cancerul -

of 94 /94
CANCERUL, O BOALĂ PROVOCATĂ DE ALTERAREA GENELOR 1

Author: chiper-zaharia-daniela

Post on 18-Dec-2015

74 views

Category:

Documents


12 download

Embed Size (px)

DESCRIPTION

cancer

TRANSCRIPT

Cancerul - Boala Provocata de Alterarea Genelor

CANCERUL, O BOAL PROVOCAT DE ALTERAREA GENELOR

CUPRINS

Capitolul 1CANCERUL, O BOAL PROVOCAT DE

ALTERAREA GENELOR......................................................................3

1.1.

ETAPE N DEZVOLTAREA CANCERULUI...............................................................................5

1.2.GENE IMPLICATE N APARIIA I DEZVOLTAREA CANCERULUI.................................................5

1.2.1. ONCOGENE.......................................................................6

1.2.2.PROTO-ONCOGENE........................................................6

1.2.3. GENE SUPRESORI TUMORALI.....................................7

1.3.ABORDRI RECENTE N TERAPIA CANCERULUI...............8

1.3.1.TERAPIA VIRAL............................................................8

1.3.2.INHIBAREA TELOMERAZEI..........................................8

1.3.3.INHIBAREA ANGIOGENEZEI........................................8

1.3.4.MIGRAREA CELULELOR TUMORALE........................8

1.3.5.APOPTOZA........................................................................9

Capitolul 2CANCERUL I DIETA.........................................................................11

2.1.DIETA N PREVENIREA CANCERULUI.................................12

2.2.ANTIOXIDANI N TERAPIA ANTI-CANCER.....................12

2.3.ANTIOXIDANII I APOPTOZA..............................................15

2.3.1.SELENIUL.........................................................................15

2.3.2.VITAMINA E....................................................................15

2.3.3.OLIGOPRAONTOCIANIDINELE...................................18

2.3.4.VITAMINA A....................................................................20

2.4.TOPUL ALIMENTELOR CU ROL N COMBATEREA CANCERULUI.......................................23

Capitolul 3MATERIALE I METODE.... 25

3.1.PREPARAREA SUBSTANELOR 25

3.2.MATERIALUL BIOLOGIC 26

3.3.TEHNICA CITOMETRIEI N FLUX27

3.3.1.PREPARAREA PROBELOR.32

3.3.2.PROTOCOLUL DE LUCRU......33

3.4.IMUNOMARCAREA...................................................................33

3.5.ANALIZA CALITATIV A FRAGMENTRII

ADN N GEL DE AGAROZ..................................................34

Capitolul 4REZULTATE I DISCUII.36

4.1.REZULTATELE CITOMETRIEI N FLUX................................36

4.2.REZULTATELE IMUMOMARCRII....46

4.3.REZULTATELE ANALIZEI CALITATIVE A FRAGMENTRII ADN N GEL DE AGAROZ.................49

Capitolul 5CONCLUZII.........................................................................................50

BIBLIOGRAFIE...............................51

Capitolul 1

CANCERUL, O BOAL PROVOCAT DE ALTERAREA GENELOR

Cancerul este o boal provocat de proliferarea celular necontrolat i invaziv. In ziua de azi se estimeaz c o treime din copii vor dezvolta o form de cancer n timpul vieii lor. Cele mai comune tipuri de cancer sunt cancerul de sn, cancerul de prostat i cel de colon.

Nu se cunoate cauza exact a apariiei i a dezvoltrii tumorilor maligne. Unele cancere sunt genetice, iar altele sunt probabil determinate de mediul de via (diet, fumat etc).Cancerul este o boal provocat de mutaia genelor implicate n reglarea ciclului celular i a proliferrii celulare.

In cancer apar alterri fundamentale ale mecanismului genetic de reglare a ciclului celular, ce au ca rezultat proliferarea celular necontrolata.Mutaiile apar, n principal, n 2 clase de gene: proto-oncogene i gene supresori tumorali. In celulele normale, produii proto-oncogenelor acioneaz la diferite nivele n calea de reglare a proliferrii celulare. Versiunile mutante ale proto-oncogenelor sau ale oncogenelor promoveaz creterea tumoral. Inactivarea total sau parial a genelor supresori tumorali, ca p53 i Rb, determin disfuncii ale proteinelor (sau chiar absena acestor proteine) care, n mod normal, inhib progresia n cadrul ciclului celular. In cancer, au fost observate mutaii la nivelul genelor ce codific pentru proteinkinaze ciclin-dependente (CDK), cicline, enzime ce activeaz CDK, inhibitori ai CDK (CKI), substraturi pentru CDK i alte proteine care activeaz n punctele de control ale ciclului celular.

Cancerele au origine clonal, rezultnd din celule normale ce au suferit mai multe modificri genetice ce le-au conferit un avantaj selectiv. n ciuda complexitii procesului de transformare a celulelor normale n celule tumorale, selecia pentru supravieuire pare s fie o trstur comun a tuturor tipurilor de cancer. Evoluia celulelor canceroase nu urmeaz un traseu specific, ci pare s fie o cale format din mai muli pai ce favorizeaz transformarea genetic ce confer celulei capacitate de supravieuire nelimitat. Cancerele avansate, care prezint independen fa de factorii de cretere i rezisten la apoptoz, prezint o capacitate de supravieuire i mai mare.

Fig 1. Etape n formarea unei celule maligne

Celulele canceroase prezint membrana plasmatic i citoplasma anormale, se divid rapid i ignor semnalele de inhibare a ciclului celular. Aceasta determin formarea de mase de celule numite tumori. Odat ce mecanismul de control al ciclului celular este ineficient, celulele canceroase se divid rapid, i pierd poziionarea normal i inhibiia de contact.

Tumorile pot fi benigne sau maligne. Tumorile benigne sunt alctuite din celule asemntoare celulelor din esutul n care se gsesc, cresc greu i nu migreaz n alte regiuni ale corpului. Celulele maligne sunt diferite fa de celulele din esutul n care se gsesc, se divid rapid i pot migra n alte regiuni ale organismului.

Fig.2. Tumor benign vs tumor malignDac au nutrieni adecvai n mediul de cultur, celulele canceroase se divid indefinit. Linia celular HeLa este cultivat deja de o jumtate de secol, indicnd c telomeraza este nc activ n aceste celule. Odat ce o linie celular devine canceroas, diviziunea celular nu poate fi oprit i va continua pn cnd organismul purttor de celule canceroase moare sau pn cnd acestea vor fi distruse sau eliminate chirurgical.

In ciuda studiilor intense efctuate i a progreselor realizate, un tratament eficient al cancerului sau o metod de prevenire a acestei teribile maladii, nu au fost nc puse al punct. Cancerul ocup locul 2 n lume n privina mortalitii, dup bolile de inim.

1.1. ETAPE IN DEZVOLTAREA CANCERULUI

1. expunerea la un carcinogen;2. ptrunderea carcinogenului n celul;3. iniierea procesului canceros prin mutaia genelor ce regleaz ciclul celular;4. promovarea cancerului prin transformarea celulelor;5. formarea tumorii i creterea celular necontrolat.Majoritatea oamenilor de tiin sunt de prere c apariia i dezvoltarea procesului canceros reprezint o acumulare de mutaii i nu o singur mutaie. La ora actual, cercetrile se concentreaz asupra cauzelor ce determin alterarea ADN-ului, cu rezultat n modificarea structurii i a funciei genelor ce controleaz ciclul celular.

1.2. GENE IMPLICATE N APARIIA I DEZVOLTAREA CANCERULUI

Unele dintre proteinele cheie asociate cu cancerele umane sunt:1. proteina Ras- prezint mutaii n 20-30% din cancerele umane;

2. proteina Src- prezint mutaii n 2-5% din cancerele umane;

3. proteina Rb- prezint mutaii n 40% din cancerele umane i aproximativ 90% din cancerele umane prezint anomalii la un anumit nivel n calea Rb;

4. proteina p53- prezint mutaii n 50% din cancerele umane.

Fig. 3. Mutaia genei p53 n celule tumorale

1.2.1. Oncogenele sunt gene care promoveaz cancerul. Existena acestei categorii de gene a fost intuit de ctre Peyton Rouse, nc din anul 1910, n urma induciei tumorale (a cancerului aviar) la puii infectai cu virusul RSV (Rous avian sarcoma virus ). Virusul RSV poart o gen ce codific un receptor enzimatic pentru o molecul semnal din calea tirozin kinazic ce funcioneaz n reglarea ciclului celular; dar pentru c gena se gsea n structura virusului, ea nu era sub controlul genetic al al celulelor organismului avian. Astfel, celulele gazd au sintetizat enzima viral, a crei prezen permanent n celul meninea calea tirozin kinazica constitutiv activ.

1.2.2. Proto-oncogenele sunt gene similare ce se gsesc n celule normale, dar nu sunt active. Proto-oncogenele codific proteine necesare celulei n anumite momente ale procesului ontogenetic (de obicei, n primele etape ale acestui proces). Mutaia genelor care, n mod normal, regleaz ciclulul celular prin represia diviziunii celulare, poate determina formarea tumorilor i apariia cancerului. Cnd o proto-oncogen este activat, ea devine oncogen i are ca rezultat o supraexprimare a produsului genei.

Printre mecanismele prin care o proto-oncogen poate fi activat, devenind oncogen, se numr:

1. translocarea genei n apropierea unui promotor activ;

2. amplificarea genei astfel nct mai multe cpii ale genei pot fi transcrise;

3. mutaia genei datorit aciunii unui carcinogen;

4. aciunea unui virus.Virusurile cu ciclu lizogen, prin inseria n genomul celulelor gazd, n anumite situri, pot activa oncogene ce codific pentru factori de cretere sau pentru receptori pentru factori de crestere, implicai in proliferarea celular.Oncogenele codific: receptori membranari sau citoplasmatici pentru factori de cretere, protein-kinaze, factori transcripionali, proteine nucleare cum ar fi, cicline, antagoniti ai genelor supresori tumorali, antagoniti ai apoptozei.

Fig. 4. Mutaia unei proto-oncogene sub aciunea unui carcinogen1.2.3. Genele supresori tumorali au rolul de a verifica integritatea ADN-ului i de a iniia repararea sa, dac este nevoie, iar dac aceasta nu poate avea loc, genele supresori tumorali mpiedic diviziunea celular sau determin distrugerea celulelor prin apoptoz. Pe lng activarea oncogenelor pentru declanarea cancerului, este nevoie, deci, i de inactivarea genelor supresori tumoraliPrintre genele supresori tumorali se numr:

1. gene ce codific pentru receptori membranari sau pentru proteine de adeziune. Mutaia acestor gene determin anularea inhibiiei de contact i diviziunea necontrolat a celulelor;

2. gene ce codific pentru proteine implicate n repararea ADN; alterarea acestor gene determin acumularea de mutaii la nivelul ADN;

3. gene ce regleaz diviziunea celular (regleaz punctele de control ale ciclului celular);

4. gene ce controleaz apoptoza.

1.3. ABORDARI RECENTE IN TERAPIA CANCERULUI

La ora actual, cercetrile n terapia cancerului se axeaz pe activarea genelor implicate n reglarea ciclului celular i a celor implicate n apoptoz. Odat identificate genele unde apar mutaii n cancer (proto-oncogene i gene supresori tumorali), n momentul de fa se ncearc contracararea efectelor acestor mutaii prin mai multe metode, cum ar fi: terapia viral, inhibarea telomerazei i a angiogenezei n celulele tumorale, prevenirea migraiei celulelor maligne sau stimularea apoptozei n celulele canceroase.

1.3.1. Terapia viral este promitoare pentru contracararea cancerelor ce prezint mutaii la nivelul genei p53. Adenovirusurile pot infecta doar celulele gazd care au proteina P53 cu funcie deficitar sau chiar absent. Astfel de virusuri pot fi folosite pentru a distruge celulele canceroase ce prezint mutaii n gena p53, dar nu afecteaz celulele normale (ntr-o celul al crei genom nu prezint mutaii, gena normal p53 nu poate fi inactivat pentru a permite sinteza ADN viral).

Fig. 6. Terapia viral1.3.2. Inhibarea telomerazei are efecte promitoare asupra ncetinirii proliferrii i dezvoltrii tumorale.1.3.3. Inhibarea angiogenezei. Pe msur ce celulele tumorale cresc, ele secret factori de cretere pentru vasele de snge, proces numit angiogenez. Blocarea formrii vaselor de snge la nivelul tumorii, conduce la nfometarea celulelor canceroase i, n final, la moartea acestor celule. 1.3.4.Migrarea celulelor tumorale. Ultima etap a procesului cancerigen este metastaza, adic migrarea celulelor tumorale, pe cale limfatic, spre alte yone ale organismului unde se vor fixa si vor determina formarea de noi tumori. Dac acest lucru se ntmpl, ndeprtarea chirurgical a tumorii devine dificil sau chiar imposibil, oricum ineficient. Substanele chimice ce pot preveni migrarea celulelor tumorale pot fi folosite n blocarea etapei metastazante.

1.3.5. Apoptoza (moartea celular programat) este de o importan vital pentru via, n sensul strict al cuvntului. Apoptoza reprezint unul dintre mecanismele principale ce ne protejeaz mpotriva proliferrii celulare necontrolate, cu potential malign. Este corect s spunem c nici o tumor malign nu se dezvolt dect dac mecanismul apoptotic este afectat de modificri genetice sau epigenetice.

Mecanismele non-imune de supraveghere i de protecie mpotriva transformrii maligne a celulelor, se mpart n 4 categorii:

mecanisme genetice - se refer la repararea ADN;

mecanisme epigenetice - se refer la stuctura cromatinei;

mecanisme intracelulare, n special apoptoza i blocarea ciclului celular;

mecanisme intercelulare, n special inhibiia de contact.

Aceste mecanisme sunt strns conectate, iar apoptoza reprezint un numitor comun ntre cel puin 3 dintre aceste mecanisme.

Apoptoza i blocarea ciclului celular reprezint cele mai importante mecanisme de control ce previn creterea tumoral. Apoptoza este un program n mai muli pai, care se termin cu clivarea enzimatic a ADN nuclear. Poate fi declanat de semnale extrinseci (ce se leag la receptorii pentru semnale externe death receptor ) sau intrinseci (calea apoptotic). Majoritatea programelor apoptotice converg spre activarea caspazelor care cliveaz substraturile celulare, conducnd la modificri specifice morfologice i biochimice.

Mecanismele de moarte celular pot fi dezactivate n celulele canceroase la mai multe niveluri, ce includ: supraexpresia inhibitorilor apoptozei (cum ar fi BCL2),mutaii ce inactiveaz caspazele, mutaii n genele proapoptotice (cum ar fi BAX, APAF1, CD 95), mutaii n genele ce au rol n suravegherea integritii ADN-ului (cum ar fi genele p53 sau Rb) sau alterarea cilor apoptotice.

Celulele tumorale pot scpa de apotoz i prin expresia ridicat a moleculelor antiapoptotice. De exemplu, gena BCL2 poate fi supraexprimat n urma unei translocaii lng un locus imunoglobulinic.

Toate celulele canceroase prezint un prag apoptotic foarte ridicat, iar blocarea cilor apoptotice este o parte esenial a evoluiei neoplazice.

Efectul terapeutic al radioterapiei sau al chimioterapiei a fost iniial atribuit efectului genotoxic direct al acestor metode terapeutice asupra celulelor canceroase. La ora actual, este clar ca efectele acestora se datoreaz i capacitii lor de a induce apoptoza n celulele canceroase. Dezvoltarea rezistenei la tratamentele genotoxice poate fi asociat cu o cretere a pragului apoptotic. Problema, n cazul radioterapiei sau al chimioterapiei, este reprezentat de faptul c agenii genotoxici utilizai afecteaz att celulele canceroase, ct i celulele normale.

Din aceast cauz, cercetri recente se axeaz pe utilizarea de suplimente nutritive ce conin combinaii de diferite extracte naturale cu capacitatea de a induce apoptoza n celulele canceroase, fr a afecta celulele normale.

Acestea reprezint cteva dintre intele cercetrii n terapia cancerului, la ora actual. Chiar dac aceste terapii sunt promitoare, pentru fiecare tip de cancer identificat trebuie analizate cauzele declanrii i promovrii sale, precum i stabilirea tratamentului potrivit. Cu toate c s-au fcut i se fac pai mari n terapia cancerului, majoritatea celor prezentate mai sus sunt n stadiu de testare i nu sunt la dispoziia publicului.

Capitolul 2

CANCERUL I DIETACancerul este a doua cauz a morii n Statele Unite. Societatea American de Cancer estimeaz 1 368 030 de noi cazuri diagnosticate cu cancer n 2004 i 5 637 000 de decese cauzate de cancer. Cota supravieuirii variaz n funcie de tipul de cancer i de stadiul n care este diagnosticat i se estimeaz c rata relativ de supravieuire pentru toate tipurile de cancer este de aproximativ 63%.

Printre cauzele declanrii cancerului se numr i lezarea ADN-ului i a altor molecule biologice de ctre speciile reactive de oxigen, aceasta reprezentnd una dintre cauzele majore de declanare i de progresie a cancerului. Speciile reactive de oxigen sunt produi secundari ai metabolismului normal, a cror concentraie crete n inflamaii i la expunerea la surse exogene, cum ar fi: oxizi de azot, fum de igar, unele droguri i radiaii. Toi aceti factori pot produce mutaii cauzatoare de cancer, oxidarea lipidelor i a proteinelor i pot altera cile de transmitere intracelular a semnalelor, ceea ce crete riscul de apariie a cancerului.

Studiile experimentale susin rolul SRO (specii reactive de oxigen) n evoluia cancerului, prin evidenierea rolului antioxidantilor din diet (vitamina E, vitamina C, seleniu, -caroten sau ali produi de origine vegetal) sau a antioxidanilor endogeni (glutation) care neutralizeaz sau capteaz SRO, jucnd astfel rolul de ageni ce previn cancerul. Studiile in vivo aduc mai multe date n acest sens, demonstrnd c stresul oxidativ crete odat cu progresia cancerului de sn i c o diet bogat n antioxidani exogeni reduce riscul de a dezvolta unele tipuri de cancere.

Rolul nutriiei n prevenirea i tratamentul cancerului a fost dezbtut intens n cadrul manifestrii tiinifice American Institute for Cancer Research Conference on Food, Nutrition and Cance, n anul 2003. Devine din ce in ce mai evident faptul c tratamentul cancerelor agresive, care metastazeaz n timp scurt, reprezint o provocare dificil i presupunerile c un singur agent ar putea elimina asemenea cancere sunt nerealiste.

Radioterapia i chimioterapia - tratamentele tradiionale anti-cancer - se bazeaz pe genererea de radicali liberi i pe distrugerea celulelor canceroase de ctre acetia. Dar se ridic ntrebarea dac antioxidanii care protejeaz celulele normale fa de efectul radicaliilor liberi nu protejeaz i celulele canceroase, anulnd astfel efectul terapiei anti-cancer.

Studii recente sugereaz totui c unii antioxidani exogeni pot aciona drept adjuvani n terapia anti-cancer datorit abilitii lor de a induce moartea celular programat (apoptoza). Studii in vitro demonstreaz c vitamina E, vitamina C, vitamina A, seleniu i ali produi vegetali induc apoptoza n celulele tumorale, dar nu i n celulele normale. Alte studii demonstreaz c vitamina C este un factor angiostatic ce prezint un efect benefic n rezistena fa de creterea i invazivitatea tumorii.

2.1. DIETA N PREVENIREA CANCERULUI

Protejarea celulelor normele fa de evenimente ce pot promova cancerul reprezint elul principal al meninerii sntii i servete la prevenirea pe termen lung a efectelor secundare ale terapei anti-cancer ce poate da natere la cancere secundare n anii urmtori. Studii epidemiologice arat c riscul de a dezvolta anumite tipuri de cancere (cancer de faringe, esofag, plmni, stomac, colon i rect) este invers proporional cu consumul de fructe i legume ce conin antioxidani naturali, microelemente, compui chimici de origine vegetal i fibre.

Datele privind cancerele reglate hormonal (cancer de sn sau de prostat) nu sunt relevante n acest sens. ansa de a nu dezvolta cancer de sn a fost frecvent asociat cu consumul de morcovi i de vegetale de culoare verde, bogate n carotenoizi, iar un risc redus de a dezvolta cancer de prostat a fost asociat cu consumul de crucifere, de roii (care sunt bogate n licopin) i vegetale galbene. Consumul de ceap i usturoi (boagte in antioxidani cu sulf) a fost asociat cu risc redus de a dezvolta cancer gastrointestinal. Ceaiul verde, bogat n polifenoli, reduce riscul de a dezvolta cancer de sn i de ovar, la femeile asiatice.

2.2. ANTIOXIDANI N TERAPTIA ANTI-CANCERAntioxidanii reprezint un grup de molecule capabile s doneze un electron unui radical liber (fr s devin ei radicali liberi) inactivnd radicalul liber prin refacerea setului normal de electroni.

Mecanismele de aciune ale antioxidanilor sunt urmtoarele:

previn efectele radicalilor liberi prin captarea lor nainte ca acetia s afecteze celule sntoase;

doneaz electronul lips radicalului liber;

repar moleculele afectate de radicalii liberi, prevenind astfel reacia n lan, ce ar conduce la distrugerea celulei.

Efectul antioxidanilor n terapia anti-cancer depinde de o gam larg de factori, cum ar fi: starea metabolic a pacientului, localizarea i stadiul cancerului, precum i tratamentul folosit. In cazul radioterapeiei, radiaiile interacioneaz cu esutul int pentru o scurt perioad de timp i numai la locul iradiat. In cazul chimioterapiei, aciunea agentului terapeutic nu este restricionat la esutul int, ci se poate rspndi i n alte regiuni interacionnd cu mai multe tipuri de celule n zone diferite i pe perioade mai lungi de timp, n funcie de metabolism.

Principala int a radioterapiei i a chimioterapiei este reprezentat de producerea de mutaii la nivelul ADN-ului celulelor tumorale, mutaii ce vor conduce la moartea acestor celule. O alt int o reprezint modificarea homeostaziei celulare, a mecanismelor de transmitere intracelular a semnalelor, a statutului redox al celulelor i al dispoziiei lor pentru apoptoz.. Toate aceste modificri vor determina, n cele din urm, moartea celulelor tumorale, n special prin apoptoz.

In chimioterapie aproximativ toate medicamentele folosite acioneaz prin afectarea sintezei ADN. Deci aceste substane au efect doar asupra celulelor aflate n faza S a ciclului celular.

Radioterapia presupune folosirea radiaiilor electromagnetice i mai rar a celor corpusculare. Radiaiile pot ioniza direct sau indirect substratul (ADN). In acest al doilea caz (mult mai frecvent) radiaiile interacioneaz cu moleculele de ap, determinnd formarea de radicali liberi (cum ar fi superoxid, radicalul hidroxid) care vor difuza i vor interaciona cu ADN.

Tratamentul cu radiaii ucide celulele canceroase, dar afecteaz n egal msur, integritatea i supravieuirea celulelor nvecinate, sntoase. Radiaiile induc moartea celulelor n diviziune i activeaz cile apoptotice n celulele interfazice sau difereniate.

Dezvoltarea cancerului produce stres oxidativ care crete odat cu progresia bolii, astfel c nivelul de antioxidani scade ca rspuns la tratament, iar dozele terapeutice de radiaii distrug -tocoferolul din celule, ceea ce conduce la creterea riscului afectrii celulelor normale. S-a observat c un declin al nivelului vitaminei E i al seleniului n timpul radioterapiei pentru cancerul de sn, ca i o reducere marcant a nivelului vitaminelor A, C, E i al -carotenului n timpul tratamentului cancerului de sn cu doxorubicin conduce la o sensibilizare a esutului la aciunea radicalilor liberi.

Studii in vivo i in vitro au demonstrat c vitamina E, vitamina C, -caroten (pro-vitamina A) i seleniul previn transformarea malign a celulelor. Avnd n vedere posibilul efect protector al antioxidanilor, 5 studii ample au fost realizate n anii 90, pentru a evalua efectul protector al unor micronutrieni asupra celulelor.

Intr-un studiu relizat n China, s-a observat c tratamente combinate cu seleniu (50g), -caroten (15 g) i vitamina E (30 g) au determinat o inciden mai sczut a cancerului i o reducere cu 10% a mortalitii n cazul bolnavilor cu cancer gastric i esofagian. Intr-un alt studiu nu s-a observat atenuarea riscului de cancer de plmni la fumtori, n urma tratamentului cu vitamina A, -caroten i vitamina E. Vitamina E a avut, n schimb, un puternic efect asupra cancerului de proastat: a redus riscul de apariie cu 32% i a redus mortalitatea n cazul bolnavilor de cancer colorectal.

De la publicarea acestor prime rezultate, s-au mai fcut multe studii asupra rolului vitaminei E, a -carotenului i a seleniului asupra reducerii riscului de apariie a cancerului.

Intr-un studiu asupra efectului asocierii de -tocoferol, -tocoferol i seleniu, n tratamentul cancerului de prostat, s-a observat un declin al tumorii odat cu creterea concentraiei de -tocoferol i o reducere de 5 ori a riscului de cancer de prostat la nivele crescute de -tocoferol. S-a observat c seleniul protejeaz mpotriva cancerului de prostat numai dac nivelurile de -tocoferol sunt ridicate. Seleniul singur protejeaz mpotriva cancerului de plmni i de prostat.

-carotenul (care nu avut nici un efect asupra cancerului de plmni la fumtori) are efecte asupra cancerului de sn. In urma unui studiu asupra nivelelor plasmatice de retinol, retinil, palmitat, - i -caroten, -criptoxantin, licopina, - i -tocoferol, n corelaie cu dezvoltarea ulterioar a cancerului de sn, s-a observat o reducere cu 50% a riscului cancerului de sn la femeile cu nivele crescute de -caroten, licopin i caroten total, comparativ cu nivelele celorlali micronutrieni.

2.3. ANTIOXIDANTII SI APOPTOZA2.3.1. Seleniul este un micronutient cu activitate antioxidanta, fiind parte integranta a enzimei glutation peroxidaza ce anihileaza peroxizii. In celulele normale seleniul inhiba transformarea celulelor determinata de radiatii prin cresterea nivelului de antioxidanti dubland distrugerea peroxizilor si stimuland repararea ADN-ului in celulele cu gena p53 functionala. In unele celule transformate malign seleniul nu modifica nivelul de antioxidanti.

Efectul apoptotic al seleniului asupra celulelor tumorale a fost observat in special in culturile de celule. Seleniul induce apoptoza in celule canceroase de prostata si protejeaza fibroblastele normale (dar nu si celulele canceroase scvamoase) de doze simple sau multiple de radiatii. Seleniul se pare ca prezinta potential in depasirea rezistentei celulelor tumorale la medicamente: tratamentul cu seleniu al celulelor tumorale pulmonare rezistente la doxorubicina a determinat apoptoza masiva, in timp ce tratamentul celulelor sensibile a determinat necroza.

2.3.2. Vitamina E este un termen general folosit pentru a defini un grup de 8 componente naturale diferite cunoscute ca tocoferoli si tocotrienoli, ca si vitamine E sintetice si reprezinta un agent preventiv al cancerului. Vitamina E naturala, in forma ei cea mai intalnita in organismul uman, este recunoscuta drept un impotant antioxidant protejand lipidele polinesaturate de peroxidare. Cercetari recente sugereaza ca unele forma de vitamina E prezinta si functii non-oxidante si date ce sugereaza ca -tocoferolul natural este incorporat selectiv in organismn fata de alte forma active biologic de vitamina E demonstreaza importanta reevaluarii rolului vitainei E in sanatate si tratamentul bolilor.

Fig.1. Vitamina EVitamina E actioneaza impreuna cu seleniul prevenind transformarea maligana a celulelor in urma actiunii razelor X, sugerand rolul ei de protectie al celulelor de efectele secundare ale radioterapiei. Alfa-tocoferol succinat, singur sau in combinatie cu razele , prezinta efect de inhibare a cresterii celulare in mai multe linii celulare. Vitamina E a indus apoptoza in celule canceroase de san, prostata si in celule leucemice.

In studii pe animale, vitamina E, orala sau injectata, administrata in doze de 50mg/kg corp cu 7 zile inaintea iradierii a dus la scaderea semnificativa a cresterii sarcomului de soarece in urma iradierii. O doza mai crescuta nu a avut nici un efect sugerand efectele complexe ale vitaminei E, in vivo, in modificarea raspunsului tumoral la tratament.

Vitamina E succinat inhiba cresterea celulelor tumorale de colon si reduce numarul de metastaze in ficat, la soarecii cu cancer de colon, in unele cazuri chiar cu 75%. Deci , vitamina E promoveaza apoptoza si inhiba cresterea celulara in vivo.

Un studiu privind dieta si cancerul de san a demonstrat o relatie intre vitamina E si vitamina C si reaparitia bolii. Cea mai amre problema a femeilor ce au avut cancer primar de san este reprezentata de reaparitia bolii (in primii 5 ani riscul este 10-20%). Studii recente dmonstreaza ca suplimentarea dietei cu antioxidanti naturali este asociata cu un risc mai redus al aparitiei si al mortalitatii cancerului de san. Consumul de vitamina E sau de vitamina C pentru cel putin 4 ani inainte de diagnostic determina o scadere semnificativa a riscului de a dezvolta cancer de san. Cand vitamina E este consumata dupa stabilirea diagnoaticului determina numai o scadere usoara a mortalitatii si a riscului de reaparitie, in timp ce vitamina C se pare ca nu are nici un efect protector. Toate aceste date sugereaza ca prelungirea perioadei de folosire a antioxidantilor naturali este asociata cu reducerea riscului de reaparitie a cancerului de san.

Studiile clinice privind potentialul folosirii vitaminelor in vederea augmentarii radioterapiei sau chimioterapiei sunt putine si inconcludente. Intr-un studiu pe 45 de pacienti cu carcinom scvamos avansat la nivelul capului si gatului carora li s-a administrat -tocoferol impreuna cu interferon si cu acid cis-retinoic (dupa tratament chirurgical, radioterapie sau amandoua) a evidentiat o supravietuire de 84% dupa 2 ani, dar in acest caz este dificil de determinat contributia vitaminei E in lipsa lotului control.

Studiile experimentale au demonstrat ca vitamina E protejeaza celulele normale impotriva distrugerilor provocate de agentii terapeutici standard:

vitamian E administrata inaintea iradierii cu raze X a condus la cresterea ratei de supravietuire a animalelor iradiate si a redus nivelul deteriorarii ADN-ului in celulele normale;

tocoferolul in combimatie cu pentoxifilina a redus nivelul fibrozei determinata de radiatii;

vitamina E a redus nivelul fibrozei pulmonare determinata de bleomicina, toxicitatea cardiaca si necroza pielii indusa de adriamicina;

vitamina E, vitamina C si acidul 13-cis retinoic reduc ruperile cromozomale induse de bleomicina;

dozele de viatmina E ce inhiba proliferarea celulelor tumorale cervicale in cultura (dar nu si a fibroblastelor normale in cultura) cand sunt adminstrate inaintea radioterapiei au amplificat efectul terapiei (adica numarul de celule in mitoza a scazut si mai mult) si alterarea cromozomala in celulele canceroase. Aceleasi doze de viatamina E nu au avut efecte similare asupra celulelor normale, protejandu-le impotriva actiunii radiatiilor; tratamentul cu antioxidanti a redus efectele secundare ale radioterapiei la nivelul tesuturilor sanatoase la pacientii cu cancer pulmonar.Vitamina E este un micronutrient esential, important pentru mentinerea echilibrului intre reactiile pro- si anti-oxidante din tesuturi. Rapoarte recente au demonstrat ca vitamina E poate induce apoptoza in mai multe linii celulare. In celulele canceroase de colon ce prezinta gena p53 mutanta, un anaolg hidrosolubil al vitaminei E a indus apoptoza dependenta de p21. Intr-o linie celulara transformat de un retrovirus, -tocoferol succinat a indus apoptoza prin activarea c-jun si prin reglerea negativa a oncogenei c-myc.

-tocoferolul sau cambinatii de diferite forme de vitamina E au indus moartea celulara in celulele canceroase umane de prostata prin intreruperea sintezei sfingolipidelor. In celulele tumorale de colon, negative pentru p53 si pentru p21, -tocoferol succinatul a indus puternic apoptoza cooperand cu factorul de necroza tumorala,in timp ce tesuturile si celulele normale nu au fost afectate.

Toate aceste date sugereaza o implicare a vitaminei E, singura sau in combinatie cu agentii terapeutici clasici, in inducerea apoptozei in celulele tumorale, in relatie cu doza si timpul de administrare, protejand in acelasi timp celulele normale.

2.3.3. OPC (oligomeric poanthocyanidins) extrase din semintele de struguri si din scoarta unor pini, reprezinta cei mai puternici anti-oxidanti cunoscuti-de 50 de ori mai puternici deact vitamina E si de 20 de ori deact vitamina C.

Fig.2. Oligomeric proantocianidine

OPC reprezinta cei mai abundenti polifenoli din plante si sunt parte integranta din dieta, gasindu-se in concentratii crescute in fructe, cum ar fi merele, perele, strugurii, in ciocolata, vin sau ceai. OPC-urile din suplimenteel nutririve sunt in general extrase din struguri sau din scoarta de pin.

Datorite calitatilor lor antioxidante, OPC sunt intens studiate si s-a demonstrat ca prezinata efecte anticancerigene, antiinflamatoare, antimicrobiale, antialergenice, antivirale si vasodilatatoare, putand fi astfel folosite in tratamentul mai multor boli.

Proantocianidinele sunt polimeri ce greutate moleculara mare, formati din monomeri de flavan-3-ol care se repeta de 4-11 ori. OPC-urile extrase din struguri sunt formate din amestecuri de dimeri, trimeri, tetrameri, oligomeri si olimeri.

OPC-urile prezinta propietati antimutagene naturale, si desi mecanismul nu este clar cunoscut se pare ca prezinta calitati citotoxice selective in mai multe linii celulare tumorale (linii celulare tumorale de san, de plaman sau gastrice), dar nu si asupra celulelor gastrice normale sau asupra macrofagelor.

Pe langa efectele citotoxice, OPC-urile regleaza pozitiv genele ce promoveaza apoptoza si negativ genele ce inhiba apoptoza in celulele tumorale. Intr-un studiu in vitro pe un model de o tumoare de piele de soarece s-a demonstrat ca OPC-urile inhiba 2 markeri ai promovarii tumorale.

Printre efectele proantocianidinelor se numara:

protectia impotriva bolilor neurodegenerative: cancer, boli cardiovasculare, alergii, imbatranire;

traversarea barierei hematoencefalice imbunatatatind oxigenarea crierului;

actioneaza impotriva migrenelor;

protejeaza si mentine colagenul si productia sa, intarind astfel peretii si rezistenta capilarelor si ai microcapilerelor;

are efect antioxidant puternic, reprezenrand cel mai valoros nutrient impotriva imbatranirii la ora actuala;

mentine functiile circulatorii normale;

inhiba colagenazele si elastazele ce pot distruge tesuturile sanatoase;

reduc riscul de cancer;

reduc inflamatiile;

imbunatatesc functiile prostatei si flexibilitatea incheieturilor;

reduce oboseala si frecventa si severitatea racelilor;

potenteaza efectul vitaminelor;

imbunatatesc sistemul imunitar si acuitatea vizuala;

actineaza asupra apoptozei, a expresiei genelor si a factorilor de transcriere.

Proantocianidinele au fost studiate prima oara de catre profesorul Jacques Masquelier de la Universitatea din Bordeaux, Franta, dupa ce a citi cartea exploratorului francez Jacques Cartier. Acesta, in 1534, a facut o expeditie de iarna pe raul St. Lawrence, in New York, si echipa sa a fost prinsa in gheata si au inceput sa prezinte semne de scorbut, cu mult inainte sa se cunoasca cauzele acestuia. Au supravietuit dupa ce un amerindian i-a invatat sa faca un ceai din scoarta de pin. Profesorul Masquelier a postulat ca scoarta de pin trebuie sa contina vitamina C si flavonoide cu efecte asemanatoare ascorbatului si a studiat intens aceste substante pe care le-a numit generic picnogenoli. Astazi, acest termen este folosit doar ca marca pentru OPC-urile extrase din scoarta de pin din Franta. Denumirea general acceptata astazi este de complexe de proantocianidine OPC (oligomeric poanthocyanidins). In 1951, profesorul Jacques Masquelier a patentat o metoda de extractie a proantocianidinelor din scoarta de pin, iar in 1970 din seminte de struguri.

Cele mai bune surse de OPC-uri sunt semintele de struguri albi sau verzi (extractele prezinta 95% OPC) si scoarta de pin (extractele prezinta 85 % OPC).

In Europa, proantocianidinele sunt folosite in principal in tratamentul bolilor vasculare, cum ar fi: insuficienta venoasa, venele varicoase, fragilitatea capilara si retinopatiile.

Proantocianidinele au captat atentia in incercarea de a explica paradoxul francez: in Franta consumul ridicat de grasimi nu este asociat cu rate crescute ale aterosclerozei sau a bolilor coronare. O prima explicatie a acestui paradox a fost reprezentata de consumul de alcool sub forma de vin rosu ca factor preventiv. Mai tarziu, atentia s-a concentrat pe fractia fenolica din vinul rosu, inclusiv pe proantocianidine, ce prezentau propietati antioxidante puternice, reducand oxidarea LDL in vitro si inhiband ciclooxigenaza si lipooxigenaza in vivo.

In 1998, la Dietary Antioxidant and Human Health Conference de la Universitatea Tufts au fost prezentate rezultatele cercetarii efectelor proantocianidinelor asupra aparatului circulator.

Recent, cercetarile asupra efectelor proantocianidinelor au luat o alta turnura, si anume se cerceteaza rolul acestora in inducerea apoptozei in diferite linii celulare tumorale. S-a constatat ca extractul de seminte de struguri induce apoptoza in celule canceroase de prostata umane prin activarea caspazelor acompaniata de disiparea potentialul membranar mitocondrial si de eliberarea citocromului c.

Proantocianidinele din extractul de struguri inhiba carcinogeneza la nivelul pielii determinata de factori chimici, cat si

cea indusa de radiatii UV la soareci, dar mecanismul este inca neclar.

Tratamentul culturii celulare model pentru studierea proliferarii tumorale la keratinocite si a fibroblastelor p53 +/+ cu extract de struguri a indus apoptoza direct proportional cu doza administrata.

2.3.4. Vitamina A este un termen generic ce include compusi naturali, dar si sintetici ce prezinta activitati bilogice asemanatoare vitaminei A naturale (retinolul). Temenul de vitamina A este folosit pentru a denumi o vitamina liposolubila -all-trans retinol- obtinuta din dieta din surse animale, drept esteri retinil, dar si din surse vegetale, drept carotenoizi ( provitamine). Vitamina A joaca un rol important in mentinerea greutatii normale a corpului, in vedere, in reproducere, in mentinerea integritatii menbranare si in formarea oaselor. La animale, deficienta in vitamina A a fost asociata cu o incidenta mai crescuta a cancerului si cu o susceptibilitate mai crescuta la carcinogeni chimici.

Fig.3. Vitamina AIn ultimii ani s-a demonstrat existenta unei relatii clare intre vitamina A si dezvoltarea cancerului. Mai mult, studiile epidemiologice indica faptul ca indivizii cu o dieta deficitara in vitamina A prezinta un risc mai crescut de a dezvolta cancer. Aceste observatii au candus la ipoteza ca nivelele fiziologice de retinol protejeaza organismul de leziunile maligne sau premaligne. Modelele experimentale de carcinogeneza au demonstrat eficacitatea nivelelor farmacologice de vitamina A in prevenirea aparitiei si dezvoltarii cancerului de piele, cavitate bucala, plamani, san, prostata, sange, ficat si pancreas la animale expuse la carcinogeni. Studiile clinice au demonstrat ca vitamian A poate fi folosita in prevenirea cancerelor de piele, san, ovar sau de la nivelul superior al tubului digestiv.

Recent s-a deonstrat ca vitamina A inhiba cresterea celulara in mielom uman pe calea p21 si prin defosforilerea consecutiva a proteinei Rb. Vitamia A este un promotor puternic al cresterii si diferentierii la nivelul mai multor sisteme de organe. Aceste fenomene sunt insotite de apoptoza.

Studii recente au demonstrat ca acidul retinoic inhiba repararea leziunilor potential letale induse de radiatii in celulele tumorale cu un efect mai puternic decat cel provocat in fibroblastele normale. Intr-un studiu asupra inducerii apoptozei in celulele tumorale de piele s-a constata ca tratamnetul cu vitamina A a condus la cresterea nivelului ARNm si a expresiai proteinelor pentru p53 si a caspazele 3,6,7,9, care reprezinta reglatori cheie ai apoptozei.

Studiile epidemiologice au demonstrat existenta unei legaturi intre suplimentarea dietei cu antioxidanti si riscul de dezvolta anumite tipuri de cancere. In Statele Unite ale Americii multe persoane consuma suplimente nutririve cu antioxidanti, uneori in cantitati foarte mari, in incercarea de a impiedica dezvoltarea unor boli, printre care si cancerul. Totusi multe intrebari raman fara raspuns si necesita cercetari suplimentare, intrebari cum ar fi:

Care antioxidanti sunt mai eficienti?

Sunt antioxidantii izolati (cei din suplimentele nutririve) la fel de eficienti ca cei proveniti din dieta?

Care sunt dozele optime in functie de boala tratata, sex, varsta si pentru diferite profiluri genetice ale populatilor?

Care este rolul antioxidantilor odata cancerul diagnosticat si care sunt beneficiile/riscurile ale adminstrarii antioxidantilor in timpul radioterapiei sau al chimioterapiei in functie de tipul de cancer?In general, studiile experimentale demonstreaza ca antioxidantii omoara selectiv celulele canceroase prin apoptoza, in timp ce previn moartea celulelor normale, in vivo si in vitro , inhiband angiogeneza la locul tumorii si metastazarea. Pentru demonstrarea efectului de prevenire al cancerului prin consum de antioxidanti sunt necesare studii aditionale.

In ceea ce priveste parerea medicilor, opiniile sunt impartite: unii oncologi isi sfatuiesc pacientii sa nu consume suplimente nutritive cu antioxidanti in timpul terapiei anticancer, in timp ce altii iau in considerare datele recente si sunt de parere ca daca consumul de antioxidanti in timpul terapiei contribuie la mentinerea unei bune calitati a vietii, acest lucru este folositor terapiei anti-cancer.

2.4.TOPUL ALIMENTELOR CU ROL IN COMBATEREA CANCERULUI

Fundatia Nationala a Cercetarii Cancerului din America (The National Foundation of Cancer Research) a stabilit in 2004 un top al alimentelor cu rol in prevenirea si in combaterea cancerului.

1. Piperul este o sursa bogata de potasiu si de vitamine cu rol in prevenirea si in combaterea cancerului, cum ar fi vitamian C, vitamian A, acid folic. Piperul poate oferi protectie impotriva cancerului pulmonar prin blocarea efectelor carcinogene ale fumului de tigara si ale unor alimente;2. Cruciferele varza, brocoli, conopida, varza de Bruxelles, mustar, ridichi, gulie- contin fitochemicale puternice ce previn cancerul prin activarea enzimelor ce blocheaza patrunderea in celule a carcinogenilor si inhiba cresterea tumorala:3. Fructele de padure capsuni, mure, zmeura, fragute- contin vitamian C, acid folic si nivele crescute de fibre si de potasiu. Fructele de padure contin antioxidanti puteinici;4. Citricile stimuleaza sistemul imunitar sa lupte impotriva celulelor canceroase;5. Tomatele sub forma de pasta, sos sau ketchup- prezinta propietati antioxidante puternice. Licopina se pare ca are abilitatea de a reduce riscul de cancer de prostata (dar si de alte cancere) si joaca un rol cheie in apararea organismului impotriva imbatranirii si a unor boli neurodegenerative. Tempeartura ridicata este calea de distrugere a materialului fibros din tomate si de eliberare a licopinei;6. Uleiul de masline obtinut prin presarea mecanica a maslinelor, fara tratament termic sau chimic, reprezinta unul dintre cele mai sanatoase tipuri de grasimi si contine vitamian E si antioxidanti. Uleul de masline poate preveni dezvoltarea cancerului de colon si de san;7. Merele, in special coaja, contin fitochemicale cu rol dovedit in inhibarea cresterii cancerului de colon si de ficat;8. Dovleacul si cartofii dulci sunt descrisi ca batalioane virtuale de carotenoizi, in special -caroten;9. Usturoiul, ceapa, prazul contin organosulfine (substamtele ce dau mirosul specific) ce blocheaza carcinogenii;10. Fasolea, nucile, cerealele si painea integrala protejeaza impotriva cancerului de pancreas si de stomac. Contin multe fibre ce cresc viteza tranzitului intestinal, scazand astfel timpul in care carcinogenii pot dauna celulelor tubului digestiv.Capitolul 3

MATERIALE I METODE

Obiectivul acestei lucrri l reprezint testarea efectelor unor suplimente nutritive cu extracte naturale de pe piaa romneasc, asupra viabilitii i a dinamicii proliferrii celulare n culturi de celule tumorale de oarece.

Testarea substanelor cu activitate antitumoral se efectueaz in vitro pe modele de culturi celulare n sisteme de curb doz-rspuns. Acest tip de investigaie experimental a fost ales i pentru testarea efectelor pe celule tumorale a trei substane antioxidante: extract de germeni de gru Wheat Germ Oil (integrator natural de vitamina E), extract din semine de struguri (Grape Select) i complex de carotenoizi Carotenoid Complex (integrator de -caroten).

Testrile au fost efectuate pe cultur de celule tumorale din sarcomul Walker 256, carcinom transplantabil de obolan. Celulele au fost obinute din ascit tumoral, modelul de tumor lichid fiind preferat datorit facilitii de obinere rapid a unei culturi omogene. Efectele substanelor au fost apreciate n funcie de dinamica viabilitii i a proliferrii celulare, ct i n funcie de eficiena lor n inducerea apoptozei (analize de citometrie n flux i analiza fragmentrii ADN).

3.1. PREPARAREA SUBSTANTELOR

Suplimentele nutritive folosite au fost procurate astfel: extractul de smburi de struguri (Grape Select Innovatics Laboratories Inc., New York) a fost cumprat din farmacie, iar extractele de vitamina A i de vitamina E au fost achizitionate de la distribuitorul n Romnia, al produselor Cardinal Health Inc., Swindon, Marea Britanie.

a. Wheat Germ Oil - extract de germeni de gru (integrator de vitamina E) capsule, 1 capsul conine 10 mg vitamina E (100% doz zilnic recomandat - RDA).

b. Grape Select extract din semine de struguri capsule, 1 capsul = 100 mg extract.

c. Carotenoid Complex - integrator de -caroten-capsule, 1 capsul conine 1,50 mg -caroten, o,56 mg -caroten, 0,35 mg licopin, 0,14 mg lutein, 6 mg vitamina E.

Substanele au fost dizolvate n DMSO (concentraie final a DMSO n mediul de cultur - 1(l/ml) i apoi diluate n mediul de cultur pn la obinerea concentraiilor dorite. Substanele preparate au fost pstrate la ntuneric, la 40C.

3.2. MATERIALUL BIOLOGIC

Au fost cultivate celule tumorale obinute din ascit de tumor Walker 256 recoltat de la obolani. Au fost recoltate, prin puncie peritoneal, 2 ml ascit de la un obolan Wistar, purttor de tumor.

Celulele tumorale au fost obinute astfel: ascita a fost centrifugat, apoi sedimentul a fost splat de 2 ori cu mediu RPMI 1640 simplu, iar sedimentul celular final a fost resuspendat n 5 ml mediu de cultur (RPMI + 10 % ser fetal de viel + antibiotic/antimicotic + bicarbonat). Suspensia final a fost ajustat la 2 x 105 celule/ml i repartizat n 2 flacoane de cultur, cte 10 ml/flacon.

Celulele astfel obinute au fost cultivate ca atare pentru a urmri dinamica spontan a celulelor tumorale Walker.

Dup cultura de testare a caracteristicilor celulelor tumorale netratate, a fost efectuat o nou recoltare de ascit, iar suspensia de celule tumorale a fost repartizat n mai multe flacoane de de cultur n care au fost adugate substanele nutritive n diluiile dorite, prezentate mai jos:

Intr-un prim set de experimente celulele au fost tratate cu extract de struguri GSE in concentraii de 20g/ml, 10 g/ml i 5g/ml i cu vitamina E n concentraii de 6.6g/ml, 3.36g/ml i 1.76g/ml , timp de 72 de ore;

In al doilea set de experimente celulele au fost tratate cu:

-GSE n concentraie de 150 g/ml, timp de 72, 48 i de 24 de ore;

-vitamina E n concentraie de 5 g/ml timp de 72, 48 i de 24 de ore;

-vitamina A n concentatie de 0.5 g/ml timp de 72, 48 i de 24 de ore i n concentraii de 1 g/ml, 2.5 g/ml i 5 g/ml, timp de 24 de ore;

-GSE n concentraie de 150 g/tub de cultur, vitamina E n concentraie de 5 g/tub de cultur i vitamina A n concentratie de 0.5 g/tub de cultura, timp de 96 de ore (volumul de mediu /tub de cultur 8 ml).

Culturile au fost incubate la 370C n atmosfer de 5% CO2. Au fost meninute, dup caz, 24, 48 72 sau 96 de ore, dup care au fost evaluate. Evaluarea a constat n determinarea densitii suspensiei prin numrarea celulelor n camera Brker-Trk i determinarea viabilitii celulare dup colorare cu colorantul vital albastru tripan.

3.3. TEHNICA CITOMETRIEI IN FLUX

Citometria in flux reprezinta o abordare tehnica noua, de mare complexitate, ce permite determinarea simultana a mai multor parametri fizici si chimici caracteristici unei singure celule aflate in miscare intr-un curent lichid.

Citometria in flux este o tehnica moderna, complexa si performanta de analiza celulara, care permite masuratori rapide, cu rezolutii superioare metodelor clasice, separate pentru fiecare celula sau constituent celular, incluzand acizii nucleici, complexe imune, cromozomi sau organite celulare, aflate in cadrul unor suspensii. Astfel, pot fi facute analize multiparametrice simultane, ale unui numar mare de particule (de la 400 la 3000 particule/secunda), ale caror caracteristici au coeficienti mici de variatie.

Componentele principale ale unui citometru in fluxUn citometru de flux este compus din trei sisteme:

-sistemul hidraulic

-sistemul optic

-sistemul electronic

Sistemul hidraulic are rolul de a prezenta celulele din proba, una cate una, unui dispozitiv de masurare. Suspensia celulara ajunge la camera de curgere unde celulele sunt constranse sa se deplaseze una cate una prin dreptul unui fascicul luminos de excitare (raze laser). Pe masura ce celulele trec prin dreptul acestuia, fiecare dintre ele disperseaza lumina incidenta si emite, eventual, fluorescenta (generate de anticorpii marcati).

Lumina dispersata e captata dupa doua directii:

-una paralela cu fasciculul incident FS

-a doua perpendicular pe fasciculul SS

Emisia fluorescenta e captata pe o directie perpendiculara fata de fasciculul incident.

Determinarea intensitatii luminii dispersate si a emisiei fluorescente precum si prelucrarea semnalelor obtinute va permite caracterizarea celulelor analizate.

Fig. 6. Citometru n fluxSistemul hidraulic are ca scop focalizarea hidrodinamica in vederea prezentarii individuala a celulor la punctul de intalnire cu fasciculul de excitatie.

Pentru ca metoda isi propune caracterizarea unei singure celule este important sa se foloseasca suspensii de celule izolate, prezenta dubletelor sau agregatelor putand compromite exactitatea rezultatelor.

Camera de curgere este cea mai importanta componenta a sistemului hidraulic. La nivelul ei celulele sunt focalizate si prezentate intr-o maniera individuala fasciculului de excitatie.

Sistemul optic cupinde sistemul optic de excitare si sistemul optic de colectare.

Sistemul optic de excitare

Sursa luminoasa are rolul de a produce un fascicul de excitatie avand o anumita intensitate si lungime de unda astfel incat sa stimuleze la un nivel acceptabil fluorocromii atasati de celula si sa determine o dispersie detectabila dupa interactiunea cu acestia

Sursele luminoase pot fi reprezentate de:

LASER

Lampi voltaice

Sursele de excitatie LASER sunt cele mai des folosite in citometria in fux. Caracteristicile sale sunt: lungime de unda, putere si profilul intensitatii fasciculului.

Elementele optice de focalizare sunt proiectate pentru a oferi o iluminare uniforma fiecarei celule ce intersecteaza fasciculul.

Forma fasciculului de excitare influenteaza puternic parametrii determinarii, atat dimensiunea verticala (paralela cu axul de curgere) cat si cea orizontala (perpendicular ape axul de curgere), trebuind avute in vedere in momentul initierii unui experiment.

Sistemul optic de colectare

Detectorul pentru dispersia in fata FS capteaza lumina dispersata de celule pe o directie apropiata de axa fasciculului incident, semnalul obtinut fiind direct proportional cu dimensiunea celulei.Lumina captata la nivelul sistemului optic reprezinta o combinatie intre toate emisiile fluorescente legate de cuplarea specifica, nespecifica, precum si de fenomenul de autofluorescenta. Filtrele optice au rolul de a separa lumina colectata in componente spectrale bine definite, permitand astfel analiza cantitativa a semnalelor de fluorescenta si de dispersie.

Filtrele de absorbtie sunt realizate din sticla colorata, iar modul de functionare se reduce la absorbtia lungimilor de unda nedorite si permiterea trecerii celor de interes.

Filtrele de interferenta sunt cele mai des folosite. In loc sa absoarba lungimile de unda nedorite, le atenueaza sau le reflecta.

Detectorii pentru emisia de fluorescenta sunt plasati perpendicular pe directia fasciculului incident.

Emisia de fluorescenta provenita de la celulele marcate prezinta o intensitate mai redusa. Deci este necesara folosirea unui tip special de fotodetectori ce se numeste tub fotomultiplicator PMT. Efectul de amplificare realizat de PMT permite detectarea unor semnale luminoase cu o intensitate foarte mica.

Detectori ai luminii dispersate lateral SS sunt plasati perpendicular pe directia fasciculului incident.Acest detector ofera informatii asupra structurii interne a celulei.

Prelucrarea semnalelor Prelucrarea optica lumina provenita de la celule este colectata si filtrate, animate lungimi de unda fiind dirijate catre detectori.

Prelucrarea optico electronica la nivelul detectorilor se genereaza un semnal electric proportional cu intensitatea semnalului optic colectat.

Prelucrarea electronica in care impulsurile de natura electrica intra intr-un proces de multiplicare urmat de interventia altor circuite de ajustare.

.Semnalele generate de detectori pot fi de tipul peak sau semnale integrale.

Semnale peak incep la linia de referinta odata cu patrunderea particolei in interiorul fasciculului de excitatie, cresc catre o amplitudine maxima revenind ulterior la valoarea initiala. Semnalul peak reprezinta intensitatea luminii emise de particular analizata.

Semnalele integrale, obtinute prin integrarea in timp a semnalelor peak, prezinta o amplitudine proportionala cu aria aflata sub curba ce corespunde acestora.

Amplificarea semnalului poate fi liniara sau logaritmica.

Achizitia, prezentarea si prelucrarea datelor

Etapa finala a unei determinari prin citometrie in flux presupune transformarea semnalelor electrice in valori digitale ce pot fi prelucrate, stocate si afisate pe computerul anexat sistemului.

Odata convertite in forma digital, datele pot fi prelucrate de computer. Pentru afisare si analiza se folosesc in mod obisnuit histograme de frecventa. Axa ox este impartita in canale iar axa oy semnifica numarul de celule. Un important avantaj al prezentarii datelor sub forma de histograma este acela ca analiza distributiei fluorescentei se face intr-o maniera cantitativa.

Histogramele cu un singur parametru nu pot prezenta decat informatii limitate. Se impune, deci, prezentarea datelor pe histograma alcatuite din doi parametric, ca de exemplu FS si FL. La intersectia valorilor corespunzatoare celor doi param,etri e plasat un punct ce reprezinta o anume celula analizata atat din punct de vedere al dimensiunii cat si al fluorescentei asociate. O astfel de histograma se numeste dot plot.

Deoarece cantitatea de date colectata de catre sistem poate fi foarte mare, continand eventual si informatii despre particulele irelevante, exista posibilitatea de a selecta anumite populatii de celule ce prezinta interes pentru aplicatia in cauza.

Aceasta functie se realizeaza cu ajutorul portilor ce grupeaza celule in functie de parametrii specifici determinati. Dupa stabilirea portilor sunt analizate doar celulele aflate in interiorul acesteia.

Principiul de finctionare al unui citometru

Principiul de operare pe care se bazeaz citometria n flux const n faptul c celulele sau alte particule existente n proba luat n studiu, sunt injectate, n anumite condiii de presiune variat, ntr-un curent de fluid numit curent de transport sau curent purttor. Cu ajutorul acestui fluid, celulele sunt forate s parcurg, una cte una, traiectorii stricte, identice, cu o vitez constant, de 10m/s. Suspensia celular trece printr-o zona de detecie considerat zona de interaciune a fiecrei particule n parte, cu o surs de excitaie luminoas. n cazul aparatului de care dispunem, aceast surs este reprezentat de un fascicul laser ionic cu argon, care are linia de emisie la 488 nm. Semnalele luminoase sunt detectate simultan de ctre 4 fotodetectori i transformate n semnale electrice echivalente, care sunt, apoi, amplificate i convertite n semnale digitale. Aadar, se vor obine simultan, pentru fiecare particul n parte, 4 parametri diferii: FSC, SSC , FL1 i FL2.

Interaciunea dintre fasciculul laser i particule este exprimat prin modalitatea n care acestea mprtie lumina, pe de o parte, i emit fluorescen, pe de alt parte.

n ceea ce privete intensitatea luminii mprtiate la diferite unghiuri, dimensiunea i forma fiecrei celule sau constituent celular determin o mprtiere nainte la unghiuri mici, a razei incidente, definit FSC (Forward Scatter). Lumina mprtiat de celule i colectat la 900 fa de raza incident, reprezint lumina reflectat de structurile interne i suprafeele celulelor, fiind interpretat ca un indicator al granularitii celulare; este denumit mprtiere lateral SSC (Side Scatter).

Prin urmare, acesti 2 parametri specifici citometriei in flux FSC si SSC permit identificarea si sortarea unui numar mare de celule sau constituenti subcelulari, pe criterii morfologice. De asemenea, pot fi urmarite si evidentiate modificarile in dimensiune si complexitatea structurii interne, care caracterizeaza evolutia unor tipuri de celule expuse la diferiti agenti stimulatori / inhibitori externi.

La interactiunea laser particula, pe langa fenomenul de imprastiere a luminii, are loc emisia fluorescenta, exprimata prin 2 parametri: FL1 si FL2. Pentru obtinerea fluorescentei, celulele sau constituentii celulari ai unei suspensii, sunt marcati, in mod specific,cu fluorocromi sau anticorpi monoclonali marcati fluorescent. Fasciculul laser excita fluorocromii legati de diferitele componente celulare, iar acestia emit energia absorbita prin: vibratii si disipare de caldura, precum si prin emisia unei radiatii luminoase vizibile in UV fenomenul de fluorescenta.

Intensitatea fluorescentei este proportionala cu cantitatea colorantului fixat, respectiv cu cantitatea componentei celulare de interes (acizi nucleici, antigene de suprafata).

Linia de emisie a laserului fiind de 488 nm, markerii fluorescenti alesi trebuie sa fie excitabili la aceasta lungime de unda.

3.3.1. Prepararea probelor.

Probele pentru citometria in flux au fost preparate cu ajutorul unui kit Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I procurat de la BD Biosciences Pharmigen si cu fost citite la un citometru Becton Dickinson.

Anexina-V are specificitate pentru fosfatidil serina PS, lipid ce se expune pe fata externa a plasmalemei in pimele faze ale apoptozei. In mod normal, fosfatidil serina se gaseste numai pe fata interna a membranei plasmatice si expunerea sa pe fata externe reprezinta primul marker al apoptozei. Anexina V poate fi conjugata cu fluorocromi, cum ar fi FITC, servind astfel drept proba sensibila pentru analiza citometrica a celulelor in apoptoza.

Externalizarea fosfatidil serinei are loc in primele fazele ale apoptozei, astfel incat marcarea celulelor cu anexina V-FITC identifica celulele apoptotice in stadii mai timpurii decat metodele ce se baseaza pe identificarea modificarilor de la nivelul nucleului, cum ar fi fragmentarea ADN-ului. De aceea, pentru identificarea celulelor in diferite stadii ale apoptozei se foloseste anexina V-FITC impreuna cu un fluorocrom cu afinitate pentru ADN, cum este iodura de propidiu PI.

Astfel, celulele care sunt viabile sunt negative atat pentru FITC, cat si pentru PI. Celulele in primele stadii ale apoptozei, cand a avut loc doar pierderea simetriei membranei plasmatice si externalizarea PS, sunt pozitive pentru FITC si negative pentru PI, iar celulele marcate cu FITC si PI sunt in apoptoza tarzie sau sunt deja moarte. Celulele marcate doar cu PI sunt celule moarte prin necroza.

3.3.2. Protocol de lucru:

Celulele sunt spalate de doua ori cu TFS prin centrifugare 10 minute la 4000 rotatii pe minut;

Dupa spalare celulele sunt resuspandate in tampon de legare 1X, la o concentratie de 1X106 celule/ml;

Se transfera 100l de solutie in tuburi de 5 ml;

Se adauga 5 l de anexina V-FITC si 5 l de PI;

Tuburile se amesteca usor si se incubeaza 15 minute la intuneric;

Se adauga 400 l de tampon de legare 1X.

Se analizeaza la citometru intr-o ora.

Datele au fost prelucrate cu progrmul de prelucrare al datelor din citometria in flux Win MDI 2.8.3.4. IMUNOMARCAREA

Tehnica imunomarcarii permite evidentierea unei anumite componente celulare in urma cuplarii ei cu un anticorp marcat cu un fluorocrom. Semnalul fluorescent este detectat la microscop, in lumina UV, el indicand prezenta si localizarea componentei celulare de interes.

Exista doua variante ale acestei tehnici: imunomarcarea directa care are dezavantajul ca, pentru fiecare tip de anticorp utilizat, trebuie obtinut conjugatul anticorp-fluorocrom corespunzator; cealalta varianta este imunomarcarea indirecta, prin care este eliminat acest dezavantaj, deoarece introduce in reactie un element suplimentar: serul imun antiimunoglobulina (umana sau animala), preparat pe animale de laborator.

La ora actuala, firmele producatoare de reactivi si materiale de laborator, ofera o gama foarte variata de anticorpi monoclonali conjugati sau nu cu fluorocromi - construiti fata de o multitudine de componente celulare a caror detectie poate sa reprezite obiectiv de cercetare. De asemenea, oferta de antiimunoglobuline conjugate cu fluorocromi este si ea corespunzatoare celei de anticorpi.

Probele pentru vizualizarea la microscopul de fluorescenta au fost prelucrate dupa acelasi protocol ca si la citometria in flux.

3.5.ANALIZA CALITATIV A FRAGMENTRII ADN-ULUI N GEL DE AGAROZ

Activarea endonucleazelor si clivarea ADN-ului in fragmente distincte de 50-300kb initial, apoi 180pb este considerata emblema a apoptozei, ceea ce o face marker al apoptozei in mai multe tipuri celulare.

Protocolul folosit ofera o metoda de separare al fragmentelor de ADN aparute in urma apoptozei si a fractiei de ADN intact si de analiza a acestora in gel de agaroza.

In celulele apoptotice clivarea ADN-ului apare in urma analizei electroferetice cu un model specific de benzi datorat fragmentelor multiple de ADN. Cu toate acestea, desi protocolul este simplu si in general cu rezultate bune, are doar valoare calitativa datoritata dificultatii recupararii si solubilizarii fragmentelor mici de ADN. Pentru a obtine un ADN cat mai curat sunt necesare si alte metode de prelucrare a ADN-ului, cum ar fi utilizarea proteinazei K pentru deproteinizare.

Protocol de lucru:

Centrifugarea suspensiei celulare la 200g la 4oC, 10 min in tuburi notate B. Suspensia celulara trebuie sa aiba o densitate de cel putin 5X105 pentru ca altfel fragmentele de ADN nu vor fi detectabile prin vizualizare la transiluminator; Supernatantul se transfera in tuburi noi notate S; Peste sediment din tuburile B se adauga 0,5 ml de TTE solutie si se amesteca viguros. Aceasta procedura permite eliberarea fragmentelor de cromatina din nuclei dupa liza celulara (datorata prezentei lui Triton-X din solutia TTE) si dupa distrugerea structurii nucleare; Centrifugare la 20 000g 10 min la 4oC pentru separarea fragmentelor de ADN de fractia de ADN intreg din tuburile B; Supernatantul se trasfera in tuburu noi notate T; Peste sedimentul din tuburile B se adauga 0,5 ml de TTE; In tuburile S, B si T se adauga 0,1 ml de NaCl 5M de la frigider sise amesteca viguros. Aceasat procedura are rolul de a indeparta histonele ce complexeaza ADN-ul;

In fiecare tub se adauga 0,7 ml de izopropanol de la frigider si se amesteca viguros;

Se la sa peste noapte la -20oC pentru precipitare;

Dupa precipitare, ADN-ul se recupereaza prin centrifugare 10 min la 20 000 g la 4oC;

Supernatantul se indeparteaza cu ajutorul pipetei sau prin inversarea rapida a tuburilor indepartand apoi,cu mare grija toate picaturile ramase pe peretii tuburilor cu ajutorul unei hartii de filtru;

Se splala sedimentul(ADN-ul) prin adaugare de 0,5-o,7 ml de etanol 70% de la frigider;

Centrifugare 10 min al 20 000g la 4oC;

Supernatantul este indepartant cu grija si se lasa la uscat 30 de minute;

Pentru resuspendarea ADN-ului se a adauga 20-50 de l de TE si se lasa 1-3 zile la 37oC. Resuspendarea ADN-ului este un pas critic pentru ca depin de cantitatea de ADN si de dimensiunile sale: astfel pentru ADN-ul nefragmentat din tuburile B ar putea fi necesar un volum mai mare de TE si o incubare mai lunga;

Probele sunt analizate in gel de agaroza 1,6% cu bromura de etidiu;

Pentru vizulizare gelul se plaseaza la un transiluminator UV si se fotografiaza.

Capitolul 4REZULTATE I DISCUII

Cultura celular martor s-a multiplicat de 4,5 ori, pstrnd o viabilitate de 100%. Cultura a fost stopat dup 4 zile pentru a preveni posibila infectare a a acesteia sau apariia de procese masive de apoptoz sau necroz spontan.

Au fost realizate mai multe culturi tratate cu antioxidanii menionai. Culturile au fost meninute intervale diferite de timp i au fost evaluate n funcie de aspectul martorului incubat mpreun cu celulele tratate.

4.1. REZULTATELE CITOMETRIEI N FLUX

In primul set de experimente celulele au fost tratate cu extract de struguri GSE in concentratii de 20g/ml, 10 g/ml si 5g/ml si cu vitamina E in concentratii de 6.6g/ml, 3.36g/ml si 1.76g/ml , timp de 72 de ore. Rezultatele obtinute sunt prezente in tabelul de mai jos:

Martor

Vitamina E ((g/ml)

GSE ((g/ml)

1,7 3,36,651020

Nr. celule analizate

10.00010.00010.00010.00010.00010.00010.000

Celule vii

(%)

40,99

50,05

42,2444,4339,5738,440,63

C. necrotice (%)

1,352,690,992,412,111,41,46

C. n apoptoz

(%)

57,6647,2656,7753,1658,3260,257,91

CELULE MARTOR DUBLU MARCATE

Nr. celule analizate: 5114

UL 690 -1,35% -necroza

UR 1362 -6,63% -apoptoza tarzie

LL 2096 -40,99% -celule vii

LR 1564 - 30,58% -apoptoza timpurie

UR+LR=57,21% CELULE IN APOPTOZA

CELULE TRATATE CU VITAMINA E(1,7 g/ml)

Nr. celule analizate: 10 000

UL 269 2,69%

UR 1689 16,89%

LL 5005 50,05%

LR 2967 29,67%

UR+LR= 46,56% CELULE IN APOPTOZA CELULE TRATATE CU VITAMINA E(3,3 g/ml)

Nr. celule analizate: 10 000

UL 99 0,99%

UR 1795 17,95%

UL 4224 42,24%

LR 3744 37,44%

UR+LR= 55,39% CELULE IN APOPTOZA CELULE TRATATE CU VITAMINA E ( 6.6 g/ml)

Nr. celule analizate: 10 000

UL 241 2,41%

UR 2299 22,99%

LL 4443 44,43%

UL 2981 29,81%

UR+LR= 52,80% CELULE IN APOPTOZA

CELULE TRATATE CU

GSE (5 g/ml)

Nr. celule analizate: 10 000

UL 211 2,11%

UR 2209 22,09%

LL 3957 39,57%

LR 540 35,40%

UR+LR= 57,49% CELULE IN APOPTOZA

CELULE TRATATE CU GSE (10 g/ml)

Nr. celule analizate: 10 000

UL 140 1,40%

UR 2372 23,72%

LL 3840 38,40%

LR 3616 36,16%

UR+LR= 59,88% CELULE IN APOPTOZA CELULE TRATATE CU GSE(20 g/ml)

Nr. celule analizate: 10 000

UL 146 1,46%

UR 2543 25,43%

LL 4063 40,63%

LR 3196 31,96%

UR+LR= 57,39% CELULE IN APOPTOZA

Diagram nfind starea celulelor tumorale n cultur,n urma tratamentului cu vitamina E n concentraii diferite.

(V = celule vii; N = celule necrotice; A = celule apoptotice)

Diagram nfind starea celulelor tumorale n cultur,n urma tratamentului cu GSE concentraii diferite.

(V = celule vii; N = celule necrotice; A = celule apoptotice)In al doilea set de experimente, celulele au fost tratate cu:

-GSE in concentratie de 150 g/ml timp de 72, 48 si de 24 de ore;

-vitamina E in concentratie de 5 g/ml timp de 72, 48 si de 24 de ore;

-vitamina A in concentatie de 0.5 g/ml timp de 72, 48 si de 24 de ore si in concentratii de 1 g/ml timp, 2.5 g/ml timp si 5 g/ml timp timp de 24 de ore;

-GSE in concentratie de 150 g/tub de cultura, vitamina E in concentratie de 5 g/tub de cultura si vitamina A in concentratie de 0.5 g/tub de cultura, timp de 96 de ore.

MartorVitamina E ( 5 (g/ml)GSE ( 150 (g/ml)

24 ore48 ore72 ore24 ore48 ore72 ore

Nr. celule analizate

10.000200010.00010.00010.00010.00010.000

Celule vii

(%)

79.14%78.20%65.92%69.50%77.10%45.96%45.25 %

C. necrotice (%)

17.55%9.90%10.44%13.69%3.05 %12.50%6.10%

C. n apoptoz

(%)

3,45%12,75%24,14%18,19%20,47%41,95%50,40%

CELULE MARTOR DUBLU MARCATE

Nr. celule analizate: 10000

UL 1755 17.55%

UR 160 1.60%

LL 7914 79.14%

LR 185 1.85%

UR+LR=3,45% CELULE IN APOPTOZA CELULE TRATATE CU 5(g/ml DE VITAMINA E TIMP DE 72 DE ORE

Nr. celule analizate :10 000

UL 1369 13.69%

UR 378 3.78%

LL 6950 69.50%

LR 1441 14.41%

UR+LR=18,19% CELULE IN APOPTOZA CELULE TRATATE CU 5(g/ml DE VITAMINA E TIMP DE 48 DE ORE

Nr. celule analizate :10 000

UL 1044 10.44%

UR 514 5.14%

LL 6592 65.92%

LR 1900 19.00%

UR+LR=24,14% CELULE IN APOPTOZA

CELULE TRATATE CU 5(g/ml DE VIT E TIMP DE 24 DE ORE

Nr. celule analizate: 2000

UL 198 9.90%

UR 61 3.05 %

LL 1564 78.20%

LR 194 9.70%

UR+LR=12,75% CELULE IN APOPTOZA

CELULE TRATATE CU 150 (g/ml DE GSE TIMP DE 72 DE ORE

Nr. celule analizate: 10000

UL 610 6.10%

UR 262 2.62%

LL 4525 45.25 %

LR 4778 47.78%

UR+LR=50,40% CELULE IN APOPTOZA

CELULE TRATATE CU 150 (g/ml DE GSE TIMP DE 48 DE ORE

Nr. celule analizate: 10000

UL 125 12.50%

UR 475 4.75 %

LL 4596 45.96%

LR 3720 37.20%

UR+LR=41,95% CELULE IN APOPTOZA CELULE TRATATE CU 150 (g/ml DE GSE TIMP DE 24 DE ORE

Nr. celule analizate: 10000

UL 305 3.05 %

UR 742 7.42%

LL 7710 77.10%

LR 1305 13.05%

UR+LR=20,47% CELULE IN APOPTOZA

Diagram nfind starea celulelor tumorale n cultur, n urma tratamentului cu vitamina E n concentraie de 5 g/ml timp de 24 h, 48 h si 72 h.(V = celule vii; N = celule necrotice; A = celule apoptotice)

Diagram nfind starea celulelor tumorale n cultur, n urma tratamentului cu GSE concentraie de 150(g /ml timp de 24 h, 48 h si 72 h.(V = celule vii; N = celule necrotice; A = celule apoptotice) Martor Vitamina A ( 0,5 (g/ml) Vitamina A((g/ml)

24 de ore

24 ore 48 ore72 ore1 (g/ml2,5 (g/ml5 (g/ml

Nr. celule analizate

10.00010.00010.00010.00010.00010.0002000

Celule vii

(%)

79.14%80.87%72.45%81.14%81.51%76.68%76.90%

C. necrotice (%)

17.55%7.41%10.99 %9.33%8.61%7.77 %7.45%

C. n apoptoz

(%)

3,45% 12,21% 16,89%10,42%10,61% 16,63%16.30%

Diagram nfind starea celulelor tumorale n cultur, n urma tratamentului cu vitamina A in concentratie de 0,5l/ml timp de 24 h, 48 h si 72h.

(V = celule vii; N = celule necrotice; A = celule apoptotice)

Diagram nfind starea celulelor tumorale n cultur, n urma tratamentului cu vitamina A in concentratie de 1 g/ml timp, 2.5 g/ml timp si 5 g/ml timp timp de 24 de ore (V = celule vii; N = celule necrotice; A = celule apoptotice)

Starea culturii de celule dupa 48 de ore de tratament cu vitamina A (A), vitamina E (E) si extract din seminte de struguri (G)(V = celule vii; N = celule necrotice; A = celule apoptotice)

Starea culturii de celule dupa 72 de ore de tratament cu vitamina A (A), vitamina E (E) si extract din seminte de struguri (G)(V = celule vii; N = celule necrotice; A = celule apoptotice)4.2. REZULTATELE IMUNOMARCARII

Imagine de microscopie optic, nfind celule tumorale din cultura martor (X100)

Stnga: n vizibil; dreapta: aceeai imagine, n fluorescen: cu verde (anexina cuplat cu FITC) celule n faz incipient de apoptoz; cu rou (PI) celule n faz avansat de apoptoz

Imagine de microscopie optic, nfind celule tumorale din cultura tratat cu GSE (varianta 10 (g/ml) (X100).

Stnga: n vizibil; dreapta: aceeai imagine, n fluorescen: cu verde (anexina cuplat cu FITC) celule n faz incipient de apoptoz; cu rou (PI) celule n faz avansat de apoptoz / necroz.

Concluziile care se desprind din analiza datelor privind dinamica proliferarii celulare i viabilitatea celular, sunt urmtoarele:

tratamentul cu vitamina E, dei a redus rata proliferrii celulare, in primul set de experimente, nu a avut un efect semnificativ asupra viabilitii celulare, procentul de celule vii din toate cele trei variante de tratament fiind comparabil (dar mai mare) cu cel din cultura martor. La concentraia de 3,3 (g/ml, se remarc procentul cel mai mare al celulelor n apoptoz, procent care este, oricum, mai mic fa de cel nregistrat la martor. La toate variantele de tratament cu vitamina E, se remarc o cretere a viabilitii celulare fa de martor, cea mai mare viabilitate nregistrndu-se n cazul variantei tratat cu 1,7 (g/ml de vitamina E.

In al doilea set de experimente se remarca ca tratamentul cu 5(g/ml de vitamina E timp de 48 de ore a avut un efect puternic asupra inducerii apoptozei in celulele tumorale (24,14%) fata de martor (3,45%). Cresterea procentului de celule in apoptoza creste in toate variantele (tratament timp de 24 h, 48, 72 h), dar valoarea cea mai mare se obeserva dupa 48 de ore de tratament. Scaderea procentului de celule in apoptoza dupa 72 de ore de tratament poate fi explicata prin faptul ca dupa 48 de ore concentratia de vitamina E in mediu a devenit prea mica.

n cazul celulelor tratate cu extract din seminte de struguri (GSE) , se remarc (in primul set de experimente) faptul c substana a determinat, n toate variantele de tratament, o scdere a procentului de celule vii, n paralel cu creterea procentului de celule necrotice i apoptotice. Cea mai sczut viabilitate celular s-a nregistrat la varianta tratat cu 10 (g/ml de GSE, variant la care s-a nregistrat i cel mai mare procent de celule apoptotice.

In al doillea set de experimente , in care celulele au fost tratate cu 150(g/ml de GSE timp de 24 de ore, 48 de ore si 72 de ore, se observa o crestere foarte mare a procentului de celule in apoptoza si o scadere a viabilitatii celulare. Cea mai mare valoare a apoptozei apare dupa 72 de ore de tratament ( 50,40%) fata de martor (3,45%). Acelesi lucru se remarca si in cazul viabilitatii celulare. In cazul celulelor tratate cu vitamina A, in concentratie de 0,5(g/ml timp de 24 de ore, 48 de ore si 72 de ore, se observa ca cea mai mare valoare a apoptozei (16,89%) si cea mai mica valoare a viabilitatii (72,45%) apar dupa 48 de ore de tratament fata de martor (3,45%, respectiv 79,14%). Scaderea procentului de celule in apoptoza (10,42%) si cresterea numarului de celule viabile (81,14%) dupa 72 de ore de tratament se explica prin scaderea concentratiei de vitamina A in mediu In cazul tratamentului cu vitamina A 24 de ore in concentratii de 1(g/ml, 2,5 (g/ml si de 5(g/ml, se observa ca valoarea apoptozei creste (16,63%), iar a viabilitatii celulare scade (76,68%) in variante cu 2,5 (g/ml si de 5(g/ml fata de martor (3,45%, respectiv 79,14%).Daca se analizeaza starea culturilor de celule la 48 de ore si la 72 de ore de tratament cu vitamina A, vitamina E si cu GSE, se constata ca administratrea extractului de samburi de struguri a avut efectul cel mai puternic asupra viabilitatii si inducerii apoptozei, efectul fiind de aproximativ de 3 ori mai puternic decat in cazul vitaminei A si de aproximativ de 2 ori mai puternic decat in cazul vitaminei E.

Se mai observa, ca in cazul vitaminei A si vitaminei E, dupa 48 de ore efectele incep sa se diminueze, fapt corelat cu scaderea concentratiei de extract natural din mediu. In cazul extractului de samburi de struguri acest lucru nu se observa, dupa 72 de ore de tratament valoarea apoptozei indusa de GSE (50,40%) era mai mare decat cea indusa dupa 48 de ore de tratament (41,95%).

In urma anlizei datelor din cele doua seturi de experimente se poate observa ca dozele de extract de samburi de struguri folosite in al doilea set au indus apoptoza cu valori mai mari decat in primul set, comparativ cu martorii. Acest lucru indica ca pentru o eficienta maxima GSE trebuie administrat in doze de aproximativ 150(g/ml.

4.3. REZULTATELE ANALIZEI CALITATIVE A FRAGMENTARII ADN, IN GEL DE AGAROZAAu fost supuse electroforezei in gel de 1,8% agaroza, in tampon Tris/acid acetic/EDTA (TAE), variantele experimentale la care analizele de citometrie in flux au indicat o crestere semnificativa a procentului de celule in apoptoza.Avand in vedere ca unul dintre aspectele cele mai importante ale mecanismului apoptotic este reprezentat de procesul de fragmentare a ADN nuclear, s-a urmarit punerea in evidenta a fragmentelor de ADN rezultate ca urmare a inducerii acestui mecanism in celule tumorale tratate cu substante cu efect antioxidant. 1 2 3 4 5

Analiza procesului de fragmentare a ADN nuclear, in cursul procesului apoptotic indus de tratamentul cu substante cu efect antioxidant.

(Electroforeza in gel de 1,8% agaroza, in TAE)1 celule tratate cu GSE 150 (g/ml, 72 ore;

2 - celule tratate cu GSE 150 (g/ml, 48 ore;

3 - celule tratate cu vit. E 5 (g/ml, 72 ore;

4 - celule tratate cu vit. E 5 (g/ml, 48 ore;

5 celule netratate (martor).

5. CONCLUZII

1. Au fost efectuate testri ale efectelor antitumorale a trei substane antioxidante: integrator de vitamina E , extract din smburi de struguri (GSE) si integrator de vitamina A.

2. Testrile antioxidanilor s-au realizat ntr-un sistem doz-rspuns pe culturi de celule tumorale Walker 256 din ascit de obolan purttor de tumor.

3. Modelul experimental a constat n realizarea a mai multe diluii din fiecare substan i tratarea culturilor cu aceste diluii perioade diferite. Aspectul culturilor a fost urmrit prin citometrie n flux, prin imunomarcare i prin extracia i analiza electroforetic a ADN genomic.

4. Dintre cele trei substane testate, extractul din semine de struguri, n toate concentraiile utilizate, s-a dovedit a avea un efect de reducere a ratei de proliferare celular i, de asemenea, un efect de scdere a viabilitii celulelor tumorale n cultur, n paralel cu creterea procentului de celule la nivelul crora au fost declanate mecanismele procesului apoptotic.

5. In cazul vitaminei A i al vitaminei E, dup 48 de ore de tratament, efectul apoptotic al acestora se diminueaz, fapt corelat cu scderea concentraiei de extract natural din mediu. 6. In cazul extractului de smburi de struguri, dup 72 de ore de tratament, valoarea apoptozei n celulele tratate cu GSE (50,40%) era mai mare decat cea indusa dupa 48 de ore de tratament (41,95%).

7. Experimentele necesit a fi continuate n vederea optimizrii dozelor i a perioadelor de aciune a extractelor naturale.

6. BIBLIOGRAFIE

1. Biological significance and molecular mechanisms of p53-induced apoptosis-A. Bedi, B. Mookerjee Apoptosis vol.3, no.4, 1998, 237-244;

2. Rb function in cell-cycle regulation and apoptosis-J.W. Harbour, D.C. Dean, Nature Cell Biology vol.2, April 2000, E65-E68;

3. Citokine induced apoptosis in human retiniblastoma cells- Amy E. Cullian, Curtis R. Brandt, Molecular Vision, 2004; 10, 315-322;

4.New careers for antioxidants-Douglas E. Bash, P. A. Havre. PNAS. October 29, 2002, vol. 99, no. 22, 13969-13971;

5.The central acidic domain of MDM2 is critical in inhibition of retinoblastoma mediated supressiom of E2F and cell grouth- Patima Salek, Hoaqianq Ying, H. Zheng, A. Margulis, X. Tang, K. Tian, Zhi-Xiong Jin Xioa- The Journal of Biological Chemistry, vol. 279, no. 51, Decmber 17, 53317-53322, 2004;

6.Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone Induces Apoptosis throught Enhancing Mitochondrial Reactive Oxygen Species Productian- Nianyu Li, Kathy Ragheb, Gretchec Lawler, Jennie Sturgist, Bartek Rajwa, J. Andres Melenatz, J. Paul Robinson- The Journal of Biological Chemistry, vol 278, no. 10, Martch 7, 8516-8525, 2003;

7.Regulation of Apoptosis by Vitamin C- M. C. M. Vissers, Wai-Gin Lee, M. B. Hampton, The Journal of Biological Chemistry, vol. 276, no. 50, 46835-46840;

8. The Role of Oxidants and Vitamin C on Neutrofil Apoptosis and Clearence- M. C. M. Vissers, M. B. Hampton, Apoptosis in Myeloid Cells 499- 501, 2004;

9. Nutrition and Cancer: A Review of the Evidence of an Anti-cancer Diet- Michel S. Donaldson, Nutritional Journal, 2004, 3-19;

10. The Cell Cycle- a review of regulation, deregulation and terapeutic targets in cancer, K. Vermaulin, D. R. Van. Bockstaele, Zwi N. Berneman, Cell Proliferation 2003, 36, 131-149;

11. Proanthocyanidins in health care: current and new trands-Cos P., De Bryne, T. Hermes, Apears S- Current Medical Rewies, 2004, May, 11(10);

12. Apoptosis in cancer cells by -tocopheryl succinate: molecular pathways and structural reqiurements-Juri Neuzil, T. Weber, A. Schroder, Min Lu, G. Ostermann, N. Gellert, G. C. Mayne, B. Olynicka, Anne Negre-Salvayre, M. Sticha, R. Coffey, C. Webwer, The FASEB Journal, 2001, Feb., vol. 15:403-415;

13. Vitamin E is a potent novel antineoplastic agent with high selectivity and ccoperativity with tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand(Apo2 Ligand) in vivo-T. Weber, Min Lu, L. Andera, H. Lahm, N. Gellert, M. Fauss, V. Korineck, W. Sattler, D. Vcker, J. Neuzil, Clinical Cancer Research, 2002, March, vol 8:863-869;

14. Apoptosis and p53 induction in human lung fibroblast exposed to chromiun: Effects of ascorbate and tocopherol- D. L. Carlisle, D. E. Pritchard, J. Singh, B. M. Owens, L. J. Blsnkenship, J. M. Orenstein, S. R> Patierna- Toxicological Sciences, 50, 60-68, 2000;

15. Severity of oxidative stress generates different mechanisms of endothelial cell death- A. Burlacu, V. Jinga, A. V. Gafencu, M. Simionescu- Cell Tissue, 2001, 306:409-416;

16. Oligomeric Praanthocyanidins Complex: History, Structure and Phytochemical Applications- Anne Fine, Altermative Medical Rewies, 200, April, 5 (2):141-151;

17. Grape Seed Extract induces apoptotic death in human prostate carcinoma DU 145 via caspase activation accompanied by dissipatian of mithocandrial membrane potential and citochrome c release-Chaja Agarwall, Rana P. Singh, Rajesh Agarwall, Carcinogenesis, vol 23, no. 11, 1869-1876;2002;

18. Grape Seed Proanthocyanidins induce apoptosis through p53, Bax, and Caspase 3 pathways- Rog A. M., Baliga M. S., Elmets C. A., Katyar S. K., Neoplasia, January 7(1 ):24-36;

19. Sinergetic anti-canceer effects of grape seed extract and conventional cytotoxic agent doxorubician against human breast carcinoma cells- Gursh Sharmal, Ail K. Tyajil, Rana P., Singh Daniel C. F., Chen, Rajesh Agarwell, Breast Cancer Research and Treatment, vol 85, May 2004, No. !:1-12:

20. Analiza fenomenului de apoptoza in proliferae celulara cutanate;- Cristina Stanciu,Progrese in Biotehnologie, Ars Docendi 2001:248-268;

21.-tocopherol or combinations of vitamin E forms induce cell death in human prostate cancer cells by interrrupting shingolipid syntetis- Qiang Jiang, Jeffrey Wong, Henrik Fyrst, Julie D. Saba, Bruce N. Ames, PNAS, December 21, 2004, vol. 101, no. 51, 17825-17830;

22. Vitamin E and Breast Cancer- Kimberly Kline, Weiping Yu, Bob G. Sanders, International Research Conference on Food, Nutrition and Canver, Washington DC, July 15-16, 2004,

23. Synergy Between Selenium and Viyamin E in Apoptosis Induction Is Associated with Activation of Distinctive Initiator Caspases in Human Prostate Cancer Cells- Ke Zu, Clement Ip, Cancer Reserch, 63, 6988-6995, october 15,2003;

24. Dietary Antioxidants and Human Cancer, Carmia Borek, Integrative Cancer Terapies, 3(4); 2004,333-341;

25. Nutrition and Cancer: a rewiew of the evidence of an anti-cancer diet- Michael S. Donaldson, Nutrition Journal, 2004, 3:19;

26. Multiple Dietary Antioxidants Enhance the Effiency of Standard and Experimental Cancer Therapies and Decrease Their Toxicity- Kedar N. Prrasad, Integrative Cancer Therapies 3(4);2004, 310-322;

27. Oligomeric Proanthocianidins-Alternativ Medical Rewies, vol. 8, no. 4, 2003, 442-450;

28. Anti-tumor-promoting activity of a polyphenolic fraction isolated from grape seeds in the mouse skin two-stage initiation-promotion protocol and identification of procyanidin B5-3- gallate as the most effective antioxidant constituent- Jifu Zhao, Jiannong Wang, Yingjie Chen, Rajesh Agarwell, Carcinogenesis, vol. 20, no. 9, 1737-1747, 1999;

29. Grape Seed Extract Prevents H2O2- Induced Chromosomal Damage in Human Lymphoblostoid Cells, Ayako Sugisawa, Shuji Inoue, Keizo Umegaki, Biol. Pharm., 27(9), 1459-1461; 2004;

30. Cancer , Apoptosis and Nonimunne Surveillence, G. Klein, Cell Death and Diffentietion, 2004, 11, 13-17;

31. MEETING report- 9th Euroconference on Apoptosis, W. Bursch, L. Fesus, Cell Death and Diffentietion;2002, 9, 696-698;32. Benzamide riboside induced mitochondrial mediated apoptosis in human lung cancer H520 cells- Neeru Khanna, H.N. Jayaram, Neeta Singh, Life Sciences ,75 (2004) 179190;

33. Retinoic acid increases the expression of p53 and proapoptotic caspases and sensitizes keratinocytes to apoptosis: a possible explanation for tumor preventive action of retinoids, Mrass P, Rendl M, Mildner M, Gruber F, Lengauer B, Ballaun C, Eckhart L, Tschachler E, Carcinogenesis, vol. 19, no. 9, 1737-1747, 1999;

34. Integrating stress-response and cell-cycle checkpoint pathways, Amanda K. Pearce and Timothy C. Humphrey, TRENDS in Cell Biology Vol.11 No.10 October 2001;

35.Effects of vitamin E succinate on the expression of Fas and PCNA proteins in human gastric carcinoma cells and its clinical significance, Kun Wu, Lan Zhao, Yao Li, Yu-Juan Shan, Li-Jie Wu, World J Gastroenterol April 1, 2004 Volume 10 Number 7;

36. ALL-TRANS RETINOIC ACID-INDUCED APOPTOSIS IN ACUTE MYELOBLASTIC LEUKEMIA CELLS With a special emphasis on p53, Bcl-2, and mitochondria, Aiping Zheng, OULU UNIVERSIT LIBRARY,OULU 2000;

37. SYNERGISTIC INDUCTION OF APOPTOSIS OF NEUROBLASTOMA

BY FENRETINIDE OR CD437 IN COMBINATION WITH CHEMOTHERAPEUTIC DRUGS, Penny E. LOVAT, Marco ANALLI, Francesca BERNASSOLA, Mike TILBY, Archie J. MALCOLM , Andy PEARSON ,Mauro PIACENTINI, Gerry MELINO,Christopher P.F. REDFERN , Int. J. Cancer: 88, 977985 (2000);

38. Epidemiologic Evidence Regarding Vitamin C and Cancer, G. Block, et al., American Journal of Clinical Nutrition, 54 (6 Suppl), December 1991, p. 1310S-1314S.;

39.The Impact of Vitamins A, C, E and Selenium Compound on Prevention of Liver Cancer in Rats -H.S. Nyandieka and J. Wakhisis, East African Medical Journal, 70(3), March 1993, p. 151-153.

40. Influence of Ascorbic Acid on MCA-induced Carcinogenesis in the Uterine Cervix of Mice ,P. Das, et al., Cancer Letters, 72(1-2), August 16, 1993, p. 121-125.

41. Ascorbic Acid is Cytotoxic for Pediatric Tumor Cells Cultured in Vitro, M. A. Medina, et al., Biochem Mol Biol Int, 34(5), November 1994, p. 871-874.

42. The Modulation of DNA Damage in Human Lymphocytes by Dietary Vitamin C Supplementation, C. F. Arlett, et al.,Molecular Mechanisms in Radiation Mutagenesis and Carcinogenesis, April 19-22, 1993, Doorwerth, The Netherlands.

43.Amylase Activity of the Malignant Rat Salivary Gland after Cisplatin, Vitamin E and C Treatment, D. K Sharma, Third International Congress on Engineered Oral Cancer, January 22-25, 1994, Madras, India, 1994.

44. Update on the Effects of Vitamins A, C, and E and Selenium on Carcinogenesis, D.F. Birt, Proc Soc Exp Biol Med, 183(3), December 1986, p. 311-320.

45. Effect of vitamin E and human placenta cysteine peptidase inhibitor on expression of cathepsins B and L in implanted hepatoma Morris 5123 tumor model in Wistar rats , Tadeusz Sebzda,Piotr Hanczyc,Yousif Saleh,Bernice F Akinpelumi,Maciej Siewinski,Jerzy Rudnicki, World J Gastroenterol 2005;11(4):587-592;

45. Cocoa Procyanidins and Human Cytokine Transcription and Secretion, Tin Mao, Judy Van de Water, Carl L. Keen, Harold H. Schmitz ,M. Eric Gershwin, 2000 American Society for Nutritional Sciences, 2093S-2099S;

46. Cancer Chemopreventive Activity of Xanthohumol, a Natural Product Derived from Hop ,