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INTRODUO

CARACTERIZAO MOLECULAR DO PAPILLOMAVRUS HUMANO E SUA PERSISTNCIA ENTRE MULHERES GESTANTES HIV+ NO

RIO DE JANEIRO, BRASIL2 2 1,2 1,2 2 1Siqueira Juliana D(ME) , Meyrelles ARI , Almeida GL , Seuanez HN , Soares MA , Machado ES , Soares Esmeralda A

1-Instituto Nacional de Cncer Jos Alencar Gomes da Silva, Rio de Janeiro, Brasil; 2-Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil

1

A infeco por HIV um fator de risco para a persistncia do HPV e o desenvolvimento de cncer de colo de tero. Este cncer o terceiro tipo mais incidente em mulheres no Brasil, e o segundo no mundo, sendo responsvel pelo bito de aproximadamente 230 mil mulheres por ano. Ao mesmo tempo, um cncer com grande potencial de preveno e cura quando diagnosticado precocemente. O cncer do colo do tero se desenvolve a partir de leses cervicais pr-invasivas, que atualmente so divididas em diferentes categorias citolgicas: leso intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL), leso intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL) e cncer invasivo (Figura 1).

Figura 1. Progresso de uma leso benigna do colo do tero para o cncer cervical invasivo. A evoluo o resultado dos efeitos combinados de genes do HPV, particularmente aqueles que codificam as protenas E6 e E7, que so as duas oncoprotenas virais; a integrao do DNA viral no DNA do hospedeiro; e uma srie de mudanas genticas e epigenticas nos genes celulares. HSIL, leso escamosa intraepitelial de alto grau; LSIL, leso escamosa intraepitelial de baixo grau (modificado de Lowy & Schiller, 2006).

RESULTADOS

Dentre as 91 amostras analisadas, os tipos de HPV encontrados so do gnero alfa e esto divididos entre as espcies 1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11. O gentipo homozigoto para arginina foi encontrado em 44% dos pacientes, o homozigoto para prolina em 22% e o heterozigoto prolina/arginina em 34%. A citologia da amostra ps-parto de 52% dos pacientes foi coletada at o momento, e 3 pacientes progrediram para leso intraepitelial escamosa de alto grau, todos com HPV de alto risco. No entanto os resultados moleculares para persistncia ainda esto em andamento.

OBJETIVOSCaracterizar a prevalncia da infeco pelo HPV, os tipos infectantes, a ocorrncia de mltiplas infeces, a persistncia da infeco e a prevalncia dos diferentes polimorfismos da p53 em uma coorte de gestantes HIV+ com diversos perfis citolgicos.

Os papillomavrus podem infectar diferentes vertebrados, e apresentam uma classificao filogentica bastante complexa. Em humanos so descritos 5 gneros (alfa, beta, gama, mu e nu). Os gneros so subdivididos em espcies, totalizando 28. As espcies por sua vez so classificadas em 132 tipos diferentes at o presente. Os tipos so divididos em alto risco e baixo risco para cncer e alguns com risco indeterminado. A maioria das infeces pelo HPV pode ser resolvida pelo sistema imune competente, e a persistncia determinada pela deteco do vrus por pelo menos um ano. Fatores virolgicos e do hospedeiro que esto envolvidos na persistncia ainda no esto elucidados.O HPV possui duas oncoproteas (E6 e E7) que so capazes de interagir com protenas que regulam o ciclo celular e que atuam como supressoras de tumores, como a p53 e pRb. Essa interao provoca a degradao e inativao das protenas celulares, o que levaria transformao e imortalizao celular, e posteriormente formao de neoplasias. O polimorfismo no cdon 72 da p53 pode codificar uma arginina ou uma prolina; quando codifica uma arginina a protena apresenta uma velocidade de degradao maior em presena da protena E6 do HPV 16 ou 18, e tem sido demonstrado que tambm confere maior risco na formao de tumores cervicais do que a p53 que possui uma prolina.Estudos sugerem que a freqncia de co-infeco e da persistncia do HPV aumentam ainda mais durante a gravidez, mas so escassos dados moleculares detalhados sobre as variantes de HPV envolvidas, especialmente nos pases em desenvolvimento como o Brasil.

METODOLOGIACento e dezenove gestantes HIV+ acompanhadas na clnica pr-natal da UFRJ, que no sabiam se eram HPV+ por testes moleculares, tiveram uma amostra cervical coletada no 2 trimestre de gravidez e outra seis meses aps o parto. O DNA viral foi extrado e usado para determinar a seqncia de nucleotdeos parcial do gene codificante do capsdeo viral (L1), usando iniciadores degenerados, gerando um fragmento de 450 pb. O cdon 72 da p53 foi amplificado e seqenciado com iniciadores especficos para o xon 4, gerando um fragmento de 450 pb. Os vrus foram classificados por filogenia utilizando referncias dos tipos encontrados selecionadas do banco de dados do PAVE (http://pave.niaid.nih.gov/index.html). As anlises foram feitas no programa MEGA5, usando neighbor-joining e Kimura 2-parmetros. Vrus com eletroferogramas apresentando ambigidade de bases foram clonados. Um questionrio detalhado com histrico clnico e laboratorial foi preenchido para cada paciente.

CONCLUSOUma alta diversidade gentica do HPV foi encontrada em gestantes HIV+, destacando o papel da imunossupresso causada pela infeco pelo HIV e pela gravidez na infeco pelo HPV. O HPV tipo 18 foi apenas o oitavo tipo mais prevalente, uma descoberta importante com implicaes para o uso da vacina disponvel atualmente. A ocorrncia de infeco por mltiplos tipos de HPV tambm primordial nesta coorte. Foi observado que mulheres infectadas pelo HIV e HPV podem ser portadoras de subtipos oncognicos, mesmo quando os esfregaos citolgicos mostram normalidade citolgica. Mais estudos so necessrios para avaliar os resultados clnicos das infeces por HPV neste cenrio.

Total de pacientes 119

Mdia de idade (anos) 27 (14-44)

Nmero de parceiro sexuais na vida

1 a 3 30%

4 ou mais 68%

Profissionais do sexo 1%

Sem informao 1%

Tabagismo

Fuma ou j fumou 42%

Nunca fumou 58%

Nmero de gestaes

1 ou 2 36%

3 ou 4 41%

5 ou mais 23%

Uso de anticoncepcional

Sim 50%

Idade da primeira relao sexual

< 16 75%

DSTs

Herpes 5%

Sfilis 18%

Tabela 1. Fatores de risco para HPV e cncer das pacientes do estudo

119Pacientes do estudo

1a Coleta (2 trimestre da gestao)

103PCR HPV Positivo

16PCR HPV Negativo

91Seqenciados e/ou

clonados

12Analise no finalizada

75Monoinfectados

16Multiploinfectados

Citologia65 Normal

6 Ascus27 Lsil (sugestivo de HPV)4 Hsil (sugestivo de HPV)

1 Sem informao

Citologia14 Normal

1 Ascus1 Lsil (sugestivo de HPV)

Figura 2. Prevalncia do HPV e citologia na 1a Coleta (2 trimestre da gestao).

Citologia Potencial oncognicoPolimorfismo do codon 72 - p53

#

Pro/Pro Pro/Arg Arg/Arg

Normal(47)

Alto risco (30)HPV16(4), HPV33(2), HPV56(1), HPV73(1)

HPV16(6), HPV18(1), HPV33(1), HPV35(1), HPV58(2)

HPV16(7), HPV18(1), HPV45(1), HPV58(2)

Baixo risco(4) 0 HPV61(1), HPV70(1) HPV81(2)

Risco indeterminado (13)

HPV53(1), HPV62(1), HPV69(1), HPV85(1)

HPV53(2), HPV62(2), HPV83(1)

HPV62(1), HPV66(1), HPV83(2)

Ascus (5)

Alto risco (2) 0 HPV82(1) HPV31(1)

Baixo risco 0 0 0

Risco indeterminado (3)

0 0HPV53(1), HPV83(1), HPV32(1)

Lsil (17)

Alto risco (9) HPV35(1)HPV16(3), HPV45(1), HPV58(1)

HPV16(2), HPV58(1)

Baixo risco (4) 0 HPV11(1), HPV81(1) HPV6(1), HPV81(1)

Risco indeterminado(4)

0 HPV66(1), HPV69(1) HPV53(1), HPV84(1)

Hsil (4)

Alto risco (4) HPV73(1) HPV16 (1) HPV16 (1) HPV35 (1)

Baixo risco 0 0 0

Risco indeterminado 0 0 0

Total 14 29 30

* Duas amostras no possuem dados de p53 ou citologia, mas possuem HPV16# Pro/ Pro - homozigoto prolina; Arg/Arg - Homozigoto para arginina; Pro/Arg - heterozigoto Prolina/Arginina

Amostra Tipos de HPV* Citologia P53#

RJ08-001 HPV31, HPV56 LSIL A/A

RJ08-004 HPV58, HPV61, HPV62 Normal A/P

RJ09-011 HPV82, HPV84 LSIL P/P

RJ08-018 HPV53, HPV83 Normal A/A

RJ09-030 HPV6, HPV83 Normal A/P

RJ09-040 HPV16, HPV35, HPV55, HPV58 Normal A/P

RJ10-057 HPV16, HPV53, HPV81 Normal A/P

RJ09-069 HPV45, HPV58, HPV81 Normal P/P

RJ10-071 HPV32, HPV62 Normal A/A

RJ10-080 HPV16, HPV35, HPV44, HPV58 Normal A/P

RJ10-087 HPV55, HPV56 LSIL P/P

RJ10-088 HPV42, HPV52, HPV68 LSIL P/P

RJ10-089 HPV53, HPV55, HPV58 LSIL A/A

RJ10-093 HPV16, HPV35 LSIL A/A

RJ10-098 HPV16, HPV52 LSIL A/P

RJ10-114 HPV11, HPV16, HPV66 LSIL A/P*Em vermelho os tipos de HPV de alto risco#P/P - homozigoto prolina; A/A- Homozigoto para arginina; P/A - heterozigoto Prolina/Arginina

Tabela 2. Prevalncia dos gentipos de HPV e a associao com a citologia cervical e o polimorfismo do cdon 72 da p53 dentre as 73 pacientes monoinfectadas*

Tabela 3. Prevalncia dos gentipos de HPV e a associao com a citologia cervical e o polimorfismo do cdon 72 da p53 dentre as amostras multiploinfectadas

Figura 3. Grfico da prevalncia dos tipos de HPV em monoinfectados.

Figura 4. Grfico de prevalncia dos tipos de HPV em multiplos infectados.

HPV1635%

HPV588%

HPV334%

HPV354%

HPV183%

HPV453%

HPV733%

HPV821%

HPV561%

HPV311%

HPV537%

HPV626%

HPV816%

HPV836%

HPV663%

HPV693%

HPV61%

HPV111%

HPV321%

HPV611%

HPV701%

HPV841%

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