caracterizaciÓn de bacterias antagÓnicas a fusarium …

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS

ANTAGÓNICAS A Fusarium sp, ASOCIADAS

A Capsicum frutescens EN GUACARÍ Y

BOLIVAR, VALLE DEL CAUCA

MARTHA LUCIA VELASCO BELALCAZAR

Universidad Nacional de Colombia Facultad De Ciencias Agropecuarias, Departamento Ciencias Agropecuarias

Sede Palmira 2016

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS

ANTAGÓNICAS A Fusarium sp, ASOCIADAS

A Capsicum frutescens EN GUACARÍ Y

BOLIVAR, VALLE DEL CAUCA

MARTHA LUCIA VELASCO BELALCAZAR

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magíster en Ciencias Agrarias

Directores

M.Sc. CELINA TORRES GONZALES

Ph.D. EYDER DANIEL GÓMEZ LÓPEZ

Línea de Investigación:

Protección de Cultivos

Universidad Nacional De Colombia Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento Ciencias Agropecuarias

Palmira, Colombia 2016

(Dedicatoria o lema)

A mis padres por el apoyo en todo momento, desde el inicio de mis estudios de maestría

A Carlos Alberto Hernández por estar a mi lado desde el principio de este proyecto

de mi vida, por su apoyo incondicional, sus consejos y su impulso a seguir

adelante.

Agradecimientos

Primero quiero agradecer a mis padres por ayudarme hacer posible la conclusión de esta

tesis y de toda la maestría.

Gracias a la Universidad Nacional de Colombia por permitirme la oportunidad de estudiar

y ofrecerme tantos conocimientos, así como también a la plataforma HERMES por el

apoyo económico y de equipos y materiales necesarios para el desarrollo de mi tesis.

Mi gratitud especial a los profesores: Carlos Alberto Huertas Davey, Carlos Germán

Muñoz, Eyder Daniel Gómez y Marina Sánchez y Alexandra Garcia por su tiempo,

consejos y colaboración durante toda la maestría.

Agradezco a mis directores de tesis Eyder Daniel Gómez y Celina Torres por la

confianza, el apoyo y los consejos que me brindaron.

Gracias a mis compañeros del grupo de investigación Carlos Alberto Hernández, Viviana

Sánchez, Claudia Carabalí, Claudia Salazar, Andrés Felipe Vélez, Andrés Felipe Rendón,

Edwin Henao y Ángela Domínguez que me apoyaron en el desarrollo de mi tesis y me

permitieron entrar en su vida brindándome su amistad por todo este tiempo.

Agradezco a Carol Marulanda, Sandra Vivas, Ashlee Arévalo y Felipe Vergara por la

amistad surgida dentro de la Universidad.

A los grupos de investigación: Protección vegetal para el mejoramiento de la

productividad de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira y al grupo de

Biología de plantas y microorganismos de la Universidad del Valle por su apoyo con la

financiación y préstamo de equipos que fueron indispensables para el desarrollo de este

trabajo.

De igual forma, agradezco a la Doctora Paola Andrea Caro y a Mariela López del grupo

de investigación Microambiente de la Universidad Libre – Seccional Cali por su apoyo,

consejos, y momentos brindados indispensables para este trabajo.

Resumen y abstract VII

Resumen

Las bacterias tienen el potencial como controladoras de fitopatógenos ya que pueden

establecer una relación mutualista, brindando protección contra factores bióticos y

abióticos adversosa a la planta, además de proporcionar sustancias promotoras de

crecimiento vegetal o servir como control biológico de fitopatógenos, entre los que se

encuentra Fusarium spp. Este hongo patógeno, en cultivos de ají, es uno de los

principales limitantes, llegando a ocasionar pérdidas por encima del 50% o la pérdida

completa del cultivo. Por ello, y ante la necesidad de encontrar alternativas de manejo a

la marchitez vascular, ocasionada por Fusarium spp., se evaluó la capacidad antagónica

in vitro de 193 aislamientos bacterianos obtenidos del tejido foliar y de la rizosfera del

cultivo de Ají Tabasco, provenientes de los municipios de Guacarí y Bolivar Valle del

Cauca-Colombia. El estudio se realizó en el laboratorio de Microbiología ambiental,

alimentos y salud, de la Universidad Libre – Seccional Cali y laboratorio de diagnóstico

vegetal en la Universidad Nacional de Colombia sede – Palmira. Las bacterias fueron

enfrentadas a seis aislamientos patogénicos pertenecientes al género Fusarium: cinco

de ellos fueron cedidos de una colección de referencia de Universidad Nacional de

Colombia sede Palmira y uno fue aislado en una de las localidades muestreadas en la

presente investigación. Se utilizó el método de cultivo dual y se evaluó el porcentaje de

inhibición del crecimiento radial del patógeno, obteniéndose 68 aislados de las muestras

foliares y 125 de la rizosfera capaces de realizar por lo menos un antagonismo frente a

uno de los aislamientos de Fusarium evaluados. Los aislados con mayor potencial

antagónico fueron caracterizados bioquímica y molecularmente, encontrándose géneros

como Pseudomonas, Bacillus, Serratia, Achromobacter, Alcaligenes, Microbacterium,

Enterobacter, Stenotrophomonas asociadas a la rizosfera y tejido endófito foliar de la

planta de ají tabasco.

Palabras Clave: Ají, biocontrol, endófitos, PCR, rizobacterias

Resumen y abstract VIII

Abstract

The bacteria have the potential of controlling pathogens since they can establish a

mutualism relationship with it host plant, giving them protection against adverse abiotic

and biotic factors. Additionally, the bacteria can provide plant grown promoting

substances or serve as control of plant pathogens, within which is Fusarium spp. This

pathogen fungus is considered one of the most limiting in this crop. Hereby, and given the

need to find alternative management to vascular wilt caused by Fusarium spp., the

antagonistic capacity in vitro of 193 bacterial isolates obtained from tissue and

rizhosphere Tabasco Pepper, from two towns located in the Valle del Cauca-Colombia

was evaluated. El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de microbiología del medio

ambiente, la alimentación y la salud, Universidad Libre – Cali and plant diagnostic

laboratory at the National University of Colombia - Palmira. The bacteria were facing 6

pathogenic isolates belonging to the genus Fusarium: 5 of them were assigned a

reference collection of National University of Colombia at Palmira and 1 was isolated in

one of the locations sampled in the present investigation. Method dual culture was used

and the percentage of inhibition of radial growth of the pathogen was evaluated, obtaining

68 strains leaf samples and 125 strains samples rhizosphere capable of performing at

least one antagonism to one of the strains Fusarium evaluated. Of these antagonistic

strains they were chosen which showed better inhibition and was performed a

biochemical and molecular characterization, finding genus as Pseudomonas, Bacillus,

Serratia, Achromobacter, Alcaligenes, Microbacterium, Enterobacter, Stenotrophomonas

associated with the rhizosphere and endophyte leaf tissue of plant Tabasco peppers.

Keywords: Biocontrol, entophytes, PCR, pepper, rizobacterias

IX

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ VII

Lista de figuras ............................................................................................................... XI

Lista de tablas .............................................................................................................. XV

Abreviaturas .................................................................................................................... 1

Introducción .................................................................................................................... 1

Revisión de literatura ...................................................................................................... 5

1.1 Ají Tabasco Capsicum frutescens .................................................................... 5 1.1.1 Fusarium en Capsicum ......................................................................... 6 1.1.2 Género Fusarium .................................................................................. 9

1.2 Rizosfera ......................................................................................................... 9 1.2.1 Rizobacterias ...................................................................................... 12

1.3 Bacterias endófitas ........................................................................................ 13

2. Objetivos ................................................................................................................. 15

2.1 Objetivo general............................................................................................. 15 2.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 15

3. Materiales y Métodos ............................................................................................. 16

3.1 Área de estudio:............................................................................................. 16 3.2 Toma de muestras en campo ........................................................................ 16 3.3 Procesamiento de las muestras en el laboratorio: .......................................... 18

3.3.1 Suelo Rizosferico ................................................................................ 18 3.3.2 Endófitos Foliares ............................................................................... 19

3.4 Conservación de los aislamientos bacterianos .............................................. 21 3.5 Selección de aislamientos y pruebas de antagonismo ................................... 22 3.6 Tasa de crecimiento micelial .......................................................................... 26

Contenido X

3.7 Caracterización Morfológica ...........................................................................26 3.8 Caracterización Bioquímica ............................................................................27

3.8.1 Tinción de Gram ..................................................................................27 3.8.2 Perfil bioquímico ..................................................................................28 3.8.3 Medios de cultivo utilizados .................................................................34

3.9 Caracterización Molecular ..............................................................................35 3.9.1 Extracción y purificación del ADN: .......................................................36 3.9.2 Condiciones para la amplificación de la región ADNr 16s (PCR) .........37

4. Resultados y Discusión ..........................................................................................41

4.1 Antagonismos ................................................................................................41 4.1.1 Antagonismo de los aislamientos rizosfericos ......................................41 4.1.2 Antagonismo de los endófitos foliares ..................................................47

4.2 Caracterización Morfológica ...........................................................................54 4.2.1 Caracterización morfología de rizobacterias ........................................54 4.2.2 Caracterización morfológica de endófitos foliares ................................60

4.3 Caracterización Bioquímica ............................................................................63 4.3.1 Caracterización bioquímica de aislamientos rizosfericos .....................63 4.3.2 Caracterización bioquímica de aislamientos endófitos .........................65 4.3.3 Medios selectivos: ...............................................................................67

4.4 Caracterización molecular ..............................................................................72

5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................79

5.1 Conclusiones ..................................................................................................79 5.2 Recomendaciones ..........................................................................................80

Bibliografía .....................................................................................................................81

Anexos .......................................................................................................................... 103

XI

Lista de figuras

Pág.

Figura 2-1. Algunas interacciones establecidas en la rizosfera entre plantas, hongos

micorrícicos, y bacterias. .............................................................................. 11

Figura 3-1. Mapa del Valle del Cauca ............................................................................. 16

Figura 3-2. Toma de muestras de suelo rizosferico. A- Planta de ají colectada B-

Selección de la raíz; C – Empacado de muestra de suelo para llevar al

laboratorio. ................................................................................................... 17

Figura 3-3. Toma de muestras para endófitos foliares en campo. A- Selección y corte de

hojas por punto cardinal; B- Empaquetamiento y rotulado de las muestras

foliares ......................................................................................................... 17

Figura 3-4. Obtención de aislamientos rizosfericos. A- Agitación del suelo rizosferico por

24 h; B- Diluciones seriadas hasta 10-7; C- Dilución de 10-7 sembrada en

Agar Nutritivo; D- Bacterias de suelo en Agar Nutritivo; E- Aislamiento de una

de las colonias con un asa bacteriológica; F- Cultivo puro con colonias

individuales. ................................................................................................. 19

Figura 3-5. A – Lavado de las muestras foliares; B- Macerado de las hojas de ají; C –

Trasfeerencia de la solución resultante del macerado a tubos de ensayo; D –

Contenido XII

Almacenamiento del macerado foliar a tubos de ensayo; E– siembra de la

solución en Agar Nutritivo; F- Homogenización de la solución en Agar

nutritivo por medio de un asa de vidrio.......................................................... 21

Figura 3-6. Conservación de los aislamientos bacterianos. A- Selección de colonia

individual para sembrar en caldo nutritivo; B- Caldo Nutritivo con la

suspensión bacteriana después de 24 h; C- Almacenamiento del cultivo

bacteriano liquido en tubos eppendorf; D- Incubadora Shaker; E – Asilamiento

de bacteriano guardado a -20°C. .................................................................. 22

Figura 3-7. Cultivos puros de aislamientos de fusarium patogénicos – Anverso ............. 23

Figura 3-8. Colecta en campo de plantas de ají afectadas por Fusarium A- Cultivo de ají

afectado por Fusarium; B- Raíz con síntomas de marchitez por Fusarium. .. 24

Figura 3-9. A- Método de inoculación por inmersión de raíces; B- Tratamientos en

plántulas de ají .............................................................................................. 24

Figura 3-10. Caracterización morfológica de las colonias bacterianas en cultivos primarios

..................................................................................................................... 27

Figura 3-11. A- Bacterias Gram positivas; B- Bacterias Gram negativas ......................... 28

Figura 3-12. A- Tiras API 20E para Gram negativas; B- Tiras API 50CH para Gram

positivas ........................................................................................................ 29

Figura 3-13. Tiras oxidasa: Tira superior positiva y Tira inferior negativa ....................... 29

Figura 3-14. Tiras API 50CH iniciales en orden del 0 -49 ................................................ 31

Figura 3-15. Preparación de inóculo para test de tiras API 50CHB. A – Aislamiento

bacteriano puro; B- Preparación de inóculo en medio selectivo CHB. ........... 32

Figura 3-16. Inoculación del medio 50CHB en los tubos de las galerías ......................... 33

Figura 3-17. A – Pruebas negativas y positivas de las tiras API 20E; B- Pruebas

negativas y positivas de las tiras API 50CH. ................................................. 34

Figura 3-18. Agitación de la suspensión bacteriana en caldo nutritivo ............................ 36

Contenido XIII

Figura 3-19. A- Muestras de PCR en el termociclador; B- Ajuste de condiciones de

amplificación (Tabla 3-2); C- Corriendo la PCR ............................................ 39

Figura 4-1. Número de aislamientos antagónicos obtenidos de las rizosfera de Ají

tabasco (Capsicum frutescens) en cada localidad por salida. ...................... 42

Figura 4-2. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP2B1M5

frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA .............. 43



Figura 4-4. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP7G2M8




Figura 4-6. Número de aislamientos antagónicos obtenidos de tejido foliar de Ají tabasco

(Capsicum frutescens) en cada localidad por salida. .................................... 47

Figura 4-7. Comparación del número de aislamientos antagónicos de la rizosfera y tejido

foliar ............................................................................................................. 48

Figura 4-8. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido foliar

EP9G2M18 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA

..................................................................................................................... 50

Figura 4-9. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido foliar

EP8G1M10 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA

..................................................................................................................... 51

Figura 4-10. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido

foliar EP5G1M9 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio

PDA ............................................................................................................. 52

TESIS%20FINAL%201-05-16%20.doc1.doc#_Toc449906776










Contenido XIV


foliar EP3B1M4 EP1B2M4 y EP1B3M4 frente a los seis aislados patogénicos

de Fusarium en medio PDA .......................................................................... 53

Figura 4-12. Morfología de rizobacterias en Agar nutriente – Observación al

estereoscopio (5X). ....................................................................................... 57

Figura 4-13. Morfología de algunos aislamientos bacterianos en Agar nutriente – vista

macroscópica................................................................................................ 59

Figura 4-14. Aislamientos bacterianos endófitos en Agar nutriente- vista macroscópica . 61

Figura 4-15. Morfología de la colonia bacteriana de algunos aislamientos endófitos en

Agar nutriente - vista en un estereoscopio .................................................... 62

Figura 4-16. Coloración de algunos aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera

en Agar King B expuestos a luz UV- Los aislamientos con la letra E,

corresponden a las bacterias endófitas; los aislamientos con la letra R

corresponden a las bacterias rizosfericas. .................................................... 68

Figura 4-17. Aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera en Agar MacConkey –

Los aislamientos con la letra E, corresponden a las bacterias endófitas; los

aislamientos con la letra R corresponden a las bacterias rizosfericas. .......... 69


sembrados en Agar cetrimida y expuestos a luz UV - Los aislamientos con la

letra E, corresponden a las bacterias endófitas; los aislamientos con la letra R

corresponden a las bacterias rizosfericas. .................................................... 70

Figura 4-19. Visualización en gel de agarosa 1% p/b, de productos de amplificación de la

región ADN ribosomal 16S mediante el primer universal D1. ........................ 72

Figura 4-20. Árbol filogenético de las secuencias de rizobacterias y endófitas obtenidas

mediante la amplificación de la región de ADNr 16S mediante el primer

universal D1, usando el coeficiente de similitud del vecino más cercano

Neighbor joining (bootstrap de 1000 replicas). Raiz Azospirillum melinis

(NR_043483.1) ............................................................................................. 74





XV

Lista de tablas

Pág.

Tabla 2-1. Costos de producción del ají, cultivado en Colombia en el año 2013............... 2

Tabla 2-2. Exportaciones de Ají 2012 – 2014 USD $ - Volumen ....................................... 2

Tabla 2-3. Algunas especies de Fusarium registradas en ají (Capsicum). ........................ 7

Tabla 3-1. “Primers” usados en la amplificación de la región 16S .................................. 37

Tabla 3-2. Condiciones de amplificación del primer usados en este estudio . ................ 38

Tabla 4-1. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas de la rizosfera

mediante el sistema API 20E ....................................................................... 64


mediante el sistema API 50CHB .................................................................. 65

Tabla 4-3. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas endófitos

mediante el sistema API 20E ....................................................................... 66


mediante el sistema API 50CHB .................................................................. 67

Tabla 4-5. Resultados de la caracterización molecular de los aislamientos endófitos de

hojas y rizobacterias de ají tabasco .............................................................. 75

XVI

Abreviaturas

Abreviatura Término

°C Grados centígrados

2KG 2-Keto-Gluconato

5KG 5-Keto-Gluconato

A.C. Antes de Cristo

ADH Arginina deshidrolasa

ADH Arginina deshidrolasa ADO Adonitol

AMD Starch

AMY Amigdalina

AMY Amygdalina

ARA Arabinosa

ARB Arbutin

Buffer TE Solución Tris – EDTA (Ácido etilendiaminotetracético)

C. Capsicum

CEL Cellobiosa

CIT Utilización del citrato cm. Centímetros

CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio

DARA D-Arabinosa

DARL L-arabinosa

DFUC D-Fucosa

DUL Dulcitol

DXYL D-xylosa

EEUU Estados Unidos

ERY Erythol ESC Esculin

et al., Otros

f. sp Forma especial

F. Fusarium

FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura

FRU Fructosa

GAL Galactosa

GEL Gelatinasa

GEL Gelatinasa

GEN Gentiobiosa

GLU Glucosa

GLU Glucosa

GLY Glicerol GLYG Glycogen

GNT Gluconato

H2S Producción de ácido Sulfhídrico

H2S Producción de ácido sulfhídrico ha Hectáreas

IND Producción de indol INO Inositol

INO Inositol

INU Inulin

ISR Inducción de resistencia sistémica

LAC Lactosa

LARA L-arabinosa

LARL L-Arabitol

LDC Lisina descarboxilasa

LDC Lisina descarboxilasa LFUC L-Fucose

LXYL L-xylosa

LYX D-Lyxosa

m. Metros

MAL Maltosa

MAN Manitol

MDG 1-Methyl-D-Glucosida

MDM 1-Methyl-D-Mannosida

MDX ß-Methyl-D-Xyloside

MEL Melobiosa

mg/ ml Miligramos por mililitros

Min Minutos

mL Mililitros

MLZ Melezitosa

mm Milímetros

MNE Manosa

NaCl Cloruro de sodio

NAG N-Acetyl-Glucosamina

ODC Ornitina descarboxilasa ONPG Beta-galactosidasa

OX Citocromo Oxidasa

PCR Reacción de cadena de la polimerasa

PDA Agar papa dextrosa

Contenido XVIII

PGPR Plant grown Promoting rizobacteria – Bacterias promotoras de crecimiento vegetal

QS Quorum sensing

pH Grado de acidez o basicidad de una solución acuosa.

r.p.m Revoluciones por minuto

RAF Raffinosa

RHA Ramnosa

RIB Ribosa

Rizho Raíz

RSI Resistencia sistémica inducida

S.D.S. Dodecilsulfato sódico

SAC Sacarosa

SAL Salicin

SBE Sorbosa

SOR Sorbitol

Sphe Ambiente habitado por microorganismos

TAG D-Tagatosa

TDA Triptófano desaminasa TRE Trehalosa

TUR D-Turanosa

UFC Unidad formadora de colonia

URE Ureasa VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer)

XLT Xylitol

μl Microlitros

Introducción 1

Introducción

Capsicum es un género de importancia económica, que pertenece a la familia

Solanaceae. El género incluye por lo menos 32 especies nativas de América tropical

(Moscone et al., 2007), de las cuales C. annuum L., C. baccatum., C. chinense Jacq., C.

fruescens L., y C. pubescens fueron domesticados en el 6000 A.C. por los nativos

americanos (Perry et al., 2007). La superficie destinada a este cultivo en las distintas

regiones del mundo varía notablemente según el uso, tradición, consumo y destino de las

exportaciones. El continente que mayor superficie destina para su producción es Asia

(China e India son los principales productores), que ocupan más del 50 % de la superficie

mundial y el segundo es África. En Europa existe una gran producción y en América, se

destaca la producción de México con 168.632 ha cultivadas, Estados Unidos con 31.000

ha cultivadas y le siguen Argentina, Chile y Venezuela. Argentina es el principal productor

en Sudamérica, ocupando una superficie que varía año a año de 3000 a 6000 ha.

Durante el año 2012 la FAO estimó una superficie de 6700 ha cultivada en ají verdes y

2500 ha de ají para secado (FAO, 2015).

Colombia, por su parte, según la Corporación Colombiana Internacional (CCI), en datos

publicados en la revista Portafolio en el año 2007, reportó que los países a los cuales se

realizó la mayor parte de las exportaciones del ají en el año 2005 fueron Estados Unidos

con el 52% de las exportaciones, Arabia Saudita con un 46% y Canadá y Antillas

Holandesas, cada uno con el 1%. También fue reportado que en el 2006 el departamento

del Valle del Cauca registró la mayor área de la producción nacional de ají con 450

Introducción 4

hectáreas cosechadas, seguido por Sucre con 132 hectáreas y 935 toneladas, y Córdoba

con 112 hectáreas y 487 toneladas producidas. En el resto de departamentos la

producción nacional es de 803 hectáreas cosechadas y una producción de 7.735

toneladas (Portafolio, 2007). Para el año 2013, la FAO presentó algunos indicadores

económicos relacionados con la producción, rendimiento y área cultivada del ají en

Colombia (tabla 2-1).

Tabla 2-1. Producción del ají, cultivado en Colombia en el año 2013

Datos Económicos Valor

Área Cultivada 4000.00 Ha

Rendimiento 74.188.00 Hg/Ha

Producción 29.675.00 Ton

De igual modo, el Ministerios de Agricultura y Desarrollo Rural en el año 2012, reportó

que para los años 2007 y 2011 las hectáreas cosechadas en Colombia fueron 2,176 y

2,045 hectáreas respectivamente. En datos recientes, la revista acción, de la Cámara de

Comercio de Cali, proyectó datos indicadores de exportaciones de ají para Colombia y el

Valle del Cauca, indicando cifras obtenidas del DANE, donde atestigua que el

departamento en los años 2012, 2013 y 2014 con una participación que sobrepasa el

82% del valor total exportado y con el 93% del volumen de producción. Estos datos se

ilustran en la tabla 2-2.

Tabla 2-2. Exportaciones de Ají 2012 – 2014 USD $ - Volumen en toneladas

Año

Colombia

Valle del Cauca

% PART

VALOR

US$

% PART EN

VOLUMEN USD$ Volumen USD$ Volumen

2012 3.573.127 1.766.256 2.795.964 1.580.679 78,2% 89,5%

2013 5.294.055 2.627.665 4.592.759 2.493.227 86,8% 94,9%

2014 3.834.270 1.757.962 3.073.368 1,673.692 80,2% 95,2%

Total 12.701.452 6.151.883 10.462.091 5.747.598 82,4% 93,4%

Introducción 3

Muchas enfermedades causadas por hongos, bacterias y virus ocasionan diferentes

limitaciones durante los estados fenológicos del cultivo, es por esto que los agricultores

suelen presentar problemas para mantener plantas saludables y establecerlas en campo

para una buena producción.

Entre estas enfermedades limitantes para el cultivo del ají se encuentra la pudrición de

raíz y tallo causada por especies del género Fusarium, el cual es un hongo cosmopolita

que existe en muchas formas patogénicas, parasitando más de cien especies de plantas

gimnospermas y angiospermas gracias a los diversos mecanismos que tiene el hongo

para vencer las defensas de las plantas (Bosland, 1988; Prieto et al., 2010; Garcés et al.,

2011; Morales et al., 2014); se presenta principalmente como saprófito en el suelo, o

también como patógeno especializado, denominado forma especial (f. sp.), según la

planta hospedante que afecte. Es posible distinguir patotipos o razas fisiológicas de una

misma forma especial, cuando se determina la variedad de la especie vegetal que ataca

y aún en poblaciones clonales al analizar características moleculares (Garcés et al.,

2001; Álvarez, 2006).

Este hongo patógeno invade el xilema de las raíces y tallos, y produce una enfermedad

que interfiere fundamentalmente sobre el flujo ascendente del agua a través del xilema.

Es evidente que las alteraciones vasculares en los marchitamientos se deben a más de

un factor. Aun cuando el patógeno sea la única causa de la enfermedad, algunos de los

factores responsables del síndrome de ésta provienen directamente del patógeno,

mientras que otros los origina el hospedero en respuesta al patógeno (Agrios, 2005).

Dentro del manejo de los múltiples problemas que afectan la producción del cultivo de ají

causados por Fusarium, el más común es la aplicación de agroquímicos los cuales

perjudican el ecosistema y aumentan la posibilidad de generar resistencia por parte del

hongo, otros microorganismos patógenos y plagas asociadas (Prieto et al., 2010; Morales

et al., 2014). La búsqueda de microorganismos capaces de erradicarlo o manejarlo es

una alternativa favorable para el control de esta enfermedad, la cual es más amigable

con el ambiente, disminuyendo la posibilidad de desarrollar resistencia en los patógenos

y bajar los costos de producción al reducir el uso de agroquímicos.

Entre estos microorganismos con capacidad antagónica se encuentran las bacterias, las

cuales forman parte primordial de un ecosistema y de su funcionamiento óptimo, ya que

Introducción 4

son protagonistas de diversas acciones benéficas para las plantas, destacando su aporte

en la nutrición y protección vegetal (Jaizme y Rodríguez, 2008; Ferrera y Alarcón, 2001).

Existe una extensa literatura que describe el uso potencial de la asociación de bacterias

como agentes estimulantes de crecimiento y sanidad vegetal (Glick, 1995; Hallman et al.,

1997; Ryu et al., 2004; Sturz et al., 2003; Welbaum et al., 2004). Según, Bashan y

Holguin, 1998, estas bacterias realizan asociaciones con casi todas las especies

vegetales y están comúnmente presentes en el ambiente. El grupo más estudiado son

las rizobacterias, las cuales colonizan la raíz y se adhieren a la interface suelo – raíz

llamada rizosfera (Kloepper et al., 1999).

Gray y Smith en el 2005, reportaron que algunas de estas rizobacterias pueden también

encontrarse en el interior de la raíz y establecer poblaciones endófitas. Muchas de estas

son capaces de trascender la endodermis, cruzando desde la corteza de la raíz hasta el

sistema vascular, donde posteriormente prosperan como endófitas en tallo, hojas,

tubérculos y otros órganos (Compant et al., 2005). Además, el alcance de la colonización

de las bacterias endófitas a los órganos y tejidos de la planta refleja la capacidad de las

bacterias para adaptarse selectivamente a estos nichos ecológicos específicos (Nava et

al., 2012; Pérez et al., 2015)

Debido a la cantidad de propiedades positivas que aportan estos microorganismos al

suelo, a las plantas y al ambiente en general, dentro del Macroproyecto de regalías

“Desarrollo de un sistema agroindustrial, rural, competitivo a partir de cultivos promisorios

en una Bioregión del Valle del Cauca” de la Universidad del Valle y en asociación con la

Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, se realizaron 200 aislamientos de

rizobacterias y bacterias endófitas asociadas a este cultivo logrando identificar y

caracterizar aquellas que presentaban un antagonismo o control frente a Fusarium.

Revisión de literatura

1.1 Ají Tabasco Capsicum frutescens

El ají tiene una amplia diversidad de formas, tamaños y colores en los frutos. Su

pungencia es utilizada como especia y el pimiento es usado como vegetal. Después del

retorno de Cristobal Colón en 1492 y los viajes posteriores de exploración, los Capsicum

fueron repartidos alrededor del mundo gracias a su adaptación a diferentes regiones

agroclimáticas y su rápida adopción en diferentes culturas para su alimentación,

medicina, y fines ornamentales (Bosland y Votava, 2012; Hayman y Kam 2008; Qin,

2014).

Colombia tiene 1.700 hectáreas de ají sembradas en todo el territorio nacional, con una

producción de 20 mil toneladas al año, y un aumento estimado del 13% anual (Ochoa,

2014), siendo la Costa Caribe y el Valle del Cauca las regiones de mayor producción

(Rada et al., 2011).

En el país, empresas se dedican a la transformación y venta de este fruto, ya sea como

alimento, o como materia prima para la obtención de colorantes y de oleorresinas e

insecticidas biológicos debido a que constituyen una fuente importante de compuestos

como fenoles, flavonoides y antioxidante (Guerrero, 2012).

Revisión de literatura 6

Capsicum frutescens es una planta con tallo de contextura herbácea en la parte superior

y leñosa en la inferior (Cooagrofuturo, 2010; FDA, 1994). Su altura varía de 30 a 120

centímetros y posee una ramificación pseudodicotómica. Las hojas son simples,

alternas, ovaladas, de borde liso y color verde oscuro. Las flores, están localizadas en los

puntos donde se ramifica el tallo, encontrándose de 1 a 5 flores por cada ramificación.

(Muciño et al., 2009; Bonilla, 2015).

Su fruto es una baya con 2 a 4 lóculos, formando cavidades inferiores con divisiones

visibles. Es de forma elíptica y pequeño en tamaño. Al llegar a la madurez su coloración

es rojiza, aunque también se pueden encontrar anaranjadas y en estado inmaduro su

coloración es comúnmente verdosa (FDA, 1994; Bonilla, 2015). En su interior se

encuentran las semillas, de color amarillo, contextura lisa y forma reniforme. Finalmente

esta planta, posee una raíz primaria y ramificada, además de raíces secundarias que

pueden extenderse hasta 120 cm y alcanzar una profundidad aproximada de 40 cm

(FDA, 1994; Cooagrofuturo, 2010; Pino, 2015; Melgarejo et al., 2004; Bonilla, 2015).

La planta es afectada por diversos patógenos a lo largo de su ciclo fenológico

impidiendo su crecimiento y producción (Flor et al., 2007; Velásquez-Valle et al., 2007).

Entre las enfermedades que afectan el cultivo se encuentra la Antracnosis, causada por

el hongo Colletotrichum sp., Cercospora sp.,que afecta las parte foliar, Pythium sp.,

Rhizoctonia sp., Phytophthora sp., afectan el sistema radical de la planta y

Pectobacterium carotovorum produce una licuefacción en el fruto de ají (FDA , 1994;

Dagnoko et al., 2013).

1.1.1 Fusarium en Capsicum

Además de las enfermedades y patógenos antes mencionados, especies del género

Fusarium causan graves problemas fitosanitarios en el cultivo, debido a las

podredumbres y necrosamientos que ocasionan en la raíz al penetrar la planta y obstruir

los vasos del xilema, impidiendo la entrada de nutrientes y afectando su desarrollo

normal. Con este hecho, las hojas comienzan a marchitarse; el proceso puede continuar

hasta que la planta completa se marchita y finalmente muere (Summerell, et al., 2003;

Leslie y Summerell, 2006).

http://www.catalogueoflife.org/col/details/species/id/d20fb27dd067294b2ced007a47aef42a


Las especies de Fusarium causantes de marchitez, siguen un patrón similar de infección;

penetran por la raíz, colonizan el tallo de las plantas y el sistema vascular, a causa de la

producción de diversos efectores de naturaleza proteica que puede ayudar al patógeno a

suprimir las defensas de las plantas logrando su penetración (Turlier et al., 1994;

González et al., 2012). Además, producen metabolitos secundarios como las

micotoxinas, que contaminan los productos de consumo humano y animal (Moretti, 2009;

Chiotta et al., 2015).

Las pudriciones del cuello de la raíz en ají y pimentón causadas por Fusarium, son

limitantes en la producción de ají en Colombia y en varios países del mundo, dado que

pueden ocasionar pérdidas por encima del 50% o la pérdida completa del cultivo cuando

las condiciones son favorables para el desarrollo del patógeno (Singh and Singh, 2004;

Madhavi et al., 2006 Citado por: Sundaramoorthy et al., 2011; Santos, 2010; Velásquez

et al., 2004; Clavijo, 2014).

La tabla 2-3 muestra algunas de las especies de Fusarium que afectan al cultivo de

Capsicum; modificada por Clavijo, (2014):

Tabla 2-3. Algunas especies de Fusarium registradas en ají (Capsicum).

Especie Países Bibliografía

F. oxysporum f. sp.

vasinfectum

México, Suroeste de Estados

Unidos, Sur América y Europa

Oelke y Bosland, 2001;

Miller, et al., 1996, Sherfy

Mac Nab, 1986

F. oxysporum f. sp.

capsici Bl. y Riv Estados Unidos, México

Rivelli, 1989 Citado por:


Velásquez, 2001

F. oxysporumf. sp.

radicis-lycopersici México

Apocada et al., 2004

F. oxysporum Israel, Pakistán, México, Provincia

de Almería (España)


Miller, et al., 1996; Mushtaq y

Hashmi, 1997; Vásquez et

al., 2009; Pérez et. al., 2014


Tabla 2-3: (Continuación)

Especie Países Bibliografía

F. solani

Israel, Canadá, Pakistán, Italia,

México, EEUU, Nigeria, Taiwán

Provincia de China.


Miller, et al., 1996; Yang et

al.,; 2009; Mushtaq y

Hashmi, 1997; Tosi et al.,

2000; Rivera, 2009; Santos,

2010; Agarwal et al., 2007

F. equiseti Corda Israel Oelke y Bosland, 2001;

Miller, et al., 1996

F. semitectum Berk Israel Oelke y Bosland, 2001;


F. javanicum Koord Israel Oelke y Bosland, 2001;


F. culmorum (W. G.

Smith) Israel



F. avenaceum (Fr)

Sacc Israel



F. moniliforme

(Sheldon) Snyd Israel, Pakistán



Fusarium lactis Bélgica y Alberta, (Canadá) Yang et al.,; 2009; Mushtaq y

Hashmi, 1997

Fusarium

subglutinans Canadá

Utkhede y Mathur, 2003

Fusarium

anthophilum

Pakistán Mushtaq y Hashmi, 1997

F. proliferatum Pakistán Mushtaq y Hashmi, 1997

F. lateritium México Vásquez et al., 2004;

Vásquez et al., 2009

F. concentricum China Wang et. al., 2013


1.1.2 Género Fusarium

El género Fusarium pertenece al reino Fungi, phyllum Ascomycota, clase

Sordariomycetes, orden Hypocreales y familia Nectriaceae. Se estima que a este género

pertenecen 178 especies (Leslie y Summerell 2006; Moretti, 2009; Lombard et al., 2015;

Roskov et al., 2016). Se conocen los teleomorfos ó formas perfectas de algunas especies

de Fusarium, las cuales se incluyen en los géneros Giberella, Nectria, Albonectria,

Haematonectria (Gams y Nirenberg, 1989; Leslie y Summerell 2006).

En cuanto a su morfología, las macroconidias son un carácter importante en la

identificación de especies de este género y en muchos casos la morfología de esta

conidio es suficiente para identificar una especie (Leslie y Summerell, 2006).

Adicionalmente puede producir otras estructuras como esporodoquios, meso y

microconidios, fialides, clamidosporas, entre otros (Gams y Nirenberg, 1989; Suarez,

2001; Leslie y Summerell 2006).

Las colonias de las distintas especies de Fusarium son de crecimiento moderado o

rápido, tienen diversos colores como blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado, purpura,

celeste, verde aceituna o pardo (Samson et al., 2004). Algunas especies presentan

zonas concéntricas de distinta morfología macroscópica debido a la secuencia luz -

obscuridad (Carrillo, 2003; Samson et al., 2004; Leslie y Summerell 2006).

Debido a su gran variabilidad genética y su amplia distribución, el manejo de las especies

del género Fusarium resulta difícil. Por ello se ha empleado inductores de resistencia,

productos de origen botánico y microorganismos como bacterias, para hallar estrategias

de manejo que contribuyan al control de este hongo patógeno (Rodríguez y Montilla,

2001; El- Khallal, 2007).

1.2 Rizosfera

La rizosfera es un entorno de suelo afectado por las raíces que posee una gran actividad

física, química y, biológica, pues representa una interface de comunicación entre las

plantas, el suelo y microorganismos (Sánchez de Praguer et al., 2007). En esta

comunicación llevada a cabo por la raíz y su entorno y viceversa, la planta traslada entre

el 30 y 60% del carbono neto proveniente de la fotosíntesis y lo libera a través de las


rizodeposiciones (Read et al., 1999; Crews, et al., 2003; Marschner, 1995; citado por

Sánchez de Praguer et al., 2007 y Paz et al., 2006).

Algunas rizodeposiciones originadas en la rizosfera, son los exudados radicales, los

cuales se caracterizan por ser diversos y propios de células vivas. Estos tienen como

función la movilización directa e indirecta de nutrientes, así como también la matriz de

protección y lubricación, que facilita la colonización de las raíces en el suelo. De igual

forma, modifican la estructura y actividad biológica del suelo y algunos de ellos

constituyen la base de fitohormonas, vitaminas y factores de crecimiento (Curl y

Truelove, 1986; Marschner, 1995; Oliveros et al., 2009).

Otras rizodeposiciones involucran, lisados, secreciones, mucílagos, mucígel, compuestos

gaseosos y nutrientes minerales (Marschner et al., 1995; González et al., 1991; Rovira et

al., 1961). Los lisados, se caracterizan por ser el resultado de la autolisis y degradación

de células epidérmicas y corticales, además de la acción de metabolitos microbianos que

actúan como fuente de materiales orgánicos para las poblaciones microbianas

(Marschner et al., 1995; Sánchez de Praguer, 2006; Paz et al., 2006).

Las secreciones, son compuestos de alto peso molecular que atraviesan las membranas

celulares. Una de estas secreciones son las enzimas, que catalizan la degradación de los

materiales orgánicos e inorgánicos presentes naturalmente en el suelo rizosferico

(Marschner et al., 1995; Sánchez de Praguer et al., 2007).

Los mucilagos y el mucígel, son materiales orgánicos y gelatinosos que protegen y

lubrican la zona de crecimiento radical. También intervienen en la disponibilidad y

absorción de minerales, así como la formación de agregados en el suelo (Siqueira y

Franco, 1988; Sánchez de Praguer, 2006; Sánchez de Praguer et al., 2007; Oliveros et

al., 2009).

Por otro parte, los compuestos gaseosos son compuestos volátiles que pueden afectar

positiva o negativamente la actividad microbiana en la zona rizosferica y más allá de ella

(Curl y Truelove, 1986; Siqueira y Franco, 1988; Marschner, 1995; Cardoso y Freitas,

1992 y Sanchez de Praguer et al., 2007). Del mismos modo, los nutrientes minerales

como el fósforo, nitrógeno, potasio, etc, juegan un papel importante en el desarrollo de la

planta pues contribuyen a la nutrición mineral de la misma (Oliveros et al., 2009; Sánchez

de Praguer et al., 2007; Sánchez de Praguer, 2006; Paz et al., 2006).


Aunque la rizosfera no es una zona uniforme, es posible diferenciar en ella algunas

regiones como el rizoplano y la endorrizosfera. Su delimitación se encuentra en un

alcance de 1-5 mm de espesor (Wild, 1992; Sánchez de Praguer et al., 2007). (Figura 2-

1).

Fuentes: Tomado de Bonfante y Anca, 2009.

Figura 2-1. Algunas interacciones establecidas en la rizosfera entre plantas, hongos

micorrícicos, y bacterias.

Los microorganismos que se establecen en cada una de estas regiones, se han

especializado en estos hábitats a través de procesos coevolutivos y varían dependiendo

de las especies de plantas, edad, condiciones sanitarias y ambientales. (Foster, Rovira y

Cock, 1983; siqueira y Franco, 1988; Cardoso y Freitas, 1992; Wild, 1992; Sánchez de P,

2007). Existen tres tipos de organismos que habitan la endorizosfera: 1. Los que

establecen simbiosis con la planta hospedera; 2. Los que hacen daño al hospedero

parasitando tejido vegetal y 3. Los que viven en el tejido muerto de la raíz (Foster, Rovira

y Cock, 1983; Sánchez de P et al., 2007).


Algunos de los organismos que establecen simbiosis con la planta hospedera y son

habitantes de la endorizosfera, interactúan con el hospedero y mientras usan las fuentes

de energía de la raíz, proveen beneficios a la planta, estableciendo complementos en los

ciclos nutricionales (Sánchez de P et al., 2007), entre los que se destacan las bacterias.

1.2.1 Rizobacterias

Las bacterias que colonizan las raíces se les conoce como “rizobacterias” (Schroth y

Hancook 1982; Hilie and Saunders, 2008) y pueden ejercer diferentes tipos de efectos en

las plantas hospedantes. Uno de ellos, es el benéfico, relacionado con la promoción del

crecimiento de la planta y/o como agentes de control biológico (Kloepper y Schroth 1981;

Hilie and Saunders, 2008). Estas bacterias también conocidas como bacterias

promotoras de crecimiento vegetal o PGPR (Plant grown Promoting rizobacteria),

contribuyen a la protección de la planta contra patógenos radicales y foliares, además

promueven el crecimiento mediante dos tipos de mecanismos: indirectos y directos, o en

combinación (Kloepper et al., 1993; Glick, 1995; Shah, 2009).

Los mecanismos indirectos se caracterizan porque las PGPR ocasionan la disminución o

eliminación de microorganismos fitopatógenos (hongos, bacterias y nematodos, entre

otros), ya sea a través de la producción de sustancias antimicrobianas, sideróforos,

enzimas líticas, o la combinación de éstas. De igual manera, pueden actuar compitiendo

por nutrimentos o espacio en el nicho ecológico, así como por estimulación de las

defensas naturales de la planta mediante mecanismos conocidos como resistencia

sistémica inducida (RSI). Esta última induce la resistencia de tejidos sistémicos al ataque

por fitopatógenos mediante la emisión de compuestos orgánicos volátiles, ácido

jasmónico, ácido salicílico y etileno que participan en la protección de las plantas

(Kloepper et al., 1993; Glick, 1995; Shah, 2009).

Los mecanismos directos incrementan la disponibilidad de nutrimentos en la rizosfera al

influir en el metabolismo de las plantas y mejorar su nutrición. Estos mecanismos son:

fijación de nitrógeno; síntesis de fitohormonas (auxinas, giberelinas, citocininas),

vitaminas y enzimas; solubilización de fósforo inorgánico y mineralización de fosfato

orgánico; oxidación de sulfuros; incremento en la permeabilidad de la raíz; producción de

nitritos; acumulación de nitratos; y reducción de la toxicidad por metales pesados (Glick


1995; Amorin y Melo 2002; Dobbelaere et al., 2003; Hernández et ál. 2004, Khalid et ál.,

2004; Kloepper et ál. 2004, Podile y Kishore 2006, Reyes et ál., 2008, Bhattacharyya y

Jha 2012, Singh y Singh 2013; Esquivel et al., 2013; Ramírez et al., 2015).

Otros mecanismos bacterianos que contribuyen al biocontrol son la interferencia de

señales de quorum sensing (QS), la inhibición en la formación de biopelículas y

producción de toxinas por el patógeno (Howell y Stipanovic 1980; Shanahan et al., 1992;

Podile y Kishore 2006; Kim et al., 2009; Ko et al., 2009; Kaymak 2011; Bhattacharyya

y Jha 2012; Singh y Singh 2013; Ramírez et al., 2015).

Por último, la selección de rizobacterias como potenciales agentes de control biológico

constituye un campo de investigación y desarrollo en expansión (Yadegari et al., 2010)

debido a sus perspectivas de aplicación en agroecosistemas sustentables con un gran

potencial en la agricultura moderna.

1.3 Bacterias endófitas

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal pueden penetrar al interior de las raíces

y establecerse como poblaciones endófitas. Muchas de ellas tienen la capacidad de

trascender las barreras de la endodermis, atravesar la corteza de la raíz hasta el sistema

vascular y, como consecuencia, vivir como endófitos en tallos, hojas, tubérculos y otros

órganos sin causar perjuicio a la planta (Reinhold-Hurek y Hurek, 1998; Kloepper et al.,

1999; Mazzanti y Gutiérrez, 2003; Pérez et al., 2013). Las rutas de acceso son las

raíces, estomas o alguna herida en la planta, ya que pueden vivir en el sistema vascular

y espacios intra o intercelulares (Zinniel et al., 2002).

La población total de endófitos puede variar debido a factores como la edad de la planta,

condiciones ambientales y el tipo de tejido (Zinniel et al., 2002; Elbeltagy et al., 2001). Se

ha considerado que las bacterias endófitas podrían tener algunas ventajas competitivas

sobre las rizosféricas, ya que la disponibilidad de nutrientes es mayor en el interior de las

plantas y el número de microorganismos endófitos es menor que el de los rizosféricos

(James, 1995). Además, las bacterias endófitas se encuentran mejor protegidas que las


rizosféricas de las condiciones adversas que se presentan en el medio ambiente (Rives

et al., 2007).

Las primeras evidencias de asociación entre microorganismos endófitos y plantas, se

originaron de observaciones en tejidos y hojas fosilizadas, lo que soporta la inferencia de

que la asociación planta- endófito pudo haber ocurrido junto con la aparición de las

primeras plantas en la tierra (Strobel, 2003). Como resultado de esa larga asociación es

posible que algunos de estos microorganismos endófitos hayan adquirido un sistema

genético para transferir información desde la planta hospedera a ellos, o viceversa. Este

posiblemente sería un mecanismo rápido y seguro de adaptación a diferentes ambientes

y a la planta hospedera (Germaine, et al., 2004; Tsavkelova et al., 2007).

Las bacterias endófitas juegan un papel importante en las actividades fisiológicas de los

hospedantes, e influyen en el mejoramiento al estrés abiótico y resistencia a

enfermedades, insectos y nemátodos (Carroll, 1988; Hallmann y Sikora, 1996; Azevedo

et al., 2000; Sturz y Nowak, 2000; Pérez et al., 2013). Estas producen metabolitos

secundarios de gran importancia (Li et al., 2000; Strobel, 2002; Pérez et al., 2013) y sería

una fuente de nuevos fármacos y programas de gestión contra enfermedades de las

plantas (Murray et al., 1992; Azevedo et al., 2000; Berg et al., 2004).

En la última década un interés creciente ha sido dirigido hacia los microorganismos

endófitos, los cuales al estar menos afectados por el estrés ambiental y más aclimatados

con su hospedero (Sturz y Nowak, 2000; Peña y Reyes, 2007) podrían representar una

mayor ventaja ecológica. Sin embargo, la presencia de bacterias endófitas y su papel

dependen probablemente del cultivar y de su coevolución con la especie microbiana

(Yanni et al., 2001; Peña y Reyes, 2007).

Se considera que muchas comunidades bacterianas endófitas, son el producto de un

proceso de colonización iniciado en la zona de la raíz (Welbaum et al., 2005), sin

embargo pueden provenir de otras fuentes como, la filosfera o la espermosfera (Hallman

et al., 1997). A pesar de sus diferentes nichos ecológicos, las rizobacterias de vida libre

y bacterias endófitas utilizan algunos mecanismos similares para promover el crecimiento

de plantas y controlar los patógenos (Bloemberg et al., 2001, Ryu et al., 2004)

2. Objetivos

2.1 Objetivo general

Caracterizar morfológica, bioquímica y molecularmente bacterias PGPR aisladas de

ají tabasco (Capsicum frutescens) con antagonismo a Fusarium spp.

2.2 Objetivos específicos

1. Determinar el efecto inhibitorio y/o controlador de las bacterias aisladas de la

rizosfera y tejido foliar frente Fusarium spp.

2. Identificar morfológica, bioquímica y molecularmente las bacterias con potencial

antagónico asociadas al cultivo de Ají tabasco en dos localidades del Valle del

Cauca.

Materiales y Métodos 16

3. Materiales y Métodos

3.1 Área de estudio:

Esta investigación Se realizó en los Municipios de Guacarí y Bolívar, Valle del Cauca

Fuente: http://www.tulua.gov.co/mapas.shtml?apc=m1m1--&x=1481902

Figura 3-1. Mapa del Valle del Cauca

3.2 Toma de muestras en campo

Se realizó un muestreo totalmente aleatorio y se colectaron 15 plantas por cada

localidad, tomando submuestras de suelo rizosferico de las planta de ají (Figura 3-2).

Municipio de Bolívar valle 4°25’00.47’’N- 76°08’54.53’’O T°: 28°C 939 m.s.n.m

Municipio de Guacarí Corregimiento de Guacas. 5 Lotes de 0.75 hectáreas T°: 28°C 3°45’21,68’’N – 76°11’57,72’’O 971 m.s.n.m

http://www.tulua.gov.co/mapas.shtml?apc=m1m1--&x=1481902


Posteriormente se guardaron en bolsas plásticas, se rotularon y llevaron al laboratorio de

Diagnostico Vegetal en la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira.

A B C

Figura 3-2. Toma de muestras de suelo rizosferico. A- Planta de ají colectada B-

Selección de la raíz; C – Empacado de muestra de suelo para llevar al laboratorio.

Paralelo al muestreo de suelo rizsosferico, se realizó el muestreo de follaje para verificar

presencia de endófitos mediante el protocolo de Morales y Rodríguez 2006. Se tomaron

tres hojas sanas por cada punto cardinal de la planta (3 órganos/punto cardinal/planta)

(Figura 3-3). Estos muestreos fueron realizados en el tercer y octavo mes del cultivo para

cada localidad. Al finalizar la toma de muestras foliares se depositaron en bolsas de

papel debidamente rotuladas y se llevaron al laboratorio de Microbiología ambiental,

alimentos y salud, de la Universidad Libre – Seccional Cali.

Figura 3-3. Toma de muestras para endófitos foliares en campo. A- Selección y corte de

hojas por punto cardinal; B- Empaque y rotulado de las muestras foliares


3.3 Procesamiento de las muestras en el laboratorio:

3.3.1 Suelo Rizosferico

El procesamiento del suelo se llevó a cabo en el laboratorio de diagnóstico vegetal de la

Universidad de Nacional de Colombia, sede Palmira, donde se depositaron 100 gr de

suelo en un erlenmeyer con 200 ml de agua destilada estéril y se agitó durante 24 horas

(Figura 3-4a). Una vez homogenizada la muestra, se extrajo 1 ml de la solución madre y

se realizó una dilución seriada de 10-1 hasta 10-7, luego se tomó 40 μL de la dilución 10-7

y se sembraron en medio agar nutritivo por triplicado. Posteriormente las cajas fueron

incubadas a 28°C durante 24 – 48 horas (Figura 3-4b). Cuando aparecieron las primeras

colonias bacterianas, se realizaron las descripciones morfológicas y se transfirieron a

otras cajas Petri con medio de agar nutritivo para llevarlas a cultivo puro y en colonias

aisladas (Figura 3-4c). Cada aislamiento bacteriano, fue debidamente rotulado de

acuerdo con el siguiente código: R (Rizosfera); P (Planta); B1 (Bolívar primer muestreo),

B2 (Bolívar segundo muestreo) o G1 (Guacarí primer muestreo), G2 (Guacarí segundo

muestreo) y M (Número de bacterias en la caja).

Ejemplo:

RP2B2M4; Aislamiento proveniente de la rizosfera de la segunda planta muestreada,

perteneciente a la localidad de Bolívar realizada en la segunda salida y la bacteria

número cuatro de la caja.


AB

C D

E F

Figura 3-4. Obtención de aislamientos rizosfericos. A- Agitación del suelo rizosferico por

24 h; B- Diluciones seriadas hasta 10-7; C- Dilución de 10-7 sembrada en Agar Nutritivo;

D- Bacterias de suelo en Agar Nutritivo; E- Aislamiento de una de las colonias con un asa

bacteriológica; F- Cultivo puro con colonias individuales.

3.3.2 Endófitos Foliares

El procesamiento de muestras foliares se llevó a cabo en el laboratorio de Microbiología

ambiental, alimentos y salud, de la Universidad Libre – Seccional Cali y en el Laboratorio

de investigaciones microbiológicas de la Universidad del Valle, y siguiendo el protocolo

propuesto por Pérez et al., (2010) con algunas modificaciones: se seleccionaron seis

hojas de cada planta de ají, las cuales fueron lavadas con hipoclorito de sodio al 0,1% 1

min, alcohol al 70% 1 min y agua destilada estéril (Figura 3-5a). En seguida de este


proceso, las muestras foliares fueron maceradas con ayuda de un mortero creando una

suspensión madre donde se tomó 1 ml y se llevó a un tubo de ensayo con 9 ml de agua

destilada estéril (Figura 3-5b). Posteriormente, esta solución se llevó al vórtex hasta

homogenizarla, de esta última se tomaron 100 μL y se vertieron a una caja Petri con agar

nutritivo. Esta solución fue extendida en todo el medio con un asa de vidrio estéril y

finalmente llevada a la incubadora a 28°C. Pasados 24 – 48 horas, las colonias de las

diferentes bacterias presentes fueron aisladas y transferidas a otra caja petri con agar

nutriente, para la obtención de cultivos puros que permitiesen la toma de datos y su

conservación.

Cada aislamiento bacteriano, fue debidamente rotulado de acuerdo al siguiente código: E

(Endófito foliar); P (Planta); B1 (Bolívar primer muestreo), B2 (Bolívar segundo muestreo)

o G1 (Guacarí primer muestreo), G2 (Guacarí segundo muestreo) y M (Número de

bacterias en la caja).

Ejemplo:

EP4B1M9; Aislamiento proveniente de la rizosfera de la cuarta planta muestreada,

perteneciente a la localidad de Bolívar realizada en la primera salida y la bacteria número

nueve de la caja.


A B C

D E F

Figura 3-5. A – Lavado de las muestras foliares; B- Macerado de las hojas de ají; C –

Trasfererencia de la solución resultante del macerado a tubos de ensayo; D –

Almacenamiento del macerado foliar a tubos de ensayo; E– siembra de la solución en

Agar Nutritivo; F- Homogenización de la solución en Agar nutritivo por medio de un asa

de vidrio

3.4 Conservación de los aislamientos bacterianos

Se siguió el protocolo de Morales et al., 2010 sobre el método de conservación a -20 °C.

Para este procedimiento se utilizó caldo nutritivo preparado de acuerdo con las

instrucciones de la casa comercial. Se sirvieron 5 ml de este medio en crioviales y se

esterilizaron en autoclave. Una vez estéril el medio, se inocularon los microorganismos

para su crecimiento. Se ubicaron en una incubadora shaker a 28 °C entre 18 – 24 horas y

se observó su crecimiento. Posteriormente se realizó la siembra de estos crecimientos

para garantizar el mismo inóculo. Una vez confirmada la pureza, se tomaron 800 μL de

la suspensión bacteriana en el caldo nutritivo y se pasaron a tubos ependorff

adicionándole 200 μL de glicerol al 30% (Figura 3-6).


A B C

D E

Figura 3-6. Conservación de los aislamientos bacterianos. A- Selección de colonia

individual para sembrar en caldo nutritivo; B- Caldo Nutritivo con la suspensión

bacteriana después de 24 h; C- Almacenamiento del cultivo bacteriano liquido en tubos

eppendorf; D- Incubadora Shaker; E – Asilamiento de bacteriano guardado a -20°C.

3.5 Selección de aislamientos y pruebas de antagonismo

Para observar el potencial antagónico in vitro de las bacterias, se utilizaron aislamientos

patogénicos pertenecientes al género Fusarium (Figura 3-7). 5 de ellos (F70, F58, F54,

F52, F09), fueron cedidos de una colección de referencia de la Universidad Nacional de

Colombia sede Palmira (obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y 1 (FB) fue aislado de

plantas de ají tabasco en el municipio de Bolívar Valle del Cauca (Figura 3-8). Debido a

que los cinco aislamientos cedidos se encontraban en latencia e inactivos, se decidió

realizar pruebas de patogenicidad para corroborar su patogenicidad y evaluar el hongo

aislado del municipio de Bolívar.


Figura 3-7. Cultivos puros de aislamientos de Fusarium patogénicos – Anverso


A

B C

B

Figura 3-8. Colecta en campo de plantas de ají afectadas por Fusarium A- Cultivo de ají

afectado por Fusarium; B- Raíz con síntomas de marchitez por Fusarium.

Las pruebas de patogenicidad se realizaron siguiendo el método de inoculación por

inmersión de raíces (figura 3-9a), y aplicación del inóculo a una concentración de 106

esporas/ml siguiendo el protocolo utilizado por Clavijo, 2014. Se inocularon un total de 15

plantas por tratamiento, es decir, por cada aislamiento de Fusarium y el control (figura 3-

9b).

Figura 3-9. A- Método de inoculación por inmersión de raíces; B- Tratamientos en

plántulas de ají

Para realizar las pruebas antagónicas, se utilizó el método de cultivo dual, que consistió

en un enfrentamiento equitativo de las bacterias y los patógenos en cajas Petri. El

patógeno fue sembrado en el centro de la caja junto con un aislamiento bacteriano a una


distancia de 3 cm respecto al Fusarium. Los ensayos se sembraron por triplicado en PDA

a 28°C, y al mismo tiempo se realizó un control del crecimiento del aislamiento del

patógeno utilizado Acosta et al., 2007.

El porcentaje de inhibición del crecimiento del patógeno se calculó empleando la fórmula

de Acosta et al., 2007.

% inhibición= ((R1-R2) / R1)* 100

Donde R2 representó el crecimiento del hongo en presencia de bacterias y R1 el

crecimiento del control.

El comportamiento de inhibición mostrado por los diferentes aislamientos se agrupó de la

siguiente manera (Benítez et al., 2007):

Negativo: ausencia de zona de inhibición o un porcentaje menor de 10% y

crecimiento normal del patógeno, de forma similar al control.

Baja: ausencia de zona de inhibición o con un porcentaje entre 10–39% y con

disminución en el crecimiento del patógeno.

Media: ausencia de zona de inhibición o un porcentaje entre 40–69% y con

disminución en el crecimiento del patógeno.

Positivo: presencia de zona de inhibición definida o en un porcentaje entre 70–

100%.

Las bacterias con mayor potencial antagónico frente a los aislamientos fúngicos

evaluados fueron caracterizadas para su identificación respectiva.


3.6 Tasa de crecimiento micelial

La tasa de crecimiento micelial se midió en centímetros por día, se determinó teniendo en

cuenta el radio de crecimiento de la colonia fúngica calculando su magnitud mediante la

expresión sugerida por Mead, 1993: T.C= (Cf -Ci)/ (Tf-Ti).

Dónde:

Cf: es el crecimiento final expresado en cm.

Ci: es el crecimiento inicial (día uno) expresado en cm.

Tf: es el tiempo final

Ti: es el tiempo inicial

3.7 Caracterización Morfológica

Para la caracterización morfológica se siguió el protocolo de Stanchi et al., 2007

observando al microscopio y al estéreoscopio las variables físicas de las bacterias.

Forma, tamaño, borde, elevación, color y pared celular con tinciones de gram. La

descripción se realizó para los aislamientos que produjeron antagonismo y sobre las

colonias formadas (agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y observable

macroscópicamente), de forma aislada, tomando de ejemplo la siguiente información

(Figura 3-10).


Tomado de: Stanchi et al., 2007

Figura 3-10. Caracterización morfológica de las colonias bacterianas aisladas.

3.8 Caracterización Bioquímica

3.8.1 Tinción de Gram

Las tinciones de Gram se realizaron con colonias de aislamientos bacterianos puros de

24 horas. Una vez se tuvieron las colonias aisladas, se tomó una pequeña masa del

microorganismo y se realizó un frotis en un portaobjeto. Se le aplicaron los colorantes

para tinción y visualización de las células, las cuales fueron observadas al máximo

objetivo para una buena visualización de colores y formas (Figura 3-11).


Figura 3-11. A- Bacterias Gram positivas; B- Bacterias Gram negativas

3.8.2 Perfil bioquímico

Una vez establecido el tipo de pared celular de las bacterias por la tinción de Gram, se

realizó el perfil bioquímico. Se utilizó un sistema rápido de identificación con Tiras API

20E y 50CH (Índice Analítico de Perfil) en las bacterias Gram positivas y Gram negativas

ya establecidas (Figura 3-12).


Figura 3-12. A- Tiras API 20E para Gram negativas; B- Tiras API 50CH para Gram positivas

Test de Oxidasa:

Se realizó a las 24 horas de siembra de las colonias bacterianas. Se tomó la tirilla estéril

y con un isopo de madera estéril se trasfirió una UFC (Unidad formadora de colonia)

bacteriana pura; se observó por aproximadamente tres minutos y en ese tiempo el área

de inoculación se debía tornar azul oscuro a púrpura, lo que significaba que los

resultados fueran positivos. De lo contrario, si no dio cambio en estos tres minutos, la

prueba era negativa (Figura 3-13).

.

Figura 3-13. Tiras oxidasa: Tira superior positiva y Tira inferior negativa


Gram Negativas

Para las bacterias Gram negativas se emplearon las Tiras API 20E las cuales permiten la

identificación y caracterización de Enterobacterias. Estas tiras contienen 21 tubos o

pocillos con reactivos, los cuales incluyen el sustrato (Figura 3-13a). Para obtener el perfil

bioquímico se siguieron las instrucciones del fabricante que se describen a continuación:

Preparación de la Galería:

1. Se repartieron aproximadamente 5 ml de agua destilada en los alveolos donde

fueron ubicadas las tiras, para crear una atmosfera húmeda.

2. Se marcó debidamente la galería en la lengüeta lateral de la cámara.

Preparación del Inóculo:

1. Se utilizó solución salina (NaCl) 0.85% como medio de suspensión para la

bacteria a identificar. Para esto, se tomaron tres colonias puras e individuales

sobre medio agar y preferiblemente de cultivos jóvenes (18-24 horas). Se

mezclaron hasta homogenizar y obtener una suspensión bacteriológica similar al

estándar de turbidez de MacFarland N° 5, el cual es utilizado para saber el

número de bacterias por mililitro, o UFC según una escala que va de 0.5 a 10.

2. Con ayuda de una pipeta, se introdujo la suspensión bacteriana en los tubos de la

galería evitando la formación de burbujas en el fondo. Para las pruebas CIT, VP Y

GEL se llenó el tubo y la cúpula, y para las otras pruebas se llenaron únicamente

los tubos.

3. Para las pruebas ADH, LDC, ODC, H2S, URE se creó una atmosfera de

anaerobiosis llenando la cúpula con parafina.

4. Finalmente se selló y se incubó a 36°C durante 24 horas.

Gram Positivas

Para las bacterias Gram positivas se utilizaron las Tiras API 50CH y se siguieron las

instrucciones del fabricante que se describen a continuación:


Preparación de las galerías

1. Se preparó una cámara de incubación y se rotuló debidamente en la lengüeta

lateral de la cámara.

2. Se repartieron 10 ml de agua destilada en los alveolos del fondo donde iban las

tiras, para crear una atmosfera húmeda.

3. Se sacaron cada una de las filas de su embalaje y se separaron siguiendo el

orden, de 0-9, 10 – 19, 20 – 29, 30 – 39 y 40 – 49 (Figura 3-14).

Figura 3-14. Tiras API 50CH iniciales en orden del 0 -49

Preparación del inóculo

1. Se cultivó el microorganismo en Agar Nutritivo

2. Se verificó la pureza de la cepa sembrándola nuevamente en agar nutritivo


3. Se tomó el cultivo mediante una asa bacteriana estéril y se introdujo en el medio

de inoculación Api 50CHB/E (ref. 50 410) obtenido de la casa comercial (Figura 3-

15).

Figura 3-15. Preparación de inóculo para test de tiras API 50CHB. A – Aislamiento

bacteriano puro; B- Preparación de inóculo en medio selectivo CHB.

4. Se agitó la solución del medio con la bacteria hasta homogenizar y se repartió la

suspensión bacteriana con la ayuda de una pipeta estéril en los 50 tubos de la

galería (Figura 3-16).

5. Finalmente se selló y se incubó a 36°C durante 24 - 48 horas.


Figura 3-16. Inoculación del medio 50CHB en los tubos de las galerías

Lectura e interpretación

La lectura e interpretación de los resultados obtenidos por las tiras API se obtuvieron a

partir de los colores ya establecidos como positivos o negativos de parte de la casa

comercial biomérieux (Figura 3-17), y a partir de un perfil numérico y un catálogo analítico

con la ayuda del software de identificación apiweb TM.


Fuente: Tomado de https://apiweb.biomerieux.com/

Figura 3-17. A – Pruebas negativas y positivas de las tiras API 20E; B- Pruebas

negativas y positivas de las tiras API 50CH.

3.8.3 Medios de cultivo utilizados

Se manejaron algunos medios específicos y otros generales para el crecimiento de los

aislamientos obtenidos de la rizosfera y el tejido endófito foliar, así como también para las

pruebas antagónicas entre las bacterias y los hongos.

Entre estos medio, se utilizó el agar nutritivo el cual en un medio general para el

crecimiento de los aislamientos bacterianos, es utilizado para el cultivo de

microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales y está compuestos

de pluripeptona, extracto de carne, cloruro de sodio y agar; del mismo modo, pero en

menor proporción, se empleó el medio tripticasa de soya para este mismo propósito. Este

favorece el desarrollo y aislamiento de microorganismos aerobios, anaerobios

facultativos y estrictos.

Para las pruebas antagónicas y para el crecimiento de los Fusarium se utilizó el medio

PDA (papa, dextrosa, agar) y en menor proporción se hizo uso del medio agar sabouraud

(peptonas y glucosa) para el crecimiento de estos ya que pueden crecer hongos y

desarrollarse cierto tipo de bacterias.

Para el almacenamiento y extracción de ADN se utilizaron los medios líquidos Caldo

Nutritivo (pluripeptona y extracto de carne) el cual es utilizado para propósitos generales

https://apiweb.biomerieux.com/


con microorganismos y Caldo LB (Luria Bertani) Compuesto de extracto de levadura,

cloruro de sodio y peptona de caseína logrando proporcionar los nutrientes necesarios

para el desarrollo óptimo de la mayoría de los microorganismos.

Los medios específicos utilizados fueron:

Agar MacConkey para clasificar bacterias pertenecientes al grupo de Enterobacterias y

fermentadoras de lactosa. Está compuesto de sales biliares, colorantes como cristal

violeta y rojo neutro, lactosa, peptona y cloruro sódico.

Agar Cetrimida, utilizado para el aislamiento selectivo de algunas bacterias

pertenecientes al género Pseudomas en especial a la especie Pseudomona aeruginosa.

Su composición es peptona de gelatina, cloruro de magnesio, sulfato de potasio, agar y

cetrimida.

Agar King B, Utilizado para la selección de bacterias del género Pseudomonas. Está

compuesto de tripteína, peptona de carne, fosfato dipotásico, sulfato de magnesio y agar.

Estos dos últimos permiten determinar la presencia y/o producción de sideróforos como

piocianinas, pioverdinas y fluoresceínas.

3.9 Caracterización Molecular

Para la caracterización molecular, previamente se seleccionaron las bacterias que

presentaron potencial antagónico frente a los seis aislamientos patogénicos. Estas

bacterias provienen de cultivo puro y fueron sembradas en caldo nutritivo e incubadas

durante 24 horas en agitación constante mediante un shaker a 180 r.p.m (Figura 3-18).


Figura 3-18. Agitación de la suspensión bacteriana en caldo nutritivo

3.9.1 Extracción y purificación del ADN:

Se partió de la suspensión bacteriana en caldo nutritivo y se siguió el protocolo de Merino

& Giusiano, 2011 con modificaciones:

Método del CTAB

1. Se centrifugó el cultivo bacteriano a 13000 r.p.m. por 10 min en frío para la

obtención de la masa bacteriana.

2. Se suspendió la masa bacteriana en 60 μL de Buffer TE ( Tris – HCl 100 mM pH

7.2; Edta 100 mM)

3. Se le agregaron 50 μL de S.D.S. al 0.5%

4. Se le añadieron 50 μL de solución de lisozima 10 mg/ ml y 5 μL de proteínasa K

(20 mg/mL).

5. Se incubaron las muestras a 37°C por 1 hora.


6. Se adicionaron 100 μL de NaCl 5 M para la desnaturalización de las proteínas.

7. Se añadieron 80 μL de CTAB agitando con vórtex por 2 min

8. Se incubó la muestra a 65°C por 10 min

9. Se agregaron 800 μL de cloroformo – Alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló en el

vórtex.

10. Se centrifugó la muestra a 13000 r.p.m. por 5 min en frio

11. Una vez obtenidas las tres fases, se rescató la fase acuosa de la superficie y se

transfirió a un tubo eppendorf limpio.

12. Se agregaron 500 μL de cloroformo – Alcohol isoamilico (24:1)

13. Se centrifugó la muestra a 13000 r.p.m. por 5 min en frio

14. Se pasó la fase acuosa a un tubo eppendorf limpio y se agregaron 600 μL de

isopropanol frio más 50 μL de acetato de sodio para después mesclar durante 5

min por inversión.

15. Centrifugar la muestra a 13000 r.p.m. por 5 min en frio

16. Se lavó el ADN con 30 μL de etanol al 70% y centrifugar a 13000 r.p.m. por 5 min

17. Se secó el ADN en baño de agua a 35°C

18. Finalmente se suspendió la muestra en 50 μL de TE y conservó a -20°C.

3.9.2 Condiciones para la amplificación de la región ADNr 16s

(PCR)

La técnica de PCR se realizó usando una mezcla de volumen final de 15 μL, preparado

con 2 μL de muestra de ADN (20 ng), 7,5 μL de mezcla GoTaq ®Green Master Mix (1,5

mM MgCl2; 200 nM dNTPs), 1 μL de cada primer (10 ng / μL) (tabla 2) y 3,5 μL de agua

libre de DNAsas.

Tabla 3-1. “Primers” usados en la amplificación de la región 16S

Primer Secuencia

fD1 5’-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

rD1 5’-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3’


Las condiciones de amplificación para los “primers” se describen en la tabla 3-2.

Tabla 3-2. Condiciones de amplificación del primer usados en este estudio - Fuente:

Weisburg et al., 1991.

fD1

Desnaturalización inicial 95°C por 2 min

Número de ciclos 30

Desnaturalización 95°C por 30 seg

Anillaje 65°C por 4 min

Extensión 72°C por 4 min

Extensión final 72°C por 5 min

La reacción de PCR se llevó a cabo en un termiciclador multigen optimax y fue

visualizada mediante electroforesis (90 minutos a 50V) en gel de agarosa al 1% en buffer

TBE 0.5X con adición de 1μL de SYBR safe. Para determinar el tamaño de los

fragmentos se usó un marcador de peso molecular GeneRuler 100 pb. La visualización

se realizó en un transiluminador UV.

Secuenciación de los productos de PCR obtenidos

La secuenciación de los productos de PCR fue realizada en el instituto de

Biotecnología de Corea, de la Empresa MACROGEN, a la cual se enviaron 21 μL del

producto de PCR amplificado, en microtubos Eppendorf de 1,7 ml debidamente

rotulados.

Análisis de las secuencias e identificación a nivel de especie

Una vez se obtuvieron las secuencias generadas por Macrogen en Corea, se

procedió a la limpieza de las mismas. Dicho proceso, se realizó con ayuda del

programa BioEdit 7.2.5. Las secuencias limpias se compararon en el programa

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) obtenido a través de NCBI (National

Center for Biotecnology Information).


A B

C

Figura 3-19. A- Muestras de PCR en el termociclador; B- Ajuste de condiciones de

amplificación (Tabla 3-2); C- Corriendo la PCR

Resultados y Discusión 41

4. Resultados y Discusión

Se obtuvieron 193 aislamientos bacterianos, de los cuales 68 provenían de muestras

foliares y 125 de suelo rizosferico. Estos aislamientos fueron clasificados de acuerdo a

su lugar de procedencia, tipo de muestra (Rizosfera – endófitos foliares) y su capacidad

antagónica.

4.1 Antagonismos

4.1.1 Antagonismo de los aislamientos rizosfericos

De los 125 aislamientos bacterianos de la rizosfera de plantas de ají tabasco, 64

produjeron antagonismo en por lo menos uno de los aislamientos de Fusarium spp

evaluados. De Guacarí se obtuvieron 31 aislamientos bacterianos antagónicos, mientras

que de la localidad de Bolívar se aislaron 33 (Anexo A).

En la figura 4-1 se observa el número de aislamientos obtenidos en las localidades,

indicando que de las muestras colectadas en la segunda visita a cada localidad (cuando

el cultivo tenía entre 8 a 9 meses), se obtuvo un mayor número de aislados con potencial

antagónico frente a los Fusarium evaluados. Lo encontrado podría estar asociado con la

edad de la planta, pues se ha indicado que las interacciones mutualistas entre especies

vegetales y microorganismos se presentan o varían, dependiendo del grado de evolución

e interacción desarrollada a través del tiempo (Grayston et al., 1998; Walker et al., 2003).

De la misma forma, el haber obtenido mayor número de aislamientos en la rizosfera en

comparación con las encontradas en los órganos aéreos, estaría relacionado con las

interacciones antes nombradas, sumado al hecho de que la planta libera a la rizosfera

entre el 10 a 60% de los fotoasimilados entre los que se encuentran aminoácidos, ácidos


orgánicos, azúcares, fenoles y proteínas, entre otros (Grayston et al., 1998; Walker et

al., 2003; Paz et al., 2006; Praguer et al., 2007).

Figura 4-1. Número de aislamientos antagónicos obtenidos de las rizosfera de Ají

tabasco (Capsicum frutescens) en cada localidad por salida.

En cuanto al potencial antagónico evaluado mediante el porcentaje de inhibición se

destacan los aislados RP15B1M1, RP10B2M31, RP2B1M9, RP7B2M4, RP8B2M22,

RP8B2M27, RP2B1M5, de la localidad de Bolívar, que presentaron antagonismo en los

seis hongos patogénicos seleccionados. De igual forma para localidad de Guacarí los

aislados RP14G1M5, RP1G2M2, RP6G2M4, RP7G2M11, RP3G2M13, RP7G2M2,

RP7G2M8, RP9G2M8, RP1G1M16, RP1G1M2 presentaron un comportamiento similar

en la inhibición de los seis hongos patógenos.

A continuación se ilustran algunos de estas inhibiciones en las figuras 4-2, 4-3, 4-4, 4-5.

El crecimiento micelial de cada uno de los aislamientos patogénicos creciendo sin

presencia de la bacteria (controles) se presentan en la figura 3-7.



frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA


Figura 4-3. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP10B2M31 frente a los seis

aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA


Figura 4-4. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP7G2M8 frente a los

seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA



frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA


4.1.2 Antagonismo de los endófitos foliares

De los 68 aislamientos bacterianos obtenidos de las hojas de ají tabasco Capsicum

frutescens, 50 produjeron antagonismo en por lo menos uno de los Fusarium spp

evaluados. De Guacarí se obtuvieron 21 aislamientos bacterianos antagónicos, mientras

que la localidad de Bolívar se aislaron 29 (Anexo B y Figura 4 -6).

Figura 4-6. Número de aislamientos antagónicos obtenidos de tejido foliar endofito de Ají

tabasco (Capsicum frutescens) en cada localidad por salida.

Estos resultados muestran una tendencia similar a la hallada en la rizosfera ya que se

obtuvo (para el caso de la localidad de Bolívar), un mayor número de aislamientos en el

segundo muestreo (cuando el cultivo tenía entre 8 a 9 meses), sin embargo no sucedió lo

mismo en la localidad de Guacarí.


Por otro lado, se encontró que la proporción de aislamientos antagónicos fue mayor en

el tejido foliar endófito que en la rizosfera, si se tiene en cuenta que en las hojas, de 68

aislados el 74% presentaron potencial antagónico, mientras que en la rizosfera de 125

aislados, el 51% presentaron antagonismo (Figura 4-7). Lo anterior, podría explicarse por

la ecología de los organismos endófitos, los cuales a menudo son menos abundantes,

pero con rutas metabólicas y funciones especializadas (Kobayashi y Palumbo, 2000;

Sziderics et al., 2007; Egamberdieva y Lugtenberg, 2014), mientras que en la rizosfera se

encuentran un gran número de microorganismos no solo benéficos si no también

patógenos y de vida libre, entre otros. Por ello, se ha reportado que la concentración de

bacterias por gramo de suelo hallada alrededor de las raíces, es mayor que en el resto

de la planta (106 a 108 células/ gr de suelo) posiblemente a los altos niveles de nutrientes

que se hallan en la zona que rodea a las raíces y permiten el desarrollo de poblaciones

microbianas (Lynch, 1990 y Calvo et al., 2008).

6461

N aislados antagonicos

N aislados NO antagonicos

50

18

N aislados antagonicos

N aislados NO antagonicos

Figura 4-7. Comparación del número de aislamientos antagónicos en la rizosfera (A) y

tejido foliar endófito (B).

Por otra parte, los aislamientos destacados en las pruebas de antagonismo fueron

EP1B2M4, EP2B2M4, EP3B1M4, EP3B2M12, EP4B2M16, EP8B2M28, de la localidad

de Bolívar, pues presentaron potencial antagónico a los seis hongos patogénicos

A B


seleccionados. De igual forma para la localidad de Guacarí, los aislados EP5G1M9,

EP5G1M10, EP8G1M10, EP9G2M18 presentaron un comportamiento similar en la

inhibición de los seis hongos patógenos.

A continuación, en las figuras 4-8, 4-9, 4-10, 4-11 se ilustra algunos de los aislamientos

bacterianos que producen inhibición frente a los fusarium patogénicos evaluados.


Figura 4-8. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido foliar EP9G2M18 frente

a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA


Figura 4-9. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido foliar EP8G1M10 frente

a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA



foliar EP5G1M9 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA


Figura 4-11. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento de los tejido foliar EP3B1M4

EP1B2M4 y EP1B3M4 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA


Finalmente, de los aislamientos bacterianos que presentaron antagonismo, se

seleccionaron los que produjeron mayor porcentaje de inhibición, en por lo menos cuatro

de los seis aislamientos de Fusarium evaluados.

De la rizosfera los aislamientos fueron: RP2B1M9, RP15B1M1, RP15B2M2,

RP10B2M31, RP2B1M9, RP7B2M2, RP7B2M4, RP7B2M5, RP8B2M27, RP2B1M5,

RP14G1M5, RP1G2M2, RP4G2M3, RP6G2M4, RP7G2M11, RP3G2M13, RP7G2M2,

RP7G2M4, RP7G2M4.1, RP7G2M8, RP7G2M8.1, RP9G2M8, RP1G2M16, RP1G1M2,

RP10G2M16.

Y de los endófitos foliares fueron: EP1B1M8, EP1B2M1, EP1B2M4, EP2B2M4,

EP2B2M7, EP2G2M10, EP3B1M4, EP3B2M13, EP3G2M4, EP4B2M16, EP4B2M18,

EP5B2M17, EP5B2M21, EP5B2M7, EP5G1M9, EP5G1M10, EP6G1M14, EP7G2M15,

EP8B2M28, EP8G1M10, EP10G1M9, EP9G2M18, EP9G1M16, EP15G1M16.

A estos se les realizó la caracterización bioquímica y molecular.

4.2 Caracterización Morfológica

La caracterización morfológica fue realizada a los aislamientos bacterianos de la rizosfera

(Anexo C) y endófitos foliares (Anexo D) con capacidad antagónica frente a por lo menos

uno de los Fusarium patogénicos. Se describió la morfología de la colonia y la forma de

la célula del microorganismo.

4.2.1 Caracterización morfología de rizobacterias

Los resultados obtenidos en la caracterización morfológica de las rizobacterias, indican

que los aislamientos antagónicos frente a los Fusarium spp., evaluados, fueron en su

gran mayoría de forma bacilar (97%) en comparación con las células en forma de coco

(3%). De igual forma, se encontró que el 64% de los microorganismos antagónicos

aislados son gram positivos. Mientras, el 36% restante son gram negativos (Anexo C).

Por otra parte, en la morfología de las colonias bacterianas se observó una gran

diversidad. Sobresalen las colonias de coloración blanca, forma circular, margen entero,

elevación plana y densidad brillante con porcentajes de 46%, 63%, 57%, 37% y 66%

respectivamente. A continuación, en las figura. 4-12 y 4-13 se ilustran algunas de las

formas encontradas en la caracterización morfológica de las rizobacterias.


A BC

D E F

G H I

J K L


M N

P R

O

Q

S T U

V W X


A.A

Y Z

B.B

Figura 4-12. Morfología de rizobacterias en Agar nutriente – Observación al

estereoscopio (5X).

En la figura 4-12, literal A. se observa una colonia de color blanco, forma circular, margen

entera con una elevación umbonada y una superficie brillante; B. Colonia circular, color

amarillo, margen entera o lisa, elevación convexa y superficie brillante; C. Colonia

oboide, color beige, margen entera o lisa, elevación convexa, superficie brillante; D.

Colonia circular, margen entera o lisa, color blanco, elevación plano convexa y superficie

opaca; E. Colonia circular acuminada, color beige, margen entera o lisa, elevación

convexa; superficie cremosa, brillante; F. Colonia irregular, color blanco crema, margen

ondulada, elevación convexa, y superficie brillante; G. Colonia Irregular, color blanco

beige, margen ondulada, elevación plana y superficie brillante, cremosa; H. Colonia

circular concéntrica, color blanco, elevación plana convexa, superficie brillante, margen

lisa o entera; I. Colonia de forma circular, margen entera, elevación plana, superficie

brillante y traslucida, hialina; J. Colonia de forma irregular, color blanco, margen o borde

filamentoso, elevación convexa, superficie brillante; K. Colonia de forma circular, color

amarillo, borde o margen filamentoso, elevación convexa, superficie brillante; L. Colonia

de forma filamentosa, color blanco crema, borde filamentoso, elevación plana, superficie

brillante, cremosa; M. Colonia rizoide, Color amarillo, borde lobulado, elevación plana,


superficie brillante; N. Colonia circular concéntrica, color blanco, borde entero, elevación

plana, densidad brillante, superficie cremosa; O. Colonia rizoide, color blanco, borde

ondulado, elevación plana, densidad brillante, superficie cremosa; P. Colonia circular

concéntrica, color blanco, borde entero, elevación acuminada, densidad brillante,

superficie rugosa; Q. Colonia circular, color blanco, borde ondulado, elevación convexa,

densidad opaca, superficie rugosa; R.Colonia circular, color amarillo, borde entero,

elevación convexa, densidad brillante, superficie cremosa; S. Colonia circular, color

blanco, borde entero, elevación convexa, densidad brillante, superficie cremosa y lisa; T.

Colonia circular, color blanco, borde ondulado, elevación convexa, densidad opaca,

superficie rugosa y seca; U. Colonia circular, color blanco, borde ondulado, elevación

convexa, densidad opaca, superficie rugosa y seca; V. Colonia circular, color blanco,

borde entero, elevación crateriforme, densidad brillante, superficie cremosa; W. Colonia

circular, color blanco, borde entero, elevación crateriforme, densidad brillante, superficie

cremosa; X. Colonia irregular, color blanco, borde entero, elevación convexa, superficie

seca y rugosa; Y. Colonia irregular, color blanco, borde ondulado, elevación plana,

superficie seca y rugosa; Z. Colonia irregular, color blanco, borde ondulado, elevación

plana, superficie seca y rugosa; A.A. Colonia irregular, color hialino, borde filamentoso,

elevación plana, superficie brillante; B.B. Colonia circular, color blanco, borde entero,

elevación convexa, superficie seca y rugosa.

Los literales P, Q, T, U, V, W, X, Z y B.B. poseen estructuras con una apariencia

tridimensional que sobresalen del medio reflejando sus caracteristicas microscópicas.

Estas colonias bacterianas se destacan sobre las otras estructuras, pues tienden a

cambiar su morfologica con el paso del tiempo.


Figura 4-13. Morfología de algunos aislamientos bacterianos en Agar nutriente – vista

macroscópica


La descripción detallada de las características morfológicas como color, forma, margen,

elevación y densidad para cada uno de los aislamientos rizosfericos se muestra en el

Anexo C.

4.2.2 Caracterización morfológica de endófitos foliares

Los resultados obtenidos en la caracterización morfológica de los endófitos foliares

antagónicos frente a los Fusarium spp., evaluados, indican que la forma bacilar fue la

más predominante entre los aislados encontrados, con un 90% en comparación con los

cocos (10%).

Por otra parte, en la morfología de las colonias bacterianas endófitas predominaron las

colonias de forma circular, color blanco, margen entero, elevación convexa y densidad

brillante con porcentajes de 90%, 50%, 74%, 66%, y 78% respectivamente. De igual

forma, se encontró que el 66% de los aislados antagónicos son gram positivos, mientras

que el 34% restante fue gram negativo.

A continuación, en las figuras. 4-14 y 4-15 se ilustra algunas de las formas encontradas

en la caracterización morfológica de los endófitos foliares.


Figura 4-14. Aislamientos bacterianos endófitos en Agar nutriente- vista macroscópica


A B C

D E F

G H I

J K L

Figura 4-15. Morfología de la colonia bacteriana de algunos aislamientos endófitos en

Agar nutritivo - vista en un estereoscopio


A. Colonia de color blanco amarillo, de forma circular, con margen lisa, elevación

convexa, una densidad o consistencia viscosa y una superficie brillante; B. Colonia de

color blanco, margen filamentoso, elevación umbonada, superficie brillante, cremosa; C.

Forma circular, color amarillo, margen ondulada, elevación convexa, superficie brillante,

cremosa; D. Forma irregular, color amarillo, margen ondulada, elevación umbonada,

superficie brillante, rugosa; E. Color hialina, forma irregular, margen ondulada, elevación

plana, densidad superficie traslucida, rugosa; F. Color amarillo, forma circular

concentrica, margen ondulada, elevación acuminada, superficie brillante, cremosa; G.

Color blanco, forma circular, margen ondulada, elevación papilada, superficie opaca,

rugosa; H. Color rosado, margen ondulada, forma irregular, elevación plana, superficie

brillante, rugosa; I. Forma Circular, color blanco, elevación Umbonada, margen ondulada,

superficie opaca, rugosa; J. Forma circular, color blanco, margen entera, elevación

convexa, superficie brillante, cremosa; K. Color amarillo, Forma circular, margen entera,

elevación convexa, superficie brillante, cremosa; L. Color amarillo, forma irregular,

margen ondulada, elevación umbonada, superficie brillante.

Los literales D, E, G, H, I, L, poseen estructuras con una apariencia sobresalen de las

colonias convencionales mostrando sus caracteristicas microscópicas. Estas colonias

bacterianas se destacan sobre las otras estructuras, pues tienden a cambiar su

estructura morfologica con el paso del tiempo.

La descripción detallada de las características morfológicas como color, forma, margen,

elevación y densidad para cada uno de los aislamientos endófitos foliares se muestra en

el Anexo D.

4.3 Caracterización Bioquímica

4.3.1 Caracterización bioquímica de aislamientos rizosfericos

Los resultados de la caracterización bioquímica de las rizobacterias con el sistema de

identificación Tiras API 20E y 50CHB, indican que de los 25 aislamientos de rizobacterias

identificados, 8 pertenecen al género Pseudomonas los que equivalen a 32% de la

población de aislados antagonistas. De este género, la especie Pseudomonas

aeruginosa presentó seis individuos, seguida de P. putida y P. fluorescens con un

individuo cada una. También se observa que las especies Bacillus amyloliquefaciens y

Chryseobacterium indologenes presentaron siete y tres aislamientos respectivamente.


Las especies Myroides spp/Chryseobacterium indologenes, Aeromonas hydrophila,

Bacillus megaterium, Bacillus smithii, Bacillus subtilis/amyloliquefaciens, Bordetella spp,

Serratia rubidae, Stenotrophomonas maltophilia presentaron un individuo cada una (tabla

4-1 y tabla 4-2)


mediante el sistema API 20E

Aislamiento Cepa identificada Posibilidad (%)

RP9G2M8 Pseudomonas aeruginosa 100

RP6G2M4 Serratia rubidae 81

RP7G2M4,1 Pseudomonas aeruginosa 99

RP7B2M4 Chryseobacterium indologenes 67

RP2B1M9 Bordetella spp 60

RP1G1M2 Aeromonas hydrophila 60

RP7B2M2 Chryseobacterium indologenes 54


RP7G2M8,1 Pseudomonas aeruginosa 99


RP7B2M5 Myroides spp/Chryseobacterium indologenes 87

RP8B2M22 Stenotrophomonas maltophilia 90

RP7G2M4 Pseudomonas putida 99


RP10G2M16 Pseudomonas fluorescens 99

RP1G2M2 Chryseobacterium indologenes 54

Las especies se determinaron de acuerdo al perfil bioquímico obtenido mediante el

sistema de tiras API 20E y 50CHB para los cuales de acuerdo al resultado arrojado en

cada una de las pruebas realizadas permite la aproximación a género y en algunos casos

especies y mediante el uso del API web se determinó el porcentaje de posibilidad de

indetificacion para cada uno de los casos.



mediante el sistema API 50CHB


RP8B2M27 Bacillus amyloliquefaciens 99


RP4G2M3 Bacillus megaterium 60

RP7G2M11 Bacillus amyloliquefaciens 99

RP7G2M2 Bacillus amyloliquefaciens 96

RP3G2M13 Bacillus smithii 65

RP10B2M31 Bacillus subtilis/amyloliquefaciens 99



Los resultados obtenidos de cada prueba bioquímica realizada mediante las tiras API con

base en la colorimetría o cambio de color del medio de inoculación se muestran en los

Anexos E y F.

4.3.2 Caracterización bioquímica de aislamientos endófitos

Los resultados ofrecidos por el sistema de identificación API 20E y 50CHB, muestran que

de los 24 aislamientos endófitos identificados, 9 pertenecen al género Pseudomonas los

que equivalen a un 38% de la población de aislados antagonistas. De este género, la

especie Pseudomonas aeruginosa presentó cinco individuos, seguida de P. oryzihibants

y P. fluorescens/putida con dos individuos cada una. También se encontró que las

especies Geobacillus thermoglucosidasius y Bacillus mycoides/ thurigiendisis

presentaron dos aislamientos cada una. Finalmente se encontró que las especies

Aneurinibacillus aneurinilyticus, Bacillus smithii, Enterobacter amnigenus, Enterobacter

cloacae, estaban representadas con un individuo respectivamente.



mediante el sistema API 20E


EP5G1M9 Enterobacter cloacae 37

EP8B2M28 Stenotrophomonas maltophilia 81

EP6G1M14 Enterobacter amnigenus 37

EP3B2M13 Pseudomonas aeruginosa 18

EP15G1M16 Pseudomonas aeruginosa 77

EP5B2M7 Pseudomonas oryzihibants 81

EP10G1M9 Pseudomonas fluorescens/putida 90

EP5B2M17 Pseudomonas oryzihibants 81

EP2G2M10 Pseudomonas fluorescens/putida 90



EP7G2M15 Stenotrophomonas maltophilia 80


Adicional a estas pruebas para enterobacterias, se realizaron pruebas con las tiras API

50CHB para caracterizar bioquímicamente las bacterias Gram positivas (Anexo F).



mediante el sistema API 50CHB


EP5G1M10 Bacillus subtilis/amiloliquenfaciens 99

EP2B2M7 Bacillus smithii 65

EP1B2M1 Bacillus mycoides/ thurigiensis 70

EP1B1M8 Geobacillus thermoglucosidasius 55

EP1B2M4 Bacillus mycoides/ thurigiendisis 73

EP3G2M4 Geobacillus thermoglucosidasius 98

EP2B2M4 Geobacillus thermoglucosidasius 50

EP4B2M18 Aneurinibacillus aneurinilyticus 99

EP4B2M16 Bacillus subtilis/amiloliquenfaciens 99

EP3B1M4 Bacillus subtilis 99

EP5B2M21 Bacillus subtilis/amiloliquenfaciens 99

Los resultados obtenidos de cada prueba bioquímica realizada mediante las tiras API con

base en la colorimetría o cambio de color del medio de inoculación se muestran en los

Anexos G y H.

4.3.3 Medios selectivos:

Los resultados obtenidos en los medios selectivos utilizados para determinar algunas

características de las bacterias antagónicas a Fusarium y posibles promotoras de

crecimiento de las plantas de ají se ilustran en las figuras. 4-16, 4-17 y 4-18.



en Agar King B expuestos a luz UV- Los aislamientos con la letra E, corresponden a las

bacterias endófitas; los aislamientos con la letra R corresponden a las bacterias

rizosfericas.

Resultados y discusión 69

Figura 4-17. Aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera en Agar MacConkey –

Los aislamientos con la letra E, corresponden a las bacterias endófitas; los aislamientos

con la letra R corresponden a las bacterias rizosfericas.



sembrados en Agar cetrimida y expuestos a luz UV - Los aislamientos con la letra E,

corresponden a las bacterias endófitas; los aislamientos con la letra R corresponden a las

bacterias rizosfericas.

De acuerdo con los resultados observados en medio King B, King A o cetrimida, los

aislamientos antagónicos bacterianos RP9G2M18, EP9G2M8, EP8B2M28, EP9G1M16,

EP14G1M5, EP7GM11, EP7G2M4, EP8G1M10, RP7G2M8,1 son productores de

piocianinas, pioverdinas y fluoresceínas los cuales son pigmentos verdosos, azules o

amarillos cuando son expuestos a luz UV. Estos pigmentos son un indicador cualitativo

de la presencia de algunos sideróforos, que a su vez se pueden clasificar en catecolatos

(fenolatos), hidroximatos e hidroxicarboxilatos. Estos sideróforos forman complejos

octaédricos hexadentados con el metal y algunos son más eficaces que otros para

quelatar el hierro (Marahiel, 1997; Crosa y Walsh, 2002; Aguado – Santacruz et al.,

2012). Igualmente, estos autores reportan que algunas especies del género


Pseudomonas producen sideróforos del tipo hidroximato, entre los que también se

encuentran la ferribactina, pseudobactina y pioverdinas del tipo catecol.

Según autores como O’Sullivan y O’Gara, 1992; Dowling et al., 1996, los sideróforos

involucran un mecanismo de secuestrar el hierro y otros minerales, disponibles en el

medio y con esto limitar el crecimiento de microorganismos fitopatógenos como

Fusarium. Este es un mecanismo de producción de crecimiento muy difundido entre las

bacterias, inclusive en las que son más reconocidas por otras actividades de estimulación

de crecimiento.

Así pues, las bacterias con la capacidad de producir estos compuestos y secuestrar el

hierro del ambiente, ocasionan que este metal no se encuentre disponible para otros

microorganismos que carezcan del sistema de asimilación específico para reconocer

dicho complejo. De esta manera, al utilizar todo o la mayoría del hierro disponible en el

suelo suprime o inhibe el crecimiento de otros microorganismos patógenos presentes en

la rizosfera (Compant et al., 2005; Schroth y Hancock, 1982) como lo observado in vitro.

Además de suprimir la presencia de patógenos con necesidades de hierro para su

supervivencia, estos sideróforos, pueden actuar como activadores eficientes de los

sistemas de resistencia sistémica inducida en las plantas como lo muestran algunos

trabajos previos de investigación (Ran et al., 2005; Meziane et al., 2005; Bakker et al.,

2007).

Por otro lado, los resultados obtenidos en el medio MacConkey (Fig. 4-17) muestran los

aislamientos de enterobacterias bacilares gram negrativas, que permiten diferenciar

aquellos que utilizan o no lactosa, el cual es el único hidrato de carbono en el medio.

Algunos de los aislamientos antagónicos bacterianos visualizados como enterobacterias

en el medio fueron EP6G1M14, EP5G1M9, EP10G1M9, EP15G1M16, RP7B2M4,

RP3G2M13, RP9G2M8, RP7G2M11, RP7G2M4, RP7G2M8, P7B2M2 produciendo

colonias de color rojo, morado o fucsia, debido a la conversión del colorante indicador

rojo neutro (rojo por debajo de Ph 6,8) a partir de ácidos mixtos. Contrario a esto, las

colonias que no fueron enterobacterias fermentadoras de lactosa aparecieron incoloras o

trasparentes, inhibidas por las sales biliares y el violeta genciana del medio o por ser

Gram positivas (Koneman y Allen, 2008). Según lo reportado por Farro y Graus, 2013,

estas enterobacterias se encuentran en la mayoría de suelos creciendo rápidamente en


medios de cultivo y en diferentes sustratos orgánicos de bajo costo. Muchas de estas

han sido empleadas como promotoras de crecimiento vegetal logrando un incremento en

la germinación de cultivos de maíz (Torres et al., 2003; Rani et al., 2011; Ogbo and

Okonkwo, 2012), así como también en el número de pelos absorbentes (Schoebitz,

2006), número de raíces laterales, altura, biomasa radical, biomas aérea y rendimiento

(Torres et al., 2003; Schoebit, 2006; Schoebitz et al., 2009; Rani et al., 2011; Koo and

Cho, 2009; Criollo et al., 2012; Ogbo and Okonkwo, 2012; Sánchez et al., 2012; Morales

et al., 2011), además de aumento en la concentración de fósforo (Cordero et al., 2008) y

nitrógeno (Beracochea, 2011) en los tejidos vegetales.

4.4 Caracterización molecular

Tras la identificación de los aislados bacterianos antagónicos por medios bioquímicos, se

confirmó la identificación de las especies de estos géneros mediante la secuenciación

genómica. Se secuenciaron 49 aislados pertenecientes a la rizosfera y tejido foliar

endófito de plantas de ají tabasco (Capsicum frutescens).

Se secuenciaron los nucleótidos de la región conservada ADN ribosomal 16S (ADNr 16S)

y el producto fue visualizado por electroforesis en gel de agarosa. Se obtuvo un

fragmento de ≈1200 pb de cada aislado, como se puede apreciar en la figura 4-19.

1200 pb

Figura 4-19. Visualización en gel de agarosa 1% p/b, de productos de amplificación de la

región ADN ribosomal 16S mediante el cebador universal D1.

Una vez obtenidas las secuencias completas de cada uno de los aislados, se determinó

la identidad a nivel de especie, mediante el programa BLAST (Basic Local Alignment


Search Tool) obtenida a través del NCBI (Nacional center for biotechnology Information,

2016).

Los resultados de la identificación se muestran en la tabla 4-5 y figura 4-20, donde se

observa que el género Pseudomonas fue el predominante de los aislados de la planta de

ají con 17 individuos del total de aislamientos secuenciados. De estos individuos, nueve

fueron encontrados en el tejido foliar endófito y los ocho restantes en la rizosfera. En este

género se destaca la especie Pseudomona aeruginosa con 11 individuos, de los cuales

cinco fueron aislados de tejido foliar endófito y seis de la rizosfera. Las especies

Pseudomona fluorescens y Pseudomona putida presentaron dos individuos aislados de

tejido foliar endófito y uno de la rizosfera cada una.

Por otro lado, el género Bacillus presenta de igual manera un papel sobresaliente dentro

de las especies encontradas, debido a que se aislaron 17 individuos del total de

aislamientos secuenciados. En estos aislados del género Bacillus, predominó la especie

Bacillus amyloliquefaciens la cual presentó ocho individuos, de los cuales siete fueron

hallados en la rizosfera y uno en tejido foliar endófito. La especie Bacillus subtilis, Bacillus

pumilus, Bacillus simplex y Bacillus thuringiensis presentaron 3, 2, 2 y 2 aislamientos

respectivamente.


RP2B1M5 Bacillus amyloliquefaciens


RP7G2M11 Bacillus amyloliquefaciens



RP7G2M2 Bacillus amyloliquefaciens


RP3G2M13 Bacillus pumilus

RP4G2M3 Bacillus pumilus

Azospirillum_melinis_NR_043483.1

RP8B2M22 Stenotrophomonas maltophilia

RP1G1M2 Achromobacter xylosoxidans

RP6G2M4 Serratia sp.

RP9G2M8 Pseudomonas aeruginosa

RP1G2M2 Alcaligenes faecalis

RP7B2M2 Alcaligenes faecalis



RP7B2M5 Stenotrophomonas maltophilia

RP7G2M8,1 Pseudomonas aeruginosa


RP7G2M4,1 Pseudomonas aeruginosa



RP7G2M4 Pseudomonas putida

RP10G2M16 Pseudomonas fluorescens

0.05

EP2B2M7 Bacillus simplex

EP4B2M18 Bacillus simplex

EP1B2M1 Bacillus thuringiensis

EP1B1M8 Microbacterium arborescens

EP2B2M4 Microbacterium arborescens

Azospirillum_melinis NR_043483.1

EP7G2M15 Stenotrophomonas maltophilia

EP8B2M28 Stenotrophomonas maltophilia

EP8G1M10 Pseudomonas aeruginosa

EP15G1M16 Pseudomonas aeruginosa

EP5B2M7 Pseudomonas aeruginosa


EP10G1M9 Pseduomonas putida

EP2G2M10 Pseudomonas putida


EP9G1M16 Pseudomonaaeruginosa

EP9G2M18 Pseudomonaaeruginosa

EP1B2M4 Bacillus thuringiensis

EP3B1M4 Bacillus subtilis

EP5B2M21 Bacillus amyloliquefaciens

EP4B2M16 Bacillus subtilis

EP5G1M10 Bacillus subtilis

EP3G2M4 Microbacterium arborescens

EP5G1M9 Enterobacter cloacae

EP6G1M14 Enterobacter cloacae

0.05

Figura 4-20. Árbol filogenético de las secuencias de rizobacterias (A) y endófitas (B)

obtenidas mediante la amplificación de la región de ADNr 16S mediante el cebador

universal D1, usando el coeficiente de similitud del vecino más cercano (Neighbor joining

bootstrap de 1000 replicas). Raiz Azospirillum melinis (NR_043483.1)

Aparte de estas especies representadas por estos dos géneros, también se encuentran

las especies Alcaligenes faecalis y Stenotrophomonas maltophilia cada una con cuatro

individuos totales. La primera estuvo presente solo en la rizosfera, mientras que la

segunda se encontró tanto en rizosfera como en hojas. También se hallaron las especies

Enterobacter cloacae y Microbacterium sp., encontradas en el tejido foliar endófito.

A B

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/343202979?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=JDEBVWGT01R

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_1002635872


Finalmente se observan con un individuo las especies Achromobacter xylosoxidans y

Serratia sp., en la rizosfera y Microbacterium arborescens en el tejido foliar.

Tabla 4-5. Resultados de la caracterización molecular de los aislamientos endófitos de

hojas y rizobacterias de ají tabasco

Código del aislamiento Especie Accesión (Gen Bank) %

identificación

RP1G1M2 Achromobacter xylosoxidans KR136349.1

98

RP1G2M2 Alcaligenes faecalis CP013119.1

84

RP7B2M2 Alcaligenes faecalis CP013119.1 92

RP2B1M9 Alcaligenes faecalis KT013265.1 95

RP7B2M4 Alcaligenes faecalis CP013119.1 92

EP5B2M21 Bacillus amyloliquefaciens KT964221.1 94

RP8B2M27 Bacillus amyloliquefaciens KT964221.1 93

RP15B1M2 Bacillus amyloliquefaciens CP014783.1 98

RP7G2M11 Bacillus amyloliquefaciens KJ767314.1 97

RP7G2M2 Bacillus amyloliquefaciens CP006058.1 94

RP10B2M31 Bacillus amyloliquefaciens KM658261.1 94

RP15B1M1 Bacillus amyloliquefaciens JN999864.1 95

RP2B1M5 Bacillus amyloliquefaciens KT964221.1 99

RP4G2M3 Bacillus pumilus KC250106.1 95

RP3G2M13 Bacillus pumilus KM438074.1 94

EP2B2M7 Bacillus simplex KT216588.1 99

EP4B2M18 Bacillus simplex KT216588.1 93

EP3B1M4 Bacillus subtilis KR055730.1 92

EP5G1M10 Bacillus subtilis KP408227.1 90

EP4B2M16 Bacillus subtilis KU764381.1 92

EP1B2M1 Bacillus thuringiensis HQ694054.1 98

EP1B2M4 Bacillus thuringiensis KF150502.1 91

EP6G1M14 Enterobacter cloacae CP009850.1 84

EP5G1M9 Enterobacter cloacae CP003737.1 83

EP1B1M8 Microbacterium arborescens JF416209.1 97

EP2B2M4 Microbacterium arborescens KF465976.1 83

EP3G2M4 Microbacterium sp. JQ659424.1 98

EP9G1M16 Pseudomonas aeruginosa GQ203623.1 85

EP9G2M18 Pseudomonas aeruginosa KF979140.1 85

EP3B2M13 Pseudomonas aeruginosa KC662503.1 96

EP15G1M16 Pseudomonas aeruginosa KC662503.1 96



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/937501645?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=GNWH06N001R


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/953007081?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=10&RID=GNXD61X001R




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/952001415?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=14&RID=GNXR2W3501R




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/1011312027?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=GNT9K7SA01R


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/1009065180?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=GNTN176801R


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/1007406663?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=GNY62FTM01R




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/1011312027?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=6&RID=GNYNJ1R501R


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/429473230?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=GNWTAG9V01R

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/950834943?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=GNS14ASF01R



Código del aislamiento Especie Accesión (Gen Bank) %

identificación

EP8G1M10 Pseudomonas aeruginosa DQ083947.1 95

RP7G2M4,1 Pseudomonas aeruginosa EF378660.1 96

RP14G1M5 Pseudomonas aeruginosa JQ660572.1 96

RP7G2M8,1 Pseudomonas aeruginosa JF513134.1 95

RP1G1M16 Pseudomonas aeruginosa JF513134.1 99

RP7G2M8 Pseudomonas aeruginosa CP013989.1 86

RP9G2M8 Pseudomonas aeruginosa CP013989.1 86

EP5B2M17 Pseudomonas fluorescens JN029804.1 99

EP5B2M7 Pseudomonas fluorescens JN029804.1 99

RP10G2M16 Pseudomonas fluorescens JN029804.1 99

EP2G2M10 Pseudomonas putida FJ788425.1 96

EP10G1M9 Pseduomonas putida FJ788425.1 96

RP7G2M4 Pseudomonas putida KU187966.1 96

RP6G2M4 Serratia sp. CP005927.1 96

EP8B2M28 Stenotrophomonas maltophilia HM755666.1 96

EP7G2M15 Stenotrophomonas maltophilia HM755666.1 96

RP8B2M22 Stenotrophomonas maltophilia GQ889255.1 96

RP7B2M5 Stenotrophomonas maltophilia KT748642.1 97

Los aislamientos bacterianos de la rizosfera RP7G2M4,1, RP14G1M5, RP7G2M8,

RP1G1M16, RP10G2M16, RP7G2M8,1, RP9G2M8, RP8B2M27, RP15B1M2, RP4G2M3,

RP7G2M11, RP7G2M2, RP3G2M13, RP10B2M31, RP15B1M1, RP2B1M5 y los

endófitos EP9G1M16, EP9G2M18, EP5B2M17, EP2G2M10, EP3B2M13, EP15G1M16,

EP5B2M7, EP10G1M9, EP8G1M10, EP3B1M4, EP5G1M10, EP5B2M21, EP2B2M7,

EP4B2M16, EP1B2M1, EP4B2M18, EP1B2M4 pertenecen a los géneros Pseudomona y

Bacillus y presentaron los mayores porcentajes de inhibición del patógeno.

Estos resultados coinciden con lo reportado en la literatura, puesto que estos dos

géneros poseen mecanismos de acción directa e indirecta como bacterias promotoras de

crecimiento vegetal debido a su capacidad de producir fitohormonas, liberar ácido

indolácetico (AIA), giberelinas o citoquininas en la rizósfera de las plantas, ejerciendo un

efecto estimulador del crecimiento (Lugtenberg y Kamilova, 2009; Sarabia et al., 2012).

Además de tener la capacidad de controlar patógenos sintetizando moléculas

antifúngicas (Whipps, 2001), producir enzimas como quitinasas, glucanasas y proteasas


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/126693362?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=10&RID=GNT1ADP401R


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/385866494?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=GNVNVGRB015


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/339959022?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=GNX3JW8701R


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/975043142?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=4&RID=GNYGARJ301R


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/975043142?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=4&RID=GNYGARJ301R

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/640856369?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=6&RID=GUTUJKEY015


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/260160077?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=44&RID=GNSNG3XD01R


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/1002635871?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=3&RID=GNTYVV7101R


que degradan y rompen las paredes celulares de los hongos o servir como competencia

presentado una agresiva colonización y desplazando a otras bacterias u hongos

perjudiciales para las plantas (Lugtenberg y Kamilova, 2009). Sumado a esto, estudios

realizados por Toyoda y Utsimi (1991) muestran que cepas de Pseudomonas cepacia y

Pseudomonas solanacearum son capaces de hidrolizar el ácido fusárico, el cual es el

agente causante del marchitamiento por infección de Fusarium.

De igual manera se reporta que en el año 2015 estudios realizados por Castillo y

colaboradores encontraron que especies del género Bacillus presentaron un efecto

antagonista in vitro sobre Rhizoctonia solani con una inhibición del micelio de 40 a 67%.

Al realizar la caracterización por secuenciación del gen 16S del ADNr determinaron que

los aislamientos pertenecían a las especies de B. subtilis, B. pumilus y a B. atrophaeus,

quienes están reportadas con efecto antagónico sobre otros organismos fitopatógenos.

De igual modo, los resultados concuerdan con el trabajo de Vega et al., 2005 quienes

realizaron el primer reconocimiento de la diversidad de bacterias endófitas en diversos

tejidos de café, encontrando bacterias del género Bacillus, Pseudomonas, Serratia y

Stenotrophomonas, entre otras. Estos autores también reportaron el primer estudio que

informó la presencia de bacterias endófitas en las semillas café. El posible papel de estas

bacterias en la biología de la planta de café es desconocido.

Sin embargo, estudios recientes (Elhalag et al., 2015), demuestran la actividad

antagónica de Stenotrophomonas maltophilia contra Ralstonia solanacearum bajo

diferentes condiciones de aplicación y su capacidad para actuar como promotora de

crecimiento vegetal (Morgado et al., 2015).

Otros estudios (Yee Liu et al., 2012), nombran a la especie Enterobacter cloacae como

una bacteria endófita encontrada en plantas de tomate infectadas con Ralstonia

solanacearum. Esta bacteria también se ha reportado como promotora de crecimiento

vegetal con capacidad de producir AIA (Malik & Sindhu, 2011) y la utilización de la

enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (precursor del etileno) metabolizandola en

alfa-cetobutirato y amoniaco (Jorquera et al., 2012). Esta reacción metabólica disminuye

el estrés en la planta generado por altas concentraciones de esta hormona, afectando a

algunas bacterias fitopatógenas; además proporciona resistencia a hidrocarburos

poliaromáticos, desecación, salinidad y metales pesados como níquel y calcio (Bal et al.,


2012). También es capaz de producir compuestos volátiles como acetoina y 2,3-

butanodiol que actúan de forma directa como fitohormonas y estimulan de forma indirecta

a la promoción del crecimiento vegeta (Farag et al., 2013).

En cuanto al género Microbacterium, varios autores reportan su capacidad de

solubilización de fosfato en especies como el Capscium annuum, Lupinus montanus,

entre otras (Oliveira et al., 2009; Bhattacharyya y Jha 2012; Babana et al., 2013; Rojas et

al., 2015). De manera similar las especies Alcaligenes faecalis y Achromobacter

xylosoxidans han sido reportadas como promotoras de crecimiento vegetal en diferentes

hospederos, produciendo hormonas como auxinas y AIA, así como también fijando

nitrógeno atmosférico (Cortés et al., 2014).

Así pues, los resultados encontrados en este estudio se constituyen como una fuente

importante y promisoria para el manejo de enfermedades y mejoramiento de la

productividad en el ají.




Conclusiones y Recomendaciones 79

5. Conclusiones y recomendaciones

5.1 Conclusiones

De la rizósfera y tejido foliar endófito de ají tabasco se identificaron ocho géneros de

bacterias correspondientes a Serratia, Achromobacter, Alcaligenes, Microbacterium,

Enterobacter, Stenotrophomonas, Bacillus, Pseudomonas que presentan capacidad

antagónica frente a los aislados de Fusarium.

La morfología, perfil bioquímica y caracterización molecular permitió determinar que

los géneros Pseudomonas y Bacillus, fueron los más representativos en cuanto

abundancia de aislados de plantas de Capsicum frutescens y capacidad antagónica

frente a Fusarium, de las cuales las especies Pseudomona aeruginosa y Bacillus

amyloliquefaciens fueron las más predominantes en el estudio y se encontraron

asociadas tanto a tejido foliar como a rizosfera.

Los aislamientos RP9G2M18 EP9G2M8 EP8B2M28 EP9G1M16 EP14G1M5

EP7GM11 EP7G2M4 EP8G1M10 RP7G2M8,1 presentaron caracteristicas

promotoras de crecimiento realacionadas con la producción de sideroforos.

Las especies Achromobacter xylosoxidans, Alcaligenes faecalis, Enterobacter

cloacae, Microbacterium spp., y Stenotrophomonas maltophilia, se constituyen como

nuevos reporte de bacterias asociadas a la rizosfera o tejido vegetal endófito de

plantas de ají tabasco Capsicum frutescens, en el Valle del Cauca – Colombia.



Conclusiones y Recomendaciones 80

5.2 Recomendaciones

Realizar pruebas de invernadero y en campo con las cepas que presentaron

antagonismo frente a Fusarium.

Determinar los mecanismos biológicos mediante los cuales las bacterias con

capacidad antagónica actúan dentro de la planta.

Evaluar las bacterias con capacidad antagónica frente a otros patógenos del ají.

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Anexos 103

Anexos

Anexo A: Promedio del porcentaje de inhibición de los aislamientos bacterianos de la

rizosfera de Ají Tabasco (Capsicum frutescens) frente a los seis aislados de Fusarium

patogénicos evaluados

N° Aislamiento Bacterianos F701 F58 F54 F52 F09 FB

1 RP15B1M1* 24,4 5,6 59 67 40 77,8

2 RP15B2M2* 14,4 0 0 56 44 77,8

3 RP10B1M20 0 5,6 11 4 2 8,9

4 RP9B1M26 0 0 0 0 0 0

5 RP10B2M31*2 69 57,8 63,3 61,1 62,2 53,3

6 RP10B2M33 0 36,7 0 0 0 0

7 RP10B2M34 0 0 0 0 0 0

8 RP10B2M35 0 0 0 0 54 36,7

9 RP10B2M37 0 0 0 0 0 0

10 RP1B1M9* 13 37 19 52 47 40

11 RP1B2M6 0 51,1 0 0 22 11

12 RP1B2M7 0 0 0 0 13 0

13 RP1B2M8 11 12 19 0 18 17,4

14 RP2B1M6 0 27,8 0 0 0 2,2

15 RP2B1M7 0 0 0 0 0 0

16 RP2B1M8 0 0 0 0 0 9,2

17 RP2B1M9* 13 37 19 52 47 40

18 RP3B1M11 0 35,6 0 0 0 40

19 RP3B1M5 0 0 0 38 26 0

20 RP3B2M2 0 0 0 0 64 32

21 RP3B2M4 0 0 0 0 0 42,2

22 RP3B2M5 46 0 0 31 0 0

23 RP4B1M1 0 0 0 0 0 0

24 RP4B1M2 0 0 0 0 0 0

25 RP4B1M3 0 0 0 0 0 0

26 RP4B2M30 22 33,3 0 0 20 34,4

27 RP5B2M1 0 0 0 0 0 0

1 F70, F58, F54, F52, F09 (colección de referencia de aislamientos de Fusarium de la Universidad Nacional de Colombia

sede Palmira, obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y FB obtenido en el municipio de Bolívar Valle. *Corresponde a los aislamientos que presentaron antagonismos en por lo menos cuatro de los seis hongos patogénicos

evaluados y fueron seleccionados para la extracción de ADN.

Anexos 104

Anexo A: (Continuación)


28 RP5B2M3 0 0 0 0 0 0

29 RP5B2M4 0 0 0 0 0 0

30 RP5B2M2 0 0 0 0 0 0

31 RP6B1M10 0 0 0 0 0 0

32 RP6B1M13 0 0 0 0 0 0

33 RP6B2M12 0 0 0 0 0 0

34 RP6B2M15 0 0 0 0 0 0

35 RP6B2M14 0 0 0 0 0 42,2

36 RP7B1M17 0 0 0 0 0 0

37 RP7B2M1 0 43,3 0 0 36 26,9

38 RP7B2M2* 61 28 39 53 47 0

39 RP7B2M3 0 0 0 0 0 16,7

40 RP7B2M4* 33 43,3 39 38 44 16

41 RP7B2M5* 30 37,8 0 31 43 44,4

42 RP8B1M25 0 0 0 0 0 41

43 RP8B2M22* 60 46 80 54 73 30

44 RP8B2M23 0 25,6 0 0 0 31,1

45 RP8B2M26 0 0 0 0 0 25,6

46 RP8B2M27* 59 69 55,6 49 61,1 85,6

47 RP9B1M26 0 0 0 0 0 58

48 RP9B2M3 0 27,8 0 0 26 35,6

49 RP1B1M3 0 0 0 0 0 0

50 RP9B1M26 0 0 0 0 0 44,4

51 RP9B1M6 0 0 0 0 0 0

52 RP2B1M5* 64 59 87 77 77 90

53 RP11B1M8 0 0 0 0 0 0

54 RP11B1M10 0 0 0 0 0 0

55 RP11B1M11 0 0 0 0 0 0

56 RP12B1M9 0 0 0 0 0 0

57 RP12B1M20 0 0 0 0 0 0

58 RP12B2M21 0 0 0 0 0 0

59 RP12B2M22 0 0 0 0 0 0

60 RP13B1M5 0 0 0 0 0 0

61 RP13B2M6 0 0 0 0 0 0

62 RP14B2M3 0 0 0 0 0 0


sede Palmira, obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y FB obtenido en el municipio de Bolívar Valle.

Anexos 105



63 RP14B2M9 0 0 0 0 0 0

64 RP14B2M10 0 0 0 0 0 0

65 RP11G1M43,1 0 17 0 0 0 0

66 RP14G1M5* 86 46,7 64 74 83 92

67 RP1G1M8 0 0 0 0 0 0

68 RP1G2M2* 63 74 60 67 76 99

69 RP1G2M1 0 0 0 0 0 0

70 RP1G1M15 0 50 36 0 0 6,7

71 RP2G1M5 0 0 0 0 0 0

72 RP2G1M6 0 0 0 0 0 0

73 RP2G2M8 0 0 0 0 0 0

74 RP2G2M7 22,2 19,4 0 0 24 41,1

75 RP3G2M2 0 0 0 0 60 63

76 RP3G2M10 0 0 0 0 0 43,3

77 RP3G2M11 0 27 35,6 0 0 51

78 RP3G2M12 0 0 0 0 27,8 0

79 RP3G2M9 0 0 29 0 0 0

80 RP4G2M1 0 0 0 0 0 0

81 RP4G2M5 0 0 0 0 0 0

82 RP4G2M6 0 0 0 0 0 0

83 RP4G2M3* 0 3,3 24 66,7 24,4 45,6

84 RP5G2M8 0 0 0 0 0 0

85 RP5G1M10 0 0 0 0 0 0

86 RP5G1M11 0 28 6 28 58 0

87 RP5G2M10 0 0 0 0 0 0

88 RP6G2M18 0 0 0 59 0 31,1

89 RP6G2M4* 42 76 66 67 64 12,2

90 RP6G2M5 0 35,6 15 20 0 31,1

91 RP6G2M8 27,8 0 0 0 0 47,8

92 RP7G2M11* 31 45 64 61,1 40 41,1

93 RP7G2M12 0 0 0 0 0 0

94 RP3G2M13* 22 23 36 28 42 51,1

95 RP7G2M2* 37 58,9 60 39 61,1 69

96 RP7G2M3 0 0 0 0 19 0

97 RP7G2M4* 0 0 70 26 0 0

98 RP7G2M5 30 0 22 11,2 0 0

99 RP7G2M30 67,8 0 0 0 0 0

100 RP7G2M8* 50 46,7 40 63 41 31,1

101 RP8G1M14 0 14 0 0 0 43,9

Anexos 106



102 RP8G1M37 0 19 0 0 0 35,9

103 RP8G2M9 0 0 0 0 0 0

104 RP8G2M21 0 0 0 0 0 0

105 RP8G2M3 0 20 0 0 0 8,9

106 RP9G2M7 0 0 0 0 0 0

107 RP9G1M3 0 0 0 0 0 0

108 RP9G1M5 0 0 0 0 0 0

109 RP9G2M8* 79 73 81,1 82 75,6 93

110 RP1G1M16* 81 83 91 73 81,1 97

11 RP10G2M16* 0 52 67 56 62 67

112 RP1G1M2* 64 86 50 84 50 84

113 RP7G2M6 0 0 0 0 0 0

114 RP11G1M1 0 0 0 0 0 0

115 RP11G1M6 0 0 0 0 0 0

116 RP11G2M10 0 0 0 0 0 0

117 RP12G2M4 0 0 0 0 0 0

118 RP12G2M15 0 0 0 0 0 0

119 RP12G1M3 0 0 0 0 0 0

120 RP13G1M7 0 0 0 0 0 0

121 RP13G1M5 0 0 0 0 0 0

122 RP13G2M11 0 0 0 0 0 0

123 RP14G2M7 0 0 0 0 0 0

124 RP15G2M6 0 0 0 0 0 0

125 RP15G2M4 0 0 0 0 0 0

Anexos 107

ANEXO B: Promedio del porcentaje de inhibición de los aislamientos bacterianos

endófitos foliares frente a los seis aislados de Fusarium patogénicos evaluados

N° Aislamiento Bacteriano

F704 F58 F54 F52 F09 FB

1 EP1B1M8* 8 11 14 6 22 0

2 EP1B2M1*5 47 28 0 0 27 20

3 EP1B2M2 0 0 0 0 0 19

4 EP1B2M3 0 0 0 0 0 0

5 EP1B2M4* 42 56 28 18 42 44

6 EP1G1M15 0 0 0 0 0 12

7 EP2B1M5 0 0 0 0 0 0

8 EP2B2M4* 61 66 48 33 48 46

9 EP2B2M5 0 0 0 0 0 0

10 EP2B2M6 0 0 0 0 0 39

11 EP2B2M7* 0 18,9 0 12 27 18

12 EP2B2M8 33 0 0 0 0 27

13 EP2B2M9 0 0 0 0 0 0

14 EP2G2M10* 20 0 0 13 20 22

15 EP2G2M4 0 0 32,2 6 0 37

16 EP3B1M4* 87 59 72 56 76 78

17 EP3B2M12* 50 29 22 18 22 41

18 EP3B2M13* 0 0 27,8 0 22,2 24

19 EP3G2M4* 67 33 0 0 0 63

20 EP4B2M4 0 0 0 0 0 0

21 EP4B2M14 0 0 0 0 0 0

22 EP4B2M15 0 0 0 0 24,4 0

23 EP4B2M16* 44,4 69 48,9 48 52 83

24 EP4B2M18* 0 0 25,6 30 27,8 18

25 EP4G2M1 0 32,2 38,9 4 0 0

26 EP4G2M8 60 0 32,2 0 0 11

27 EP5B1M10 0 0 0 0 0 0

28 EP5B2M17* 26 0 15,6 11 0 0



5 Corresponde a los aislamientos que presentaron antagonismos en por lo menos cuatro de los seis hongos patogénicos

evaluados y fueron seleccionados para la extracción de ADN.

Anexos 108

Anexo B: (Continuación)


F706 F58 F54 F52 F09 FB

29 EP5B2M19 0 0 26,7 0 0 0

30 EP5B2M21* 0 15,6 40 38,9 0 24

31 EP5B2M22 0 0 0 0 30 0

32 EP5B2M7* 0 24 19 13 33 33

33 EP5G1M9* 50 13 0 17 33 8

34 EP5G1M10* 76 77 87 82 83 86

35 EP5G1M14 0 57,8 0 0 0 34

36 EP6B2M20 0 0 52 50 0 8

37 EP6B2M22 0 28 26 0 18 0

38 EP6B2M23 36,7 0 27,8 0 0 12

39 EP6B2M25 8 28 0 11 0 14

40 EP6G1M14* 0 64,4 0 0 28 0

41 EP6G2M14 6 18 0 13 28 14

42 EP7B1M6 0 0 0 0 0 0

43 EP7B2M26 0 0 0 0 22,2 0

44 EP7G2M15* 0 0 37 22 0 26

45 EP8BM6 0 0 16 0 28 47

46 EP8B2M28* 52 58 51,1 37 50 89

47 EP8G2M14 0 0 0 0 0 0

48 EP8G2M9 13 32 0 0 24 38

49 EP10G1M9* 50 22 0 0 0 0

50 EP8G1M20 0 17 0 0 0 0

51 EP8Gverde 71 80 62 69 67 89

52 EP9B1M3 0 0 0 0 0 0

53 EP9B2M9 0 0 47,8 0 0 17

54 EP9G2M18* 67 71 70 68 67 71

55 EP9G1M16* 44 19 27 34 0 33

56 EP10G2M18 0 0 0 0 22 48

57 EP10B1M13 0 0 0 0 0 0

58 EP10B2M7 0 0 16 0 13 21

59 EP10G1M7 3 16 11 27 0 0



Anexos 109



F707 F58 F54 F52 F09 FB

60 EP12B1M8 0 0 0 0 0 0

61 EP15G1M16* 66,7 11,1 38,9 0 0 44

62 EP1G1M10 0 0 0 0 0 17

63 EP2G2M16 0 0 0 0 0 0

64 EP3B2M11 0 0 0 0 0 0

65 EP3B2M10 0 0 0 0 0 0

66 EP7B2M29 0 0 13 0 28 0

67 EP8G2M17 0 0 0 0 0 0

68 EP4G2M6 0 0 0 0 0 0



Anexos 110

ANEXO C: Caracterización Morfológica de las rizobacterias antagónicas a los

aislamientos de Fusarium evaluados.

Aislamiento Bacteriano

Gram Morfología Características de colonias

Color Forma Margen Elevación Densidad

RP15B1M1 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Estriada

RP15B1M2 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Estriada

RP10B1M20 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante

RP10B2M31 + Bacilo Blanco Irregular Ondulada Estriada Brillante

RP10B2M33 + Bacilo Beige Circular Lisa Brillante Brillante

RP10B2M35 + Bacilo Blanca Circular Lisa Plana Brillante

RP1B1M9 + Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante

RP1B2M6 + Bacilo Amarillo crema

Circular Entera Convexa Brillante

RP1B2M7 + Bacilo Blanco crema

Circular Entera Plana Brillante

RP1B2M8 Bacilo Amarillo Circular Entera Convexa Brillante

RP2B1M6 + Bacilo Hialina Irregular Lobulado Plana Traslucida

RP2B1M9 - Bacilo Blanca Circular Entera Plana Opaca

RP3B1M11 + Bacilo Blanca crema

Irregular Entera Plana Brillante

RP3B2M2 + Bacilo Beige Circular concéntrica Ondulado Umbonada Opaca

RP3B1M4 + Coco Blanca Circular Lisa Umbonada Opaca

RP3B2M5 + Bacilo Amarilla Irregular Lobulado Plana Brillante

RP4B2M30 + Bacilo Blanca crema

Circular lobulada Convexa Opaca

RP6B2M14 + Bacilo Beige Circular Entera Plana Brillante

RP7B2M1 + Bacilo Blanca Circular Entera Plana Brillante

RP7B2M2 - Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante

RP7B2M3 + Bacilo Amarilla crema

Circular Entera Convexa Brillante

RP7B2M4 - Bacilo Amarilla hialina

Circular Entera Plana Brillante

RP7B2M5 - Bacilo Blanca crema

Entera Entera Plana Brillante

RP8B1M25 + Bacilo Beige Circular Entera Elevada Brillante

RP8B2M22 - Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante

RP8B2M23 + Bacilo Blanca Rizoide Ondulada Umbonada Opaca

RP8B2M26 + Bacilo Blanca Rizoide Entera Plana Opaca

RP8B2M27 + Bacilo Blanca Irregular crestada Lobulada Plana Opaca

RP9B2M3 - Bacilo Amarilla Circular Ondulado Plana Traslucida

RP9B1M26 + Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante

RP2B1M5 + Bacilo

Blanca Beige

Circular Aserrado Umbonada Brillante

RP11G1M43,1 - Bacilo Grisácea afelpada

Circular Ondulado Convexa Opaca

RP14G1M5 - Bacilo Verde Circular Entera Convexa Brillante

RP1G2M2 + Bacilo Blanca invasiva

RP1G1M15 - Bacilo Amarilla crema

Circular Aserrada Umbonada Brillante

Anexos 111

Anexo C: (Continuación)


Gram Morfología Características de colonias


RP2G2M7 + Bacilo Amarillo crema

Circular Entero Convexa Brillante

RP3G2M2 - Bacilo Grisácea Circular Entero Convexa Brillante

RP3G2M10 - Cocos Blanca Circular Entera Convexa Opaca

RP3G2M11 + Bacilo Amarilla Circular Entera Convexa Brillante

RP3G2M12 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante

RP3G2M9 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Estriada

RP4G2M3 + Bacilo Blanca Irregular estriada Lobulado Umbonada Brillante

RP5G1M11 - Bacilo Amarilla Irregular Filamentosa Umbonada Brillante

RP6G2M18 + Bacilo Blanca hialina

Circular Lisa Convexa Traslucida

RP6G2M4 - Bacilo Naranja crema

Circular Entero Umbonada Brillante

RP6G2M5 + Bacilo Beige circular Entero plana Brillante

RP6G2M8 + Bacilo Blanca Filamentosa Filamentosa Plana Traslucida

RP7G2M11 + Bacilo Blanca Rizoide Entero Convexa Opaca

RP3G2M13 + Bacilo Hialina Irregular Lobulado Plana Traslucida

RP7G2M2 + Bacilo Beige Rizoide viscosa Ondulado Umbonada Brillante

RP7G2M3 + Bacilo Beige Irregular Ondulado Plana Brillante

RP7G2M4,1 - Bacilo Verde Circular Entero Convexa Brillante

RP7G2M4 - Bacilo Blanca Irregular Lobulado Plana Brillante

RP7G2M5 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Opaca

RP7G2M30 + Bacilo Beige Circular Entero Plana Brillante

RP7G2M8 - Bacilo Verde Circular Entero Convexa Brillante

RP8G1M14 - Bacilo Blanca crema

Circular Entero Elevada Brillante

RP8G1M37 - Bacilo Blanca crema

Circular Entero Elevada Brillante

RP8G2M3 + Bacilo Beige Circular Ondulado Elevada Brillante

RP9G2M8 - Bacilo Verde Circular Lisa Convexa Brillante

RP1G1M16 - Bacilo Verde Rizoide Aserrada Elevada Brillante

RP10G2M16 - Bacilo Verde Irregular Lisa Plana Brillante

RP1G1M2 - Bacilo Blanca Irregular Lobulada Plana Brillante

Anexos 112

ANEXO D: Caracterización Morfológica de las endófitas foliares antagónicas a los

aislamientos de Fusarium evaluados


Test de

Gram Morfología

Características de colonias


EP1B1M8 + Bacilo Amarilla Circular Entera Convexa Brillante

EP1B2M1 + Bacilo Beige Circular Entera Convexa Brillante

EP1B2M2 - Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante

EP1B2M4 + Bacilo Amarillo crema Circular Entera Elevada Brillante

EP1G1M15 + Bacilo Hialina Circular Entera Elevada Brillante

EP2B2M4 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Opaca

EP2B2M6 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Opaca


EP2B2M8 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante

EP2G2M10 - Bacilo corto Blanca Circular Entera Convexa Brillante

EP2G2M4 + Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante

EP3B1M4 + Bacilos Blanca Circular Entera Convexa Brillante

EP3B2M12 + Bacilo Blanca Filamentosa Lobulada Umbeliforme Brillante

EP3B2M13 - Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Opaca

EP3G2M4 + Bacilo Amarilla Circular Entera Convexa Brillante

EP4B2M15 + Bacilo Amarillo hialino Circular Entera Convexa Brillante, traslucida

EP4B2M16 + Bacilo corto Blanca Circular Entera planoconvexa opaca

EP4B2M18 + Bacilo Blanco crema Circular Entera Pulvinada Brillante

EP4G2M1 + Bacilo corto Amarilla Circular Entera Convexa Brillante

EP4G2M8 + Bacilos largos Blanca Circular Entera Convexa Brillante

EP5B2M17 - Bacilo Crema/ Pequeña Circular Entera Convexa Brillante

EP5B2M19 + Bacilos Pequeños Amarilla hialina en los

bordes Circular Entera Convexa Traslucida

EP5B2M21 - Cocobacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante

EP5B2M22 + cocos Beige Circular Entera Convexa Brillante

EP5B2M7 - Bacilo Crema/ Pequeña Circular Entera Convexa Brillante

EP5G1M9 - Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante

EP5G1M10 + Bacilo Blanca con Beige Circular Entera Elevada Brillante

EP5G1M14 - Bacilo corto Amarilla hialina Circular Entera Convexa Brillante

EP6B2M20 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Opaca

EP6B2M22 + Bacilo Rosada Circular Entera Convexa Brillante

EP6B2M23 + Bacilo Blanca con amarillo Circular estriada

Ondulado Papilada Brillante

EP6B2M25 + Bacilo Blanca Circular Filamentosa Pulvinada Brillante

EP6G1M14 - Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante


EP7G2M15 - Bacilo corto Amarilla clara Circular Entera Convexa Brillante

Anexos 113

Anexo D: (Continuación)


Test de

Gram Morfología

Características de colonias


EP8B1M6 + Bacilo Amarilla Rizoide Filamentosa Convexa Brillante

EP8B2M28 - Bacilo Blanca Irregular Ondulado PlanoConvexa Brillante

EP8G2M9 + Bacilo Blanca Circular Entera Pulvinada Opaca

EG10M9 + Bacilo Amarilla crema Circular Filamentosa Convexa Brillante

EP8G1M20 + Cocos grandes Amarilla Circular Lobulada Umbeliforme Brillante

EP8G1M10 - Bacilo Verde Circular Entera Convexa Brillante

EP9B2M9 + Bacilo Blanco crema Irregular Entera Convexa Brillante

EP9G2M18 - Bacilo verde opaca Circular entera Convexa Brillante

EP9G1M16 - Bacilo Verdosa Irregular Entera Convexa Brillante

EP10G2M18 - Bacilos cortos Blanca Rizoide Filamentosa Convexa Opaca

EP10B2M7 + Cocos grandes Amarilla Circular Entera Elevada Brillante

EP10G1M9 - Bacilos Blanca Rizoide Filamentosa Pulvinada Opaca

EP15G1M16 - Bacilo corto Crema / Pequeña Circular Entera Convexa Brillante

EP1G1M10 + Bacilo corto Blanca Irregular Filamentosa Mamelonada Brillante

EP7B2M29 + Cocos Amarilla crema Circular Entera Convexa Brillante

Anexos 114

ANEXO E: Resultados de la caracterización bioquímica de los aislados antagonistas de las rizobacterias- mediante el sistema API 20E

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX NO2 N2

RP7B2M5 - - - - + - + - - - + - - - - - - - - - - - +

RP7G2M4 - - - - + - - - - - - + - - - - - + - + + - +

RP6G2M4 + - - + + - - - - + + - - - - - - - - - - + -

RP7B2M2 + - - - + - + - - + + - - - - - - - - - - + -

RP2B1M9 - - - - + - - - - + - - - - - - - - - - + - +

RP7G2M8 - - - - + - + - - - + + - - - - - + - + + - +

RP7G2M8,1 - - - - + - + - - - + + - - - - - + - + + - +

RP14G1M5 - - - - + - - - - - + + - - - - - + - + + + -

RP7B2M4 + - - - + - + - - - + + - - - - - - - + + - +

RP9G2M8 - - - - + - + - - - + + - - - - - + - + + - +

RP1G1M2 + - - - + - - - - + - - + - - - + - + + + + -

RP7G2M4,1 - - - - + - + - - - + + - - - - - + - + + - +

RP8B2M22 - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - -

- +

RP1G1M16 - + - - + - - - - - - - - - - - - + - - +

+ -

RP10G2M16 - + - - + - - - - - - - - - - - - + - - + - +

RP1G2M2 + - - - + - + - - + + - - - - - - - - - - + -

Anexos 115

Beta-Galactosidasa (ONPG), Arginina Deshidrolasa (ADH), Lisina Descarboxilasa (LDC),

Ornitina Descarboxilasa (ODC), Utilización del Citrato (CIT), Producción de H2S (H2S),

Ureasa (URE), Triptófano Desaminasa (TDA), Producción de Indol (IND), Producción de

acetoína (Voges-Proskauer) (VP), Gelatinasa (GEL), Fermentación/oxidación de glucosa

(GLU), Fermentación/oxidación de Manitol (MAN), Fermentación/oxidación de Inositol

(INO), Fermentación/oxidación de Sorbitol (SOR), Fermentación/oxidación de Ramnosa

(RHA), Fermentación/oxidación de Sacarosa (SAC), Fermentación/oxidación de

Melobiosa (MEL), Fermentación/oxidación de Amigdalina (AMY), Fermentación/oxidación

de Arabinosa (ARA), Citocromo oxidasa (OX).

Anexos 116

ANEXO F: Resultados de la caracterización bioquímica de los aislados antagonistas de la rizosfera – Mediante tiras API 50CHB

RP8B2M27 RP15B1M2 RP4G2M3 RP7G2M11 RP7G2M2 RP3G2M13 RP10B2M31 RP15B1M1 P2B1M5

0 + + + + + + + + +

GLY + + + + + + + + +

ERY - - - - - - - - -

DARA - - - - - - - - -

LARA + + + + + + + + +

RIB + + - + + + + + +

DXYL + + - + + + + + +

LXYL - - - - - - - - -

ADO - - - - - - - - -

MDX - - - - - - - - -

GAL - - - - - - - - -

GLU + + + + + + + + +

FRU + + + + + + + + +

MNE + + + + + + + + +

SBE - - - - - - - - -

RHA - - - - - - - - -

DUL - - - - - - - - -

INO + + + + + - + + +

MAN + + + + + - + + +

SOR + + + + + - + + +

MDM - - - - - - - - -

MDG + + - + + - + + +

NAG - - + - - - - - -

AMY + + + - + - - - -

ARB + + + + + - + + +

ESC + + + + + + + + +

Anexos 117

Anexo F: (Continuación)

RP8B2M27 RP15B1M2 RP4G2M3 RP7G2M11 RP7G2M2 RP3G2M13 RP10B2M31 RP15B1M1 P2B1M5

SAL + + + + + - + + +

CEL + + + + + - + + +

MAL + + + + + - + + +

LAC - - - + - - + + +

MEL + + - + + + + + +

SAC + + + + + - + + +

TRE + + + + + + + + +

INU + + - - + - - - -

MLZ - - + - - - - - -

RAF + + - + + - + + +

AMD + + - + + - + + +

GLYG + + - + + - + + +

XLT - - + - - - - - -

GEN - - - + - - + + +

TUR - - + - - - - - -

LYX - - - - - - - - -

TAG - - - - - - - - -

DFUC - - - - - + - - -

LFUC - - - - - - - - -

DARL - - + - - - - - -

LARL - - - - - - - - -

GNT - - - - - - - - -

2KG - - - - - - - - -

5KG - - - - - - - - -

Anexos 118

Glycerol (GLY), Eritritol (ERY), D- Arabinosa (DARA), L- Arabinosa (LARA), Ribosa (RIB), D- Xylosa (DXYL), L- Xylosa (LXYL),

Adonitol (ADO), ß-Metil-D-Xylosida (MDX), Galactosa (GAL), Glucosa (GLU), Fructosa (FRU), Manosa (MNE), Sorbosa (SBE),

Ramnosa (RHA), Dulcitol (DUL), Inositol (INO), Manitol (MAN), Sorbitol (SOR), 1-Metil-D-Manósido (MDM), 1-Metil-D-Glucósido

(MDG), N-Acetol-Glucosamina (NAG), Amygdalina (AMY), Arbutin (ARB), Esculin (ESC), Salicin (SAL), Celobiosa (CEL), Maltosa

(MAL), Lactosa (LAC), Melobiosa (MEL), Sucrosa (SAC), Trehalosa (TRE), Inulin (INU), Melecitosa (MLZ), Rafinosa (RAF), Almidon

(AMD), Glucógeno (GLYG), Xylitol (XLT), Gentiobiosa (GEN), D-turanosa (TUR), D-lyxosa (LYX), D-tagatosa (TAG), D-fucosa

(DFUC), L-fucosa (LFUC), D-arabitol (DARL), L-arabitol (LARL), Gluconato (GNT), 2-Keto-Gluconato (2KG), 5-Keto-Gluconate

(5KG).

Anexos 119

ANEXO G: Resultados de la caracterización bioquímica de los aislados antagonistas endófitos mediante tiras API 20E

Beta-Galactosidasa (ONPG), Arginina Deshidrolasa (ADH), Lisina Descarboxilasa (LDC), Ornitina Descarboxilasa (ODC), Utilización

del Citrato (CIT), Producción de H2S (H2S), Ureasa (URE), Triptófano Desaminasa (TDA), Producción de Indol (IND), Producción

de acetoína (Voges-Proskauer) (VP), Gelatinasa (GEL), Fermentación/oxidación de glucosa (GLU), Fermentación/oxidación de

Manitol (MAN), Fermentación/oxidación de Inositol (INO), Fermentación/oxidación de Sorbitol (SOR), Fermentación/oxidación de

Ramnosa (RHA), Fermentación/oxidación de Sacarosa (SAC), Fermentación/oxidación de Melobiosa (MEL),

Fermentación/oxidación de Amigdalina (AMY), Fermentación/oxidación de Arabinosa (ARA), Citocromo oxidasa (OX).

ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

EP5GM9 + + - + + - - - - + - + + - - + + + + + -

EP8B2M28 - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - -

EP6G1M14 + + - + + - - - - + - + + - - + + + + + -

EP3B2M13 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - - -

EP15G1M16 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - - -

EP10G2M18 + - - - - - - - - + - - + - - - - - - - -

EP5B2M7 - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - -

EP10G1M9 - + - - + - - - - - - - - - - - - + - - +

EP5G1M14 + - - - + - - - - + - + + + + + + + + + -

EP5B2M17 - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - -

EP2G2M10 - + - - + - - - - - - - - - - - - - - - +

EP7G2M15 - - - - + - - - - - + - - - - - - - - - -

EP8G1M10 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - + +

EP9G2M18 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - + +

EP9G1M16 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - + +

Anexos 120

ANEXO H: Resultados de la caracterización bioquímica de los aislados antagonistas endófitos – Mediante tiras API 50CHB

EP5GM10 EP2B2M7 EP4B2M16 EP1B2M1 EP1B1M8 EP1B2M4 EP3G2M4 EP2B2M14 EP4B2M18 EP3B1M4 EP5B2M21

0 + + + - + - + + - + +

GLY + + + - - - + + - + +

ERY - - - - - - - - - - -

DARA - - - - - - - - - - -

LARA + + + - + - + + + + +

RIB + + + + - + - - + + +

DXYL + + + - + - + - + + +

LXYL - - - - - - - - - - -

ADO - - - - - - - - - - -

MDX - - - - - - - - - - -

GAL - - - - + - + - + - -

GLU + + + + + + + + - + +

FRU + + + + + + + + - + +

MNE + + + + + + + + - + +

SBE - - - - - - - - - - -

RHA - - - - + - + - - - -

DUL - - - - - - - - - - -

INO + - + - - - - + - + +

MAN + - + - + - + + - + +

SOR + - + - - - - + - + +

MDM - - - - - - - - - - -

MDG + - + - - - - - - + +

NAG - - - + + + + + - - -

AMY - - + - + - - + - - -

Anexos 121

Anexo H: (Continuación)


ARB + - + + + + - + - + +

ESC + + + + + + + + - + +

SAL + - + + + + - + - + +

CEL + - + - + - - + - + +

MAL + - + + + + + + - + +

LAC + - - - - - - - - + +

MEL + + + - - - - - - + +

SAC + - + + + - + + - + +

TRE + + + + + + + + - + +

INU - - + - - - - - - - -

MLZ - - - - + - + + - - -

RAF + - + - - - + - - + +

AMD + - + + - + - - - + +

GLYG + - + + - + - - - + +

XLT - - - - - - - + - - -

GEN + - - - - - - - - + +

TUR - - - - + - + + - - -

LYX - - - - - - - - - - -

TAG - - - - - - - - - - -

DFUC - + - - - - - - + - -

LFUC - - - - - - - - - - -

DARL - - - - - - - + - - -

LARL - - - - - - - - - - -

Anexos 122

Anexo H: (Continuación)


GNT - - - - - - - - - - -

2KG - - - - - - - - - - -

5KG - - - - - - - - - - -

Glycerol (GLY), Eritritol (ERY), D- Arabinosa (DARA), L- Arabinosa (LARA), Ribosa (RIB), D- Xylosa (DXYL), L- Xylosa (LXYL),

Adonitol (ADO), ß-Metil-D-Xylosida (MDX), Galactosa (GAL), Glucosa (GLU), Fructosa (FRU), Manosa (MNE), Sorbosa (SBE),

Ramnosa (RHA), Dulcitol (DUL), Inositol (INO), Manitol (MAN), Sorbitol (SOR), 1-Metil-D-Manósido (MDM), 1-Metil-D-Glucósido

(MDG), N-Acetol-Glucosamina (NAG), Amygdalina (AMY), Arbutin (ARB), Esculin (ESC), Salicin (SAL), Celobiosa (CEL), Maltosa

(MAL), Lactosa (LAC), Melobiosa (MEL), Sucrosa (SAC), Trehalosa (TRE), Inulin (INU), Melecitosa (MLZ), Rafinosa (RAF), Almidon

(AMD), Glucógeno (GLYG), Xylitol (XLT), Gentiobiosa (GEN), D-turanosa (TUR), D-lyxosa (LYX), D-tagatosa (TAG), D-fucosa

(DFUC), L-fucosa (LFUC), D-arabitol (DARL), L-arabitol (LARL), Gluconato (GNT), 2-Keto-Gluconato (2KG), 5-Keto-Gluconate

(5KG).

caracterizaciÓn de bacterias antagÓnicas a fusarium …

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