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CARACTERÍSTICAS Y ANÁLISIS DE
Listeria monocytogenes
6 de junio de 2019
María Jesús Zamora Escribano
Jefe de Servicio de Microbiología Alimentaria
CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIÓN
Datos Listeria monocytogenes
Mayor fuente de información Centro Europeo para la Prevención y Control de Enfermedades(ECDC)
y EFSA Datos C.O. 2073/2005.
Los casos confirmados de listeriosis aumentaron entre 2013 y 2017 en un 20%.
Número de análisis en 2017 de veinticinco EM es de 80.044 muestras en alimentos.
Los principales alimentos en los que se ha detectado L. monocytogenes son:
Pescado y productos de la pesca
Carne y productos cárnicos
Quesos blandos y semiblandos (leche cruda).
Los datos de los análisis se han obtenido en diferentes puntos: en el procesado (material crudo,
intermedio y final), en muestras ambientales y en comercio minorista.
Los datos con mayor número de no satisfactorios se encuentran en el procesado.
Limitaciones uniformidad en los criterios.
Como métodos de referencia se aplicarán los métodos analíticos y los
planes y métodos de toma de muestras que figuran en el anexo I.
Los explotadores de las empresas alimentarias podrán usar otros
procedimientos de toma de muestras y de pruebas si pueden
demostrar, a satisfacción de las autoridades competentes, que dichos
procedimientos proporcionan al menos garantías equivalentes. Dichos
procedimientos podrán incluir el uso de localizaciones de muestreo
alternativas y de análisis de tendencias.
Reglamento (UE) 2073/2005
REGLAMENTO (CE) no 2073/2005 DE LA COMISIÓN de 15 de
noviembre de 2005 relativo a los criterios microbiológicos
aplicables a los productos alimenticios. Métodos ofiiciales para
cumplir con el control oficial.
Reglamento (UE) 2073/2005
ISO 16140
1.1 al 1.3 se establecen los criterios para L. monocytogenes : Alimentos listos para el consumo (RTE)
Productos para personas que pertenecen a un grupo especial (lactantes y usos médicos especiales)
Los RTE que favorecen o no favorecen el crecimiento de Lm.
Si el fabricante demuestra
Si el fabricante NO demuestra
(1) n
=
nú
m
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ni
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n v
a
lo
r
es
e
nt
r
e m
y
M.
(2) Pa
ra lo
s pun
tos 1.1-1.25 m = M.
(3) Se utilizará la última versión de la norma. (4) En circunstancias normales, no se exige realizar pruebas regulares con respecto a este criterio para los siguientes productos
alimenticios listos para el consumo:—
los que hayan recibido tratamiento térmico u otro proceso eficaz para eliminar L. monocytogenes, cuando la recontaminación no sea posible tras este tratamiento (por ejemplo, productos tratados térmicamente en su envase final), — frutas y hortalizas frescas, enteras y no transformadas, excluidas las semillas germinadas,
— pan, galletas y productos similares, — aguas embotelladas o envasadas, bebidas refrescantes sin alcohol, cerveza, sidra, vino, bebidas espirituosas y productos
similares, — azúcar, miel y golosinas, incluidos productos de cacao y chocolate, — moluscos bivalvos vivos.
(5) Este criterio se aplica si el fabricante puede demostrar, a satisfacción de la autoridad competente, que el producto
no superará el límite de 100 ufc/g durante su vida útil. El explotador podrá fijar límites intermedios durante el
proceso que deberían ser lo suficientemente bajos para garantizar que no se supere el límite de 100 ufc/g al
final de la vida útil.
(6) Sobre una placa de Petri de 140 mm de diámetro o tres placas de Petri de 90 mm de diámetro se siembra 1 ml de inóculo.
(7) Este criterio se aplica a los productos antes de que hayan abandonado el control inmediato del explotador de la empresa alimentaria cuando este no pueda demostrar, a satisfacción de la autoridad competente, que el producto no superará el límite de 100 ufc/g durante su vida útil.
(8) Se considera automáticamente que pertenecen a esta categoría los productos con pH ≤ 4,4 o aw ≤ 0,92, productos con pH ≤ 5,0 y aw ≤ 0,94, y los productos con una vida útil inferior a 5 días. Otras categorías de productos también pueden pertenecer a esta categoría, siempre que se justifique científicamente.
20
05
R20
73
— E
S —
27
.12
.20
07
— 0
01
.00
2 —
18
Las semillas germinadas favorecen el crecimiento de Listeria monocytogenes y, por lo tanto, deben
estar sujetas al criterio de alimentos listos para el consumo que pueden favorecer el crecimiento de
Listeria monocytogenes, que no sean aquellos destinados a infantes y para propósitos médicos
especiales.
Factores que intervienen en el crecimiento microbiano
Factores intrínsecos Son todos aquellos que se refieren a las características fisico-químicas
propias de cada alimento.
1. Actividad agua aw
2. Disponibilidad de nutrientes
3. pH
4. Cantidad de oxígeno
Factores extrínsecos Son aquellos que se refieren a las condiciones físicas del ambiente en
el que se almacena o produce el alimento.
Principalmente la temperatura y la composición gaseosa.
Factores de crecimiento
ACTIVIDAD AGUA aw aw=𝑃 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑣𝑎𝑝𝑜𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜
𝑃0 𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑣𝑎𝑝𝑜𝑟 𝑑𝑒𝑙 𝑎𝑢𝑎 𝑝𝑢𝑟𝑎
Cantidad de agua disponible para el crecimiento microbiano.
Valores 0 a 1. Agua pura =1 y el alimento seco = 0
Los valores medios de aw en los que crecen las bacterias 0,90-0,97, en
cantidades bajas de agua las bacterias gram + son más resistentes.
Los alimentos con más actividad agua, más posibilidad de contaminación, menor
vida útil y peor conservación. >aw > crecimiento bacteriano
Los alimentos frescos son los que tienen mayor actividad agua, los procesos de
salado, el exceso de azúcar, la fermentación y otros procesos disminuyen la
actividad agua.
a w ≤ 0,92, productos con pH ≤ 5,0 y a w ≤ 0,94,
Factores de crecimiento
Ph medida de acidez de una alimento
Valores van del 1 hasta el 14. Los mayoría de las bacterias crecen a un pH cercano
a 7, valor neutro.
En función del pH los microorganismos se clasifican:
Acidófilos 1-5,5
Neutrófilos 5,5-8
Basófilos 8-11,5
En los alimentos con valores de pH por debajo de 4.0, no se produce
crecimiento de microorganismos patógenos o indicadores de contaminación fecal.
pH ≤ 4,4 o a w ≤ 0,92, productos con pH ≤ 5,0 y a w ≤ 0,94,
Factores de crecimiento
PRESENCIA DE OXÍGENO
Factores de crecimiento
1. Aerobios Requieren O2 para crecer (21 %)
2. Anaerobios estrictos No pueden crecer en
presencia de O2
3. Anaerobios facultativos No requieren O2 pero
crecen mejor en su presencia
4. Micraerófilos Requieren O2 pero a niveles más
bajos que los atmosféricos (1 - 15 %)
1 2 3 4
Factores de crecimiento
BACTERIAS T° mínima T° óptima T° máxima
Psicrófilas ≤0°C 10-15 °C <20°C
Mesófilas 8-20°C 20°-45°C (37) 50°C
Termófilas >45°C 45-55°C 70°C
Hipertermófilas 55°C 80-106°C
La temperatura: factor extrínseco
Factor limitante de crecimiento que se
emplea para el mantenimiento, conservación
y tratamiento
30ºC y 37ºC,
Los alimentos más frecuentemente asociados con brotes y con alto nivel de riesgo son quesos
y productos lácteos, patés y salchichas, pescados ahumados, ensaladas y en general
productos industrializados, refrigerados, listos para el consumo, sin requerimientos de
cocción o calentamiento previo. Los alimentos se pueden contaminar en cualquier eslabón
de la cadena productiva, así como también en el almacenamiento en frío.
Características Lm
Fuentes de contaminación:
Contaminación en el alimento.
Los alimentos listos para el consumo pueden ser contaminados durante el proceso por
patógenos presentes en las plantas de procesado. Es importante que se haga un muestreo
adecuado para detectar la presencia de Listeria monocytogenes, eliminarla e implementar las
acciones oportunas.
El primer paso de un análisis es el muestro, de este depende la detección del microorganismo.
La presencia de las bacterias se puede detectar de diferentes formas, aislando la bacteria por
métodos en los que se detectan la bacteria a través de los antígenos o detectando el material
genético de las bacterias.
Métodos microbiológicos
Detectan o recuentan bacterias viables
La identificación bacteriana que emplea métodos convencionales se basa en las características
fenotípicas, es decir en las características morfológicas, desarrollo, propiedades bioquímicas y
metabólicas.
Son métodos estandarizados, normalizados y armonizados.
Bajo coste, más lentos.
Métodos de detección y de recuento emplean medios de cultivo: Métodos Norma ISO: Normas
ISO 11290-1 y 11290-2 (2073/2005)
Norma ISO toma de muestras de superficies de muestreo:
Norma ISO 18593
Métodos microbiológicos convencionales
Norma ISO 18593:2018 Métodos horizontales para toma de muestras de superficies.
El objeto de la Norma es determinar la presencia o el número de microorganismos presentes en las
superficies de utensilios, superficies de trabajo y equipos y describir un método horizontal para el
muestreo en el entorno de la cadena alimentaria. (La toma de muestras en canales queda cubierta
con la Norma 17604).
Técnicas de muestreo: Placas de contacto o empleando hisopos, esponjas o trapos/toallitas.
Ofrece recomendaciones sobre las ubicaciones y las áreas a muestrear, y el momento más
adecuado.
La localización de las áreas de muestreo se deben establecer en función del riesgo, en relación con
la máxima probabilidad, que se puede obtener de un histórico o de un estudio específico.
En general se muestrean áreas que están en contacto y que no están en contacto con el alimento.
IMPORTANTE que la superficie muestreada sea representativa,
definir si se trata de una detección o de un recuento,
establecer el momento y la frecuencia.
Norma ISO 18593:2018
Norma ISO 18593:2018 Métodos horizontales para toma de muestras de superficies.
LR UE ANSES ha realizado un estudio comparando los sistemas de muestreo para los dos
sistemas:
En las áreas de procesamiento de alimentos se forman biofilms, que es una comunidad de
microorganismos fijados en un área que se mantienen adheridos a una matriz por secreción.
Hay muchos biofilms en la industria alimentaria. Es importante que se haga una limpieza y
desinfección efectiva.
Técnicas de muestreo:
Por fricción: hisopos, esponjas, gasas.
Por contacto: petrifilms, placas de contacto, láminas de contacto
Las superficies de ≤ 100 cm2 hisopos
Las superficies de > 100 cm2 gasas y esponjas.
Conclusiones preliminares:
Todas las técnicas de muestreo son efectivas.
A 20 ºC hay un mejor desarrollo de los biofilms.
En el caso de Listeria monocytogenes se deben ampliar los estudios para comprobar la
influencia del neutralizante.
Norma ISO 18593:2018
ESQUEMA DE PROCEDIMIENTO de SCREENING Toma de la muestra 25 g
Enriquecimiento 1/10 Semi-Fraser
Segundo Enriquecimiento en caldo Fraser
Aislamiento en medios sólidos selectivos
Aislamiento de las colonias típicas en medio no selectivo
Pruebas bioquímicas para confirmación
Método Norma ISO 11290-1
Pruebas bioquímicas que se emplean para confirmar e identificar la presencia de la
bacteria estudiada.
Algunas pruebas son inmediatas o requieren poco tiempo para leer su resultado como
la catalasa y la oxidasa
Otras requieren una incubación previa como la óxido-fermentación, reducción de
nitratos, rojo de metilo, Voges-Proskauer, Agar hierro de Kligler, fermentación de
azúcares, coagulasa,, hidrólisis de la gelatina, decarboxilasas, lipasa, lecitinasa,
utilización de citratos, utilización de malonato, y prueba de CAMP entre las más
frecuentes.
Existen galerías comerciales, que consisten en bacterias
de pruebas bioquímicas que ayudan a la identificación. API (bioMérieux), Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID systems y MicroID (Remel), Biochemical ID
systems (Microgen), etc.
Características de las principales bacterias
Método de
recuento
Métodos de recuento
25 ufc 2 ufc
ESQUEMA DE PROCEDIMIENTO de SCREENING Toma de la muestra
Diluciones directamente diluyente
Siembra en medio selectivo
Recuento y aislamiento en medios sólidos selectivos
Aislamiento de las colonias típicas en medio no selectivo
Pruebas bioquímicas para confirmación
Método Recuento de bacterias
Kits de comerciales y equipos automatizados
Hay en el mercado numerosos equipos que realizan de manera automática todo el
proceso. La inoculación, incubación y lectura se efectúan de modo automatizado.
También hay paneles en los que además de encontrarse los sustratos para el desarrollo
de pruebas bioquímicas, se encuentran diversos antimicrobianos a distintas
concentraciones, con lo que se realiza simultáneamente la identificación y antibiograma
del microorganismo objeto de estudio.
Existen distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La inoculación y la
lectura de estos paneles se suele hacer de forma automática, incorporándose los datos
obtenidos en un ordenador, el cual proporciona con un índice alto de fiabilidad la
identificación del microorganismo.
Estos son algunos de los sistemas en paneles comerciales más extendidos disponibles
en el mercado: MicroScan, Vitek, ATB, Pasco, Wider, Phoenix, etc.
Métodos alternativos microbiológicos
La identificación mediante métodos alternativos
en control oficial sólo operadores
Deben ser según métodos estandarizados y
validados según Norma ISO 16140.
Detectan o recuentan bacterias viables o no
Métodos de detección y de recuento.
Mayor coste, más rápidos
Métodos alternativos microbiológicos
Los métodos alternativos más empleados son los inmunológicos y los moleculares.
Los primeros se basan en la reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo
policlonal o monoclonal, produce una unión entre un anticuerpo y un mediante el
empleo de una enzima se pone de manifiesto que se ha producido la unión. De esta
manera se puede determinar si en la muestra está presente una bacteria o una toxina.
En microbiología de los alimentos, el método inmunológico más empleado para la
detección de microorganismos o sus toxinas es el ensayo ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) tipo sándwich.
En los métodos moleculares se basan en el estudio del material genético de los
microorganismos. El más empleado es la Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR.
Este método emplea unos primers o iniciadores que son específicos y una enzima
termoestable, la Taq Polimerasa., con objetivo de obtener un elevado número de copias
del fragmento de ADN seleccionado.
Métodos alternativos microbiológicos
Los métodos inmunológicos
En los últimos años, se han desarrollado sistemas que permiten realizar el ensayo
ELISA de manera automatizada, dirigidos fundamentalmente a la detección de
Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp. y toxinas
estafilocócicas (Assurance EIA y TRANSIA PLATE, Biocontrol; TECRA VIA, Biotrace
International; Salmonella UNIQUE, Tecra; Detex, Molecular, VIDAS, bioMérieux).
Otro tipo de ensayos inmunológicos rápidos y listos para usar son los basados en la
inmunodifusión en un vial de agar (1-2 Test, Biocontrol) o en la aglutinación reversa
pasiva con partículas de látex para la detección de microorganismos patógenos
(Microscreen, Microgen Bioproducts) y toxinas microbianas (RPLA kits, Oxoid)
Métodos alternativos microbiológicos
Métodos PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa
PCR CONVENCIONAL O SENCILLA
Se pueden dividir en dos grupos
PCR TIEMPO REAL
Métodos alternativos microbiológicos
PCR CONVENCIONAL
• Kits comerciales con termociclador cerrado
• Protocolos adaptados con primers y sondas
en sistema abierto
LNR PCR TIEMPO REAL
Los métodos genéticos
• Respuesta a los problemas para realizar una identificación fenotípica correcta, En
estos casos los métodos de identificación basados en la detección molecular
pueden solucionar estos problemas y utilizarse como procedimientos
complementarios o alternativos.
• En la investigación epidemiológica de brotes alimentarios es fundamental.
• Punto clave y de futuro la tipificación molecular y la secuenciación completa del
genoma.
• La técnica de PCR en tiempo real es una de las opciones más interesante en los
laboratorios de control de calidad de los alimentos Es importante para identificar
microorganismos pero también para cuantificar.
• En las actividades de vigilancia y monitorización es una herramienta de gran ayuda.
En los laboratorios de microbiología de los alimentos se emplean actualmente
numerosos métodos de PCR para amplificar el ADN, como: BAX Q7, Du Pont
Qualicon; iQCheck, Bio-Rad; TaqMan Pathogen Detection Kits, Applied Biosystems;
Roche/Biotecon Diagnostics LightCycler, Roche; Warnex, AES Chemunex
Métodos alternativos microbiología
a) Métodos cualitativos.
• Su objetivo es detectar la presencia o la ausencia de un microorganismo en
una cantidad de muestra. No se obtiene un resultado.
• Se detecta o No se detecta g/ml/esponja…..
b) Métodos cuantitativos.
• Su objetivo es obtener un número de ufc/unidades de alimento de un
microorganismo objetivo.
Métodos de recuento. Se realiza un recuento real de las unidades formadoras de
colonias, existentes en el cultivo final. Cantidad de ufc/g ó l.
