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NMR e diffusione molecolare in tessuti biologici

CAPITOLO 2 STUDIO DELLA DIFFUSIONE MEDIANTE IMMAGINI DI RISONANZA MAGNETICA 2.1 NMR e diffusione molecolare in tessuti biologici

Con il termine diffusione si indica il moto caotico e disordinato delle molecole di un

sistema dovuto all’agitazione termica.

I tessuti biologici possono svolgere le loro funzioni vitali all’interno di un range di

temperature che va da 273°K a 315°K : in tali condizioni la maggior parte degli elementi

biologici si presenta allo stato liquido o in soluzione acquosa. La diffusione riveste perciò

un ruolo primario nei processi di trasporto che avvengono in ambito metabolico; il

principale mezzo di trasporto in tali processi è l’acqua, che rappresenta circa il 70% in

volume dei tessuti biologici.

I tessuti, a livello microscopico, non presentano una struttura omogenea: le membrane

cellulari ed i vari organelli formano ostacoli al movimento dell’acqua e delle altre molecole

biologiche. Misure riguardanti la mobilità delle molecole d’acqua possono quindi fornire

rilevanti informazioni sulla struttura dei tessuti e sulla presenza di eventuali alterazioni

patologiche.

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NMR e diffusione molecolare in tessuti biologici

2.1.1 Processo di diffusione molecolare

Le tecniche tradizionali per lo studio di processi diffusivi utilizzano un tracciante, iniettato

nella zona di interesse, di cui registrano i profili spazio-temporali di concentrazione. Per

un mezzo isotropo vale la legge di Fick , in base alla quale il flusso di tracciante risulta: a1

J = - D (2.1) C∇ dove C è la concentrazione molecolare di tracciante e D il “coefficiente di diffusione”

del mezzo. Quindi è possibile determinare D a partire dal rapporto tra J e , dove

queste ultime grandezze possono essere misurate mediante opportuni metodi di natura

fisica o chimica.

C∇

Secondo il Sistema Internazionale si utilizzano le seguenti unità di misura:

J = [moli/sec · 2m ] , = [moli/C∇ 4m ] , D = [ 2m /sec ] Sostituendo l’eq.(2.1) nell’equazione di conservazione della massa, data da:

t∂

∂C = - ∇ · J (2.2)

si ottiene l’equazione di diffusione:

t∂

∂C = ∇ · (D ) (2.3) C∇

Nel caso in cui D sia uniforme nello spazio, il mezzo sia infinito (ossia il flusso non è

ostacolato) ed il profilo iniziale di concentrazione sia:

C(r,t) = δ(r - ) 0r

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l’eq. (2.3) ha una soluzione data da:

⎟ ⎠

⎞ ⎜ ⎝

⎛ −⋅− ⎟⎟ ⎠

⎞ ⎜⎜ ⎝

⎛ π

= 4Dt

)()(-exp Dt4

1t)C( 3

00 rrrr,r (2.4)

Utilizzando l’equazione di diffusione e ricorrendo all’ausilio di traccianti radioattivi o

fluorescenti è possibile perciò determinare il coefficiente di diffusione del sistema in

esame.

Si può notare, poi, che il coefficiente D definito sopra coincide con quello presente nella

relazione ricavata da Einstein:

(r - ) · (r - ) = 6Dt (2.5) 〈 0r 0r 〉 che esprime la varianza del processo stocastico P(r/r0,t), il quale fa riferimento alla probabilità di trovare una molecola in una posizione r ad un istante t partendo da una

posizione iniziale . La (2.5) è valida in caso di diffusione libera (senza ostacoli). 0r

In accordo alla relazione di Einstein esiste una proporzionalità diretta tra la distanza di

diffusione (cioè il cammino medio percorso da una molecola in movimento diffusivo) ed il

tempo di percorrenza: andando a disegnare su un piano cartesiano tale relazione, la

pendenza della retta ottenuta è una misura del coefficiente di diffusione della specie in

esame.

Le tecniche che utilizzano traccianti operano in situazioni di non equilibrio e riescono

difficilmente a sondare strutture inferiori al millimetro. Per studi di diffusione a livello

microscopico si utilizzano tecniche di scattering laser o neutronico, arrivando anche a

risoluzioni dell’ordine del nanometro; tali procedure sono però molto invasive e quindi

difficilmente applicabili per studi in vivo e sull’uomo.

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NMR e diffusione molecolare in tessuti biologici

2.1.2 NMR e diffusione

La tecnica NMR rappresenta l’unica metodica totalmente non invasiva che ci permetta di

eseguire studi di diffusione molecolare a livello cellulare.

Il principio su cui si basa tale procedura è quello dell’effetto IVIM (Intra Voxel Incoherent

Motion): in condizioni di equilibrio il flusso macroscopico molecolare in un mezzo diffusivo

è nullo, anche se a livello microscopico le singole molecole sono soggette ad un moto

incoerente e casuale.

In NMR è possibile implementare specifiche sequenze sensibili al moto incoerente delle

molecole, ottenendo una perdita di segnale FID nelle zone a maggior diffusione. L’idea è

quella di utilizzare un gradiente bipolare come quello di fig. 2.1 (sequenza di Stejskal-

Tanner): in pratica si tratta di una sequenza Spin-Echo cui si aggiungono due gradienti di

campo magnetico, di ampiezza G, intervallati dall’impulso a 180°. Il tempo di applicazione

di ogni gradiente è pari a δ, mentre il tempo che intercorre tra le applicazioni dei due

gradienti è ∆. I due gradienti, detti “gradienti di diffusione”, per distinguerli da gradienti

utilizzati per altre funzioni (tipo l’imaging), hanno lo scopo di marcare magneticamente gli

spin.

Figura 2.1: Sequenza di Stejskal – Tanner con i due gradienti di diffusione, G, applicati per un intervallo di tempo pari a δ e distanziati a loro volta di un intervallo ∆.

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Il primo gradiente induce uno sfasamento 1φ della magnetizzazione trasversale che

dipende dalla posizione del singolo spin. Se il gradiente è applicato lungo l’asse z si ha:

(2.6) 1 0

11 zGdtzG δγ∫

δ

==φ

dove è la posizione dello spin , che viene supposta costante durante l’intervallo δ. 1z

Lo sfasamento prodotto dal secondo gradiente di diffusione (applicato ancora lungo la

direzione z) è dato similmente da:

(2.7) 222 zGdtzG δγ∫ δ+∆

∆

==φ

dove è la posizione dello stesso spin all’istante di applicazione del secondo gradiente. 2z

Tenendo conto che il secondo gradiente di diffusione è applicato dopo l’impulso a 180°,

che inverte la magnetizzazione trasversale , otteniamo uno sfasamento totale dato da:

( ) ( )2121 zzG −− δγ=φφ=φδ (2.8) Per spin statici si ha e lo sfasamento prodotto dai due gradienti è nullo. Al

contrario, per gli spin in movimento si ha uno sfasamento globale diverso da zero, che

dipende dal moto molecolare durante l’intervallo ∆, ossia dai processi di diffusione nel

mezzo in esame. Possiamo anche notare come lo sfasamento ottenuto sia indipendente

dalla posizione dei due gradienti in termini temporali rispetto all’impulso a 180°.

21 zz =

La magnetizzazione che noi andiamo a misurare è data dalla somma dei momenti

magnetici di ogni singolo spin, ognuno con le sue caratteristiche di moto. Otteniamo perciò

la seguente relazione:

( )(∑ φδ= j

j 0

iexp M M ) (2.9)

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dove è la magnetizzazione di equilibrio. 0M