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Jose A. Peña - UPV/EHU

Antropogenética - Capítulo 3 - Página 1

CAPÍTULO 3. MARCADORES DE DETERMINACIÓN DIRECTA Técnicas - Extracción y cuantificación de ADN - Enzimas de restricción - PCR - Secuenciación - RT-PCR - Micromatrices Polimorfismos - RFLPs - VNTRs - Genes - Inserciones Alu - SNPs - ADN mitocondrial - Cromosoma Y - CNVs - Genomas completos Introducción

Los grandes avances que tuvieron lugar en las últimas décadas del siglo XX en numerosas técnicas de Biología molecular y sobre todo en las que tienen que ver con el análisis y la manipulación del ADN, abrieron las puertas a un nuevo tipo de estudios de polimorfismos, ya no sobre los productos de los genes, sino directamente sobre los genes mismos.

La gran cantidad de polimorfismos encontrados entre los productos de expresión de los genes, como los grupos sanguíneos o las proteínas plasmáticas, es superada ampliamente por la variación genética en las moléculas de ADN.

Hay una gran fracción del genoma que no aparece envuelta en la codificación de proteínas. Se compone de fragmentos de ADN situados entre los genes, con secuencias reguladoras, genes que han perdido su utilidad a lo largo de la evolución y ya no son transcritos, etc. Las mutaciones en las regiones no codificantes del ADN generalmente no producen un efecto fenotípico y se comportan como selectivamente neutrales. Por ello, pueden acumularse una tras otra sin ser eliminadas por selección, dando lugar a herramientas muy interesantes para estudiar la variabilidad y la heterogeneidad entre los individuos y las poblaciones.

Desde el comienzo del Proyecto Genoma Humano, dedicado a la secuenciación de todo el ADN humano, se pudo acceder al conocimiento de una gran variedad de polimorfismos, muchos de los cuales han sido o están siendo analizados en diferentes poblaciones. En general, han revelado una enorme variabilidad que es transmitida según la herencia mendeliana. Ha aparecido por tanto, un nuevo y vasto campo de investigación sobre marcadores genéticos.

La clasificación de los polimorfismos de ADN podría realizarse de acuerdo a diferentes criterios. Podrían por ejemplo, desde el punto de vista funcional, dividirse entre ADN nuclear y ADN mitocondrial y dentro de cada grupo en ADN codificante y no codificante. Además, las técnicas de análisis avanzan continuamente, por lo cual diferentes estudios sobre el mismo fragmento de ADN no son siempre comparables. Por ello, primero se describirán las principales técnicas utilizadas para a continuación enumerar los tipos de polimorfismos que han sido analizados con una cierta frecuencia.



Extracción y cuantificación de ADN Puede obtenerse ADN de una gran cantidad de tejidos. Habitualmente se toman

muestras de sangre total en tubo, de manchas de sangre en papel, de células bucales, de pelos o de hueso.

Entre las varias técnicas disponibles, puede comenzarse con una solución tamponada de lisis (detergente y proteinasa K). El detergente rompe las membranas celulares y nucleares y libera el ADN. La proteinasa K degrada las histonas sobre las que se enrolla el ADN. Centrifugando a alta velocidad, precipitarán las proteinas y otros elementos de las células, quedando el ADN en el sobrenadante.

Una vez recuperado el ADN, puede añadirse una sal concentrada, con lo cual se

formarán agregados, que precipitarán al añadir etanol o isopropanol, ya que el ADN no es soluble en alcohol. Centrifugando nuevamente, quedará un precipitado de ADN. Entonces se puede eliminar el sobrenadante y disolver a la concentración adecuada. Una técnica alternativa que obtiene mejores resultados, es la que se basa en la aplicación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, aunque algunos de los reactivos son altamente tóxicos.

Otra técnica alternativa se basa en Chelex, una resina quelante que atrapa los iones de Magnesio, necesarios para la acción de las DNAsas. De este modo, el ADN de la muestra no se degrada y puede ser almacenado durante un tiempo. En sentido estricto no es una extracción, ya que no se depura el ADN.



También pueden utilizarse diferentes kits comerciales (basados en columnas de filtración, partículas metálicas, etc.) e incluso puede realizarse de forma automática.

El ADN se conserva a -20ºC al menos, o mejor a -80ºC.

Puede evaluarse la calidad del ADN extraído de dos formas: 1. Puede realizarse una electroforesis de agarosa con una pequeña parte de las

muestras y valorar la intensidad de la fluorescencia, lo que nos dará una idea aproximada de la concentración. Si aparece una estela de fluorescencia, sabremos que el ADN se encuentra roto en fragmentos de diferentes tamaños.

2. O bien, puede analizarse la pureza y concentración mediante un espectrofotómetro

UV, que leerá la absorbancia a 260 y 280 nm, evaluando la proporción de ADN y proteínas de las muestras. Los ácidos nucleicos se revelan a 260 nm y las proteínas a 280. Una unidad de absorbancia (OD) equivale a unos 50 µg/ml de ADN de doble cadena, 40 µg/ml de ARN, 33 µg/ml de ADN de hebra sencilla y 30 µg/ml de oligos. La pureza se mide por la relación A260/A280 y debe ser aproximadamente 1,8 para ADN y 2 para ARN.

Ambos métodos pueden considerarse complementarios.

Fluorímetro



Enzimas de restricción Las enzimas de restricción tienen como

característica principal que reconocen una determinada secuencia de nucleótidos en el ADN y cortan la cadena por ese punto. Algunas de las más de 100 conocidas en la actualidad aparecen en el cuadro adjunto. Puede observarse que las secuencias que reconocen son de una longitud variable, normalmente entre 4 y 8 nucleótidos. También puede apreciarse que en cada caso, la cadena complementaria es idéntica si se lee en sentido contrario. Esto permite que las cadenas cortadas puedan unirse de nuevo.

Enzima Secuencia Enzima Secuencia Eco RI GAATTC Nar I GGCGCC Bcl I TGATCA Nae I GCCGGC Nco I CCATGG Sma I CCCGGG Bam HI GGATCC Acc III TCCGGA Alu I AGCT Taq I TCGA Hae III GGCC Mae II ACGT Apa I GGGCCC Mae I CTAG Not I GCGGCCGC Nde I CATATG Bal I TGGCCA Ssp I AATATT Hind III AAGCTT Spe I ACTAGT Cfo I GCGC Swa I ATTTAAAT

El uso clásico de las enzimas de restricción para el análisis de polimorfismos de ADN se esquematiza en la figura.

Básicamente, se trataba de cortar el ADN mediante las enzimas adecuadas. A continuación, se separaban los fragmentos obtenidos mediante electroforesis. Después, se transferían a una membrana, donde quedaban fijados. En un siguiente paso se hibridaban los fragmentos resultantes con una sonda complementaria de la secuencia que buscáramos, marcada con radioactividad para poder visualizarla. Después de lavar, si la sonda seguía en la membrana por haberse fijado al ADN, se vería en la autorradiografía.

Esquema de un análisis básico con enzimas de restricción



Son los primeros análisis que se realizaron en Genética forense.

Pero con estos resultados era virtualmente imposible estimar las probabilidades de coincidencia, porque generalmente se desconocía el origen de las bandas.

Además, este método consumía tradicionalmente una gran cantidad de ADN.

En la actualidad, se aplican las enzimas sobre un fragmento de ADN amplificado, optimizándose el proceso y no se utilizan isótopos radioactivos para el marcaje. ¿Cómo se amplifica el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa, en este capítulo

La existencia de una mutación en un lugar de restricción impedirá que la enzima corte por ese punto, de modo que puede detectarse dicha mutación.

En esta figura se encuentra una mutación que define un nuevo genotipo. La banda que se obtiene en este caso es más larga y por tanto más pesada, lo que se detecta al realizar la electroforesis.

Siguiendo con el ejemplo anterior, los homocigotos para la mutación tendrán una sola

banda más pesada, los homocigotos sin mutación tendrán las 2 bandas (intermedia y ligera) y los heterocigotos tendrán las 3 bandas.



¿Cuál de los dos sospechosos podría ser el

culpable?

¿Podría ser el padre en el gel de la izquierda? ¿Y

en el gel de la derecha?

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (en inglés Polymerase Chain Reaction, PCR) es un método diseñado para amplificar ADN, de modo que se obtienen una gran cantidad de copias del fragmento del genoma que se pretenda estudiar. Merced a este proceso, la manipulación y el análisis del material hereditario resultan mucho más sencillos y eficaces.

La enzima implicada es la Taq polimerasa, proveniente de Thermus aquaticus, que tiene como particularidad ser efectiva a una elevada temperatura (72 ºC), de modo que puede controlarse de un modo relativamente sencillo el tiempo durante el cual está sintetizando nuevo ADN.

Esta técnica se realiza en un aparato denominado termociclador, que utiliza una hebra de ADN como molde para sintetizar la cadena complementaria mediante la Taq polimerasa, de un modo muy similar a como ocurre en la propia célula. El termociclador somete a las muestras a una serie de cambios cíclicos de temperatura, que facilitan cada uno de los procesos implicados en la replicación del ADN.

La PCR se realiza en termocicladores



Generalmente es preciso conocer la secuencia del fragmento que se quiere amplificar o al menos dos fragmentos que flanqueen la secuencia en ambos extremos. Con esta información, se pueden diseñar y sintetizar dos cebadores (o primers, oligonucleótidos de no más de 30 nucleótidos de longitud) complementarios de dos secuencias situadas a ambos extremos de la cadena. Las secuencias se diseñan mediante herramientas informáticas que permiten comprobar si son secuencias únicas o se encuentran repetidas en otros lugares del genoma. Los cebadores se unirán específicamente a estas secuencias y le indicarán a la enzima por dónde debe comenzar a copiar el ADN. Un cebador actúa en sentido 3' y el otro en sentido 5'.

Como se observa en la figura, se obtienen algunas cadenas de un tamaño mayor del esperado.

¿Cómo se diseña un par de cebadores? Aplicación BLAST, práctica O1

Sin embargo, al cabo de varios ciclos, el número de cadenas indeseadas (línea azul) es mucho menor que el número de cadenas adecuadas (línea roja).

En primer lugar, el ADN se desnaturaliza, es decir, se calienta a unos 95-98 ºC, de modo que se rompen los enlaces por puentes de hidrógeno que unen ambas cadenas y se separan. A continuación se baja la temperatura a entre 50 y 65ºC (dependiendo de la secuencia del ADN y de los cebadores), facilitándose la hibridación de los cebadores con las cadenas de ADN.

Un nuevo calentamiento del medio, esta vez hasta unos 72 ºC, permitirá que la Taq polimerasa realice una copia de cada hebra en la que se haya insertado un cebador. Repitiendo una serie de veces este ciclo de temperaturas, se obtendrán un número muy elevado de copias del fragmento de ADN situado entre ambos cebadores. Una electroforesis permitirá analizar el resultado de la amplificación.



La ventaja de esta técnica para el análisis de diferentes polimorfismos estriba en que la cantidad de ADN necesario para realizar la prueba es muy pequeña, ya que se obtienen un gran número de copias a partir de un reducido número de hebras y la calidad del resultado de la electroforesis es mucho mejor. En realidad, se pueden realizar amplificaciones PCR a partir de una sola célula, aunque el riesgo de contaminación de ADN foráneo es entonces muy alto. Secuenciación

El análisis más completo y directo del ADN es el análisis de la secuencia de bases nitrogenadas. Mediante la secuenciación pueden detectarse absolutamente todas las variaciones que pueda haber en un fragmento del genoma. Además, puede analizarse cualquier región, sea codificante o no.

Existen varias técnicas, entre las que destacan el método de los dideoxinucleótidos o de Sanger, que ha sido tradicionalmente el más habitual. Se basa en la síntesis enzimática de ADN marcado mediante dideoxinucleótidos que terminan la síntesis de la cadena. Actualmente, se usan cada vez más métodos de secuenciación masiva.

Lectura manual de una secuencia

El método de los dideoxinucleótidos se basa en la existencia de cuatro tubos de reacción PCR. En cada uno de ellos, una parte de una de las bases está marcada. Así, un tubo tendrá dideoxiadenina, otro dideoxicitosina, otro dideoxiguanina y otro dideoxitimina. En la secuenciación automática, cada uno de ellos además lleva adherido un fluorocromo diferente.

Cuando en la síntesis de una nueva cadena por la polimerasa se inserta un dideoxinucleótido, la síntesis de esa cadena se detiene. Al finalizar los ciclos PCR, en cada tubo habrá tantas cadenas de longitud diferente como posiciones en las que se haya podido insertar el dideoxinucleótido.

Aunque se comenzó realizando secuenciaciones manuales, ahora se utilizan los

analizadores de ADN, popularmente llamados secuenciadores automáticos. En un secuenciador de capilaridad, las muestras se desplazan desde el cátodo (1) hasta

el ánodo (2) a lo largo de un capilar (3) pasando a través del haz de un láser (4). Hay una gradilla con muestras al principio del recorrido (5) y un émbolo que inyecta polímero entre cada muestra para limpiar y rellenar el capilar (6).



Analizador de ADN

El resultado es un electroferograma como el de la figura.

En los últimos años se están desarrollando nuevos métodos, más eficaces para secuenciar el ADN. Se denominan genéricamente como Next Generation Sequencing (NGS) methods.

En estos métodos se realizan simultáneamente una gran cantidad de amplificaciones PCR de pequeños fragmentos. Este proceso puede darse o bien mediante una PCR en emulsión o una PCR puente.

En el primer caso (PCR en emulsión), la mezcla de reacción consiste en una emulsión aceite-agua creada para encapsular complejos con ADN y nanoesferas dentro de gotículas de agua. Tras la emulsión, se lleva a cabo la amplificación añadiendo los reactivos adecuados, de tal manera que cada nanoesfera queda recubierta por varios miles de copias de la misma secuencia molde.

Metzker, M. L. (2010). Nature reviews genetics, 11(1), 31-46.

En el segundo caso (PCR puente), la secuenciación tiene lugar en una placa de vidrio,

sobre la que están fijados mediante adaptadores específicos b) los cebadores y la polimerasa, c) los cebadores, d) las moléculas de ADN e) o bien la polimerasa.



Los fragmentos de ADN son entonces secuenciados simultáneamente. Después se reconstruye la secuencia completa a partir de los solapamientos de las diferentes cadenas.

Uno de los métodos basados en emulsiones es la pirosecuenciación. En el esquema de la izquierda se muestran los pocillos donde se disponen los fragmentos de ADN unidos a microesferas, con el objeto de facilitar el acceso de las enzimas implicadas.

En la pirosecuenciación se van añadiendo sucesivamente soluciones de A, C, G y T. A medida que se polimeriza la nueva cadena un conjunto de 3 enzimas (sulfurilasa, luciferasa y apirasa) transforma los pirofosfatos liberados por la unión de un nucleótido en emisión de fotones. Si se encuentran dos nucleótidos iguales seguidos, la emisión en la ronda de ese dNTP será el doble.

La imagen que se obtiene se denomina flujograma.



Entre los ejemplos de soporte sólido, en la figura se observa el método de los terminadores reversibles.

El ADN se encuentra fijado junto al cebador en la placa, con un terminador reversible 3'-O-azidometil.

Se añade una solución de dNTPs, cada uno marcado con un fluorocromo diferente.

Se lava para eliminar los sobrantes y se lee la emisión en cada punto de la placa.

Entonces se regenera el grupo 3'-OH del terminador usando un agente reductor y se repite el proceso.

Trabajo publicado en 2013 presentando la primera amplificación y secuenciación del ADN

mitocondrial de un resto de 300.000 años, extraído de la Sima de los huesos, en Atapuerca.

Meyer et al., 2013. Nature, 505(7483), 403-406.

Simulación de un análisis PCR: Programa PCRprog.java, sección <software> de la página de Antropogenética

RT-PCR, PCR a tiempo real o PCR cuantitativa

La PCR cuantitativa o PCR a tiempo real es una modificación de la técnica original que permite conocer la existencia de amplificación y el número de copias obtenidas conforme se desarrolla el proceso.

La PCR a tiempo real combina un termociclador, un espectrofotómetro y un ordenador.



El termociclador efectúa la PCR sobre

unas muestras a las que añade un fluorocromo en cada amplificación si ésta se realiza. El espectrofotómetro detecta la emisión del fluorocromo y lo transmite al ordenador.

Puede conocerse en qué pocillos ha habido amplificación y la intensidad de la misma.

En la modalidad HRM, se ha añadido un fluorocromo que solo emite fluorescencia cuando se encuentra en una doble hebra de ADN. Después de la amplificación, se desnaturaliza la muestra de ADN subiendo la temperatura gradualmente desde 55 hasta 95ºC. Cuando se separan las 2 hebras, deja de emitir fluorescencia. Pero la velocidad con que esto ocurre depende de la secuencia de nucleótidos, de modo que una mutación alterará la curva de disminución de la fluorescencia.

Micromatrices

Las micromatrices son soportes de cristal, silicio o plástico en las que se fijan miles de

sondas específicas de secuencia conocida. Al poner una muestra amplificada PCR en contacto con las sondas, aquellas cadenas que tienen una secuencia complementaria se hibridan. A continuación se eliminan todas las cadenas que no se han unido mediante lavados. Después se analiza la imagen obtenida para obtener un patrón de intensidades en cada casilla.



También pueden fijarse los fragmentos de ADN que se pretende analizar y realizar una

miniPCR con dNTPs marcados.

RFLPs

El tipo más tempranamente estudiado de variante de ADN fue el que puede detectarse cuando una enzima de restricción encuentra una mutación puntual en su secuencia de reconocimiento habitual, por lo que no puede fijarse. En ese caso, alguno de los fragmentos de ADN obtenidos mediante esta enzima serán de una longitud diferente. Por ello se conocen estos polimorfismos como polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP en inglés).

Puesto que las diferencias entre las variantes del polimorfismo estriban en la longitud de la molécula y por tanto, en su peso molecular, pueden reconocerse mediante electroforesis.

Mediante enzimas de restricción puede analizarse cualquier región del genoma, codificante o no. Sin embargo, sólo pueden detectarse cambios dentro de unas secuencias determinadas, de modo que no todas las mutaciones existentes serán reveladas mediante esta técnica.

Las enzimas de restricción se han utilizado para estudiar numerosas variantes de polimorfismos, desde secuencias de ADN repetitivas hasta ADN mitocondrial o mutaciones puntuales. Sin embargo, los resultados obtenidos a menudo no son comparables a los obtenidos por otros métodos, por lo que pueden considerarse un tipo de polimorfismo diferenciado.

La tabla muestra los valores de los diferentes componentes de la varianza molecular (AMOVA) obtenidos a partir de RFLPs, comparados con varios trabajos sobre proteínas.



Barbujani et al, 1997. Proc Natl Acad Sci Usa 94:4516-4519 ¿Qué es un AMOVA? Capítulo 5b

La figura muestra un dendrograma obtenido a partir de RFLPs. Se incluye una muestra de chimpancés para ubicar la raíz.

Nei M, Takezaki N 1996. Mol Biol Evol 13:170-177

STRs

Otro tipo de polimorfismo de ADN consiste en la existencia de diferentes números de repeticiones en tandem de un núcleo de unos pocos pares de bases. Son las repeticiones en tándem de número variable (VNTR en inglés). Cuando la secuencia que se repite consta de 2 a 6 pares de bases, se denominan microsatélites (microsatellites, short tandem repeats o STRs). Si la secuencia es de una longitud mayor (de entre 7 y 100 nucleótidos), reciben el nombre de minisatélites. Es un tipo de polimorfismo muy extendido por el genoma, calculándose que existe al menos un millón de STRs, que suponen el 3% del genoma humano.

En general, las secuencias repetidas en tándem se encuentran en regiones no codificantes del ADN. Sin embargo, se han detectado en algunos casos microsatélites que invaden un gen, lo que suele conllevar consecuencias negativas para el individuo portador, como en el caso de la distrofia miotónica.

El polimorfismo que determinan los VNTRs se caracteriza por el número de repeticiones, de modo que se considera un número de repeticiones determinado como un alelo y su frecuencia alélica será la frecuencia con la que aparece el mismo número de repeticiones en una población.



La aparición de nuevos alelos se ve facilitada por la existencia de secuencias repetidas, lo que posibilita la incorrecta hibridación de las hebras complementarias del ADN. Por ello, tienen tasas de mutación relativamente altas.

Los VNTRs pueden analizarse mediante enzimas de restricción y electroforesis. En este ejemplo se han buscado dos lugares de restricción situados en las regiones flanqueantes de dos VNTRs.

Actualmente, el método más habitual es la amplificación PCR y la identificación

mediante un analizador de ADN. Los analizadores de ADN no sólo secuencian. También pueden estimar el tamaño de un

fragmento amplificado. En el electroferograma de la figura se observan los dos alelos (3 y 4) de un heterocigoto

para el STR D11S1984. Las bandas rojas corresponden al ADN control de tamaño conocido, que el aparato utiliza para extrapolar el tamaño de los amplificados.

Los tamaños que muestra son 174,18 y 178,13. Es decir, 174 y 178 nucleótidos. Es un microsatélite tetramérico, de modo que el amplificado se compone de (3x4) 12 y (4x4) 16 nucleótidos, respectivamente, más 162 nucleótidos de las regiones flanqueantes que han quedado entre ambos cebadores.



A partir de un grupo suficientemente amplio de STRs, puede discriminarse razonablemente bien entre individuos de diferentes grupos poblacionales, como muestra este análisis de Structure sobre poblaciones de varios continentes.

Concretamente, se han analizado 377 microsatélites en 1056 individuos de 52 poblaciones.

Rosenberg et al, 2002. Science 298:2381-2385

¿Qué es un análisis Structure? Capítulo 5b

Análisis MDS a partir de frecuencias de STRs en

poblaciones de la cuenca mediterránea. Las

poblaciones del Norte de África y Próximo Oriente

aparecen separadas de las europeas por un lado y las

vascas por otro.

Pérez-Miranda et al 2005. J Hum Genet 50:403-414



La distrofia miotónica es una enfermedad genética caracterizada por severas dificultades para relajar los músculos contraídos, pérdida de masa muscular, cataratas, defectos en las gónadas y el corazón y retraso mental. Puede aparecer a diferentes edades, entre la infancia y la vejez. Puesto que es una enfermedad degenerativa, cuanto más temprana sea la edad de comienzo, más grave será su manifestación. Su origen se encuentra en la invasión de un gen estructural (DMPK, myotonic dystrophy protein kinase, 19q13.3) en su región 3' no traducida, por un microsatélite con una secuencia repetida CTG, que puede tener entre 5 y 37 repeticiones en individuos normales y hasta varios miles en afectados, con síntomas más severos cuanto mayor es el número de repeticiones. Hasta 80 repeticiones determinan una forma leve, en tanto que a partir de 2.000 copias los síntomas son severos.

Paciente de 40 años de edad con distrofia miotónica, cataratas bilaterales y bloqueo

cardíaco

o

La tasa de mutación estimada para esta enfermedad es de 9,5 . 10-6. Afecta a 1 de cada 20.000 personas.

En Saguenay (Canadá), la prevalencia es de 1/530, con un origen común para todos los afectados, localizado en una pareja de inmigrantes que se instaló en la región en el siglo XVII.

La DM1 presenta anticipación, es decir, aparece más temprano en las sucesivas generaciones de una familia, lo que suele ser proporcional al número de repeticiones, como se observa en esta genealogía.

Curiosamente, como también se observa en esta genealogía, el mecanismo de anticipación se transmite exclusivamente por línea materna.



Hamzi et al, 2010. Antropo, 23, 73-76.

Frecuencias alélicas de genes

Utilizando las técnicas de análisis PCR, también es posible detectar polimorfismos en los genes, incluyendo aquellos que eran analizados anteriormente por técnicas inmunológicas. Naturalmente, ahora se obtiene una mayor resolución.

Existen varios métodos mediante los cuales es posible analizar los diferentes genotipos de un gen. Entre ellos se encuentran la PCR-SSP (Sequence Specific Primer) y la PCR-SSO (Sequence Specific Oligonucleotide). En la actualidad es posible analizar, por ejemplo, grupos sanguíneos como el sistema AB0 o genes HLA. Para ello, basta con disponer de sondas específicas de la secuencia codificante de cada alelo.

Para poder distinguir el resultado negativo del error, el control positivo se consigue con otro par de cebadores que permiten amplificar una fracción no polimórfica del genoma, de modo que se amplifica siempre.

Conocida la secuencia de los diferentes alelos de un gen, es posible diseñar cebadores

específicos de cada alelo para su amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Cuando sean complementarias la secuencia del cebador y la del ADN, se producirá amplificación. Se conocerá, por tanto, el genotipo de un individuo por electroforesis de los productos PCR. Donde haya habido amplificación aparecerá la correspondiente banda en la electroforesis y donde no haya habido amplificación no aparecerá nada.

Puesto que un gen a menudo consta de varios exones y puede haber mutaciones en más de uno, será preciso utilizar varios pares de cebadores para identificar las diferencias entre todos los alelos del gen.

En la imagen, cada fila corresponde a un alelo HLA-A, del grupo A2 y cada columna a una mutación con su correspondiente par de cebadores.



Estas técnicas son muy

utilizadas en la actualidad para el análisis de los loci HLA.

A menudo también pueden identificarse los alelos de un gen mediante enzimas de restricción y desde luego siempre está disponible la secuenciación.

Figura: Gel de agarosa con el

resultado de un análisis PCR-SSP para un gen HLA.

Número de alelos, en noviembre de 2017, de la región HLA en humanos http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html



En esta figura se

muestra un análisis comparativo entre la posición geográfica y la posición genética obtenida a partir de frecuencias de alelos HLA-B en poblaciones de Africa.

La posición genética se obtuvo mediante un Análisis de Escalamiento Multidimensional (MDS) ¿Qué es un MDS? Capítulo 5a

Sanchez‑Mazas et al (2017). Molecular Ecology. DOI:

10.1111/mec.14366

Inserciones Alu Las inserciones Alu son secuencias de aproximadamente 300 pares de bases originadas

a partir del gen 7SL RNA por retrotransposición. La estructura de los elementos Alu es dimérica; es decir, su secuencia está compuesta por dos subunidades similares. Esto se debe a que surgieron de la fusión cabeza-cola de dos Alu primitivos, que eran monoméricos. El resultado fue una estructura con dos regiones similares, unidas por una región rica en Adenina y con una cola Poli-A. El monómero del extremo 3’ (derecha) contiene un segmento adicional de 31 pb del que carece el monómero del extremo 5’ (izquierda). Sin embargo es en el 5´ donde se controla el proceso de retrotransposición porque es allí donde se encuentra el promotor de la RNA polimerasa III.



Son los más abundantes dentro del grupo de secuencias SINE (short interspersed elements) en el genoma humano, ya que hay más de un millón de copias, lo que supone el 10% del genoma. El origen y la amplificación de los elementos Alu son fenómenos evolutivamente recientes, que coinciden con la radiación de los primates hace 65 millones de años.

Existen varias familias de elementos Alu, dentro de las cuales algunas son exclusivas de los seres humanos. No todos los elementos Alu son polimórficos puesto que algunos con el paso del tiempo se han fijado o perdido. Sin embargo, aquellos Alu que se han insertado recientemente son polimórficos, con dos alelos, presencia o ausencia de inserción.

En la figura se esquematiza el proceso de inserción: En primer lugar, el elemento Alu se transcribe a ARN mensajero. Después, eventualmente, puede unirse en otro lugar del genoma y mediante una transcripción inversa quedar insertado.

Su análisis es relativamente sencillo. Dado que se trata de una secuencia de gran

tamaño, puede identificarse su ausencia o presencia mediante una PCR y una electroforesis en gel de agarosa. La diferencia entre las bandas resultantes, generalmente de unos 300 pares de bases, puede apreciarse a simple vista.

En la figura, una electroforesis de agarosa de varias muestras analizadas para una inserción Alu.



A pesar de ser marcadores

bialélicos y por tanto con un escaso grado de polimorfismo, son interesantes en Antropogenética, ya que puede conocerse el genotipo ancestral (no inserción). Además, se supone que cada inserción es un evento evolutivo único (o casi), por lo que todos los portadores de una secuencia derivarían de un antepasado común.

En la figura se observa un dendrograma obtenido a partir de frecuencias de 100 inserciones Alu. La población ancestral se ha definido como una población hipotética con frecuencia de inserción 0 para las 100 inserciones.

Watkins et al 2003. Genome Research 13:1607–1618

Se ha especulado sobre su importancia evolutiva, incluso sobre su implicación en el

proceso de especiación, pero todavía no existen datos consistentes. En todo caso, entre otros hallazgos recientes, se ha observado que existen genes que derivan de elementos genéticos móviles, como Rag1, una transposasa implicada en los reordenamientos del ADN para la codificación de la región hipervariable de las moléculas de anticuerpos. Se ha estimado que el 0,5% de las nuevas enfermedades genéticas son producidas por efecto de la recombinación entre inserciones Alu. También podrían estar implicadas en la reparación del ADN mutado.

En la figura se observa la capacidad de discriminación de tan sólo 8 inserciones Alu, de

modo que cada región aparece claramente diferenciada. La población ancestral se ha definido como en el caso anterior, como una población

hipotética con frecuencia de inserción 0 para las 8 inserciones.



Gómez-Pérez et al 2007. Antropo, 14, 29-36.

Son más numerosas las

inserciones Alu específicas de humanos que de otros primates. No obstante, sólo una parte de esas inserciones es polimórfica.

Locke et al 2011

Nature, 469, 529-533.

Polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) Su abreviatura deriva del nombre en inglés (Single Nucleotide Polymorphisms). Son

variaciones de una sola base. La mayor parte de la variabilidad del genoma es de este tipo, estimándose que suponen el 80% de los polimorfismos. Se ha calculado su densidad en aproximadamente 1 por cada mil pares de bases. A pesar de que son generalmente bialélicos, son más frecuentes y estables que los microsatélites, lo que les hace interesantes sobre todo para estudios de desequilibrio de ligamiento.

En la figura, la mutación responsable de la anemia falciforme, que es un SNP, detectada mediante enzimas de restricción.



Para su identificación pueden utilizarse distintas técnicas, como las enzimas de restricción, la secuenciación, las micromatrices o la PCR cuantitativa.

En la figura, 2 SNPs identificados mediante secuenciación (Técnica SNaPshot).

Actualmente, estos polimorfismos son muy utilizados para la localización de genes causantes de enfermedades, en Genética Humana.

Se analizan diferentes SNPs en población afectada y en controles, buscando diferencias significativas en las frecuencias de alguno de ellos.

En la figura se muestran los resultados obtenidos para 393.000 SNPs en un estudio sobre la diabetes tipo 2.

Sladek et al. 2007. Nature. 445:881-885.

Cuando se encuentran SNPs con diferencias significativas, se analizan los bloques de ligamiento que puedan involucrar algún gen próximo.

En la imagen se muestra un análisis de ligamiento entre varios SNPs en la región de un hipotético gen (LOC387761). Se muestra un punto naranja cuando existe correlación entre 2 SNPs, es decir, cuando se ha observado desequilibrio de ligamiento entre ellos.

Sladek et al. 2007. Nature. 445:881-885. ¿Qué es el desequilibrio de ligamiento? Capítulo 5b



Estudio de cartografía de riesgo relativo de asma en 994 niños asmáticos y 1.243 no

asmáticos mediante el análisis de 317.447 SNPs. Se muestran los valores de significación al 1% y 5%. Se ha observado una asociación con el gen ORMDL3, situado en 17q21

Moffatt et al 2007.

Nature. 448(7152):470-3.

MDS y análisis Structure realizados a partir de 60.000 SNPs en una serie de muestras europeas. Se observa que las poblaciones quedan bastante bien definidas.

Rodríguez-Ezpeleta et al 2010 Hum Genet. 128(1):113-7



ADN mitocondrial Las mitocondrias se transmiten

únicamente de la madre a sus hijos. Dado que las mitocondrias que porta el espermatozoide no penetran en el óvulo en el momento de la fertilización (sólo penetra el núcleo), todas las mitocondrias que posee una persona en sus células provienen de su madre. Por tanto, no hay diploidía, meiosis, ni existe la recombinación en el ADN de las mitocondrias.

El ADN mitocondrial es circular, con dos cadenas complementarias de 16.569 nucleótidos y tiene 37 genes, de los que 13 codifican para ARN mensajeros y por lo tanto para proteínas, 22 para RNA de transferencia y 2 para RNA ribosómico.

El ADN mitocondrial se analiza habitualmente mediante secuenciación o enzimas de restricción, aunque lógicamente en este caso el resultado es menos informativo. Habitualmente se estudian dos regiones hipervariables, HVR-I y HVR-II, dos zonas en su mayor parte neutrales y con una gran variabilidad, lo que permite una resolución prácticamente a escala familiar.

Esquema del ADN mitocondrial humano

Puesto que el ADN mitocondrial no experimenta recombinación, todos los nucleótidos

de su secuencia están completamente ligados. Por ello, pueden definirse haplotipos mediante diferentes SNPs, que se transmitirán de las madres a sus descendientes. Conforme se acumulen las mutaciones, los haplotipos irán cambiando. Entonces, aquellos que sean similares pueden agruparse en haplogrupos, que tendrán un origen común.

Desde los primeros análisis, se utilizó el ADN mt para describir el proceso de colonización de los diferentes continentes por el hombre moderno (versión femenina). En la figura se muestra la dispersión de los principales haplogrupos a lo largo de este proceso. L3 deriva de L; M y N derivan de L3; R deriva de N y así sucesivamente.



Dendrograma de un grupo de primates obtenido a partir de ADN mt. Se incluye la secuencia del neandertal encontrado en Alemania en 1856 y la secuencia de numt, un fragmento de ADN nuclear del cromosoma 11, cuyo origen parece ser mitocondrial.

Gagneux et al 1999 Proc Natl Acad Sci 96:5077-5082

Dendrograma obtenido a partir de secuencias de ADN mt de humanos, Neandertales y Denisovanos.

Slon et al. (2017). Science Advances, 3(7), e1700186. ¿Quiénes eran los Denisovanos? Capítulo 6



Cromosoma Y El cromosoma Y tiene una región no recombinante, que no se empareja con el

cromosoma X. Este fragmento, por tanto, permite definir haplotipos con SNPs completamente ligados. Y con haplotipos similares pueden definirse haplogrupos. Analizar la distribución geográfica de los haplogrupos del cromosoma Y permite describir la colonización de los diferentes continentes por el hombre moderno, en su versión masculina.

Genealogía de los haplogrupos del cromosoma Y. Con estos marcadores se ha intentado que las denominaciones siguieran el alfabeto por orden de antigüedad.

Hallast et al. 2015. Mol Biol Evol, 32: 661-

673



Número de copias variable (CNVs) Los polimorfismos de variación en el

número de copias se refieren a las alteraciones en el número de copias de un fragmento de ADN mayor de 1 Kb, respecto de un genoma de referencia. Estas alteraciones pueden implicar deleciones (menor tamaño que la referencia), duplicaciones (mayor tamaño) deleciones y duplicaciones combinadas o patrones más complejos, como puede observarse en la figura.

Pueden incluirr desde 1.000 nucleótidos a varios millones.

Redon et al, 2006. Nature 444:444-454

Podría estar implicado en polimorfismos de este tipo entre el 5 y el 10% del genoma.

En la figura se muestra la distribución de los CNVs por cromosomas para inserciones (a), delecciones (b) y mezcla de ambas (c), analizados a dos niveles de resolución.

Analizando este tipo de polimorfismos se han encontrado alrededor de 100 genes que pueden encontrarse completamente eliminados de un cromosoma sin aparentes efectos para sus portadores.

Zarrey et al, 2015 Nature Reviews Genetics 16:172-183



Pueden analizarse mediante diferentes

técnicas, pero principalmente mediante micromatrices, con sondas que identifican zonas representativas de las regiones duplicadas o perdidas.

En general son bastante útiles para discriminar entre poblaciones de diferentes orígenes, como se observa en la figura.

Redon et al, 2006. Nature 444:444-454

Genomas completos

Los métodos de secuenciación de segunda generación (Next Generation Sequencing, NGS) han permitido obtener genomas completos, tanto de individios vivos como de muestras de ADN antiguo y arcaico.

No obstante, el término genoma completo no implica una secuencia completa del ADN. A veces se incluyen en este grupo los exomas completos, que son secuencias de los exones de todos los genes de un individuo, pero en general se refiere a la identificación de todos los SNPs. De hecho, las inserciones Alu y los VNTRs todavía no han sido analizados por estos métodos.

Como toda técnica novedosa y relativamente cara, no todos los continentes o poblaciones se encuentran igualmente representados en estos análisis. A modo de ejemplo, en la figura se representan los ADNs antiguos y arcaicos que se han analizado hasta 2017. Claramente hay una sobrerrepresentación de poblaciones europeas.

Marciniak et al. (2017). Nature Reviews Genetics. 18(11):659-674

Naturalmente, con este tipo de datos la resolución es máxima. En la imagen se muestra un análisis Structure de 300 genomas completos de individuos actuales de diferentes continentes.

Mallick et al. (2016). Nature, 538, 201-206.



En un análisis de Componentes Principales sobre los mismos datos, la disposición de

los individuos refleja claramente el proceso Out of Africa.

Mallick et al. (2016). Nature, 538, 201-206.

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