Pôle Viandes Fraîches et Produits Transformés Juin 2008

Caractérisation par sérotypage et pulsotypage des souches de Salmonella isolées dans le secteur abattage-découpe porc

Carole FEURER, Gwénaël PIAUDEL

3

Sommaire

Sommaire ................................................................................................................... 3

Lexique....................................................................................................................... 4

Résumé ...................................................................................................................... 5

Introduction................................................................................................................. 6

Matériel et Méthodes .................................................................................................. 7

Isolats et commémoratifs ........................................................................................ 7

Sérotypage.............................................................................................................. 7

Pulsotypage ............................................................................................................ 7

Antibiorésistance..................................................................................................... 8

Traitement statistique des données ........................................................................ 8

Résultats................................................................................................................... 10

Isolats et commémoratifs ...................................................................................... 10

Sérotypage............................................................................................................ 10

Pulsotypage .......................................................................................................... 12

Antibiorésistance................................................................................................... 17

Conclusions et Perspectives..................................................................................... 19

Bibliographie............................................................................................................. 21

4

Lexique

AFSSA Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments

CNR Centre National de Référence

PCR Polymerase chain reaction – Réaction d’amplification en chaîne

PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis – Electrophorèse en Champ Pulsé

TIAC Toxi-infection alimentaire collective

TSAYE Trypton Soja Agar plus Yeast Extract

Antibiotiques AM Ampicilline

AMC Amoxicilline + acide clavulanique

C Chloramphénicol

CAZ Ceftazidime

CF Céfalotine

CS Colistine

CTX Céfotaxime

ENR Enrofloxacine

GM Gentamicine

K Kanamycine

NA Acide nalidixique

OFX Ofloxacine

S Streptomycine

SSS Sulfamides

SXT Sulfaméthoxazole-triméthoprime

TE Tétracycline

5

Résumé

L’objectif de ce projet est d’enrichir en souches de Salmonella une base de données filière

mise en place lors d’une précédente étude financée par l’OFIVAL.

Un total de 200 souches ont été analysées lors de cette étude. Elles proviennent de deux

entreprises partenaires du projet et sont issues des maillons abattage/découpe et

transformation. Deux techniques de typage ont été utilisées : le sérotypage et le

pulsotypage. En effet, le sérotype et le pulsotype ont été définis lors de la précédente étude

comme informations essentielles à obtenir pour toute souche intégrant la base de données.

Un antibiogramme a également été réalisé sur certaines souches de sérotype Typhimurium

présentant un pulsotype pouvant être associé à des souches DT104 chez lesquelles ont

retrouve communément de nombreuses résistances aux antibiotiques.

Les résultats obtenus montrent une forte prévalence de deux sérotypes (Derby et

Typhimurium), avec au sein de ces 2 sérotypes une prédominance importante de deux

pulsotypes (Ty01 et Der03), représentant à eux seuls plus de la moitié des isolats collectés

lors de cette étude. Les sérotypes obtenus pendant ce travail sont au nombre de 12, avec

une plus grande diversité obtenue dans l’entreprise de transformation, résultats en accord

avec ceux obtenus dans des études similaires et confirmés par ceux du pulsotypage (46

pulsotypes identifiés dont 39 pour l’entreprise de transformation et seulement 12 pulsotypes

identifiés pour l’entreprise d’abattage-découpe).

La très forte prévalence du pulsotype Ty-01 (28%) montre, dans ce cas particulier,

l’importance et l’utilité d’une base de données. Ce pulsotype est en effet régulièrement

associé aux souches de type DT104. Ces dernières sont impliquées dans de nombreux cas

humains de salmonellose, avec de surcroît une tendance à présenter de nombreuses

antibiorésistances, tendance qui semble être à la hausse depuis quelques années. Le suivi

de ce type de souches est donc d’un grand intérêt au sein de la filière porcine, de part son

impact avéré en santé humaine, mais nécessite l’emploi de méthodes d’analyse plus fines

que la seule sérotypie.

Les analyses concernant l’antibiorésistance de souches pouvant être assimilées au type

DT104 montrent qu’aucune des souches étudiées n’était sensible à tous les antibiotiques

testés, la plupart présentant même plusieurs résistances (jusqu’à sept résistances pour deux

souches). Cependant l’échantillonnage testé pour l’antibiorésistance ne permet pas de tirer

de conclusions compte-tenu du faible nombre de souches étudié (20).

Afin de mieux utiliser cette base de données Salmonella et pouvoir tirer des conclusions

utilisables pour les acteurs de la filière, il est nécessaire de continuer à incrémenter le

souchier (300 souches prévues sur l’année 2008) et si possible de pérenniser l’apport de

souches dans l’avenir. L’utilisation d’une telle base n’a en effet d’intérêt que si elle est

régulièrement alimentée par l’ensemble de la filière afin de pouvoir jouer son rôle

d’observatoire et donc de gestion du risque Salmonella.

6

Introduction

Salmonella représente à l’heure actuelle une des principales causes de toxi-infections

alimentaires d’origine bactérienne en France et dans le monde. Leur présence dans les

matières premières est critique compte-tenu des exigences réglementaires nationales ou

communautaires en vigueur. Le contexte réglementaire actuel vise à réduire la

séroprévalence de Salmonella dans la filière porcine et par conséquent le risque pour le

consommateur par la mise en place de programmes de contrôles nationaux à partir de 2009

(directive 2003/99/CE et règlement 2160/2003 du 17 novembre 2003). La création d’une

base de données Salmonella recouvrant spécifiquement les différents maillons de la filière

porc s’inscrit donc dans ce cadre en offrant à terme un outil permettant d’aider à remplir ces

objectifs.

Au niveau européen, différentes bases de données ont été constituées pour réaliser la

surveillance de plusieurs bactéries pathogènes (Listeria avec le réseau Listernet, Salmonella

avec les réseaux Salmgene et Enternet, Campylobacter avec le réseau Campynet). Des

collaborations entre l’Ifip et les laboratoires responsables de ces bases de données sont

menées depuis plusieurs années pour Listeria et Salmonella ce qui a permis d’obtenir de

nombreuses données de pulsotypage pour Listeria ainsi que pour Salmonella mais dans une

moindre mesure .

Dans le cadre de ce projet, l’objectif était d’alimenter la base de données existante en

souches de Salmonella isolées dans les différents maillons de la filière à partir

d’autocontrôles réglementaires ou volontaires. Une analyse de ces souches par des

méthodes fines (sérotypage et pulsotypage) a ensuite été réalisée.

La compilation des résultats devrait permettre de mieux comprendre la transmission de

Salmonella de l’élevage jusqu’au produit fini, ainsi que d’établir les liens ou les spécificités

des souches tout au long de la filière, dans le but de déterminer les meilleures pratiques qui

pourront permettre la maîtrise du danger Salmonella dans l’ensemble de la filière porc.

Le projet consistait à :

-identifier et démarcher les entreprises partenaires pouvant fournir des souches de

Salmonella issus de leurs autocontrôles.

-déterminer le pulsotype et le sérotype de ces souches ainsi que le profil

d’antibiorésistance pour certaines souches d’intérêt.

L’obtention de ces données nous a permis d’obtenir un premier aperçu de la diversité des

souches de Salmonella au sein de la filière ainsi que de leur transmission du maillon

abattage/découpe au maillon transformation.

7

Matériel et Méthodes

Isolats et commémoratifs

Pour permettre la création d’un souchier Salmonelle, des entreprises correspondant aux

différents maillons de la filière porc ont été contactées afin de pouvoir collecter sur la base

du volontariat des isolats provenant de leurs procédures d’autocontrôles volontaires ou

réglementaires. Deux entreprises ont été sollicitées et ont répondu positivement à cette

requête, un abattoir industriel (entreprise E1) et une entreprise de transformation (E2).

Un commémoratif complet pour chaque échantillon expédié était demandé, de manière à

disposer de l’information la plus complète concernant les isolats à intégrer dans la base de

données (date et lieu de prélèvement, origine et stade du prélèvement).

Les souches collectées ont ensuite été isolées sur gélose Hektoen pour vérifier leur pureté.

A partir de colonies isolées, les isolats ont été mis en gélose de conservation en vue de leur

analyse par sérotypage et pulsotypage.

Sérotypage

Pour chaque souche, le sérotypage a été effectué au laboratoire LERQAP de l’Afssa de

façon anonyme. La détermination antigénique a été réalisée selon le schéma de Kauffmann-

White (2001 8ème édition).

Pulsotypage

Le pulsotypage a été réalisé au laboratoire de microbiologie de l’IFIP de Maisons-Alfort en

utilisant l’enzyme de restriction XbaI qui offre une bonne discrimination entre les souches de

Salmonella. L’extraction, la digestion et la migration de l’ADN des souches ont été réalisées

selon le protocole élaboré par le CDC (Center of Disease Control) d’Atlanta.

Une culture sur gélose TSAYE de 24 heures est inondée de tampon CSB (Tris-Hcl 100mM,

EDTA 100mM), puis la densité optique (DO) de la suspension obtenue est mesurée avant

d’être ajustée à une unité de DO. Un volume de 240µl de la suspension ajustée est prélevé

puis mélangé à de l’agarose (1% au final) en surfusion contenant du SDS et de la protéinase

K, puis disposé dans un moule de manière à obtenir des mini blocs d’agarose. Une lyse

cellulaire est ensuite effectuée pendant 2 heures à 52°C dans un tampon de lyse (Tris

0,05M, EDTA 0,05M, N-lauryol sarcosine 1%, Protéinase K 0,156g/ml). Une fois l’incubation

réalisée, les blocs d’agarose sont lavés avec du tampon TE (Tris-Hcl 10mM, EDTA 1mM) à 6

reprises, puis conservés à 4°C dans du tampon TE jusqu’à utilisation.

8

La digestion de l’ADN chromosomique est réalisée au moyen de l’enzyme de restriction XbaI

pendant 4 heures à 37°C dans le tampon optimal de l’enzyme.

Une fois la digestion effectuée les blocs d’agarose sont transférés dans un gel d’agarose à

1% TBE 0,5X (Agarose Seablock), puis la migration est réalisée dans les conditions

suivantes (Bloc 1 : 2 s–64 s, 20h, 6 V/cm, 120°) au moyen d’un appareil CHEF DR® III de

Biorad. A la fin de la migration, le gel est coloré au moyen d’une solution de bromure

d’éthidium (BET) avant d’être révélé sous UV.

Les profils obtenus sont numérisés avant d’être analysés et comparés au moyen du logiciel

Molecular Analyst de Biorad, en utilisant le profil de la souche S.enterica sérotype

Brandeburg H4229 comme référence externe (nécessaire pour la comparaison de gels

indépendants). Les données seront progressivement analysées avec le logiciel Bionumerics

(Applied Maths) dont l’acquisition fonctionnelle est en cours.

Antibiorésistance

La détermination de l’antibiorésistance a été réalisée à l’Afssa de manière anonyme. La

recherche d’antibiorésistances a porté sur 16 antibiotiques parmi les plus courants (Tableau I) et interprétée selon les recommandations du Comité Antibiotiques de la Société Française

de Microbiologie. Cette recherche de résistance a porté spécifiquement sur les souches de

sérotype Typhimurium, du fait de l’implication clinique de ces souches, ainsi que de la forte

prévalence de multirésistances chez celles-ci.

Traitement statistique des données

Afin de valider ou d’infirmer le fait que les résultats obtenus (sérotypes, pulsotypes) étaient

ou non corrélés à certains paramètres (entreprise d’origine, type de matrice d’origine), des

hypothèses d’indépendance ont été testées à l’aide du test d’indépendance du khi2 (χ²). Le

principe est de calculer l’écart entre la distribution obtenue et une distribution théorique que

l’on obtiendrait si les deux variables étaient totalement indépendantes. Cet écart permet

d’accepter ou de rejeter l’hypothèse d’indépendance H0 (données indépendantes).

Les résultats de cette étude étant de nature qualitative et l’échantillonnage suffisant (> 50), il

est donc possible de vérifier si la distribution des types identifiés est liée ou non au

paramètre pris en considération. Dans ce rapport, l’hypothèse de départ (indépendance des

données entre elles) est acceptée ou refusée au seuil de 5%.

9

Tableau I : Récapitulatif des antibiotiques utilisés dans cette étude, les doses testées et les

diamètres critiques utilisés pour l’interprétation.

Famille d’antibiotique Panel I (charge, diamètres critiques selon le CA-SFM*, mm)

PÉNICILLINES AM : Ampicilline (10 µg, 14-19)

AMC: Amoxicilline + acide clavulanique (20 µg + 10 µg, 14-21)

CEPHALOSPORINES CF : Céfalotine (30 µg, 12-18)

CTX : Céfotaxime (30 µg, 15-21)

CAZ : Ceftazidime (30 µg, 15-21)

AMINOSIDES S : Streptomycine (10 UI, 13-15)

GM : Gentamicine (10 UI, 14-16)

K : Kanamycine (30 UI, 15-17)

PHENICOLES C : Chloramphénicol (30 µg, 19-23)

TETRACYCLINES TE : Tétracycline (30 UI, 17-19)

SULFAMIDES-

TRIMETHOPRIMES

SXT : Sulfaméthoxazole-triméthoprime (23.75 µ+1.25 µg, 10-16)

SSS : Sulfamides (200 µg, 12-17) ouSSS250 : Sulfonamides (300 µg, 12-17)

QUINOLONES NA : Acide nalidixique (30 µg, 15-20)

OFX : Ofloxacine (5 µg, 16-22)

ENR : Enrofloxacine (5 µg, 17-22)

POLYPEPTIDES CS : Colistine (50 µg, 15)

: Critères du CA-SFM, 2007 sauf pour l’enrofloxacine (Bayer).

10

Résultats

Isolats et commémoratifs

Lors de cette étude, 200 isolats de Salmonella ont été collectés. Parmi ces isolats, 88

provenaient de l’entreprise E1 (abattage découpe) et 112 de l’entreprise E2 (transformation).

Les origines de prélèvement étaient diverses : environnement (2), animaux (13), abats (10),

matières premières (épaule, poitrine, onglets, longe, panne … ; 104), produits partiellement

transformés (hachés, découpés-désossés … ; 26) ou transformés (saucisses, saucisson,

merguez, jambon cuit, jambon sec… ; 45). Le panel de produits couvert dans cette étude est

donc relativement important. Cependant, certaines catégories de prélèvements sont très peu

représentées ce qui montre la nécessité d’implémenter la base en souches issues de ces

catégories afin de tirer des conclusions plus pertinentes.

Sérotypage

Le sérotypage des différents isolats collectés a été réalisé par l’unité de Caractérisation et

Epidémiologie Bactérienne (CEB) de l’Afssa LERQAP de Maisons-Alfort. Dans le cadre de

notre étude, nous n’avons pas pu obtenir de résultats de sérotypage pour 7 isolats par les

méthodes de référence. Quatre souches n’étaient pas agglutinables et 3 présentaient un

sérotype dit incomplet dans le schéma de Kauffmann-White (SI 21:i ; SI 1,3,19:- ; SI 4,12:-

:1,2). Les résultats de sérotypage des isolats collectés lors de ce travail ont été intégrés dans

le cadre du réseau Salmonella auquel l’IFIP collabore depuis plusieurs années. Ce réseau

recense les prévalences des sérotypes de Salmonella présents dans les différentes filières

alimentaires en France. La surveillance réalisée les années passées montre une très faible

représentation de souches issues de la filière porcine, en particulier par rapport aux souches

d’origine aviaire, d’où un intérêt supplémentaire de la constitution d’une base de données

filière.

Les résultats obtenus pour l’ensemble des isolats collectés lors de cette étude sont

présentés dans le diagramme figure 1. Les figures 2 et 3 présentent respectivement la

diversité des sérotypes obtenue dans les entreprises E1 et E2.

Sur l’ensemble de l’étude, le sérotypage a mis en évidence 12 sérotypes différents. Les

principaux sérotypes retrouvés dans le panel de souches étudié sont le sérotype Derby

(44%) et le sérotype Typhimurium (39%), les autres sérotypes se partageant les 17%

restants, avec en troisième place Infantis (3%), puis Rissen et Kedougou (2%), London

11

(1,5%), Brandeburg, Anatum et Bredeney (1%), puis des sérotypes plus rares (Ohio,

Kapemba, Panama).

Une plus grande variété des sérotypes est observée dans le cas de l’entreprise E2

comparée à l’entreprise E1 (10 contre 6). Dans les deux entreprises, on retrouve la

prépondérance importante des sérotypes Derby et Typhimurium, avec 47,7% de souches de

sérotype Derby et 40,9% de souches de sérotype Typhimurium dans l’entreprise E1 pour

42% et 37,5% respectivement pour l’entreprise E2.

L’ensemble de ces chiffres correspond à ceux obtenus dans le cadre d’études similaires

réalisées précédemment (FARM 2006 Afssa), en particulier concernant la forte

prédominance des deux sérotypes Derby et Thyphimurium. La proportion de souches de

sérotype Infantis identifiée dans cette étude est également cohérente avec les données

récentes existantes dans la filière, c'est-à-dire une baisse importante de la prévalence de ce

sérotype par rapport aux années précédentes.

Brandeburg

Anatum

Bredeney

London

Kedougou

Rissen

Infantis

Typhimurium

Derby

SI 1,3,19:-

SI 4,12:-:1,2

Ohio SI 21:iKapemba

Panama

Figure 1 : Résultats du sérotypage sur l’ensemble des souches agglutinables.

12

Derby

Ohio

Typhimurium

Non sérotypable

Brandenburg

Kedougou

Derby

Typhimurium

Rissen

LondonPanama

Kapemba

Bredeney

BrandeburgAnatumNon

sérotypables

Infantis

Figure 2 : Résultats du sérotypage pour

l’entreprise E1 Figure 3 : Résultats du sérotypage pour

l’entreprise E2

Pulsotypage

Le pulsotypage des isolats de Salmonella avec l’enzyme XbaI, a permis une bonne

discrimination entre les souches de même sérotype. Un nombre faible d’isolats (4) n’a

cependant pas pu être typé par cette méthode, le plus souvent s’agissant de sérotypes rares

et peu représentés lors de cette étude (Panama, Kapemba, Ohio).

La Figure 4 résume les résultats obtenus pour l’ensemble des isolats reçus et analysés. Les

résultats du pulsotypage sont en accord avec les résultats du sérotypage, la quasi majorité

des pulsotypes pouvant facilement être classés dans les sérotypes précédemment obtenus

(voir Figure 5). Seule une souche identifiée comme Brandenburg par sérotypage n’a pu être

regroupée par la méthode du pulsotypage avec les autres souches Brandenburg. Un

deuxième sérotypage de cette souche sera réalisé afin de vérifier qu’il n’y ait pas eu d’erreur

lors du traitement de l’échantillon.

La méthode de pulsotypage se montre cependant beaucoup plus discriminante que le

sérotypage, puisque 46 pulsotypes ont été identifiés contre 12 pour la sérotypie. En

particulier, 18, 13, 2, 2, 2, 2, 2 et 2 pulsotypes différents ont été identifiés au sein des

sérotypes Derby, Typhimurium, Anatum, Bredeney, Brandenburg, Rissen, London et Infantis

respectivement. Un seul pulsotype a été identifié parmi les 4 souches de sérotype Kedougou

du panel.

Une autre information apportée par le dendrogramme obtenu dans cette étude révèle la forte

clonalité des isolats. En effet, on peut constater que les profils obtenus par exemple pour les

pulsotypes Der-04, , Der-06, et Der-16 sont très proches de celui obtenu pour le pulsotype

Der-03, révélant une parenté génétique importante (supérieure à 80%) donc peu de

mutations séparant un pulsotype d’un autre.

13

Der22

Inf05

Ty01

Ty12

Ty13

Ty14

Der03

Ty05

Ty15

Ty11

Ty07

Ty10

Ana01

Ana02 Bra04

Bra03Bre03

Der01

Bre05Ty16

Ty18

Ty19

Ty20

Der04

Der06

Der07

Der12Der09

Der16Der14

Der17Der18

Der19

Der20Sal02

Sal01

Ri02Ri01

Lon02 Ko03Lon01 Inf01

Der23

Der25

Der24

Der21

Figure 4 : Résultats du pulsotypage sur l’ensemble des isolats de cette étude.

De plus, l’utilisation du pulsotypage a permis d’obtenir une information concernant les isolats

qui s’étaient révélés non agglutinables, donc non sérotypables, la réciproque étant

également vérifiable, dans le sens où les 4 souches non pulsotypables ont toutes été

sérotypées avec succès. Concernant les souches non agglutinables ou présentant un

sérotype incomplet, 5 d’entre-elles ont pu être classées dans le groupe Typhimurium au sein

du dendrogramme (voir Figure 5), donc sont vraisemblablement des souches de sérotype

Typhimurium. Les deux autres souches non sérotypables dénommées Sal-01 et Sal-02 n’ont

pu être associées à un sérotype par homologie de profil , même si le profil Sal-01 présente

une homologie de près de 80% avec les souches du groupe Typhimurium. Les informations

obtenues démontrent tout l’intérêt de coupler le sérotypage et le pulsotypage de

14

Figure 5 : Dendrogramme récapitulatif des pulsotypes répertoriés dans la base de données. En gras

sont indiqués les pulsotypes des souches identifiées lors de cette étude.

Typhim19Typhim05Typhim20Typhim08Typhim14Typhim10Typhim13Typhim12Typhim01Typhim02Typhim03Typhim09Typhim21Typhim16Typhim11Typhim07Typhim04Typhim06Typhim17Typhim18Typhim15Sal-01Brandenbg04Rissen01Rissen02Bredeney04Bredeney01Bredeney03Bredeney02Bredeney05Kedougou01Kedougou02Kedougou03Sal-02Anatum01Anatum02Branderup01Infantis04Infantis02Infantis03Infantis01Infantis05Livingst01Cerro01Brandenbg03Brandenbg01Brandenbg02Derby09Derby23Derby18Derby07Derby20Derby24Derby22Derby13Derby19Derby04Derby03Derby05Derby06Derby10Derby16Derby08Derby25Derby01Derby12Derby14Derby21Derby11Derby17Derby02Derby15Duisburg01London02London01

100908070605040

Pourcentage de similarité PulsotypeProfil de restriction par XbaI

Derby

Typhimurium

Bredeney

Rissen

Brandenburg

Infantis

Kedougou

Anatum

London

Typhim19Typhim05Typhim20Typhim08Typhim14Typhim10Typhim13Typhim12Typhim01Typhim02Typhim03Typhim09Typhim21Typhim16Typhim11Typhim07Typhim04Typhim06Typhim17Typhim18Typhim15Sal-01Brandenbg04Rissen01Rissen02Bredeney04Bredeney01Bredeney03Bredeney02Bredeney05Kedougou01Kedougou02Kedougou03Sal-02Anatum01Anatum02Branderup01Infantis04Infantis02Infantis03Infantis01Infantis05Livingst01Cerro01Brandenbg03Brandenbg01Brandenbg02Derby09Derby23Derby18Derby07Derby20Derby24Derby22Derby13Derby19Derby04Derby03Derby05Derby06Derby10Derby16Derby08Derby25Derby01Derby12Derby14Derby21Derby11Derby17Derby02Derby15Duisburg01London02London01

Typhim19Typhim05Typhim20Typhim08Typhim14Typhim10Typhim13Typhim12Typhim01Typhim02Typhim03Typhim09Typhim21Typhim16Typhim11Typhim07Typhim04Typhim06Typhim17Typhim18Typhim15

Typhim19Typhim05Typhim20Typhim08Typhim14Typhim10Typhim13Typhim12Typhim01Typhim02Typhim03Typhim09Typhim21Typhim16Typhim11Typhim07Typhim04Typhim06Typhim17Typhim18

Typhim19Typhim05Typhim20Typhim08Typhim14Typhim10Typhim13Typhim12Typhim01Typhim02Typhim03Typhim09Typhim21Typhim16Typhim11Typhim07Typhim04Typhim06Typhim17Typhim18Typhim15Sal-01Brandenbg04Rissen01Rissen02Bredeney04Bredeney01Bredeney03Bredeney02Bredeney05Kedougou01Kedougou02Kedougou03Sal-02Anatum01Anatum02Branderup01Infantis04Infantis02Infantis03Infantis01Infantis05Livingst01Cerro01Brandenbg03Brandenbg01Brandenbg02Derby09Derby23Derby18Derby07Derby20Derby24Derby22Derby13Derby19Derby04Derby03Derby05Derby06Derby10Derby16Derby08Derby25Derby01Derby12Derby14Derby21Derby11Derby17Derby02Derby15

Derby09Derby23Derby18Derby07Derby20Derby24Derby22Derby13Derby19Derby04Derby03Derby05Derby06Derby10Derby16Derby08Derby25Derby01Derby12Derby14Derby21Derby11Derby17Derby02Derby15

Derby23Derby18Derby07Derby20Derby24Derby22Derby13Derby19Derby04Derby03Derby05Derby06Derby10Derby16Derby08Derby25Derby01Derby12Derby14Derby21Derby11Derby17Derby02

Derby23Derby18Derby07Derby20Derby24Derby22Derby13Derby19Derby04Derby03Derby05Derby06Derby10Derby16Derby08Derby25Derby01Derby12Derby14Derby21Derby11Derby17Derby02Derby15Duisburg01London02London01

100908070605040 100908070605040

Pourcentage de similarité PulsotypeProfil de restriction par XbaI

Derby

Typhimurium

Bredeney

Rissen

Brandenburg

Infantis

Kedougou

Anatum

London

15

Salmonella pour constituer une base de données de souches finement caractérisées.

Lors de cette étude, nous avons remarqué la prépondérance de deux pulsotypes, Ty-01

(28% du total des souches analysées) et Der-03 (23.5%). Même si ces deux pulsotypes sont

retrouvés de manière majoritaire dans les deux entreprises, des disparités apparaissent

entre l’entreprise E1 et l’entreprise E2. Statistiquement, le profil Ty-01 serait plus présent

dans l’entreprise 1 que dans l’entreprise E2 (36,36% contre 19,64%), phénomène que l’on

ne retrouve pas pour le pulsotype Der-03. Cette donnée pourrait montrer une sensibilité plus

grande des souches de type Ty-01 aux contraintes présentes dans les ateliers de

transformation par rapport aux souches de type Der-03.

Les autres pulsotypes identifiés ont une incidence comprise entre 0,5% et 10% en moyenne

dans les deux entreprises (Figures 6 et 7). De manière encore plus flagrante que pour le

sérotypage, une différence notable entre les deux types d’ateliers se retrouve dans la

diversité des pulsotypes identifiés dans chaque entreprise : 12 types dans l’entreprise E1 et

39 dans l’entreprise E2. Cette différence importante peut s’expliquer de différentes

manières :

- Une plus grande variété dans les apports de matières premières au sein des ateliers de

transformation, comparativement à l’entreprise 1 d’abattage-découpe qui abat des animaux

provenant toujours des mêmes élevages .

- D’autres sources d’entrée propres à une entreprise de transformation (emballages,

ingrédients…).

Cependant, quantitativement, 75% des souches identifiées dans l’entreprise E1 sont

également identifiées dans l’entreprise E2, montrant ainsi que la matière première resterait la

principale source de contamination dans l’entreprise. Ces résultats devront être confirmés

par l’analyse d’un panel plus important de souches.

Le profil dénommé Ty-01 est très souvent associé aux souches Salmonella enterica

sérotype Typhimurium lysotype DT104 (type déterminé par l’utilisation de virus bactériens

spécifiques). Les souches Salmonella Typhimurium de lysotype DT104 sont fréquemment

impliquées dans l’apparition de salmonelloses multirésistantes aux antibiotiques chez

l’homme. Les études portant sur ce lysotype en particulier ont montré une augmentation

importante dans l’apparition de résistances à de nombreux antibiotiques, la majorité vis à vis

d’antibiotiques classiques (ampicilline, chloramphénicol, tétracyline, sulfonamides,

streptomycine), certaines souches arborant une résistance vis à vis de 16 antibiotiques différents (Malorny, 2001).

Ce pulsotype est retrouvé pour 36,4% des souches analysées dans l’entreprise 1 et 19.6%

des souches issues de l’entreprise 2. Il se pose donc le problème de la gestion du risque vis

à vis de ces isolats potentiellement pathogènes et porteurs de plus de nombreuses

16

antibiorésistances. Confortant l’idée d’une base de données filière de souches finement

caractérisées, la présence de ce pulsotype en particulier n’a été mise en évidence que grâce

à des méthodes de typage fines. La connaissance du sérotype seul d’un isolat ne permet

pas de pouvoir déterminer son potentiel de dangerosité. De plus, le suivi et l’évolution à la

fois dans l’espace mais aussi dans le temps de ce pulsotype particulier, qui présente un

risque avéré pour la santé humaine pourrait permettre de mieux contrôler le risque

Salmonella au sein de la filière porcine.

Le second pulsotype prépondérant Der-03 est identifié à hauteur de 26,1% et 21,4%

respectivement dans les entreprises E1 et E2 (Figure 6 et 7). La forte prévalence à laquelle

ce pulsotype est retrouvé, tout comme le pulsotype Ty-01 laisse penser que ces souches

sont particulièrement bien adaptées à l’environnement constitué par la filière porcine. Il est

possible de les retrouver en effet à tous les maillons de la chaîne et cette prévalence pourrait

donc être le résultat d’une adaptation particulière des souches de ces types vis à vis des

contraintes spécifiques de la filière ou d’une capacité de colonisation du porc plus importante

que pour d’autres lignées génétiques de Salmonella. Des analyses ont été effectuées pour

mettre en évidence l’existence d’une relation entre les pulsotypes identifiés et leurs origines

de prélèvement (produits transformés ou non, matières premières…), mais ce type

d’association n’apparaît pas dans nos résultats.

Der03

Der22

Der23NT

Ty01

Ty05

Ty16

Ty18

Der24Ke03

Der01Bra03

Der25

Der03

Lon01

Lon02

Ris01

Ty01

Ty15

Der18Der17

Der16

Der14Der12Der09Der07

Der04

Bra4

Der06

Der21

Inf01

Inf05

Ty14

Ty13

Ty12

Ty11

Ty10

Ty07

Ty05

Ris02

Ty20

Ty19

Ty18

Non pulsotypables

Sal02

Der01

Bre03

Bre05

Ana1Ana2

Sal01

Der20

Der19

Figure 6 : Diversité des pulsotypes identifiés

pour l’entreprise 1. Figure 7 : Diversité des pulsotypes identifiés

pour l’entreprise 2.

17

Antibiorésistance

L’antibiorésistance d’un panel de souches correspondant au pulsotype Ty-01 caractéristique

des souches Salmonella Typhimurium DT104, a été testée, de manière à disposer

d’informations complémentaires de caractérisation. Dix isolats issus de chacune des

entreprises E1 et E2 ont été analysés. Compte tenu du faible panel de souches testé, ces

résultats ne sont que des tendances qui doivent être confirmées par l’analyse de

l’antibiorésistance d’un panel de souche plus vaste. Les résultats obtenus sont décrits dans

le tableau suivant :

Tableau 2: Récapitulatif des antibiorésistances sur 20 souches de S. Typhimurium Ty-01Souche IFIP AM AMC C CAZ CF CS CTX ENR GM K NA OFX S SSS SXT SXT T1 S S S S S S S S S S S S R S S S2 S S S S S S S S S S S S R R R S3 S S S S S S S S S S S S R R R S4 R I S S S S S S S S S S R R S R5 R R S S S S S S S S S S R R S R6 R I S S S S S S S S S S R R S R7 R I S S S S S S S S S S R R S R8 R I S S S S S S S S S S R R S R9 R I S S S S S S S S S S R R S R10 R I S S S S S S S S S S R R S R11 R I S S S S S S S S S S R R S R12 R I S S S S S S S S S S R R S R13 R I S S S S S S S S S S R R S R14 R R S S S S S S S S S S R R S R15 R I S S S S S S S S S S R R S R16 R I S S S S S S S S S S R R S R17 R R S S S S S S S S S S R R S R18 R I S S S S S S S S S S R R R R19 R I S S S S S S S S R R R R S R20 R I S S S S S S S S R R R R S R

AM Ampicilline

AMC Amoxicilline + acide clavulanique

C Chloramphénicol

CAZ Ceftazidime

CF Céfalotine

CS Colistine

CTX Céfotaxime

ENR Enrofloxacine

GM Gentamicine

K Kanamycine

NA Acide nalidixique

OFX Ofloxacine

S Streptomycine

SSS Sulfamides

SXT Sulfaméthoxazole-triméthoprime

TE Tétracycline

Toutes les souches testées présentent au moins une résistance (streptomycine (S)). La

résistance à l’ampicilline, la streptomycine et à la tétracycline est retrouvée pour 85% des

souches analysées, ce qui dans le cas des pénicillines (AM, AMC) est très supérieur aux

données issues d’autres études récentes (Rapport FARM AFSSA, 2006).

Une quintuple résistance à l’ampicilline (AM), l’amoxycilline (AMC), la streptomycine, les

sulfamides (SSS, SXT) et la tétracycline (T) est retrouvée pour 65% des souches, et une

18

résistance à 7 antibiotiques a été constatée pour 2 souches (ampicilline, amoxycilline,

streptomycine, sulfamides, tétracycline, acide nalidixique (NA) et ofloxacine (OFX)).

La sensibilité aux céfalosporines (CAZ, CF, CTX ) (100%) correspond à ce qui a été mis en

évidence précédemment dans la filière porc. De la même manière, la sensibilité aux

fluoroquinolones (ENR, NA, OFX) reste très élevée, ainsi que pour la gentamicine (GM), la

kanamycine (K) et le chloramphénicol (C). Dans le cas de la tétracyline, la résistance

retrouvée correspond également aux chiffres publiés précédemment et il semblerait qu’une

augmentation de la sensibilité aux sulfamides soit détectable par rapport aux années

précédentes (FARM, AFSSA, 2006).

Au contraire, la prévalence des résistances observées s’avère supérieure dans le cas de la

streptomycine (100% contre 57,6% en 2004 dans la filière porc) ainsi que pour les

pénicillines (85% contre 21% pour l’ampicilline et 1% pour l’amoxyciline).

Cependant nous n’avons pas mis en évidence le profil de pentarésistance « classique »

ASCTSu arboré par un grand nombre d’isolats de lysotype DT104 (prévalence de 15,4% en

2004, en augmentation par rapport aux années précédentes), qui correspond à la résistance

à l’ampicilline, la streptomycine, le chloramphénicol, la tétracycline et aux sulfamides.

Ces profils de résistance peuvent être associés à une utilisation importante de ces

antibiotiques dans la filière porcine, ce qui entraîne l’émergence de résistances bactériennes

vis-à-vis de ces additifs et/ou médicaments vétérinaires dans l’ensemble de la filière avec les

problèmes subséquents en thérapeutique humaine.

De plus, il serait intéressant d’étendre la surveillance des antibiorésistances à des souches

de pulsotypes prépondérants dans la filière (en particulier le pulsotype Der-03). Cela

permettrait de déterminer s’il existe une corrélation entre les antibiorésistances arborées par

les souches bactériennes les plus représentées, donc de potentielles voies de transmission

des résistances entre souches dans la filière. Pour répondre à ces interrogations et valider

les tendances décrites ici, un panel plus important d’isolats devra être analysé.

19

Conclusions et Perspectives

L’intérêt d’établir une base de données Salmonella pour la filière est multiple. Une fois

implémenté, cet outil peut permettre de mieux appréhender l’épidémiologie du germe dans

l’ensemble de la filière, et par conséquent réduire la prévalence de Salmonella afin de

satisfaire aux exigences de la directive zoonose d’une part et du règlement 2073/2005

concernant les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires d’autre part.

Lors de cette étude, les résultats obtenus en sérotypie sont conformes avec ceux présentés

dans des études récentes (Rapport AFSSA 2006) avec deux sérotypes majeurs dans la

filière porc qui sont Derby et Typhimurium.

La mise en évidence de deux pulsotypes fortement représentés dans l’ensemble des isolats

collectés (Der-03 et Ty-01) montre une potentielle adaptation de ces deux types à la filière

porcine, ce qui expliquerait leur sur-représentation dans le cadre de cette étude.

Le point critique dans les analyses effectuées est que le profil Ty-01 identifié fait partie des

profils généralement associés aux souches de type DT104. Ces dernières correspondent à

des souches de plus en plus identifiées en médecine humaine depuis quelques années et

qui présentent généralement de nombreuses résistances à différentes familles

d’antibiotiques.

L’analyse de l’antibiorésistance d’un petit panel de souches Ty-01 isolées dans cette étude a

confirmé un taux important de résistance aux antibiotiques les plus courants, même si

l’échantillonnage testé n’était pas suffisamment représentatif pour tirer d’autres conclusions

et qu’il faudra mener cette analyse sur un panel plus large pour confirmer les tendances qui

ont été observées.

Il ressort de ce travail que certaines souches de Salmonella qui sont d’intérêt majeur en

médecine humaine sont retrouvées à une prévalence très forte ( 28% des souches sont de

type Ty-01). Leur présence pouvant être considérée comme un danger avéré, la surveillance

de ce type de souches en particulier présente un intérêt fort pour la gestion du risque

Salmonella au sein de la filière.

Pour cela, il est nécessaire de continuer à incrémenter cette base de données afin d’estimer

l’évolution de la représentativité du type Ty-01 au sein de la filière et de son profil

d’antibiorésistance. Par ailleurs, il serait utile d’analyser un plus grand panel de souches afin

d’obtenir une meilleure représentativité de la base de données concernant les souches de

sérotypes et/ou pulsotypes rarement identifiés ou les souches issues d’origines de

prélèvement peu représentées. L’implémentation pérenne de la base de données permettra

d’obtenir une vision précise de la prévalence de Salmonella dans la filière à un moment

20

donné, tout en permettant un meilleur suivi dans le temps de l’évolution de sa prévalence,

donc un suivi de l’efficacité des mesures visant à améliorer la situation dans la filière.

Cette base de données filière permet également de se placer de manière complémentaire

par rapports aux autres bases existantes constituées soit à partir d’isolats humains (CNR

Pasteur) soit à partir d’isolats majoritairement issus de la filière aviaire (AFSSA)

(Swanenburg, 2001 ; Fravalo, 2002), et donc de contribuer à une meilleure connaissance de

l’épidémiologie de cette bactérie dans la filière porcine.

21

Bibliographie

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22

Antenne Rennes – Le Rheu La Motte au Vicomte B.P. 35104 - 35651 Le Rheu Cedex Tél. : + 33 (0)2 99 60 98 20 - Fax : + 33 (0)2 99 60 93 55

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