozóides com um aumento de 1.000 a 1.250 vezes (SILVA et al., 1993)
Figura 10- Representação do espermatozóide Fonte: www.fotosearch.com.br/fotos.../esperma.html
2.4 Diluidores
Os diluidores tem como função de fornecer nutrientes às células espermáticas
(BERBER, 2009). Este devem ser isentos de toxidez para os espermatozóides, a pressão
osmótica deverá ser igual à do sêmen, apresentar pH (6,5 a 6,9) favorável à sobrevivência dos
espermatozóides, ser de baixo custo e de fácil preparo e não produzir metabólitos nocivos aos
espermatozóides (MIES FILHO, 1987).
Os diluidores devem ser preparados assepticamente e estocados por menos de uma
semana, a menos que sejam congelados (HAFEZ; HAFEZ, 2004).
26
2.4.1 Tipos de diluidores
2.4.1.1 Gema Citrato .
No preparo desse diluidor utiliza-se basicamente citrato de sódio, glicerol e gema de
ovo. A gema deve ser oriunda preferencialmente de ovos livres de patógenos específicos; no
entanto, devido ao custo e baixa disponibilidade no mercado, utilizam-se ovos de galinha
postos no dia. Para a extração da gema, os ovos devem ser lavados com água e detergente,
enxaguados com água destilada e secos com álcool 70% medidas que previnem a
contaminação bacteriana no meio diluidor (BERBER, 2009).
Para o preparo de duas frações de 500ml cada, de diluidor Gema citrato, pode-se
utilizar o protocolo abaixo:
Tabela 3- Composição do diluidor Gema Citrato.
Componente Fração A
(sem glicerol)
Fração B
(com glicerol)
% Final da mistura
Citrato de sódio 2,5% 400 ml 330 ml 73
Gema de Ovo 100 ml 100 ml 20
Glicerol _ 70 ml 7
Total 500 ml 500 ml 100%
Fonte: adaptado Berber (2009)
Nesse protocolo o glicerol só será utilizado na fração B, o que garante menor tempo de
exposição dos espermatozóides ao efeito tóxico desse crioprotetor.
A solução final do meio diluidor citrato gema apresenta pH = 6,8 a 6,9 e osmolaridade = 285 a
300 mOsm, e portanto, é isotônico e isosmol em relação ao líquido seminal (quando feita a
diluição não ocorrem mudanças físicas e químicas importantes que possam alterar bruscamente as
condições do meio que contêm os espermatozóides).
27
2.4.1.2 Meios à base de leite
Meios à base de leite são particularmente populares nos EUA devido principalmente a sua
facilidade de preparo e baixo custo. A principal desvantagem desse tipo de diluidor é a
opacificação do meio, que dificulta a observação microscópica individual dos espermatozóides os
glóbulos de gordura presente no leite deixam o meio opticamente opaco (BERBER, 2009).
Para o prepara desse diluidor deve-se utilizar leite resfriado, pasteurizado e homogeinizado,
com até 3,5% de gordura (quantidade média contida nos leites desnatados de caixinha); o leite
deve ser aquecido por 10 minutos a temperatura de 92 - 95 C (temperatura que garante
desnaturação das proteínas do leite, que podem ser nocivas aos espermatozóides) e deixado esfriar
a temperatura ambiente. A seguir, procede-se a remoção da nata sobrenadante por meio de
filtração (BERBER, 2009).
Para o preparo de meio diluidor leite, em duas frações de 500 ml cada, pode-se adotar o
seguinte protocolo:
Tabela 4- Composição do diluidor meios à base de leite.
Componente Fração A
(sem gordura)
Fração B
(com gordura)
% Final da
Mistura
Leite 500 ml 430 ml 93
Glicerol _ 70 ml 7
Total 500 ml 500 ml 100%
Fonte: adaptado BERBER (2009)
O pH (6,5 a 6,6) e a osmolaridade desse diluidor (260 a 290 mOms) encontram-se em
equilíbrio com os valores encontrados no plasma seminal (BERBER,2009).
28
2.4.1.3 TRIS – Gema de Ovo
É o meio mais utilizado comercialmente devido aos ótimos resultados obtidos quanto a
congelabilidade do sêmen e posterior motilidade ao descongelamento, frente aos outros meios
diluidores (BERBER,2009).
A solução TRIS é composta por Tris, ácido cítrico e água destilada e para o preparo desse
diluidor em duas frações, pode-se seguir o seguinte protocolo:
Tabela 5- Composição do diluidor Tris- gema de ovo.
Componente Fração A
(sem glicerol)
Fração B
(com glicerol)
% Final da Mistura
TRIS (0,2 M) 400 ml 330 ml 73
Gema de ovo 100 ml 100 ml 20
Glicerol _ 70 ml 7
Total 500 ml 500 ml 100%
Fonte: adaptado BERBER (2009)
A quantidade de gema de ovo utilizada no preparo desse diluidor pode chegar até 28% do total
da mistura, apresentando bons resultados. Além disso, o meio pode ser acrescido por frutose ou
glicose em qualquer uma das frações, garantindo um maior aporte de energia aos
espermatozóides. Assim como outros meios diluidores citados anteriormente, o TRIS gema de ovo
é isotônico e isosmol em relação ao plasma seminal (BERBER, 2009).
29
2.5 Diluição
A diluição tem por objetivo aumentar o volume do ejaculado, permitindo que um
grande número de fêmeas seja inseminado a partir de uma pequena quantidade, tornando o
processo mais lucrativo (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
Antes de se realizar a diluição deve-se observar se o ejaculado e o diluidor estão na
mesma temperatura, utiliza um banho-maria com temperatura a 37oC, onde o sêmen e o
diluidor são colocados para que alcancem a mesma temperatura (GONÇALVES;
FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
Para a determinação da taxa de diluição, é necessário que se tenham alguns dados
fundamentais, como: concentração espermática relativa, volume do ejaculado, tipo de
envasamento e concentração espermática por dose sendo normalmente 40 milhões/sptz/dose.
Onde o primeiro passo é determinar a concentração total (CT) do ejaculado, o que se faz a
partir da concentração relativa (CR), a qual deve ser multiplicada pelo volume do ejaculado
(CT= CR x volume do ejaculado). Em seguida, determina-se o número total de
espermatozóides com motilidade progressiva, a qual se obtém a partir da motilidade do sêmen
(CT x motilidade espermática/100), a partir do número de espermatozóides com motilidade
progressiva, determina-se o número de doses que se pode obter do sêmen, o que se consegue
dividindo-se a concentração total do ejaculado pelo número de espermatozóide por dose
(número de espermatozóide com motilidade progressiva / número de espermatozóide por dose.
Onde será possível ter o volume de diluidor a ser acrescentado ao ejaculado é determinado
pela multiplicação do número de doses pelo volume do envasamento, subtraído do volume do
ejaculado (nodoses x volume do envasamento) – volume do ejaculado (GONÇALVES;
FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
Após determinar o número de doses e o volume de diluidor a ser acrescentado ao
ejaculado, procede-se à diluição, que deve ser seguida de movimentação circular e lenta do
frasco contendo o sêmen para que ocorra a homogeneização adequada, evitando a formação de
bolhas de ar (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
Na criopreservação a diluição do sêmen é essencial para o sucesso da técnica, pois os
componentes dos meios diluidores fornecem condições para a sobrevivência do
30
espermatozóide, auxiliando na preservação da integridade da membrana plasmática, que pode
sofrer alterações devido a mudanças de temperatura (BUENO, 2001).
2.6 Substâncias crioprotetoras
As substâncias crioprotetoras são divididas em permeáveis ou impermeáveis de acordo
com o peso molecular e a conseqüente propriedade de atravessar ou não a membrana celular
(RODRIGUES, 1992).
Os crioprotetores permeáveis mais utilizados são o glicerol, etilenoglicol e
dimetilsulfóxido (DMSO), essenciais para minimizar ou prevenir a formação de cristais de
gelo intracelular. Os crioprotetores impermeáveis, como a sacarose, lipoproteínas da gema do
ovo e proteínas do leite, por outro lado, auxiliam na estabilização da membrana plasmática
(RODRIGUES, 1992). Os crioprotetores serão adicionados ápos ocorrer o resfriamento.
2.7 Envasamento
As palhetas precisam, antes do envase, ser identificadas manualmente utilizando
canetas com tinta que não saem na água, ao contrário das grandes centrais onde as palhetas são
identificadas por maquinário especifico (Figura 11) onde a máquina carimba as palhetas
automaticamente (BERBER, 2009).
Figura 11- Equipamento automático de identificação
de palhetas
Fonte: Arquivo pessoal (2009)
31
Após a diluição, faz-se o envasamento do sêmen, dividindo-o em doses para que sejam
armazenadas no botijão de nitrogênio líquido. O modo de envasamento do sêmen sofreu
modificações e aperfeiçoamentos. Em bovinos, no início do emprego da técnica da IA com
sêmen congelado, as doses eram congeladas na forma de pellets, moldados em pequenos
buracos feitos no bloco de gelo seco (-79oC). No entanto por questões sanitárias, dificuldades
no manuseio, no armazenamento, descongelação, entre outras, essa técnica foi substituída pelo
método de ampola de vidro, com capacidade para cerca de 1mL. Esse método, também por
apresentar dificuldades de manuseio, armazenamento e descongelação em água com gelo, foi
substituído pela palheta francesa (média) com capacidade para 0,5 mL, sem os problemas dos
métodos de envasamento anteriores. A vantagem do congelamento em palhetas é que há uma
perda menor de espermatozóides durante o processo de congelamento e descongelamento
cerca de 15 a 20%, em razão do processo de congelamento ser mais uniforme por toda a
superfície da palheta, ao passo que com a ampola a perda espermática era de cerca de 50% .
Atualmente, o melhor método de envasamento é o que utiliza a palheta francesa fina de
0,25mL, cuja perda espermática durante o processo de congelamento e descongelamento do
sêmen é de somente cerca de 10 a 15%. Além disso, a referida palheta apresenta maior
facilidade de armazenamento do que a palheta média em virtude do menor diâmetro
(GONCALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
Para envase das palhetas existem vários métodos automáticos (Figura 12) que
compreendem o envasador próprio para palheta, de origem francesa e por meio de bomba a
vácuo. Também se utiliza o método manual como mostra (Figura 13) por meio de pipetas e
seringas, envasando um palheta por vez, mais utilizado a campo, onde a quantidade de sêmen
a ser envasado é pequena (BERBER, 2009).
32
A mistura sêmen- diluidor é mantida durante várias horas antes do congelamento para
permitir que as células espermáticas se equilibrem com o diluidor (HAFEZ; HAFEZ, 2004).
Após a mistura e envasamento as palhetas serão acondicionadas dentro de uma câmara de
resfriamento regulada para 5oC (Figura 14) para que a sua temperatura baixe gradualmente,
permanecendo cerca de 3 a 4 horas (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
.
Figura 12- Equipamento automático de envase. Figura13 - envase manual do sêmen.
Fonte: Arquivo pessoal (2009) Fonte: Arquivo pessoal (2009)
2.8 Congelamento
33
Figura 14- Câmara de resfriamento do sêmen
Fonte: Arquivo pessoal (2009).
Decorrido o tempo de resfriamento, prossegue-se no processo de congelamento,
colocando-se as palhetas no vapor de nitrogênio líquido, se utiliza uma plataforma, que esta
localizada aproximadamente 4 a 5 cm do nível do nitrogênio líquido, com temperatura em
torno de -150oC. O sêmen deve ser mantido no referido vapor por 15 minutos e, depois disso,
deve ser mergulhado no nitrogênio líquido, completando o processo de congelamento
(GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
Posteriormente, o sêmen é transferido para o vapor do nitrogênio líquido à uma
temperatura aproximada de 150°C negativos por 15 minutos e logo após mergulhado em
nitrogênio líquido, onde a temperatura é de 196°C negativos, concluindo-se o processo de
congelamento (GONÇALVES; FIGUEIREDO; FREITAS, 2008).
Após o congelamento as palhetas são raqueadas, o sêmen congelado em palhetas é
acondicionado em hastes metálicas chamadas raques (capacidade de 10 palhetas por raque)
que facilitam a organização nos botijões e posterior facilidade de manejo do sêmen. Após o
raqueamento o sêmen é armazenado nos botijões de nitrogênio líquido (OHASHI, 2001).
34
3 CONCLUSÕES
Pode-se concluir de acordo com o presente estudo que:
É fundamental métodos adequados de coleta, armazenamento, congelamento do sêmen,
para obter maior índice de produtividade.
O método mais utilizado é a vagina artificial, quando comparada a eletroejaculação e
massagem dos ductos deferentes ela é superior, tanto em quantidade como qualidade,
pelo fato da vagina ser o que mais se aproxima com a monta natural.
Com a análise do sêmen podemos verificar a fertilidade do macho e compreender a
avaliação e a análise das patologias espermáticas, sendo uma das etapas mais
importantes da coleta.
A diluição permite aumentar o volume do ejaculado, permitindo assim que um maior
número de fêmeas sejam inseminadas a partir de uma pequena quantidade do
ejaculado, tornando o processo mais lucrativo e facilitado o melhoramento genético.
35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTI, K. Congelação de sêmen Bovino: Novos enfoques em meios diluentes.
(Monografia de Pós-Graduação): Botucatu, 2004.
ASBIA - ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL. Manual do
inseminador. São Paulo: Imagem Rural, 2005.
BALL, P. J. H. Reproduction in cattle. New York: Wiley-Blackwell, 2004.
BERBER, R. C. A. Coleta e processamento de sêmen bovino. 2009.
BUENO, L. G. de F. Considerações sobre o exame andrológico em touros. Espírito Santo
do Pinhal: Relatório, 1999.
BUENO, R. et al. Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães: I - efeito do meio
diluidor. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., Belo Horizonte, v. 53, n. 3, jun. 2001.
CARDOSO, J. A. et al. Evaluation Reproductiva Del Macho Bovino en Condiciones
Tropicales. Bogotá: Corpoica, 2004.
CORREA, J. R., PACE, M, M.; ZAVOS, P. M. Relationship among frozen-thawed sperm
characteristics accessed via the routine semen analysis, sperm functional tests and fertility of
bulls in an artificial insemination program. Theriogenology, v. 48, p. 721-731, 1997.
FEITOSA, F. Semiologia Veterinária a arte do diagnóstico. 7.ed. São Paulo, 2004. 412-423.
FLOWERS, W. L. Biotechnology: Artificial Insemination. In: POND, W. G.; BELL, A. W.
Encyclopedia of animal science. New York: CRC Press, 2005.
FURST, R.; CARVALHO, G.R.; FURST, M.C.O; RUAS, J.R.M; BORGES, A.M.; MAFILLI,
V., Efeito do resfriamento do sêmen eqüino sobre sua congelabilidade, Arquivo Brasileiro
de Medicina Vetetrinária e Zootecnia Vol. 57 n.5 Outubro, 2005.
HAFEZ, B. Reproduction in farm animals. New York: Wiley-Blackwell, 2000.
HAFEZ, E.S.E.; HAFEZ, B. Reprodução animal. 7.ed. São Paulo, 2004. 582 p.
HORN, M. M. et al. Qualidade do sêmen bovino congelado submetido a repetidas exposições
ao ambiente. Arch. Latinoam. Prod. Anim. v. 5, p. 353-355, 1997.
36
MARQUES FILHO, W. C. et al. Avaliação do estresse em touros Nelore (Bos tauriis indicus)
submetidos à eletroejaculação. Vet. Zootec., v.15, n.3, p. 531-541, 2008.
MARQUES FILHO, W. C. et al. Indicadores de bem-estar em touros submetidos à colheita de
sêmen por eletroejaculação. Vet. e Zootec., v.16, mar. 2009, p.52- 63.
MCGUIDO. Colheita de sêmen. Disponível em:
<http://www.mcguido.vet.br/colheita_de_semen.htm>. Acesso em: 14 nov. 2009.
MELO, C. M. Ação dos crioprotetores na biotecnologia de sêmen congelado. Unesp:
Botucatu, 2003.
MUCCIOLO. Fotos de coleta. Disponível em:
<http://www.mcguido.vet.br/colheita_de_semen.htm>. Acesso em: 14 nov. 2009.
Rev.Bras Reprod Anim, Belo Horizonte, v.32, n.4, p.225-232, out./dez.2008.
Disponível em www.cbra.org.br. Acesso em 30 nov. 2009.
RODRIGUES, J. L. Aspectos da congelação de embriões bovinos. In: REUNIÃO ANUAL
DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES, Jaboticabal.
Anais…[S.l.: s.n.], p. 55-79, 1992.
RODRÍGUEZ, F. P. C. Bases de la producción animal. Sevilla: Universidad de Sevilla,
2002.
SILVA, A. E. D. F. et al. Capacidade reprodutiva do touro de corte: funções,
anormalidades e outros fatores que a influenciam. Campo Grande: Embrapa Gado de Corte,
Documento 51, 1993.
VASCONCELLOS, P. M. B. Guia prático para o fazendeiro. São Paulo: Nobel, 1983.
YOSHIDA, M. Conservation of sperms: current status and new trends. Animal Reproduction
Science, v.60-61, p.349-355, 2000.
<http://www.beefpoint.com.br/brasil-o-maior-exportador-de-carne-do-mundo-e-a-reproducao-
animal-como-fica_noticia_43140_57_172_.aspx. Acesso em 30 nov.2009.
<http://www.cbra.org.br/pages/publicacoes/rbra/download/RB176%20Matos%20p225.pdf).
37