bombay blood type
TRANSCRIPT
P r o c . N a t i . A c a d .
S c i . USA
V o l . 9 1 , p p . 5 8 4 3 - 5 8 4 7 , J u n e 1 9 9 4
M e d i c a l S c i e n c e s
M o l e c u l a r b a s i s f o r H b l o o d
g r o u p
i n
Bombay ( O h )
a n d
p a r a - B o m b a y
i n d i v i d u a l s
(ABO b l o o d
g r o u p / S e c r e t o r b l o o d g r o u p / o l i g o s a c c h a r i d e
b i o s y n t h e s i s / f u c o s y l t r a n s f e r a s e / s u r f a c e a n t i g e n )
ROBERT J .
K E L L Y * ,
LINDA K .
E R N S T * ,
ROBERT
D .
L A R S E N t ,
JANE G .
B R Y A N T ,
JUDY S .
R O B I N S O N § ,
AND JOHN B . LOWE*t¶
* H o w a r d H u g h e s M e d i c a l I n s t i t u t e a n
t D e p a r t m e n t
o f
P a t h o l o g y , U n i v e r s i t y
o f
M i c h i g a n ,
M e d i c a l S c i e n c e R e s e a r c h
B u i l d i n g I
Room
3 5 1 0 ,
1 1 5 0 W e s t
D r i v e ,
An n
A r b o r
MI
4 8 1 0 9 - 0 6 5 0 ;
§ A m e r i c a n R e d C r o s s
R e f e r e n c e
L a b o r a t o r y ,
2 4 2 5 P a r k
R o a d ,
C h a r l o t t e ,
NC
2 8 2 0 3 ;
a n d
t U n i v e r s i t y
o f
K e n t u c k y
B l o o d
B a n k ,
Room
H A 6 2 8 ,
U n i v e r s i t y
o f
K e n t u c k y
M e d i c a l
C e n t e r ,
8 0 0 R o s e
S t r e e t ,
L e x i n g t o n ,
KY 4 0 5 3 6
C o m m u n i c a t e d
b y
R o b e r t L .
H i l l ,
D e c e m b e r
9 ,
1 9 9 3
ABSTRACT
T h e p e n u l t i m a t e
s t e p
i n
t h e
b i o s y n t h e s i s
o f
t h e
h u m a n AB O b l o o d g r o u p o l i g o s a c c h a r i d e
a n t i g e n s
i s
c a t -
a l y z e d b y a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l t r a n s f e r a s e ( s ) ( G D P - L - f u c o s e : f l D -
g a l a c t o s i d e
2 - a - L - f u c o s y l t r a n s f e r a s e ,
EC
2 . 4 . 1 . 6 9 ) ,
w h o s e e x -
p r e s s i o n
i s d e t e r m i n e d
b y
t h e
H a n d
S e c r e t o r
( S E )
b l o o d
g r o u p
l o c i ( a l s o k n o w n a s FUTI a n d F U T 2 ,
r e s p e c t i v e l y ) .
T h e s e
e n z y m e s
c o n s t r u c t F u c a l
-)
2 G a l h 3 - l i n k a g e s , k n o w n a s H
d e t e r m i n a n t s ,
w h i c h
a r e e s s e n t i a l
p r e c u r s o r s
t o t h e A a n d B
a n t i g e n s .
E r y t h r o c y t e s
f r o m i n d i v i d u a l s w i t h t h e r a r e
B o m b a y
a n d
p a r a - B o m b a y
b l o o d
g r o u p p h e n o t y p e s
a r e d e f i c i e n t i n H
d e t e r m i n a n t s ,
a n d t h u s A a n d
B
d e t e r m i n a n t s ,
a s
a c o n s e -
q u e n c e
o f
a p p a r e n t
h o m o z y g o s i t y
f o r n u l l a l l e l e s a t t h e H l o c u s .
W e r e p o r t
a m o l e c u l a r
a n a l y s i s
o f
a human
a - ( 1 , 2 ) -
f u c o s y l t r a n s f e r a s e g e n e , t h o u g h t
t o
c o r r e s p o n d
t o t h e H
b l o o d
g r o u p l o c u s ,
i n
a
B o m b a y p e d i g r e e
a n d
a
p a r a - B o m b a y p e d i -
g r e e .
W e f i n d
i n a c t i v a t i n g p o i n t m u t a t i o n s
i n
t h e
c o d i n g r e g i o n s
o f b o t h a l l e l e s
f
t h i s
g e n e
i n
e a c h H - d e f i c i e n t
i n d i v i d u a l .
T h e s e
r e s u l t s d e f i n e t h e
m o l e c u l a r b a s i s f o r
H
b l o o d
g r o u p
a n t i g e n
d e f i c i e n c y
i n
B o m b a y
a n d
p a r a - B o m b a y
p h e n o t y p e s , p r o v i d e
c o m p e l l i n g
e v i d e n c e
t h a t t h i s
g e n e r e p r e s e n t s
t h e human
H
b l o o d
g r o u p
l o c u s ,
a n d
s t r o n g l y s u p p o r t
a
h y p o t h e s i s
t h a t
t h e
H a n d
SE l o c i
r e p r e s e n t a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l t r a n s f e r a s e
g e n e s .
C a n d i d a t e
s e q u e n c e s
f o r t h e human SE l o c u s a r e
i d e n t i f i e d b y l o w - s t r i n g e n c y
S o u t h e r n
b l o t
h y b r i d i z a t i o n
a n a l -
y s e s ,
u s i n g
a
p r o b e
d e r i v e d f r o m
t h e
H
a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l t r a n s -
f e r a s e
g e n e .
T h e
a n t i g e n s d e t e r m i n e d
b y
t h e h u m a n
AB O b l o o d
g r o u p
l o c u s
a r e
o l i g o s a c c h a r i d e
m o l e c u l e s c o n s t r u c t e d
b y
t h e
s e -
q u e n t i a l
a c t i o n o f
s p e c i f i c g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s .
T h e
f i n a l
s t e p
i n
t h i s
p a t h w a y
i s
c a t a l y z e d
b y
a l l e l i c
g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s
e n c o d e d
b y
t h e
AB O
l o c u s . T h e s e
e n z y m e s
r e q u i r e
a
p r e -
c u r s o r
o l i g o s a c c h a r i d e
s u b s t r a t e
( F u c a l
- *
2 G a l f - )
k n o w n a s
t h e
H b l o o d
g r o u p a n t i g e n ,
c o n s t r u c t e d
b y a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l -
t r a n s f e r a s e ( s ) [ a ( 1 , 2 ) F T s ; G D P - L - f u c o s e : 4 3 D - g a l a c t o s i d e
2 - a - L - f u c o s y l t r a n s f e r a s e ,
EC
2 . 4 . 1 . 6 9 ] .
G e n e t i c
a n d b i o -
c h e m i c a l
o b s e r v a t i o n s a r e c o n s i s t e n t w i t h a
h y p o t h e s i s
t h a t
t h e H a n d
S e c r e t o r ( S E ) b l o o d
g r o u p
l o c i
( a l s o k n o w n a s
FUTI a d
F U T 2 , r e s p e c t i v e l y ) c o r r e s p o n d t o d i s t i n c t
a ( 1 , 2 ) F T g e n e s
w i t h
t i s s u e - s p e c i f i c
e x p r e s s i o n p a t t e r n s a n d
c l o s e
g e n e t i c
l i n k a g e
o n
c h r o m o s o m e
1 9 ( 1 - 6 ) . U n d e r
t h i s
t w o - l o c u s
m o d e l
( 2 ) , t h e h u m a n
H
b l o o d g r o u p l o c u s d e t e r -
m i n e s
e x pr e ss i o n o f t h e H
a n t i g e n ( a s w e l l a s A a n d / o r B
a n t i g e n s )
i n
t h e
e r y t h r o i d l i n e a g e ,
w h e r e a s t h e SE l o c u s
c o n t r o l s
H
e x p r e s s i o n ( a n d
t h u s A o r B
a n t i g e n
e x p r e s s i o n )
i n a
v a r i e t y o f s e c r e t o r y e p i t h e l i a a n d i n
s a l i v a ( T a b l e 1 ) .
N e a r l y
a l l h u m a n s
m a i n t a i n a t l e a s t o n e
f u n c t i o n a l H a l l e l e
( 1 ) .
R o u g h l y 8 0 % o f t h e s e
( S e c r e t o r s ) a l s o m a i n t a i n
a t l e a s t
o n e
f u n c t i o n a l SE
a l l e l e , w h e r e a s t h e r e m a i n d e r ( n o n -
T a b l e 1 . P h e n o t y p e s
a n d
p r e d i c t e d g e n o t y p e s
a t
t h e h u m a n H
a n d SE b l o o d
g r o u p l o c i ( s e e r e f . 2 )
P h e n o t y p e
S e c r e t o r y
T r i v i a l name
E r y t h r o i d e p i t h e l i a G e n o t y p e
S e c r e t o r
H
p o s i t i v e
H
p o s i t i v e H/H, SE/-
N o n - S e c r e t o r H p o s i t i v e H n e g a t i v e H/H,
s e / s e
p a r a - B o m b a y
( h / h
H
H
p o s i t i v e SE/-
Bombay
( h / h
n o n - S e c r e t o r )
H
n e g a t i v e
H
n e g a t i v e h / h , s e / s e
S e c r e t o r s )
a r e
h o m o z y g o u s
f o r n u l l a l l e l e s
a t t h e SE
l o c u s .
I n d i v i d u a l s
o f t h e r a r e O h ( B o m b a y ) p h e n o t y p e ( 1 , 7 )
l a c k H
d e t e r m i n a n t s i n a l l t i s s u e s a n d a r e t h o u g h t t o b e
h o m o z y g o u s
f r n u l l a l l e l e s a t b o t h
l o c i
( T a b l e 1 )
( 2 ) .
O t h e r r a r e
i n d i v i d -
u a l s , o f t h e p a r a - B o m b a y p h e n o t y p e ( 1 ,
8 ) , s y n t h e s i z e H
d e t e r m i n a n t s
i n
t h e i r
s e c r e t o r y e p i t h e l i a b u t n o t i n t h e
e r y t h r o i d l i n e a g e ( 1 ) .
T h e s e
p e r s o n s
a r e b e l i e v e d
t o
b e
h o m o z y g o u s f o r
n u l l
a l l e l e s
a t t h e
H
l o c u s
( 1 , 2 ) b u t
a p p a r -
e n t l y h a v e a t
l e a s t o n e f u n c t i o n a l SE a l l e l e .
T h e b a s i s f o r n u l l
a l l e l e s
a t
t h e s e l o c i h a s
n o t b e e n d e f i n e d ,
n o r h a s t h e
t w o - l o c u s
h y p o t h e s i s c o n f i r m e d a t
t h e
m o l e c u l a r l e v e l . W e h a v e
p r e v i o u s l y i s o l a t e d a h u m a n
a ( 1 , 2 ) F T
cDNA w h o s e
c o g n a t e e n z y m e i s k i n e t i c a l l y
s i m i l a r
t o
t h a t
o f t h e H
a ( 1 , 2 ) F T
a n d w h o s e c h r o m o s o m a l
l o c a t i o n
( n u m b e r 1 9 )
i s
s y n t e n i c
t o t h e H b l o o d g r o u p l o c u s ( 9 ) .
c o n f i r m
t h e
h y p o t h e s i s
t h a t t h i s
cDNA c o r r e s p o n d s t o t h e H
l o c u s , a n d t o
i d e n t i f y
t h e m o l e c u l a r
b a s i s f o r d e f i c i e n c y o f
H
d e t e r m i n a n t s i n
p r e s u m e d
h / h
i n d i v i d u a l s ,
we d e t e r m i n e d t h e
g e n o m i c
s t r u c t u r e a n d
s e q u e n c e o f a
w i l d - t y p e a l l e l e a n d
c o m p a r e d
i t
t o a l l e l e s t a k e n
f r o m
H - d e f i c i e n t
i n d i v i d u a l s .
I n a c t i v a t i n g p o i n t m u t a t i o n s w e r e
i d e n t i f i e d w i t h i n t h e
c o d i n g
p o r t i o n s
o f e a c h s u c h
a l l e l e , i n c l u d i n g
a l l e l e s
i n i n d i v i d u a l s
w i t h w i l d - t y p e SE l o c u s - d e t e r m i n e d
H
a n t i g e n e x p r e s s i o n .
T h e s e r e s u l t s
y i e l d a m o l e c u l a r
e x p l a n a t i o n f o r A B H
b l o o d
g r o u p
d e f i c i e n c y
i n B o m b a y
a n d
p a r a - B o m b a y i n d i v i d u a l s ,
p r o v i d e
g e n e t i c
s u p p o r t f o r a s s i g n m e n t
o f
t h i s
a ( l , 2 ) F T
g e n e
t o t h e H
l o c u s ,
a n d i n d i c a t e t h a t t h e SE l o c u s
r e p r e s e n t s a n
a ( 1 , 2 ) F T
g e n e
d i s t i n c t f r o m t h e H
l o c u s .
M A T E R I A LS
AN D
M E T H O D S
C l o n i n g
o f
a ( 1 , 2 ) F T A l l e l e s .
G e n o m i c DNA s e q u e n c e s
c o r r e s p o n d i n g
t o
a
p r e v i o u s l y d e s c r i b e d h u m a n a ( 1 , 2 ) F T
cDNA
[ p C D M 7 - a ( 1 , 2 ) F T ;
r e f . 9 ] w e r e i s o l a t e d f r o m
p h a g e
g e n o m i c DNA
l i b r a r i e s p r e p a r e d
f r o m
l e u k o c y t e DNA i s o -
l a t e d f r o m a n
H - p o s i t i v e
i n d i v i d u a l a n d
f r o m a n H - d e f i c i e n t
A b b r e v i a t i o n :
a ( 1 , 2 ) F T , a - ( 1 , 2 ) - f u c o s y l t r a n s f e r a s e .
T o
w h o m
r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e
a d d r e s s e d .
5 8 4 3
T h e
p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e
d e f r a y e d
i n p a r t b y p a g e
c h a r g e
p a y m e n t .
T h i s
a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e
h e r e b y
m a r k e d
a d v e r t i s e m e n t
i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C .
§ 1 7 3 4 s o l e l y
t o i n d i c a t e t h i s
f a c t .
5 8 4 4
M e d i c a l S c i e n c e s : K e l l y e t a l .
i n d i v i d u a l ( X ; Bombay p h e n o t y p e ) ( 1 0 ) .
L i b r a r i e s w e r e
s c r e e n e d
b y
p l a q u e h y b r i d i z a t i o n ( 1 1 ) u s i n g
a 1 . 2 - k b
H i n f l
f r a g m e n t i s o l a t e d f r o m t h e i n s e r t
i n p C D M 7 - a ( 1 , 2 ) F T ( 9 ) .
A d j a c e n t E c o R I f r a g m e n t s o f 2 . 7 a n d . 5 k b f r o m a s i n g l e
p h a g e w e r e s u b c l o n e d i n t o t h e u n i q u e E c o R I s i t e i n t e v e c t o r
pWE15 ( S t r a t a g e n e ) . B o t h s t r a n d s o f t h e s e f r a g m e n t s w e r e
s e q u e n c e d
b y u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e p r i me r s c o r r e s p o n d i n g t o
t h e i n s e r t
s e q u e n c e .
T h e c o d i n g s e q u e n c e s o f t h e t w o a l l e l e s
( Y 1 a n d Y 2 ) f r o m
a p a r a - B o m b a y i n d i v i d u a l w e r e g e n e r a t e d
w i t h t h e PCR ( 1 1 ) ,
u s i n g
p r i m e r p a i r s f l a n k i n g t h e m u t a t i o n
i n Y 2 ( F i g .
1 ) .
O n e
p a i r o f t h e s e p r i m e r s a m p l i f i e s a
s e q u e n c e
b e t w e e n a p o s i t i o n
w i t h i n i n t r o n a t a l o c a t i o n 1 8 7 - 1 5 7
n t 5 ' t o t h e A o f t h e
i n i t i a t i o n c o d o n (GCGCAAGCTTCTCAICCCTiAAAC.
CTAGGACTCAGGCTCT)
a n d a t n t 1 0 3 5 - 1 0 6 5 w i t h i n t h e
c o d i n g
s e q u e n c e ( t a k i n g
t h e A r e s i d u e o f t h e
i n i t i a t i o n
c o d o n
a s n t 1 ,
n u m b e r e d
a s i n
r e f . 9 ; GCGCTCTAGAE[CAT-
TAATGCCCACCCACTCGGGCAG)
a t a s i t e 3 '
t o t h e
Y 2
m u t a t i o n .
T h e o t h e r p r i m e r p a i r a m p l i f i e s
a
s e q u e n c e
b e -
t w e e n n t
6 5 7 a n d 6 8 5 o f
t h e
c o d i n g s e q u e n c e ( 5 '
t o t e
Y 2
m u t a t i o n ; GCGCAAGCTTGCGCCGTGGGGACTATCTG-
CAGGTTATGCC)
a n d b e t w e e n n t 1 1 3 5 a n d 1 1 6 6
w i t h i n
t h e
3 ' u n t r a n s l a t e d
r e g i o n
(GCGCTCTAGACAGGCCTCT-
GAAGCCACGTACTGCTGGCTC).
G e n o m i c DNA w a s
s u b j e c t e d t o 3 0 c y c l e s
o f
a m p l i f i c a t i o n ( d e n a t u r a t i o n
a t
9 4 T C
a
1 k b
exon 1 i n t r o n
5
u t
f o r
1 . 5
m i n ;
a n n e a l i n g / e x t e n s i o n f o r 2 . 5
m i n
a t 7 2 0 C ) . F r a g -
m e n t s g e n e r a t ed w i th t h e s e p r i m e r p a i r s w e r e s u b c l o n e d i n t o
pTZ19R
( P h a r m a c i a L K B ) . C l o n e s c o r r e s p o n d i n g t o
a l l e l e
Y ,
a n d t o a l l e l e Y 2 w e r e d i s t i n g u i s h e d b y d i g e s t i o n w i t h B s t N I
( c l e a v e s Y 2 , n o t w i l d t y p e
o r Y 1 ,
a t t h i s p o s i t i o n ) . M u l t i p l e
c l o n e s c o r r e s p o n d i n g t o e a c h a l l e l e w e r e s e q u e n c e d
t o d i s -
t i n g u i s h PCR e r r o r s f r o m a c t u a l s e q u e n c e
p o l y m o r p h i s m s .
T h e s e a n a l y s e s i d e n t i f i e d t h e m u t a t i o n i n
t h e Y 1 a l l e l e c o r -
r e s p o n d i n g t o a m i n o a c i d r e s i d u e 1 6 4 a n d i n d i c a t e d
t h a t t h e
Y 1
a n d Y 2 c o d i n g r e g i o n s a r e o t h e r w i s e i d e n t i c a t o
t h e
w i l d - t y p e
c o d i n g r e g i o n .
E x p r e s s i o n V e c t o r C o n s t r u c t i o n a n d A n a l y s i s .
E x p r e s s i o n
v e c t o r s c o n t a i n i n g s i n g l e o r m u l t i p l e m u t a t i o n s w e r e a s s e m -
b l e d w i t h r e s t r i c t i o n f r a g m e n t e x c h a n g e p r o c e d u r e s ( 1 1 ) ,
u s i n g r e s t r i c t i o n s i t e s i n t h e 6 . 5 - k b E c o R I f r a g m e n t t h a t
e n c o m p a s s e s t h e t w o
a ( 1 , 2 ) F T
e x o n s
( F i g . 1 ) , c l o n e d i n t o
t h e
E c o R I s i t e
o f v e c t o r pWE15 ( 1 2 ) . D e t a i l s o f v e c t o r c o n s t r u c -
t i o n s a r e a v a i l a b l e f r o m
t h e
a u t h o r s . C O S - 1 c e l l s
w e r e
t r a n s f e c t e d
b y
a D E A E - d e x t r a n p r o c e d u r e ( 1 1 ) . A c o n t r o l
v e c t o r (pCDM7-CAT) e n c o d i n g c h l o r a m ph e n i c o l a c e t y l -
t r a n s f e r a s e [ d e r i v e d
f r o m
pSV2-CAT ( 1 1 )
a n d
pCDM7 ( 9 ) ]
w a s c o t r a n s f e c t e d t o a l l o w n o r m a l i z a t i o n f o r t r a n s f e c t i o n
e f f i c i e n c y .
C e l l e x t r a c t s w e r e
p r e p a r e d 7 2
h r
a f t e r t r a n s f e c -
t i o n
( 9 )
a n d
w e r e
u s e d i n
a ( 1 , 2 ) F T a c t i v i t y a s s a y s ( 1 2 )
p e r f o r m e d
i n
d u p l i c a t e
u n d e r
l i n e a r
r e a c t i o n c o n d i t i o n s .
e x o n
2
c o d i n g r e g i o n
:
X.
1 .
y
K
X
(
7 ~
r
oL
B o m b a y
X 1
w i l d - t y p e
...t t t t t t t t
aagacag...
B o m b a y
.
.
. t t t t t t t t o a a g a c a g . . .
X 2 w i l d - t y p e
... . t g c t g g g a t t a c a g g
...
B o m b a y
...t g c t g g g g t t a c a g g ...
X 3 w i l d - t y p e
B o m b a y
...g c c t c a g t g c a t t t g ...
...
g c c t c a g g g c a t t t g
...
B s t N I
X 4 w i l d - t y p e
...
G C T
G C C
T A C
C T G G C T
...
* - -
A
A
Y 3 1 6 L
A ...
A / u l
B o m b a y
... G C T
G C CTAC
TG GCT
... A
A
S t o p
p a r a - B o m b a y
A I u l
Y 1
w i l d - t y p e
. . . C T G A A G
C T C
T C T
G G C . . .
* - -
L K
L 1 6 4 S
G ...
p a r a - B o m b a y
. . . C T G
A A G C A C T C T
G G C
. . .
.. .
L K H
S G . . .
B s t N I
Y 2
w i l d - t y p e
... A C C T C C
C A G G G C G A T ...
T
S Q 2 7 6 G
D ...
B f a l
p a r a - B o m b a y
...
A C C T C C
J A G
G G C G A T
.. .
...
T
S
S t o p
.. .
X 5
w i l d - t y p e
..
. g t t g g c c g g g a t g g t ...
B o m b a y
...
g t t g g c c a g g a t g g t
X 6 w i l d - t y p e
...
t t t t t t t
a a t t a t t t . . .
B o m b a y
...
t t t t t t t t a a t t a t t t
...
F I G . 1 . S t r u c t u r e o f w i l d - t y p e
a n d
m u t a n t
a ( 1 , 2 ) F T
a l l e l e s .
( a )
S c a l e a n d l i n e a r
map
o f t h e
g e n e . C o d i n g p o r t i o n
o f
exon
2 i s d e n o t e d
b y
t h e s o l i d a r e a .
N o n c o d i n g p o r t i o n s
o f exons 1 a n d
2
ar e s h a d e d . P o s i t i o n s o f
DNA
sequence
d i f f e r e n c e s b e t w e e n a
w i l d - t y p e
a l l e l e
a n d a l l e l e s
i s o l a t e d
f r o m H - d e f i c i e n t i n d i v i d u a l s
( X 1 - X 6 , B o m b a y ;
Y 1 a n d
Y 2 , p a r a - B o m b a y )
are
i n d i c a t e d a b o v e t h e s c h e m a t i c .
R e g i o n
i n d i c a t e d
b y
A b e l o w
t h e
map c o r r e s p o n d s t o t r a n s c r i p t i o n
i n i t i a t i o n
s i t e .
DNA
sequence
o f t h i s area i s
cctcccaagcCCTCGCTGCCAGTCCGGACAGGCT-
GGCGGAGGGGAGGGCCTGCCGGGCCGGATAGCCGGACGCCTGGCGT...,
w h e r e
u n d e r l i n e d
n u c l e o t i d e s
r e p r e s e n t
t h e f i r s t
9 b a s e s
o f t h e h u m a n
a ( 1 , 2 ) F T
cDNA
( 9 ) .
P r i m e r - e x t e n s i o n
a n a l y s e s ( d a t a
n o t
s h o w n )
d e f i n e t h e
g e n e ' s t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e
( b o l d f a c e
C)
i n
a
c e l l
l i n e
( A 4 3 1 )
t h a t
expresses t h i s gene ( 9 , 1 2 ) . R e g i o n
i n d i c a t e d b y
B
c o r r e s p o n d s t o
t h e
5 ' s p l i c e
j u n c t i o n
b e t w e e n
exon
I a n d
t h e i n t r o n
( . . .
AGCAGCTCGGgtaagtgg
...
. ;
i n t r o n i c
sequence
i n l o w e r c a s e
l e t t e r s ) . u t ,
U n t r a n s l a t e d
r e g i o n . R e g i o n
i n d i c a t e d
b y
C i n t h e
s c h e m a t i c
c o r r e s p o n d s
t o t h e
3 '
s p l i c e j u n c t i o n
b e t w e e n t h e
i n t r o n
( l o w e r c a s e
l e t t e r s )
a n d
exon 2
( u p p e r c a s e l e t t e r s ) ( .
.
. c a g l g c a t t t g c t a a t t c g c c t t t c c t c -
c c c t g c a g C C AT G
T GG
CT C
. ) .
U n d e r l i n e d
t
r e s i d u e i n t h i s
sequence c o r r e s p o n d s
t o m u t a t i o n
X 3 ( s e e b ) .
U n d e r l i n e d
A T G r e s i d u e s
c o r r e s p o n d
t o t h e
e n z y m e ' s
i n i t i a t o r
m e t h i o n i n e c o d o n
( 9 ) .
R e s t r i c t i o n
s i t e s
u s e d
t o
c r e a t e c h i m e r i c
a ( 1 , 2 ) F T
v e c t o r s
( s e e F i g . 2 ) ,
a n d t h e
E c o R I
a n d D r a I s i t e s
u s e d
i n
F i g . 5 ,
ar e
s h o w n
b e l o w .
( b ) S e q u e n c e
d i f f e r e n c e s b e t w e e n
t h e
w i l d - t y p e
a l l e l e a n d t h e H - d ef i c i e nt a l l e l e s .
N u c l e o t i d e
sequence, p r e d i c t e d
a m i n o
a c i d
sequence,
a n d a m i n o a c i d n u m b e r
ar e
s h o w n f o r e a c h
sequence
d i f f e r e n c e . N u c l e o t i d e
sequence
d i f f e r e n c e s
i n
H - d e f i c i e n t a l l e l e s ar e u n d e r l i n e d .
S e q u e n c e
d i f f e r e n c e s
( X 1 - X 6 )
i d e n t i f i e d
i n t h e
Bombay p r o p o s i t u s
X ar e a t l e f t
( B o mb a y ) . P o l y m o r ph i c
B s t N I a n d
A l u
I
s i t e s c o r r e s p o n d i n g
t o
t h e X 4 a l l e l e are o v e r l i n e d . S e q u e n c e d i f f e r e n c e s
( Y 1
a n d
Y 2 )
i d e n t i f i e d
i n
t h e
p a r a - B o m b a y i n d i v i d u a l
Y
ar e s h o w n a t
r i g h t ( p a r a - B o m b a y ) . P o l y m o r p h i c
A l u
I , B s t N I ,
a n d B f a I s i t e s
c o r r e s p o n d i n g
t o
t h e
Y ,
a n d
Y 2
a l l e l e s
ar e
o v e r l i n e d .
I 0
A B
b
............
P r o c . N a t l . Acad S c i . USA
9 1
( 1 9 9 4 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 1
( 1 9 9 4 )
5 8 4 5
E x t r a c t s w e r e a l s o
s u b j e c t e d
t o
c h l o r a m p h e n i c o l a c e t y l t r a n s -
f e r a s e a c t i v i t y a s s a y s ( 1 1 ) .
P e d i g r e e A n a l y s e s . H a n d L e w i s b l o o d
g r o u p
p h e n o t y p e s o f
e a c h i n d i v i d u a l w e r e
d e t e r m i n e d b y
s t a n d a r d
b l o o d
t y p i n g
p r o c e d u r e s ( 1 3 ) . F o r PCR a n a l y s e s , g e n o m i c D N A w a s
p r e p a r e d f r o m p e r i p h e r a l b l o o d
( 1 1 ) , o r f r o m
f r e s h l y
p l u c k e d
h a i r s
( 1 4 ) ,
a n d w a s
u s e d a s
PCR t e m p l a t e
u n d e r t h e
r e a c t i o n
c o n d i t i o n s d e s c r i b e d a b o v e . PCR
p r i m e r s
u s e d
t o s a m p l e t h e
X 4
a n d
Y 2 p o s i t i o n s
(GCGCAAGCTTGCGCCGTGGGGAC-
TATCTGCAGGTTATGCC a n d
G C G C T C T A G A Q T f J - Q
CATTAATGCCCACCCACTCGGGCAG)
c o r r e s p o n d
t o
p o s i t i o n s 6 5 7 - 6 8 6 a n d 1 0 3 5 - 1 0 6 5 ,
r e s p e c t i v e l y ,
o f t h e
a 1 , 2 ) F T
cDNA
( 9 ) .
T h i r t y
n u c l e o t i d e s o f
e a c h
p r i m e r
( u n -
d e r l i n e d ) a r e
d e r i v e d f r o m
t h e cDNA
s e q u e n c e .
T e n
f l a n k i n g
n u c l e o t i d e s i n c l u d e a r e s t r i c t i o n s i t e
( L i n d I , AAGCTT;
X b a I ,
T C T A G A ) .
T h e Y 1 p o s i t i o n
w a s
a n a l y z e d u s i n g
n e s t e d
PCR p r i m e r s . T h e o u t e r m o s t p a i r c o r r e s p o n d s
t o
p o s i t i o n s
3 3 5 - 3 6 4
(TCCTGCCTGCCATGCATGCCGCCCTGGCCC)
a n d 6 5 7 - 6 8 6
(GGCATAACCTGCAGATAGTCCCCACG-
GCGC)
o f t h e
a ( 1 , 2 ) F T
cDNA ( 9 ) .
T h e
i n n e r
p a i r
c o r r e -
s p o n d s t o p o s i t i o n s 3 6 6 - 3 9 5
(GGTATTCCGCATCACCCT-
GCCCGTGCTGGC)
a n d 6 2 6 - 6 5 5
(CGTGGACGCCGA-
CAAAGGTGCGCGGGCGGT).
PCR p r o d u c t s w e r e t h e n s u b j e c t e d t o r e s t r i c t i o n e n d o n u -
c l e a s e
d i g e s t i o n
a n d
a c r y l a m i d e g e l
e l e c t r o p h o r e s i s ( s e e
F i g s .
3 a n d
4 ) . P r o d u c t s e n c o m p a s s i n g t h e
Y 1
p o s i t i o n
w e r e a l s o
f i x e d t o n y l o n h y b r i d i z a t i o n m e m b r a n e s a n d p r o b e d w i t h
3 2 P - l a b e l e d
a l l e l e - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e s ( 1 5 )
( w i l d -
t y p e p r o b e ,
CTGAAGCTCTCTGGC;
Y 1 - s p e c i f i c
p r o b e ,
C T -
GAAGCACTCTGGC)
( s e e F i g . 4 ) . F i l t e r s w e r e
h y b r i d i z e d
a t
3 7 0 C i n
5 x s t a n d a r d s a l i n e
p h o s p h a t e / E D T A ( S S P E ) / 5 x
D e n h a r d t ' s
s o l u t i o n / 0 . 5 %
S D S / 0 . 1 mg
o f s h e a r e d s a l m o n
s p e r m
DNA
p e r m l ,
r i n s e d i n 2 x
S S P E / 0 . 1 %
SD S
a t
r o o m
t e m p e r a t u r e ,
w a s h e d
f o r
1 0
m i n
a t 4 2 0 C i n
2 x
S S P E / 0 . 1 %
S D S ,
a n d
s u b j e c t e d
t o
a u t o r a d i o g r a p h y .
RESULTS
To
i d e n t i f y
DNA
s e q u e n c e
d i f f e r e n c e s
t h a t
m i g h t
i n a c t i v a t e
t h e
a ( 1 , 2 ) F T
g e n e
i n
B o m b a y i n d i v i d u a l s ,
we
s e q u e n c e d
= 6 . 5
k b o f
g e n o m i c DNA
e n c o m p a s s i n g
a
w i l d - t y p e
a l l e l e
a n d t h e
c o r r e s p o n d i n g
6 . 5 - k b
r e g i o n
i n
a
B o m b a y
a l l e l e
( F i g . 1 ) .
T h e
B o m b a y
a l l e l e
( i n d i v i d u a l X
i n
F i g . 1 ) d i f f e r s f r o m
t h e
w i l d - t y p e a l l e l e
a t s i x
p o s i t i o n s . T h r e e o f t h e s e
s i n g l e n u c l e -
o t i d e
d i f f e r e n c e s a r e i n t h e
g e n e ' s
s i n g l e i n t e r v e n i n g s e q u e n c e
( X 1 , X 2 , X 3 ) ,
o n e i s
w i t h i n
t h e
c o d i n g r e g i o n ( X 4 ) ,
a n d
t w o
a r e
i n t h e 3 '
u n t r a n s l a t e d
r e g i o n ( X 5 ,
X 6 ) .
T h e s e q u e n c e
d i f f e r -
e n c e t h e
c o d i n g r e g i o n ( X 4 )
i s
a
n o n s e n s e
m u t a t i o n t h a t
c r e a t e s a t e r m i n a t i o n c o d o n
c o r r e s p o n d i n g
t o a m i n o a c i d 3 1 6
o f t h e
w i l d - t y p e
a ( 1 , 2 ) F T
( T y r - 3 1 6
- -
t e r ) .
T h i s
s e q u e n c e
a l t e r a t i o n p r e d i c t s
a m u t a n t
p o l y p e p t i d e
t h a t i s
m i s s i n g
t h e 5 0
C - t e r m i n a l a m i n o a c i d s o f t h e
w i l d - t y p e e n z y m e .
A
N o n s e n s e M u t a t i o n
I n a c t i v a t e s
t h e
a ( 1 , 2 ) F T
G e n e i n
a
B o m b a y
I n d i v i d u a l .
T o c o n f i r m
t h a t t h e
T y r - 3 1 6
- *
t e r
m u t a t i o n i n a c t i v a t e s t h i s
a l l e l e ,
t h i s
DNA
s e q u e n c e
d i f f e r -
e n c e
a n d
e a c h o f t h e
o t h e r s w e r e m o v e d i n t o
t h e
w i l d - t y p e
s e q u e n c e b a c k g r o u n d
a n d t e s t e d
f o r f u n c t i o n b y t r a n s f e c t i o n
i n t o a
a ( 1 , 2 ) F T - d e f i c i e n t m a m m a l i a n
h o s t ( C O S - 1 c e l l s ; r e f .
9 ) ( F i g .
2 ) .
T h e
w i l d - t y p e
c o n s t r u c t
( p l a s m i d p H H H ;
F i g . 2 )
e n c o d e s a
s u b s t a n t i a l
a m o u n t
o f a ( 1 , 2 ) F T
a c t i v i t y , w h e r e a s
t h e
B o m b a y
c o n s t r u c t
( p l a s m i d p B B B )
g e n e r a t e s n o e n z y m e
a c t i v i t y .
I n t r o d u c t i o n o f t h e
T y r - 3 1 6
- -
t e r m u t a t i o n
i n t o
t h e
w i l d - t y p e
b a c k g r o u n d c o m p l e t e l y i n a c t i v a t e s t h e
w i l d - t y p e
g e n e ( p l a s m i d p H B H ) . By
c o n t r a s t , v e c t o r s c o n t a i n i n g e a c h
o f
t h e o t h e r
D N A
s e q u e n c e d i f f e r e n c e s
i n
t h e B o m b a y a l l e l e
e x p r e s s n o r m a l l e v e l s o f a ( 1 , 2 ) F T
a c t i v i t y i n t r a n s f e c t e d c e l l s
( p l a s m i d s
p B H H a n d
p H H B ) . C o r r e c t i o n o f
t h e T y r - 3 1 6
t e r
m u t a t i o n
i n
t h e
B o m b a y a l l e l e
( p l a s m i d
pBHB) f u l l y
r e s t o r e s
e n z y m e a c t i v i t y . T h e s e
r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e
T y r - 3 1 6
- +
t e r
m u t a t i o n i s
r e s p o n s i b l e
f o r
i n a c t i v i t y
o f
t h i s
a l l e l e i n t h e
B o m b a y
i n d i v i d u a l
a n d
i n d i c a t e t h a t t h e o t h e r
VECTOR
p W
p
V F
I 1 E -
p i r 1 P s
p ; , B
p ; J . ) B H
CQONSTRUC
I
. 2 1 F
ACTIVITY
. -
.-
,-
::
F
^
£ 3 -
1 1 _ 7t
- £ 3 a - - - - - - - . : < N - ;I Z--
F I G .
2 .
F u n c t i o n a l
a n a l y s i s
o f
a ( 1 , 2 ) F r
a l l e l e s
i s o l a t e d f r o m
w i l d - t y p e a n d H - d e f i c i e n t
i n d i v i d u a l s . E x p r e s s i o n v e c t o r s
c o n t a i n ,
s i n g l y
o r i n
c o m b i n a t i o n ,
t h e
D NA
s e q u e n c e
d i f f e r e n c e s a s s o c i a t e d
w i t h t h e H - d e f i c i e n t
p h e n o t y p e ( p l a s m i d s
p B B B ,
p B H B ,
pHBH,
pBHH,
p e % - B 1 ,
a n d
p p a a - B D )
o n
a w i l d - t y p e s e q u e n c e
b a c k g r o u n d
( p l a s m i d
H H H ) . P o i n t
m u t a t i o n s a r e i n d i c a t e d a b o v e
e a c h v e c t o r
d i a g r a m . S i n g l e
l i n e s i n d i c a t e
i n t r o n i c o r
f l a n k i n g s e q u e n c e .
S t i p p l e d
b o x e s c o r r e s p o n d t o t h e 5 n o n c o d i n g
e x o n a n d 3 '
u n t r a n s l a t e d
r e g i o n . S o l i d b o x d e n o t e s
c o d i n g s e q u e n c e . O p e n a r e a s w i t h i n t h e
s o l i d b o x c o r r e s p o n d
t o
r e g i o n s
o f t h e
p r o t e i n p r e d i c t e d t o
b e
t r u n c a t e d b y n o n s e n s e m u t a t i o n s
( v e c t o r s p B B B , pHBH,
a n d
p p , -
B 2 ) . E a c h v e c t o r , o r a
c o n t r o l p l a s m i d ( p W E 1 5 ) , w a s
t r a n s f e c t e d i n t o
C O S - 1
c e l l s ,
a n d
e x t r a c t s f r o m t h e
t r a n s f e c t e d
c e l l s
w e r e
s u b j e c t e d
t o
a ( 1 , 2 ) F T a c t i v i t y d e t e r m i n a t i o n s .
a ( 1 , 2 ) F T a c t i v i t y l e v e l s a r e
m e a n v a l u e s ± SE M
d e t e r m i n e d f o r a t l e a s t t h r e e i n d e p e n d e n t
t r a n s f e c t i o n s , e a c h n o r m a l i z e d f o r
t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y a s d -
s c r i b e d .
DNA s e q u e n c e d i f f e r e n c e s
r e p r e s e n t
f u n c t i o n a l l y n e u t r a l
DNA
s e q u e n c e
p o l y m o r p h i s m s .
T h e B o m b a y P r o p o s i t u s I s
H o m o z y g o u s
f o r t h e N o n s e n s e
M u t a t i o n .
B e c a u s e o f t h e
r a r i t y
o f t h e r e c e s s i v e
B o m b a y
p h e n o t y p e ( 1 ) , a n d b e c a u s e
c o n s a n g u i n i t y i s
n o t uncommon
i n
B o m b a y p e d i g r e e s
( 1 , 1 6 ) ,
we
s o u g h t t o d e t e r m i n e w h e t h e r
i n d i v i d u a l X wa
h o m o z y g o u s
f o r
t h e
T y r - 3 1 6
- -
t e r
m u t a -
t i o n .
T h i s
s e q u e n c e
d i f f e r e n c e y i e l d s
r e s t r i c t i o n s i t e c l e a v a g e
p o l y m o r p h i s m s f o r B s t N I
( c l e a v e s t h e w i l d - t y p e a l l e l e ) a n d
A l u I
( c l e a v e s
t h e B o m b a y a l l e l e ) ( F i g . 1 ) .
A l l e l e a s s i g n m e n t
a t t h i s p o s i t i o n w a s t h e r e f o r e
a c c o m p l i s h e d b y r e s t r i c t i o n
a n a l y s i s
o f t h e
c o r r e s p o n d i n g s e g m e n t
o f t h e c o d i n g r e g i o n
g e n e r a t e d b y
t h e
PCR
( F i g .
3 )
T h e s e
a n a l y s e s i n d i c a t e t h a t
t h e
p r o p o s i t u s i s
h o m o z y g o u s
f o r
t h e
T y r - 3 1 6
- -
t e r
m u t a t i o n
a s a r e s u l t o f
i n h e r i t i n g t h e c o r r e s p o n d i n g DNA
s e q u e n c e
a l t e r a t i o n f r o m e a c h
h e t e r o z y g o u s p a r e n t ( F i g .
3 ) . E a c h o f h i s
l i v i n g
s i b l i n g s i s n o t
e r y t h r o i d H d e f i c i e n t a n d i s
e i t h e r
h e t e r o z y g o u s
f o r t h i s a l l e l e
o r i s
h o m o z y g o u s f o r t h e
w i l d -
t y p e a l l e l e ( F i g . 3 . T h i s
i s a
r a r e
a l l e l e i n t h e g e n e r a l
p o p u l a t i o n , s i n c e
t h i s
DNA
s e q u e n c e a l t e r a t i o n w a s n o t
d e t e c t e d i n a n
a n a l y s i s
o f a l l e l e s
f r o m u n r e l a t e d
H - p o s -
i t i v e
i n d i v i d u a l s
( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t
t h e
T y r - 3 1 6
- -
t e r
m u t a t i o n i s
r e s p o n s i b l e
f o r t h e
H - d e f i c i e n t
p h e n o t y p e
o f
t h e p r o p o s i t u s . When c o n s i d e r e d
t o g e t h e r w i t h
e n z y m e k i n e t i c d a t a
a n d c h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o n r e s u l t s ,
t h e
d a t a a l s o
s t r o n g l y s u p p o r t
t h e h y p o t h e s i s t h a t t h i s g e n e
c o r r e s p o n d s
t o
t h e h u m a n H b l o o d g r o u p l o c u s ( 9 ) .
N o n s e n s e
a n d
M i s s e n s e
M u t a t i o n s I n a c t i v a t e
t h e
a ( 1 , 2 ) F T
G e n e
i n
p a r a - B o m b a y I n d i v i d u a l s . A s a d i r e c t t e s t
o f t h e
h y p o t h e s i s t h a t t h e
H a n d
SE l o c i a r e
d i s t i n c t
a ( 1 , 2 ) F T
g e n e s ,
a n d
t o f u r t h e r
s u p p o r t
t h e
a s s i g n m e n t o f
t h i s
g e n e t o t h e
H
l o c u s ,
we
e x a m i n e d b o t h a l l e l e s
o f
t h i s g e n e i n a S e c r e t o r -
p o s i t i v e , e r y t h r o i d H - d e f i c i e n t
i n d i v i d u a l [ p a r a - B o m b a y
p h e -
n o t y p e ( 1 , 2 , 8 ) ; i n d i v i d u a l Y
i n
F i g . 1 ] . W e f o u n d t h a t t h e
c o d i n g r e g i o n
o f
e a c h a l l e l e
i n
t h i s p a r a - B o m b a y p e r s o n
c o n t a i n s
a
s i n g l e
b a s e
s e q u e n c e a l t e r a t i o n
r e l a t i v e t o c o r r e -
s p o n d i n g p o s i t i o n s
i n
t h e
w i l d - t y p e s e q u e n c e ( F i g . 1 ) . O n e
M e d i c a l S c i e n c e s :
K e l l y
e t
a l .
5 8 4 6
M e d i c a l S c i e n c e s : K e l l y e t a l .
a
n d i g e s t e d 4 0 9
B s t N I d i g e s t i o n W i l d
t y p e
1 7 0
1 2 3
2 4 ^
9 2
( B )
B o m b a y
1 7 0 T
[ 1 A U :
9 2
A l u l
d i g e s t i o n W i l d t y p e _
4 0 9
( A )
B o m b a y
L14Z71
U n d i g e s t e d
b
4 0 9
B s t N I W i l d t y p e
1 7 0 1 2 3
2 4 9 2
A / l
( B )
p B o m b a y
2 9 3
2 4
9 2
A
B f a l W i l d
t y p e 4 0 9
( F )
p B o m b a y
7
0 J 2 3 9
C
J n d i g e s i e c
2 9 0
W i l d
t v o e
6 4 - 6 5 4 1 1 4 : 5 2
p B o m b a v 6 4 6
1 6 8
5 2
a
Bc
T i c
H H h A H I h H h u h HH H
H h H : . i h H . - H t i . : h
H
h
H J F
-
S e l s e S e i s e S e l s e
S e
-
s e s e S e s e S e s e -
e
0 3
3 1 0
-
2 8 1
27 1
2 3 4
t 9 4
1 1 8
6 0 3
3 1 0
2 8 1
2 7 1
7 2 3 4
1 9 4
1 1 8
2
F I G .
3 . A n a l y s i s o f t h e
X 4 m u t a t i o n i n a
B o m b a y p e d i g r e e ( 1 0 ) .
( a )
A l l e l e - s p e c i f i c r e s t r i c t i o n s i t e p o l y m o r p h i s m s a t t h e X 4 p o s i t i o n . T h e
single
base
c h a n ge
C
--
G)
corresponding
to the
X4
Bombay
allele
( i n d i c a t e d b y * ) d e s t r o y s
a B s t N I r e s t r i c t i o n s i t e a n d c r e a t e s a n A l u I
s i t e
( s e e F i g . l b ) .
PCR was u s e d t o a m p l i f y 4 0 9
b p
o f t h e
a ( 1 , 2 ) F T gene
e n c o m p a s s i n g
t h i s
p o s i t i o n ( t o p ) ,
u s i n g
p r i m e r s ( i n d i c a t e d b y a r r o w s )
d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d
M e t h o d s . B s t N I
c l e a v a g e
o f t h i s
s e g m e n t
( m i d d l e , l a b e l e d B )
f r o m t h e
w i l d - t y p e
a l l e l e
y i e l d s
1 2 3 -
2 4 - b p
f r a g m e n t s ,
w h e r e a s a
s i n g l e d i a g n o s t i c
B s t N I - r e s i s t a n t
1 4 7 - b p
f r a g m e n t
i s o b t a i n e d
w i t h t h e
X 4
B o m b a y
a l l e l e ( s h a d e d ) .
C o n v e r s e l y ,
A l u I
d i g e s t i o n ( b o t t o m ,
l a b e l e d A )
o f t h e PCR
f r a g m e n t
g e n e r a t e d
f r o m
t h e
X 4 B o m b a y
a l l e l e
y i e l d s
2 9 2 - a n d
1 1 7 - b p
f r a g m e n t s ( s h a d e d ) ,
w h e r e a s
t h e 4 0 9 - b p s e g m e n t
f r o m
t h e w i l d - t y p e
a l l e l e i s n o t c l e a v e d
b y
A l u I .
( b )
A n a l y s i s
o f
a l l e l e - s p e c i f i c
r e s t r i c t i o n
s i t e
p o l y m o r p h i s m s .
G e n o m i c
DNAw a s
s u b j e c t e d
t o PCR a m p l i f i c a t i o n a n d r e s t r i c t i o n
c l e a v a g e
a s o u t l i n e d i n
a .
C l o n e d
DNA
s e g m e n t s
c o n t a i n i n g w i l d - t y p e
sequence ( H c )
o r t h e
X 4
m u t a t i o n
( B c )
as c o n t r o l
t e m p l a t e s .
PCR
f r a g m e n t s
were
d i g e s t e d
w i t h e i t h e r B s t N I ( l a n e s
B )
o r
A l u I ( l a n e s
A )
a n d were f r a c t i o n a t e d b y a c r y l a m i d e
g e l
e l e c t r o p h o r e s i s . M o l e c u l a r
s i z e
s t a n d a r d s
( b p )
a r e
i n l a n e M. S o l i d
s y m b o l s
w i t h i n t h e
p e d i g r e e
d e n o t e
a n i n d i v i d u a l w i t h t h e
B o m b a y p h e n o t y p e . B o m b a y
p r o p o s i t u s
i s
i n d i c a t e d
b y
a n arrow.
O p e n s y m b o l s
d e n o t e a n i n d i v i d u a l w i t h
H - p o s -
i t i v e e r y t h r o c y t e s .
H
o c u s
g e n o t y p e s
u n d e r e a c h
s y m b o l
a r e i n f e r r e d
f r o m t h e i n d i v i d u a l ' s e r y t h r o c y t e H a n t i g e n
s t a t u s a n d r e s t r i c t i o n
f r a g m e n t
p a t t e r n s . G e n o t y p e s
a t t h e
SE l o c u s ar e i n f e r r e d f r o m e a c h
i n d i v i d u a l ' s L e w i s b l o o d
group p h e n o t y p e ( 1 ) a n d / o r
w i t h
c o n s i d e r -
a t i o n
f o r t h e
S e c r e t o r
s t a t u s o f t h e
p a r e n t s
a n d
s i b l i n g s . D a s h i n d i c a t e s
t h a t t h e s t a t u s
o f o ne
a l l e l e a t t h e SE l o c u s
i s
n o t k n o w n .
a l l e l e c o n t a i n s
a m i s s e n s e m u t a t i o n
a t
c o d o n 1 6 4 t h a t
p r e d i c t s
t h e s u b s t i t u t i o n
o f
a h i s t i d i n e r e s i d u e f o r t h e
w i l d - t y p e
l e u c i n e
residue at
t h i s
position
( Y 1 ;
Leu 164
His).
The other a l le le
c o n t a i n s a t e r m i n a t i o n c o d o n
a t a
p o s i t i o n c o r r e s p o n d i n g
t o
aminoacid residue 276
( Y 2 ;
Gln-276
ter)
and
predicts
a
p r o t e i n
9 0
a m i n o a c i d s
s h o r t e r t h a n t h e
w i l d - t y p e enzyme.
B o t h m u t a n t a l l e l e s
y i e l d
u n d e t e c t a b l e
a ( 1 , 2 ) F T a c t i v i t y
w h e n t e s t e d b y t r a n s f e c t i o n ( F i g . 2 ) .
I n h e r i t a n c e o f
t h e s e a l l e l e s was
e x a m i n e d
i n
t h i s para-
Bombay p e d i g r e e , u s i n g r e s t r i c t i o n s i t e
c l e a v a g e p o l y m o r -
p h i s m s
f o r
B s t N I , B f a I ,
a n d
A l u
I
( s e e F i g . 1
a n d
b y
a l l e l e - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n
a n a l y s i s o f t h e
Y 1
a l l e l e . T h e s e a n a l y s e s d e m o n s t r a t e t h a t t h e p a r a - B o m b a y
s i b l i n g
o f t h e
p r o p o s i t u s
i s a l s o a c o m p o u n d h e t e r o z y g o t e f o r
t h e Y 1
a n d a l l e l e s
( F i g . 4 ) . A l l o t h e r f a m i l y m e m b e r s
e x a m i n e d
are
n o t
e r y t h r o i d H d e f i c i e n t
a n d are e i t h e r h e t -
erozygous f o r o ne o f t h e two m u t a n t a l l e l e s
( p a r e n t s a n d
c h i l d r e n
o f t h e
p a r a - B o m b a y i n d i v i d u a l s ) or
m a i n t a i n t h e
w i l d - t y p e
sequence
a t b o t h p o s i t i o n s ( o t h e r s i b l i n g s ) . T a k e n
t o g e t h e r
w i t h t h e r e s u l t s f r o m t h e Bombay a l l e l e s , t h e s e d a t a
i n d i c a t e t h a t i n a c t i v a t i n g p o i n t m u t a t i o n s w i t h i n t h e
c o d i n g
sequence
o f
t h i s
a ( 1 , 2 ) F T gene
are
r e s p o n s i b l e f o r H b l o o d
- 1 9 4
- 1 1 8
72
*
W W W
*
*Wild
type
*
i o m b a v
F I G .
4 .
A n a l y s i s
o f
Y 1
a n d Y 2 m u t a t i o n s i n a
p a r a - B o m b a y
p e d i g r e e
( 8 ) . ( a ) A l l e l e - s p e c i f i c
r e s t r i c t i o n
s i t e
p o l y m o r p h i s m s a t p o s i t i o n
8 2 6
(Y2).
The
single
base
change
C
T)
in
allele
Y2
in the
para-Bombay
person
( i n d i c a t e d b y * ) d e s t r o y s
a
B s t N I r e s t r i c t i o n s i t e a n c r e a t e s
a
B f a
I s i t e
( s e e
F i g . l b ) .
PCR w a s u s e d t o
a m p l i f y
4 0 9
b p
o f t h e
a ( 1 , 2 ) F T
gene
encompassing
t h i s
p o s i t i o n ( t o p ) , u s i n g p r i m e r s ( i n d i c a t e d b y
a r r o w s )
d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s .
B s t N I
c l e a v a g e
o f t h i s
s e g m e n t
( m i d d l e ,
l a b e l e d
B )
f r o m t h e
w i l d - t y p e
a l l e l e
y i e l d s
d i a g n o s t i c
1 7 0 - a n d 1 2 3 - b p
B s t N I
f r a g m e n t s ,
w h e r e a s a
s i n g l e d i a g n o s t i c
B s t N I -
r e s i s t a n t 2 9 3 - b p
f r a g m e n t
( s h a d e d )
i s o b t a i n e d w i t h t h e
Y 2
a l l e l e i n t h e
p a r a - B o m b a y i n d i v i d u a l . C o n v e r s e l y , B f a
I
d i g e s t i o n ( b o t t o m , l a b e l e d
F )
o f t h e PCR
f r a g m e n t
f r o m t h e Y 2 a l l e l e y i e l d s
f r a g m e n t s
t h a t a r e 1 7 0
a n d 2 3 9
b p l o n g ( s h a d e d ) ,
w h e r e a s t h e
4 0 9 - b p s e g m e n t
f r o m
t h e
w i l d - t y p e a l l e l e i s n o t
c l e a v e d b y B f a
I .
( b ) A l l e l e - s p e c i f i c r e s t r i c t i o n s i t e
p o l y m o r p h i s m
a t
p o s i t i o n
4 9 1
( Y 1 ) .
T h e
s i n g l e
n u c l e o t i d e
c h a n g e
T
A )
a t
p o s i t i o n
4 9 1
( i n d i c a t e d b y * )
i n a l l e l e Y 1 o f t h e
p a r a - B o m b a y
p e r s o n d e s t r o y s a n A l u I
s i t e
( s e e F i g .
l b ) .
PCR p r i m e r s
f l a n k i n g t h i s
s i t e
g e n e r a t e
a
2 9 0 - b p w i l d - t y p e
f r a g m e n t
t h a t
y i e l d s d i a g n o s t i c
5 4 - a n d
1 1 4 - b p
A l u I
f i r g m e n t s .
A b s e n c e o f t h e A l u I
s i t e
a t t h i s
p o s i t i o n
i n t h e
Y 1
a l l e l e y i e l d s
a
d i a g n o s t i c 1 6 8 - b p
f r a g m e n t
( s h a d e d ) .
( c ) A n a l y s i s o f
a l l e l e - s p e c i f i c sequence p o l y m o r p h i s m s .
T h e
p a r a - B o m b a y p r o p o s i t u s
i s i n d i c a t e d b y
a n
arrow;
b o t h
p a r a - B o m b a y
i n d i v i d u a l s
ar e i n d i c a t e d b y
s o l i d
s y m b o l s .
T h e r e s t o f t h e
p e d i g r e e
i s l a b e l e d as i
F i g . 3 .
PCR
f r a g m e n t s
s h o w n i n a
a n d
b were
g e n e r a t e d b y
u s i n g
g e n o m i c
DNA
f r o m
f a m i l y
m e m b e r s o r
b y
u s i n g c l o n e d
DNA
s e g m e n t s c o n t a i n m i n g
w i l d - t y p e
sequence ( H c ) or t h e m u t a t i o n s
i n
t h e p a r a - B o m b a y i n d i v i d -
u a l s
( p B c ; a l l e l e
Y 2
i n
t o p g e l ;
a l l e l e Y 1
i n b o t t o m g e l ) . PCR f r a g m e n t s
were d i g e s t e d
w i t h B s t N I
( l a n e s B ) o r B f a I ( l a n e s F ) ( t o p g e l ) , o r A l u
I
( l a n e s A ) ( b o t t o m g e l )
a n d
were f r a c t i o n a t e d b y a c r y l a m i d e g e l
e l e c t r o p h o r e s i s . M o l e c u l a r
s i z e s t a n d a r d s ( b p ) ar e
i n
l a n e M. A l t e r n a -
t i v e l y ,
f o r
a l l e l e - s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e a n a l y s i s o f t h e
Y j
p o s i t i o n ,
PCR
p r o d u c t s d i a g r a m m e d
i n b were
g e n e r a t e d
f o r e a c h i n d i v i d u a l
a n d
f r
c o n t r o l
t e m p l a t e s ( p B c ,
Y 1
a l l e l e ;
H c ,
w i l d - t y p e a l l e l e ) .
T h e s e
f r a g m e n t s
were t h e n p r o b e d w i t h r a d i o l a b e l e d o l i g o n u c l e o t i d e s p e c i f i c
f o r e i t h e r
t h e w i l d - t y p e sequence
a t
t h e Y 1
p o s i t i o n W i l d t y p e )
o r f o r
t h e
m u t a n t Y 1
sequence ( p B o m b a y ) .
group a n t i g e n d e f i c i e n c y
i n
t h e s e
Bombay
a n d
p a r a - B o m b a y
i n d i v i d u a l s
a n d t h u s
p r o v i d e g e n e t i c s u p p o r t
f o r b i o c h e m i c a l
a
b
h h l i H H
s e
-
gee I s e
s e : s e
R A
R
A R A
H c
B c
M
S h / h H / h
H / h H / h H / h H
h
s e / s e
S e / s e s e / s e S e / s e S e ' s e s e
RARARARARABABARA
P r o c .
N a t l . A c a d .
S c i . USA
9 1
( 1 9 9 4 )
P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA
9 1
( 1 9 9 4 )
5 8 4 7
E D
13 3
6
. 2
-4.3
F I G .
5 . Human DNA
sequences
t h a t w i t h t h e H
a ( 1 , 2 ) F T
c o d i n g
r e g i o n . Human g e n o m i c
DNA
was d i g e s t e d w i t h
E c o R I ( l a n e E )
or D r a I
( l a n e D ) ( s e e
F i g . l a )
a n d
s u b j e c t e d
t o
S o u t h e r n
b l o t a n a l y s i s ( 1 1 )
u s i n g
t h e
c o d i n g r e g i o n
o f t h e
a ( 1 , 2 ) F T
cDNA
as a
p r o b e ( 9 ) . H y b r i d i z a t i o n
w a s
d o n e a t 4 2 T C , w i t h a
f i n a l
w a s h a t 6 5 T C i n 2 x
s t a n d a r d
s a l i n e c i t r a t e / 0 . 2 %
S D S . M o l e c u l a r
s i z e
s t a n d a r d s ( k b ) ar e i n d i c a t e d
o n t h e r i g h t .
( 9 , 1 2 ) a n d c h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o n ( 9 )
d a t a ,
i n d i c a t i n g
t h a t
t h i s
gene
c o r r e s p o n d s
t o t h e
human
H b l o o d
group
l o c u s .
T h e H
a ( 1 , 2 ) F T
G e n e
I d e n t i f e s C a n d i d a t e s
t h e Human
SE Locus. S i n c e
t h e two
p a r a - B o m b a y
i n d i v i d u a l s maintain a
f u n c t i o n a l S E - d e t e r m i n e d
a ( 1 , 2 ) F T ,
b u t
n o t
a n H - e n c o d e d
a ( 1 , 2 ) F T ,
i t
ca n b e
c o n c l u d e d
t h a t t h e SE l o c u s m u s t t h e r e -
f o r e
c o r r e s p o n d
t o
a n
a ( 1 , 2 ) F T gene
d i s t i n c t f r o m
t h e
o ne
e x a m i n e d h e r e .
T h e s e r e s u l t s
p r o v i d e
a d d i t i o n a l
s u p p o r t
f o r
g e n e t i c ( 2 )
a n d b i o c h e m i c a l ( 3 - 5 )
d a t a
i n d i c a t i n g
t h a t t h e
human
H
n d S b l o o d
group
l o c i c o r r e s p o n d
t o
d i s t i n c t
a ( 1 , 2 ) F T
genes.
I n d e e d ,
when
u s e d
i n
S o u t h e r n b l o t
a n a l y -
s e s ,
t h e c o d i n g p o r t i o n
o f t h e
H
gene
i d e n t i f i e s c r o s s -
h y b r i d i z i n g
human DNA
sequences
d i s t i n c t f r o m
t h o s e c o r -
r e s p o n d i n g
t o
t h e H
a ( 1 , 2 ) F T gene ( F i g . 5 ) .
By a n a l o g y
o
t h e
s t r u c t u r a l l y
r e l a t e d
f a m i l y
o f
human
a - ( 1 , 3 ) - f u c o s y l t r a n s -
f e r a s e
genes
( 1 7 ) ,
s u c h
sequences
r e p r e s e n t
c a n d i d a t e s
f o r
a n o t h e r a ( 1 , 2 ) F T gene
t h a t
may c o r r e s p o n d
t o t h e SE
l o c u s .
DISCUSSION
Bombay
a n d
p a r a - B o m b a y
i n d i v i d u a l s
d i s p l a y
n o
a p p a r e n t
d e l e t e r i o u s p h e n o t y p e ( 1 )
e x c e p t
i n
c i r c u m s t a n c e s
r e q u i r i n g
b l o o d
t r a n s f u s i o n ,
w h e r e i n
t h e y
are c r o s s - m a t c h
i n c o m p a t i -
b l e
w i t h a l l d o n o r s e x c e p t
o t h e r
H - d e f i c i e n t
i n d i v i d u a l s
( 1 ) .
S i n c e
t h e
c o d i n g sequence
m u t a t i o n s i d e n t i f i e d
h e r e
y i e l d
n o n f u n c t i o n a l a ( 1 , 2 ) F T s ,
i t
t h a t t h e
f u c o s y l t r a n s -
f e r a s e a c t i v i t y
e n c o d e d
b y
t h e H
gene
i s
n o t e s s e n t i a l
i n
h u m a n s
[ b a r r i n g
processes
t h a t
suppress
nonsense
c o d o n s
( 1 8 )
o r o t h e r
RNA e d i t i n g
e v e n t s
( 1 9 ) ] .
G i v e n
t h e
h i g h
f r e q u e n c y
o f
n o n - S e c r e t o r
i n d i v i d u a l s
( = 2 0 %
o f
C a u c a s i a n s ;
r e f .
1 ) ,
t h e
a ( 1 , 2 ) F T
e n c o d e d
b y
t h e SE
l o c u s i s
a p p a r e n t l y
a l s o
n o t e s s e n t i a l ( a t
l e a s t i n t h e
a d u l t
h u m a n ) ,
a l t h o u g h
a
d e f i n i t i o n o f t h e m o l e c u l a r b a s i s
f o r n u l l a l l e l e s
a t
t h i s l o c u s
m u s t
a w a i t
t h e
i s o l a t i o n
a n d c h a r a c t e r i z a t i o n
o f
t h i s
g e n e .
T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t
t h a t
a ny e v o l u t i o n a r y
con-
s t r a i n t s
t h a t
may
h a v e o nce
s e l e c t e d f o r
f u n c t i o n a l a l l e l e s
a t
t h e s e
a ( 1 , 2 ) F T
l o c i
h a v e
s i n c e c e a s e d t o
b e
o p e r a t i v e
i n
a d u l t
h u m a n s .
I t
r e m a i n s
p o s s i b l e ,
h o w e v e r ,
t h a t
r e l a t e d
l o c i
m a i n t a i n c o m p e n s a t i n g
f u n c t i o n a l r e d u n d a n c y
s u f f i c i e n t t o
s u s t a i n a n o r m a l
p h e n o t y p e . I n d e e d ,
b y a n a l o g y
t o
t h e
f a m i l y
o f human
a - ( 1 , 3 ) - f u c o s y l t r a n s f e r a s e
genes
( 1 7 ) ,
i t r e m a i n s
p o s s i b l e
t h a t o t h e r
a ( 1 , 2 ) F T s ( 2 0 ) ,
e n c o d e d b y as y e t
un-
c l o n e d
genes,
may
f u l f i l l o n e o r
more e s s e n t i a l r o l e s . M o r e -
o v e r ,
s u c h r o l e s
( l i k e
e m b r y o
i m p l a n t a t i o n
i n
t h e m o use; r e f .
2 1 ) may
b e
o p e r a t i v e
i n
t i s s u e s ,
o r a t
d e v e l o p m e n t a l
s t a g e s ,
n o t
y e t
e x a m i n e d
i n
H o m o s a p i e n s .
A l t e r n a t i v e l y , t h e
f u n c -
t i o n s
m a i n t a i n e d b y
t e r m i n a l
a ( 1 , 2 ) f u c o s e
l i n k a g e s
may b e
a c c o m p l i s h e d
b y
o t h e r
t e r m i n a l s u g a r m o i e t i e s
t h a t a r e ,
i n
t u r n , e n c o d e d
b y
n o n p o l y m o r p h i c
g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s
( d i s -
c u s s e d
i n r e f .
2 2 ) . T h e s e i s s u e s a r e n o t
i d i o s y n c r a t i c t o
t h e
a ( 1 , 2 ) F T s . N u l l
a l l e l e s a r e
r a t h e r common
w i t h i n
o t h e r
g l y c o s y l t r a n s f e r a s e
g e n e s
( t h e ABO, L e w i s ,
P ,
a n d S d a
b l o o d
g r o u p s y s t e m s ,
e x a m p l e ; s e e r e f . 1 ) a n d i n s o m e
i n s t a n c e s
h a v e b e e n s h o w n t o c o r r e s p o n d
t o i n a c t i v a t i n g
c o d i n g
s e -
q u e n c e
m u t a t i o n s ( 2 3 ) .
E x p e r i m e n t a l t e s t s o f
h y p o t h e s e s
c o n c e r n i n g
a f u n c t i o n ( s ) o f t h e s e a n d
o t h e r m a m m a l i a n
g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s , a n d t h e i r
c o g n a t e o l i g o s a c c h a r i d e
p r o d -
u c t s ,
s h o u l d b e f a c i l i t a t e d
w i t h t h e u s e o f
c l o n e d g l y c o s y l -
t r a n s f e r a s e g e n e s
i n
c o n j u n c t i o n
w i t h
t r a n s g e n i c a n d g e n e
d i s r u p t i o n
t e c h n o l o g i e s ( 2 4 ) .
W e t h a n k
M s . J o b e r t a W e l l s
a n d D r s .
D a v i d
G i n s b u r g ,
C r a i g
T h o m p s o n , R a f a e l O r i o l , J o h n J u d d , a n d P e t e r I s s i t f o r h e l p w i t h t h i s
w o r k . T h i s w o r k
w a s s u p p o r t e d
b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h
G r a n t R O 1
H L 4 8 8 5 9 . J . B . L . i s a n A s s o c i a t e
I n v e s t i g a t o r o f t h e
H o w a r d
H u g h e s M e d i c a l I n s t i t u t e .
1 W a t k i n s , W. M . ( 1 9 8 0 )
A d v . Hum. G e n e t .
1 0 , 1 - 1 1 6 .
2 . O r i o l , R . ,
D a n i l o v s , J .
H a w k i n s ,
B .
R . ( 1 9 8 1 ) Am . J .
Hum.
G e n e t . 3 3 ,
4 2 1 - 4 3 1 .
3 . L e
P e n d u ,
J . , C a r t r o n , J . P . , L e m i e u x , R . U . O r i o l , R . ( 1 9 8 5 )
Am .
J . H u m . G e n e t . 3 7 , 7 4 9 - 7 6 0 .
4 .
K u m a z a k i ,
T .
Y o s h i d a ,
A .
( 1 9 8 4 )
P r o c . N a t l .
A c a d . S c i . USA
8 1 , 4 1 9 3 - 4 1 9 7 .
5 .
S a r n e s t o , A . , K o h l i n , T . ,
T h u r i n ,
J .
B l a s z c z y k - T h u r i n ,
M .
( 1 9 9 0 )
J . B i o l . C h e m . 2 6 5 ,
1 5 0 6 7 - 1 5 0 7 5 .
6 . R e g e ,
V . P . , P a i n t e r ,
T .
J . ,
W a t k i n s , W. M . M o r g a n ,
W. T . J . ( 1 9 6 4 )
N a t u r e ( L o n d o n ) 2 0 3 , 3 6 0 - 3 6 3 .
7 .
B h e n d e ,
Y .
M . , D e s h p a n d e ,
C .
K . B h a t i a ,
H . M . , S a n g e r , R . ,
R a c e ,
R .
R . , M o r g a n ,
W. T . J .
W a t k i n s , W.
M .
( 1 9 5 2 )
L a n -
c e t i 9 0 3 - 9 0 4 .
8 .
S o l o m o n ,
J . M . ,
W a g g o n e r ,
R .
L e y s h o n ,
W. C .
( 1 9 6 5 )
B l o o d
2 5 ,
4 7 0 - 4 8 5 .
9 .
L a r s e n ,
R . D . , E r n s t ,
L . K . , N a i r , R . P .
L o w e ,
J .
B . ( 1 9 9 0 )
P r o c . N a t I . A c a d . S c i . USA
8 7 , 6 6 7 4 - 6 6 7 8 .
1 0 .
B r y a n t , J .
G . , L l o y d , B . , D a v i s ,
J .
S h a f e r ,
A . W . ( 1 9 7 4 )
T r a n s f u s i o n
A 5 0 6
1 1 . A u s u b e l , J . F r e d e r i c k ,
M . ,
e d s .
( 1 9 8 7 ) M o l e c u l a r
B i o l o g y :
L a b o r a t o r y
M a n u a l s
( W i l e y ,
New
Y o r k ) ,
V o l s . 1 a n d 2 .
1 2 .
R a j a n ,
V .
P . , L a r s e n ,
R . D . , A j m e r a , S . , E r n s t ,
L . K . L o w e ,
J .
B .
( 1 9 8 9 )
J .
B i o l . C h e m .
2 6 4 , 1 1 1 5 8 - 1 1 1 6 7 .
1 3 . W a l k e r ,
R . H . ,
e d .
( 1 9 9 0 )
A m e r i c a n A s s o c i a t i o n
o f
B l o o d
B a n k s T e c h n i c a l
M a n u a l ( A m .
A s s o c . o f B l o o d B a n k s , A r l i n g -
t o n , V A ) .
1 4 .
H i g u c h i ,
R . ,
v o n B e r o l d i n g e n ,
C .
H . , S e n s a b a u g h ,
G .
F .
E r l i c h ,
H . A .
( 1 9 8 8 )
N a t u r e
( L o n d o n )
3 3 2 ,
5 4 3 - 5 4 6 .
1 5 .
R o t h ,
M . S . ,
A n t i n ,
J .
H . , B i n g h a m ,
E . L . G i n s b u r g ,
( 1 9 9 0 ) T r a n s p l a n t a t i o n
4 9 ,
7 1 4 - 7 2 0 .
1 6 .
B h a t i a ,
H . M .
S a t h e ,
M . S . ( 1 9 7 4 )
V o x
S a n g .
2 7 , 5 2 4 - 5 3 2 .
1 7 .
W e s t o n ,
B .
W . ,
S m i t h ,
P .
L . , K e l l y ,
R .
J .
L o w e ,
J . B .
( 1 9 9 2 )
J . B i o l . C h e m . 2 6 7 ,
2 4 5 7 5 - 2 4 5 8 4 .
1 8 .
C h a n ,
L .
( 1 9 9 3 )
B i o e s s a y s 1 5 ,
3 3 - 4 1 .
1 9 . K o h l e r , M . ,
B u r n a s h e v , N . , S a k m a n n ,
B .
S e e b u r g ,
P . H .
( 1 9 9 3 )
N e u r o n 1 0 ,
4 9 1 - 5 0 0 .
2 0 .
B l a s z c z y k - T h u r i n ,
M . , S a r n e s t o ,
A . , T h u r i n , J . , H i n d s g a u l
0 .
K o p r o w s k i ,
H .
( 1 9 8 8 )
B i o c h e m .
B i o p h y s .
R e s . C o m m u n .
1 5 1 , 1 0 0 - 1 0 8 .
2 1 . L i n d e n b e r g ,
S . , S u n d b e r g , K . , K i m b e r ,
S .
J .
L un d b l a d , A .
( 1 9 8 8 )
J .
R e p r o d .
F e r t i l . 8 3 ,
1 4 9 - 1 5 8 .
2 2 .
K u k o w s k a - L a t a l l o , J . F . , L a r s e n ,
R . D . , R a j a n ,
V . P . L o w e ,
J .
B .
( 1 9 9 0 ) G e n e s
D e v .
4 , 1 2 8 8 - 1 3 0 3 .
2 3 .
Y a m a m o t o , F . - I . ,
C l a u s e n , H . , W h i t e ,
T . , M a r k e n , J .
H a k o m o r i ,
S . - I .
( 1 9 9 0 )
N a t u r e ( L o n d o n )
3 4 5 , 2 2 9 - 2 3 3 .
2 4 .
K o l l e r ,
B . H .
S m i t h i e s ,
0 .
( 1 9 9 2 ) A n n u . R e v . I m m u n o l . 1 0 ,
7 0 5 - 7 3 0 .
M e d i c a l
S c i e n c e s :
K e l l y
e t
a l .