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    ' C f f c c f C c t c c f c c c C C

    JNOI.IBRL : Alberto M a r t r i GuzmSri (:: c a n f e l l

    J'E1,EFONO : 5 8 1 - 7 7 - 4 1

    MATRICULA: 7 51 18 O R O

    c IAV c :

    TRIMESTRE:

    HORAS SEMANA: 3 0

    L,UGAR DONDE SE LLEVARA A CABO: Unidad I n v e s t i g a c i n Hiorndica -CMN (Temporalmente en l a F a c u l t a d d e M e d i c i n a UNAM)

    I

    FECHA DE IN IC IO : Ma r z o 2 de 1987 I /$ECHA DE TERMINACION:

    /NOMBRE DE TUTOR EXTERNO: Dr. Juan Jos Hicks Gmez

    A g o s t o 2 de 1 9 8 7 .J Je fe S e c c i n E n d o c r i n o l o g a M o l e c u l a r D i v i s i & R io1 .og a d e l a Reproducc i n 1

    4 I T l J L O :

    j I n v e i t i g d c i 6 i i tiiorn6dica - CMN i

    E s t u d i o d e do:; g l i c o s i d a c a s e i .ncorporacin d e glu osa a g l i c o c o n j u g a d o s en e l e n d o m e t r i o de la r a t a emba s a zada . j

    I A/LUMNO :

    TUTOR: I J J u a n Jose Hicks; Gornez

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    C c c c L f c c c f c c f f C c f

    1.

    2 .

    PROYECTO INICIAL

    TITULO DEL PROYECTO IN ICIAL : Estudio de do4 gl icosidasas e incorporacin de glucosa a g l i - cocon~ugados en e l endometrio de l a rata emqarazada.

    JUSTIFICACION Y NATURALEZA DEL PROYECTO

    E l estudio de l a bioqumica de l a reproducc& en mamferos es

    ,

    importante no s6lo por constituir un problema bj ico en biologa del cual se desconoce gran parte, sino porque adems4 los conocimientos generados por l a b io loga de l a reproducci6n ha permitido e l desarro - 110 de prcticas mdicas en humanos y animales q\ie han sido de bene- f i c i o para e l hombre.

    ~

    E l presente proye.cto, de naturaleza bsica, lpretende contribuir en e l conocimiento de l o s mecanismos bioqumicos(que . . operan en e l f e - nineno de ' l a reproducci6n en mamferos, centrnddse en l a implanta-- ci6n del blastocisto a l endometrio.

    3 . INTRODUCCION Y ANTECEDENTES I

    En l a rata , l a adhesi6n del blaetocisto a l e/ndometriQ se rea l iza en e l . quinto d a post-coito,.;.?n unas regiones es ecial izadas del endo -

    tan cambios morfoigicos y f i s io lg icos que no sd observan en l a s zo- nas adyacentes del ' endometrio conocidas como int$rsit ios de implanta-

    metrio conocidas como s i t i o s ae implantacin (S I ) , , Fi l a s cuales presen- ' ' ci6n (1).

    Entre l o s cambios ms sobresalientes en l o s sitios de implante - se pueden mencionar l o s siguientes: diferenciaci+ de l a s clulas es- tromales a clulas deciduales; incremento en l a plermeabilidad vascular

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    y ~sminucibn de l a polaridad membranal ( 3 , 4 ) . Por o t r o lado, se ha postulado l a modif icacibn s e l e c t i v a de giicoconjugados de supez f i c i e de l endometrio y10 b l as toc i s t o como un requisito prev io para l a implantacin < 5 , 6 ) , participando l os carbohicp-atos .

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    b) Desarrollar un mtodo con los recursos de que se disponga que permita evaluar en forma global l a biosntesis de glicoprotenas en e l endometrio de l a rata.

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    PROGRAMA Y METODOLOGIA DE TRABAJO.

    A. - PROGRAMA DE TRABAJO

    a ) Aprender a determinar l a s fases d e l Ciclo e s t r a l y emba- razo de l a r a t a mediante c i t o l o g a vaginal .

    b) Aprendizaje de l a t6cnica de visualizacpbn y extraccin de los s i t i o s de implantacibn d e l tero1 de l a r a t a ; as como l a separacin da! los t e j i d o s e p i t e h i a l y estromal de este brgano. I

    c) Montaje y e s t a n d a r i z a c i h d e l mtodo pa+ cuant i f i car - l a s act iv idades e n z i d t i c a s de l a s g l i cbs idaaas a estu- d i a r , primero empleando muestras de enzpmas comerciales y posteriormente los t e j i d o s uter inos. I

    d) Cuanti f icaci6n de l a s act iv idades enzimgticas de las dos g l i cos idasas , en e l e p i t e l i o y e l estro4a endometriales, en e l So d a de embarazo de l a r a t a (peifodo justo antes de v e r i f i c a r s e l a implantacibn). Esto s+ r e a l i z a r en -- l os s i t i o s de implantacibn (v isual izado4 por medio de l a t cn ica que se descr ib i r posteriormentd) y zonas adyacec tes d e l endometrio, y usando animales dc$ una misma cepa, igual peso y mantenidas en condiciones dontroladas. ,

    . e) Recopilaci6n de los datos obtenidos en qas determinacio- nes anter io res , para poder establecer 1 s pos ib les d i f e - renc ias e s t ad s t i c a s en l a s act iv idades lenzimticas en- tre los s i t i os de implante y l a s region& adyacentes.

    f ) Debido a que se han reportado var ias i s enzimas para*-ma - nosidasa y d-g lucosidasa en otros brga os de l a r a t a -- ( 8 1 , se estudiar esta pos ib i l idad en ids t e j i d o s endome t r i a l e s . Esto ser importante, ya que de han adjudicado d i s t i n t o s s i gn i f i cados f is iolgicos a caida una de l a s -- isoenzimas.

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    g) Finalmente, y hasta l o posible, se trabajar (con l a meto-

    dologa que se mencionaird ms adelante) eh e l desarrollo - de un mtodo para evaluar en forma global l a biosfntcsis de glicoconjugados en e l endometrio de la1 rata.

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    B.- METODOLOGIA DE TRABAJO

    a ) I den t i f i cac i n de l a s fases d e l c i c l o e s t r a l y diagns- t i co de l embarazo.

    Se u t i l i z a r n r a t& de l a cepa Long-Evans mantenidas en - condiciones controladas: v rgenes, adultas, de 2-3 meses de edad, con peso de 200 - 3Ogramo6, mantenidas en un cuarto con temperatura y luz controladas, alimentadas coq purina r a t chow y agua ad l ib i tum. de tro ( 2 hembras y 1 macho). Se rea l i zaran d r o t i s vaginales diariamente y por l a s maanas. Las etapas de l c i c l o e s t r a l se i den t i f i ca rn de acuerdo a l a s imngenes c i t o l g i c a s de los -- f r o t i s ( 9 ) y en e l caso de aparecer espermatoqoides se conside rard como da cero de embarazo.

    +

    Las ra tas &e aparean mediante e l sistema

    b) V isual i zac in de l o s s i t i o s de implantqcin y separacin de los t e j i d o s e p i t e l i a l y estromal dell tero.

    Los s i t i o s de implante serdn v isual i zados mediante l a inyes cin endovenosa de 0 .5 m l de una solucin sa l jna de azul de tri - pbn a l a s ra tas en e l So da de embarazo. E l qolorante a l extra - basarte en l o s s i t i o s de implante (debido a l a gran vasaular iza cin y permeabilidad en estas zonas) t i e claxtamente de azul e s ras regiones (lO).Los t e j i d o s d e l endometrio s/erbn separados m e cnicamente por e l mtodo de FAGG y c o l . (11)

    c) Mtodo para cuant i f i car l a s act iv idaded enzimdticas.

    E l mtodo que se usar6 s e d bsicamente ell de SHOUP Y TOUSTER (12) : se emplearn l o s sutratos a r t i f i c i a l e s a-nitrofenoi-d -D- glucopiransido y p-nitrofenol -6 - D manopir+6sido. La reacci6n enzimtica es l a s iguiente :

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    El p-nitrofenol liberado se cuantifica espectrofotomtricamen - te ( 1 m ~ . r ~ 4 0 0 n * ), con l a ayuda de una curva patrn previa- mente realizada.

    Cuando se desee cuantificar las actividades einzimdticas ucan- do los tejidos uterinos, se adicionar al siqtema de incubacin el detergente no inico Trit6n X-100, para sqlubilizar a las isoenzimas asociadas a membranas celulares. (18).

    d.- Separaci6n de las posibies isoenzimas die las glicosida- sas. Para este fin, se emplear la tcnica de eletroforesis en gel empleado por SHOUP Y TOUSfER ( 1 2 ) , en la bual se incuban los geles con el sustrato despus de haberse pealizado la sepa - racin. Las regiones conteniendo la actividad1 enzimbtica'sern teidas de amarillo a pH alcaiino debido a la liberacin del - p-nitrofenol. Si este mtodo funciona, se pod/rb determinar las actividades enzimdticas de cado isoenzima por densitometra del gel.

    8 . - Evaluaci6n global de la biosfntesis de blicoconjugados. Los estudios de biosfntesis de glicoconbugados usan gene -

    ralmente los NDP-azcares con marca radioactika en el carbohi- drato, seguido posteriormente de la separacip de los glicocvn - jugados, a los cuales se les determina la inc@rporacin del car - bohidrato radioactivo. Sin embargo, en el lugbr donde se traba- jar no se dispone de estos reactivos, por eska raz6n se inten- tar usar glucosa marcada papa estos fines. Ebto se intentar aunque de antemano se espera una gran diluci$ de la marca de- bido a la diversidad de rwcciones enzimdticab en que participa este carbohidrato, de tal manera que s610 unalfraccin muy pe- quea se espera que se incorpope a glicoconju$ados (ver esquema 11) . Los glicoconjugados sern separados del sisteha de incubacidn bsicamente por la metodologa empleada por WdECHTER y col. ( 1 3 ) ' El mtodo se basa en las diferencias en las cgractersticas de solubilidad de las distintas especies de polifsoprenoles y gli- coprotenas: los poliisoprenoles -fosfo-mono-$licosilados se a-

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