8/3/2019 Blood Imp2

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P r o c .N a t l .A c a d .S c i .USAVo l .8 2 ,p p . 1 1 9 9 - 1 2 0 3 ,F e b r u a r y1 9 8 5I m m u n o l o g y

R e p e t i t i v eA e p i t o p e( t y p e 3 c h a i nA ) d e f i n e db y b l o o d g r o u pA 1 -s p e c i f i cm o n o c l o n a la n t i b o d yT H - 1 :C h e m i c a lb a s i s o fq u a l i t a t i v eA 1 a n d A 2d i s t i n c t i o n

( s u b g r o u p s / e r y t h r o c y t e / g l y c o l i p i d / m e t h y l a t i o na n a l y s i s / 1 HNMR)

H E N R I KC L A U S E N ,S T E V E NB . L E V E RY,EDWARDNUDELMAN,S H I G E R UT S U C H I YA ,AND S EN - I T I R OHHAKOMORI

P r o g r a mo f B i o c h em i c a lO n c o l o g y / M e m b r a n eR e s e a r c h ,F r e d H u t ch i ns o nC a n c e rR e s e a rc h C e nt e ra n d D e p a r t m e n t so f P a t h o b i o l o g y ,M i c r o b i o l o g ya n dI m m u n o l o g y ,Un i v e r s i t yo f Wa s h i n g t o n ,1 1 2 4C o l u m b i aS t r e e t ,S e a t t l e ,WA 9 8 1 0 4

C o m m u n i c a t e db y E l o i s eR . G i b l e t t ,O c t o b e r9 , 1 9 8 4

ABSTRACT T h e I g G2 am o n o c l o n a la n t i b o d yT H - 1 ,w h i c hr e a c t ss p e c i f i c a l l yw i t hb l o o dg r o u pA lb u t w i t hn e i t h e rA 2n o r 0 e r y t h r o c y t e s ,h a s b e e ne s t a b l i s h e d .T h ea n t i b o d yr e -a c t e d o n l yw i t hA le r y t h r o c y t e si nh em a g g l u t i n a t i o na n d a n t i -b o d ya b s o r p t i o na s s a y s ;i t d i dn o t r e a c tw i t hA 2e r y t h r o c y t e s ,e v e na f t e rt r y p s i no r s i a l i d a s et r e a t m e n t .T h i sa n t i b o d yd e t e c t -e d ,o n TL C i mm u n o s t a i n i n g ,a s e r i e so fg l y c o l i p i d sf r o mA le r y t h r o c y t e sb u t v i r t u a l l yn o n eo r v er yw e a kb a n d sf r o mA 2e r y t h r o c y t e s .I t d i d n otr e a c tw i t h t y p e 1 o r t y p e2 c h a i nA , o rw i t h g lo bo - A.T h e s i m p l e s tr e a c t i v ec om p on e n t w a si s o l a t e df r o ma p r e v i o u s l ya s s i g n e dA bf r a c t i o nb y HPTLCo fa c e t y l a t -e d c o m p o u n d s .T h e s t r u c t u r eo f t h er e a c t i v ec o m p o n e n tw a sc h a r a c t e r i z e db y ' H NMR s p e c t r o s c o p y ,m e t h y l a t i o na n a l y s i s ,a n d e n z ym a t i cd e g r a d a t i o n ,a s s h o w nb e l ow :G a I N A c a l- 3 G a 1 l 1 - 3 G a I N A c a l- 3 G a I l - 4GkNAcj l - 3Ga I l I - 4G 1 c j 1-Cer

2

F u c a l

21

F u c a e l

T h e s t r u c t u r ei s e s s e n t i a l l ya r e p e t i t i v eA e p i t o p ea t t a c h e dt ot y p e2 c h a i na n d i sh e r e b yc a l l e dt y p e3 c h a i nA . T h ed e t e r m i -n a n t c an b ec a r r i e do n e x t e n d e da n d / o r b r a n c h e ds t r u c t u r e s ,b u t i t w a s n o t d e t e c t a b l ei n g l y c o p r o t e i n s .T h e s t r u c t u r ew a s

c h a r a c t e r i s t i co fA l e r y t h r o c y t e sa n d p r e s e n ti n o n l yt r a c ea m o u n t si n A 2 e r y t h r o c y t e s .T h e p r e c u r s o rH ( F u c a l -*2 G a l . 1-* 3 G a l N A c a l- 3 [ F u c a l- - 2 ]G a l f i l-) 4 G l c NA c f i l- + R ; t y p e3 c h a i nH ) w a sp r e s e n ti n g r e a t e rq u a n t i t yi n A 2e r y t h r o c y t e st h a n i nA l e r y t h r o c y t e s ,b u t i tw a sa b s e n ti nb o t hO a n d B e r y t h r o c y t e s .T h e A l t r a n s f e r a s ea p p a r e n t l yc a nt r a n s f e ra - G a l N A ct o t y p e 3 c h a i nH , w h i l et h eA 2t r a n s f e r a s emay no t h a v e t h i sa b i l i t y .

B l o o dg r o u pA h a s b e e nd i v i d e di n t ot h em a j o rs u b g r o u p sA 1a n d A 2 s i n c ei t w a s f i r s td e s c r i b e db y v o n D u n g e r na n dH i r s z f e l di n 1 9 1 1( 1 ) .A l t h o u g ht h es e r o l o g ya n d g e n e t i c so fA l a n dA 2h av e b e e nw e l l - e s t a b l i s h e d( 2 ) ,t h ec h e m i c a lb a s i so f t h e d i s t i n c t i o nb e t w e e nA 1a n dA 2h a s b e e na n u n r e s o l v e dp r o b l em .Some i n v e s t i g a t o r sh a v ec o n c l u d e dt h a tA l e r y t h -r o c y t e sc o n t a i ng r e a t e rq u a n t i t i e so f A d e t e r m i n a n t st h a n d oA 2e r y t h r o c y t e s( 3 ) ;o t h e r sh a v es u g g e s t e da q u a l i t a t i v ed i f -f e r e n c eb e t w e e nA 1a n d A 2b a s e do n t h ep r o d u c t i o no f s p e -c i f i ca n t i b o d i e sr e a c t i n gw i t hA 1b u t n o t A 2e r y t h r o c y t e s( 4 ) ,a n d o n b i n d i n gk i n e t i c so f A 1a n dA 2b l o o dg r o u pg l y c o p r o -t e i n sw i t h i n s o l u b i l i z e da n t i - Aa n t i b o d i e s( 5 ) .T h eg l y c o l i p i df r a c t i o nw i t h l o wTLC m o b i l i t ys e p a r a t e df r o mb l o o dg r o u pA 2e r y t h r o c y t e sw a sw e a k l yA a c t i v e ,i nc o n t r a s t t o t h es ames l o w - m i g r a t i n gf r a c t i o ns e p a r a t e df r o mA 1e r y t h r o c y t e s( 6 ) .We h a v e f ou nda mo n o c l o n a la n t i b o d yt h a tr e a c t s s p e c i f i c a l -l yw i t hA 1 e r y t h r o c y t e s .T h i s a n t i b o d yd e f i n e sc l e a r l yt h e

A l - a s s o c i a t e dA d e t e r m i n a n tc a r r i e db y a d i f f e r e n tt y p e o fg l y c o l i p i ds t r u c t u r ef r o m t h a tp r e v i o u s l yk n o w n .

MATERIALSANDMETHODS

A n t i b o d i e sa n d De t e r m i n a t i o no fA n t i b o d yS p e c i f i c i t y .T h e

A 1 - s p e c i f i cmo n o c l o n a la n t i b o d yT H - 1w a s o b t a i n e db y i m -mu n i z a t i o nw i t h A 1 e r y t h r o c y t e sf o l l o w e db y f u s i o n o fs p l e e nc e l l sw i t h S p 2m y e l o m ac e l l s( 7 )a n d s e l e c t i o no f h y -b r i d om a b ys t r o n g r e a c t i v i t yw i t hA ba n d A cg l y c o l i p i d s( f o rd e s i g n a t i o no f A v a r i a n t s ,s e e Ta b l e 1 ) .T h eo r i g i n a lp l a n o ft h i se x p e r i m e n tw a st o i s o l a t ea mo n o c l o n a la n t i b o d yd i r e c t -e d t ob r a n c h e dA ( A ca n dA ds p e c i e s )b u t n o t t ou n b r a n c h e dA 5a n d A b s p e c i e s .T h e o r i g i n a la t t e m p tf a i l e d ,b u t t h i sh y -b r i d om a , s e c r e t i n ga n a n t i b o d y t h a t s p e c i f i c a l l yd i s t i n -g u i s h e sA 1a n dA 2e r y t h r o c y t e s ,w a s i s o l a t e d .T h emo n o c l o -n a la n t i b o d i e sA H 1 6 ,w h i c hd e f i n e sb o t h t y p e 1 a n d t y p e 2c h a i nA ( 9 ) ;A H 2 1 ,w h i c hd e f i n e st y p e 1 c h a i nA ( 9 ) ;M B r l ,w h i c hd e f i n e st h eg l o b o - Hs t r u c t u r e F u c a l - * 2 G a l , 8 1- -3 G a l NA c / 3 1- * 3 G a l a( i t i s now c l e a rf r o m t h i sw o r kt h a tMBrl a n t i b o d ya l s or e a c t s w i t h t h e s e q u e n c eF u c a l2 G a l B 1- 3 G a l N A c a l 3 G a l , 8 )( 11 ) ;BE 2 ,w h i c hd e f i n e st y p e 2 c h a i nH ( F u c a l 2 G a l f 8 1- 4 G l c NA c ) ;a n d 1 B 2 ,w h i c hd e f i n e sN - a c e t y l l a c t o s a m i n e( G a l / 3 1- * 4 G I c N A c )( 1 2 )w e r ee s t a b l i s h e da sd e s c r i b e d .T h eMBrl a n t i b o d yw a sa g i f tf r o mS a nd r o S o nn i n o( U n i v e r s i t aD e g l iS t u d id iM i l a n o ,M i -l a n o ,I t a l y ) .R e a c t i v i t yo f g l y c o l i p i d sw i t h mo n o c l o n a la n t i -b o d i e sw a st e s t e db y i m m u no s t a i n i n g o nTLC ( 1 3 ,1 4 )a nd b ys o l i d - p h a s er a d i o i m m u n o a s s a ya s d e s c r i b e d( 1 4 ) .G l y c o p r o t e i n sa n d G l y c o l i p i d s .A t o t a le r y t h r o c y t eg l y c o -

p r o t e i np r o f i l ew a sd e t e r m i n e db y i mm u n o b l o t t i n g( 1 5 ) .T h eu p p e rn e u t r a lg l y c o l i p i df r a c t i o nw a sp r e p a r e da n d p u r i f i e d ,a n d t h ed e s i r e df r a c t i o nw a s r e c h r o m a t o g r a p h e do n HPLCt h r o u g ha n l a t r o b e a d s6 R S - 8 0 1 0c o l u m na s d e s c r i b e d( 1 6 ) .T h eA bg l y c o l i p i df r a c t i o n( 6 )w a sa c e t y l a t e da n d s e p a r a t e di n t oc om p on e n t s o nM e r c kHPTLC p l a t e s( s i l i c ag e l 6 0 ;Me r c k ,D a rm s t a d t ,F. R . G . )w i t h a s o l v e n to f d i c h l o r o e t h -a n e / a c e t o n e / w a t e r( 4 0 : 6 0 : 2 . 5 ,v o l / v o l / v o l )o r c h l o r o f o r m /me t h a n o l / w a t e r( 8 9 : 1 1 : 0 . 0 1 ,v o l / v o l / v o l ) .T h e l o c a t i o no fg l y c o l i p i d sw a s d e t e c t e d b y P r i mu l i n s p r ay( A l d r i c h )f o l -l o w e db y o b s e r v a t i o nu n d e rUV l i g h t( 1 7 ) ,a n dg l y c o l i p i da c -e t a t e sw e r e e x t r a c t e df r o m s i l i c ag e la n d d e a c e t y l a t e d .

D i r e c t I mm u n o s t a i n i n go f G l y c o l i p i dA c e t a t e sS e p a r a t e do nHP I T LC .To i d e n t i f yw h i c hc o m p o n e n t so f a n a c e t y l a t e dg l y -c o l i p i ds e p a r a t e do n a HPTLC p l a t ew e r e r e a c t i v et o a s p e -c i f i ca n t i b o d y ,t h eHPTLCp l a t e( B a k e r ) ,a f t e rd e v e l o pm e n ta n dd r y i n g ,w a st r a n s f e r r e di n t om e t h a n o lc o n t a i n i n g2% s o -d i u mm e t h o x i d e( w t / v o l ) .A f t e r1 5m i n ,HPTLCp l a t e swe r ei m m e r s e di np h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e( 0 . 9 %NaC l / 1 0mMNa p h o s p h a t e ,pH 7 . 0 )c o n t a i n i n g5% b o v i n es e rum a l b u m i n ,a n d t h ei m m un o s t a i n i n g p r o c ed u r ewas p e r f o r m e da c c o r d i n gt o t h em e t h o do f Ma g n a n ie t a l . ( 1 3 )a s mo d i f i e db y K an na g i

1 1 9 9

T h ep u b l i c a t i o nc o s t so f t h i s a r t i c lew e r ed e f r a y e di np a r tb y p a g ec h a r g ep a ym e n t .T h i s a r t i c l em u s tt h e r e f o r eb e h e r e b ym a r k e d" a d v e r t i s e m e n t "i na c c o r d a n c ew i t h 1 8U . S . C . 1 7 3 4s o l e l yt o i n d i c a t et h is f ac t .

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1 2 0 0 I mm u n o l o g y :C l a u s e ne t a l .

Ta b l e 1 . B l oo d g ro upA d e t e r m i n a n tc a r r i e db y f o u rt y p e s o f c a r b o h y d r a t ec h a i n si n h u m a ne r y t h r o c y t e s

( A )Ty p e1 c h a i nA a * :G a l N A c a l- * 3 G a l B 1- >3 G l c N A c , 8 1- . 3 G a l f 3 14G l c2

F u c a l( B )T y p e2 c h a i n

A a t :G a l N A c a l- - 3 G a l B 1- 4GlcNAcB1- 3 G a l , 1- . 4 G l c2T

F u c a lA b t :G a l N A c a l- - 3 G a l / 3 1- 4 G l c N A c B 1- . 3 G a l , 8 1- - 4 G l c NA c ( 3 1- 3 G a l , 8 14G l c

2

F u c c a lA c t :A b r a n c h e dt y p e 2 c h a i n( f o rt h es t r u c t u r e ,s e er e f s .6 a n d 8 )A d t :S a m ea sA c ,b u t t h eu n i tGa l , 8 1- 4 G l c N A ci n , B 1- * 3 s i dec h a i n i s r e p e a t e dt w i c e ( 8 )

( C )T y p e3 c h a i nA b ( r e p e t i t i v eA ) tG a l N A c a l- - 3G a l , ( 1- - 3 G a l N A c a l- . 3 G a l , 3 1- > 4 G l c NA c ( 8 1- - 3 G a l / 3 1- * 4 G l c

2 2T T

F u c a l F u c a l( D )T y p e4 c h a i n( A x ;G l o b o -A )

G a l N A c a l- . 3GalB1-* 3 G a l N A c B 1-> 3 G a l a l- * 4G a l , 8 1- 4 G l c2

F u c a l

* F r o m h u m a ng a s t r i cc a n c e r c e l ll i n eMKN45( 9 )a nd f r o mh u m a ne r y t h r o c y t e sw i t hL e a b b l o o dg r o u ps t a t u s .A v a r i a n tw i t h i n t e r n a lF u c a l- . 3 G l c N A cs u b s t i t u t i o n( A L e b )w a sd e t e c t e di nLe a be r y t h r o c y t e s( u n p u b l i s h e dd a t a ) .t F r o mh u m a ne r y t h r o c y t e s( 6 ) .t F r o mhuman e r y t h r o c y t e s ,t h i sp a p e r . F r o mh u m a ne r y t h r o c y t e s( 1 0 ) .

e t a l . ( 1 4 ) .S o l i d - p h a s er a d i o i m m u n o a s s a yo n a v i n y ls t r i pw a sc a r r i e dou t a s d e s c r i b e d( 1 4 ) .G l y c o l i p i dC h a r a c t e r i z a t i o n .P r o t o nn u c l e a rm a g n e t i cr e s o -

n a nc e ( 1HNMR) s p e c t r o s c o p yi n d e u t e r a t e dd i m e t h y ls u l f -o x i d ew i t h 2% 2 H 2 0( 1 8 ) ,a n d m e t h y l a t i o na n a l y s i sw i t h

Ta b l e 2 . R e a c t i v i t i e so f mo n o c l o n a la n t i b o d yT H - 1w i t hA l a n dA 2e r y t h r o c y t e sT r y p s i n - S i a l i d a s e -

I n t a c t t r e a t e d t t r e a t e d tA 1 A 2 O / B A l A 2 A l A 2

T H - 1H ema g g l u t i n a t i o n *T H - 1s u p e r n a t a n t 3 2 0 0 3 2 0 1 2 8 0T H - 1a s c i t e s 3 2 0 0 0 0 ND ND 1 2 , 8 0 0 0AH16 a s c i t e s 3 2 0 2 8 0 4 4 8 ND 2 2 4 ND

T H - 1Ab s o r p t i o n $T H - 1s u p e r n a t a n tB e f o r ea b s o r p t i o n 3 2 3 2 3 2

A f t e ra b s o r p t i o n 0 3 2 3 2

* N u m b e r si n d i c a t et h er e c i p r o c a l so f t h emax imum d i l u t i o nt h a tc a u s e do b v i o u sh e m a g g l u t i n a t i o n .0 ,No a g g l u t i n a t i o nb y u n d i l u t e da n t i b o d y .t T r e a t e dw i t h 0 . 0 5 %t r y p s i na t 3 7 Cf o r1 h r .t T r e a t e dw i t hs i a l i d a s e( C l .p e r f r i n g e n st y p eVI ; S i gm a ) ,0 . 1u n i t /m la t 3 7 Cf o r1 h r .ND, n o t d e t e rm i n ed . T i t e ro f t h eAH16 a n ti b o dy w i t hABOe r y t h r o c y t e sa sr e p o r t e d( 9 )i s c o r r e c t e d .$ A 1h e m a g g l u t i n a t i o nt i t e ro f s u p e r n a t a n tb e f o r ea n d a f t e ra b s o r p -t i o nw i t hA 1e r y t h r o c y t e s .E r y t h r o c y t e sw e r ew a s h e d5 t im es w i thp h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e ;1 v o lo f p a c k e de r y t h r o c y t e sw a sm i x e dw i t h2 v o lo f T H - 1a n t i b o d ya n d i n c u b a t e da t 4 Co v e r n i g h t .A f t e ra b s o r p t i o n , e r y t h r o c y t e sw e r ec e n t r i f u g e d ,a n d a g g l u t i n a t i o nt i t e ro ft h es u p e r n a t a n tw a s d e t e rm in eda s d e s c r i b e da b o v e .

m e t h a n ec h e m i c a li o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r yo f p a r t i a l l yO -m e t h y l a t e da l d i t o lo r h e x o s am i n i t o la c e t a t e sw e r ec a r r i e do u t u s i n gs e l e c t e di o nm a s s c h r o m a t o g r a p h ya s d e s c r i b e d( s e er e f s .1 6 a n d 1 9 a n d r e f s .t h e r e i n ) .To o b t a i na d d i t i o n a ls t r u c t u r a li n f o r m a t i o no n t h eg l y c o l i p i d s ,TLC i mm u n o s t a i n -i n g( 1 3 )b y mo n o c l o n a la n t i b o d i e sw a sp e r f o r m e db e f o r ea n d

a f t e rs u c c e s s i v ee n z y m a t i cd e g r a d a t i o n .E n z y m a t i cd e g r a d a -t i o nw a sc a r r i e do u t a s d e s c r i b e d( 1 6 ,1 9 ) .

RESULTS

A lS p e c i f i c i t yo fM o no c lo na l A n t ib o dyT H - 1 .T h e T H - 1a n t i b o d y( I g G 2 a )s p e c i f i c a l l ya g g l u t i n a t e dA1e r y t h r o c y t e

A _,B tGl o b -

A a

ALAb-_ t t

rl__

1 2 1 2 1 2

F I G .1 . I mmu n o s t a i n i n gp a t t e r no fA - a c t i v eg l y c o l i p i d ss e p a r a t -e d o n HPTLC f r o mt h eu p p e rn e u t r a lg l y c o l i p i df r a c t i o no f A 1 a n dA 2 e r y t h r o c y t e s . S o l v e n t wa s c h l o r o f o r m / m e t h a n o l / w a t e r( 6 0 : 4 5 : 1 0 )o n B a k e r ' s s i l i c ag e lp l a t e s .( A )G l y c o l i p i d ss t a i n e db y0 . 5 %o r c i n o li n 1 0 %s u l f u r i ca c i d ;( B )s t a i n e db y mo n o c l o n a la n t i -b o d yAH16 ( a s c i t e s ) ;( C )s t a i n e db y mo n o c l o n a la n t i b o d yT H - 1 .L a n e s1 ,g l y c o l i p i d sf r o mA l e r y t h r o c y t e s .L a n e s2 ,g l y c o l i p i d sf r o mA 2e r y t h r o c y t e s .P o s i t i o n so f g l o b o s i d e ,A a ,A b ,A c ,A d( 9 ) ,a n dA x( 1 0 )a r es h o w no n t h el e f t .

P r o c .N a t l .Acad S c i .USA 8 2 ( 1 9 8 5 )

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P r o c . N a t L .A c a d .S c i .USA 8 2 ( 1 9 8 5 ) 1 2 0 1

N a t i v eA b S e r i e s : aG a lNA c -C l e o v e dA bS e r i e s :

8 E ^ 20 i - I y p X. . oA . :. ... .. . .. ....it ,..=>J:::g~~~~

I2 3 4 5 6 7 8Hi

F IG . 3 . Tw o - d i m e n s i o n a lHPTLC o f Ab f r a c t i o ns e p a r a t e d a sp e r a c e t y l a t e dd e r i v a t i v e .F i r s td i m e n s i o ni n d i c h l o r o e t h a n e / a c e -t o n e / w a t e r( 4 0 : 6 0 : 2 . 5 )a n d s e c o n d i n c h l o r o f o r m / m e t h a n o l / w a t e r( 8 9 : 1 1 : 0 . 0 1 ) .( A )Or c i n o ls t a i n ;( B )i n s i t ud e a c e t y l a t i o na n d i m m u n o -s t a i n i n gw i t h T H - 1 .F r a c t i o n s 1 , 2 , 4 ,a n d 7 w e r e r e a c t i v ew i t h t h ea n t i b o d yT H - 1 .

b u t n o t A2 , 0, o r B e r y t h r o c y t e s .T h e a n t i b o d ywas a b -s o r b e db y A l b u t n o t b y A 2o r 0 e r y t h r o c y t e s ,a n d i t d i dn o tr e a c t w i t h A 2 e r y t h r o c y t e se v e n a f t e rs i a l i d a s eo r t r y p s i nt r e a t m e n t( Ta b l e 2 ) .

1 2 34 56 7 8 W

F IG . 2 . I m m u n o s t a i n i n go f A " s u b f r a c t i o n sa n d t h e i rd e g r a d a t i o np r o d u c t sb y a - N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n i d a s e .( A )S u b f r a c t i o n s1 - 8 o fA bs t a i n e db y o r c i no l / su l f u r i c a c i d; ( B )s t a i n e db yAH16m o n o c l o n a la n t i b o d y ;( C ) s t a i n e db y T H - 1m o n o c l o n a la nt i bo dy . ( D ) S ub f r ac -t i o n so f A bt r e a t e dw i t h a - N - a ce t y l ga l a ct o s a mi n i d as e o fC .l a m p a s .N o t et h a tf r a c t i o n s3 , 5 , 6 ,a n d 8 w e r e d e g r a d e dt o H 2 ,b u t f r a c t i o n s1 , 2 , 4 ,a n d 7 we r e d e g r a d e dt o a c ompon en t w i t h a s l o w e rm o b i l i t yt h a n H 2 .T h e f i g u r es h o w so n l y a p a r t i a lc o n v e r s i o n ,b u t c o m p l e t ec o n v e r s i o ni sp o s s i b l eb y r e p e a t e di n c u b a t i o n .F r a c t i o n s1 ,2 , 4 ,a n d7 w e r e more d i f f i c u l tt o h y d r o l y z e .( E )E n z y m e - d e g r a d e dp r o d u c ts t a i n e db ym o n o c l o n a la n t i b o d yB E 2 .( F )E n z y m e - d e g r a d e dp r o d u c ts t a i n e db y MBr1 a n t i b o d y .

Ix

G o I N A c a I ' 3V

G o l I l - 3 G o INA c a l - 3F u c a c I 2 GoO I 4 G l c N A c l4 3 G o l f i - # 4 G I c P i - o i C e r

VII F u c a i - 2 m I RffV

)mG o I N A c a i - + 3

G o I p i - 4 G I cNAF u c a i 2

Z [ Y I V Il L E I R

R- ) M5 M 1 - 4i s Y [ l e -o m - l v - w - r u VM- 122 ( a ) +

a A I h A A AhAR - , bI I

.

F I G .4 . ' H NMR s p e c t r u mo f t y p e 3 c h a i nA b as c o m p a r e dt ot y p e 2 c h a i n Ab o b t a i n e d on a B r u k e rWM-500 s p e c t r o m e t e re q u i p p e dw i t h a n A s p e c t2 0 0 0D a t aS y s t e mo p e r a t i n gi nt h eF o u r i e r -t r a n s f o r mmode a n d w i t h q u a d r a t u r ed e t e c t i o n .A p p r o x i m a t e l y3 0 0, g go f e ac h s a m p l ewas 2 H e x c h a ng e d a n dd i s s o l v e di n 0 . 4m l o fd e u t e r a t e dd i m e t h y ls u l f o x i d ec o n t a i n i n g2% 2 H 2Oa n d 1% t e t r a -me t h y l s i l a n eas a c h e m i c a ls h i f tr e f e r e n c e .( L o w e r )S p e c t r u mo ft y p e2 c h a i nA " a t 3 0 3K; (M i d d l e )s p e c t r u mo f t y p e 3 c h a i nAb a t 3 0 3K ; ( U p p e r )S p e c t r u mo f t y p e 3 c h a i nAb a t 3 2 3K . N i n eh u n d r e df r e ei n d u c t i o nd e c a y sw e r e a c c u m u l a t e dpe r s p e c t r u ma t a g i v e n p r o b et e m p e r a t u r e .T h e s e s p e c t r a a r e f r a c t i o n5 ( t y p e2 ) a n d f r a c t i o n7( t y p e3 ) .I d e n t i c a ls p e c t r a w e r e o b t a i n e df o r f r a c t i o n3 ( t y p e2 )a n df o r f r a c t i o n s1 a n d 2 ( t y p e3 ) .( a ) ,a - G a I N A cH - i , H - 2c o n n e c t i v i t i e se s t a b l i s h e db y c o n t i n u o u si r r a d i a t i o nd e c o u p l i n g ;( b ) ,a - F u cH - 5e s -t a b l i s h e db y d e c o u p l i n gf r o mMe d o u b l e t a t 1 . 0 8 0ppm ( 3 J 5 , 6= 6 . 7H z ) ; ( c ) ,a - F u cH - 5 e s t a b l i s h e db y d e c o u p l i n gf r o mMe d o u b l e t a t1 . 0 2 4ppm; a n d ( d ) ,a - F u cH - 5e s t a b l i s h e db y d e c o u p l i n gf r o mMed o u b l e t a t 1 . 0 7 6 p pm . ( L o w e r )Tw o a - a n o m e r i cp r o t o n s a t 4 . 9 3 3ppm ( 3 J ,2 = 3 . 7H z )a n d a t 5 . 1 4 6ppm ( 3 J , , 23 4 . 3H z )w e r e a s s i g n e d ,r e s p e c t i v e l y ,t o a - G a I N A ca n d a - F u c . F i v e o t h e r , - a n o m e r i cr e s o -n a n c e s a re a s s i g n e da s s h o w na b o v e , b a s e d on t h e s p e c t r a o f A ag l y c o l i p i d sa n d d e c o u p li n g e x p e r i me n t s .A s s i g n m e n t sf o ro t h e r r e s -o n a n c e s a re d e t e r m i n e di na n a l o g yt o t h o s ef o u n di n t h e s p e c t r u mo ft y p e 2 c h a i nA . ( M i d d l ea n d U p p e r )R e s o n a n c e sh a v eb e e n i d e n t i -f i e db a s e don t h ef o l l o w i n gr a t i o n a l e :( i )Of t h e f o u r a - r e s o n a n c e s

, 2 3 4 H z ) a t 4 . 9 4 7 , 4 . 9 5 5 , 5 . 06 1 ,a n d 5 . 3 2 9p p m , s e p a r at e d o n lya t i n c r e a s e dt e m p e r a t u r e ,t h e f u r t h e s tu p f i e l dmus t b e a n a - G a l N A c ,b e c a u s ei t i s d e c ou p l ed b yi r r a d i a t i o no f t h e a-GalNAc H - 2a t 4 . 0 8 4p pm . I n t he same e x p e r i m e n t ,t h e r e s o n a n c e a t 4 . 9 5 5ppm i s p a r t i a l -l yd e c o u p l e d ,i n d i c a t i n gt h a ti t i s a l s oo n a - G a l N A cH - 1 ,c o u p l e dt oa n a - G a l N A cH - 2 t h a ti s n e a r t h e o n e i r r a d i a t e d ,b u t h i d d e n ; ( i i )t h e r ea re t wo a - F u cr e s i d u e s ,i n d i c a t e db y H - 5q u a r t e t s a t 4 . 1 0 4a n d4 . 2 3 7ppm t h a ta re c o u p l e dt o a - F u cMe d o u b l e t sa t 1 . 0 7 6a n d 1 . 0 2 4ppm

( 3 J 5 , 6= 6 . 7H z ) ; t h e r e f o r e ,t h e o t h e r two a s i g n a l sa re a - F u cH -

1 r e s o n a n c e s ; ( i i i )w h i l e t h e s p e c t r u mo f t y p e 2 c ha inA ' c o n t a i n stw o N - a c e t y ls i g n a l sa t 1 . 8 2 4a n d 1 . 8 2 0ppm ( f - G l c N A c s )a n d o n e a t1 . 8 4 6ppm ( a - G a I N A c ) ,t h a to f t y p e 3 c h a i nAb s h o w so n e N - a c e t y ls i g n a la t 1 . 8 1 8 ( P - G l c N A c )a n d t wo a t 1 . 8 4 3 ppm ( a - G a I N A C s ) .T h e s ea - r e s o n a n c e s , a n d t h e f i v e 3 - H - 1r e s o n a n c e s ( 3 J , 2 7 - 8 H z )a re r e a d i l yd e c o d e db y c o m p a r i s o nw i t h t h e NMR s p e c t r u mo f t h ep r e c u r s o r t y p e 3 c h a i nH s t r u c t u r e ( t h esame c o m p o u n dm i n u s t h et e rm i n a l a - G a l N A c )i s o l a t e df r o mA e r y t h r o c y t e s( u n p u b l i s h e do b -s e r v a t i o n s ) .T h u s , t h e o n l y m a j o rc h a n g e si n t h e a n o m e r i cr e g i o nb r o u g h ta b o u to n a d d i t i o no f t h e Ga lNAc ( a l -- 3 )r e s i d u ear e ( i )t h ea pp e a r a n c e o f t h e a d d i t i o n a la - G a I N A cH - i ; ( i i )t h e s h i f to f a n a - F u cH - 1f r o m5 . 2 2 9ppm d o w n f i e l d0 . 1ppm t o i t sp o s i t i o ni n t h e A bt y p e3 s p e c t r u m ;a n d ( i i i )t h e s h i f to f a r e s o n a n c e a t 4 . 5 4 8ppm d o w n f i e l dt o 4 . 6 6 3 ppm ( 3 J 1 . 2= 7 . 9H z ) , w h i c hi s t h e r e f o r e a s s i g n e d t o t h es u b t e r m i n a lG a l , 8 1-* 3 .

20

I mm u n o l o g y :C l a u s e ne t a l .

4 . 0. 0 8 (PP M)

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1 2 0 2 I m m u n o l o g y :C l a u s e ne t a L

G l y c o l i p i d sa n d G l y c o p r o t e i n sR e a c t i n gw i t h A l - S p e c i f i cM o n oc l o na l A n t i b o dyT H - l .A s e r i e so f g l y c o l i p i d sw i t hl o n g -c h a i nc a r b o h y d r a t e sw a sd e t e c t e db y t h ea n t i b o d yT H - 1i nt h eu p p e r n e u t r a l g l y c o l i p i d f r a c t i o ne x t r a c t e d f r o m A le r y t h r o c y t e s( F i g .1 C , l a n e1 ) ;o n l y v e r y w e a kb a n d sw e r ed e t e c t e db y t h i sa n t i b o d yi nt h es a m ef r a c t i o nf r o mA 2e r y t h -r o c y t e s ( l a n e2 ) .A s e r i e so f g l y c o p r o t e i nb a n d s , i n c l u d i n gb a n d3 a n d b a n d4 . 5 ,i n b o t h A l a n d A 2e r y t h r o c y t e sw e r en o t s t a i n e db y t h eT H - 1a n t i b o d yb y i mmu n o b l o t t i n g( d a t an o t s h o w n ) .I s o l a t i o no fa n A - A c t i v eG l y c o l i p i dAn t i g e nD e f i n e db yA n t i -b o d yT H - 1( Ty p e3 C h a i nA ) f r o m t h eA bF r a c t i o n .T h e s i m -p l e s tg l y c o l i p i ds p e c i e ss h o w i n gs p e c i f i cr e a c t i v i t yw i t hTH -1 a n t i b o d yw a s i s o l a t e df r o mt h eA b f r a c t i o nb y a c e t y l a t i o nf o l l o w e db yHPTLC s e p a r a t i o n .A t l e a s te i g h tb a n d s ,t e r m e df r a c t i o n s1 - 8 ,w e r e s e p a r a t e df r o mt h eA f r a c t i o nb y o n e -d im e n s i o n a lHPTLC ( d a t an o t s h ow n ) .T h e s ec o m p o n e n t s ,s e p a r a t e do n p r e p a r a t i v eHPTLC, w e r ei n d i s t i n g u i s h a b l eo nHPTLC a f t e rd e a c e t y l a t i o n( F i g .2 A ) ,a n d a l lo ft h e mw e r es t a i n e db y a n t i - Aa n t i b o d yAH16 ( F i g .2 B ) ,b u t n o n eo ft h e mw a s s t a i n e db y a n t i - At y p e 1 c h a i n AH21 o r b y t h en e wmo n o c l o n a la n t i b o d i e s d i r e c t e dt o d i f u c o s y lA - i . e . , a n t i -A L e bo r a n t i - A L e y( d a t an o t s h ow n ) .S o m ef r a c t i o n s( f r a c -t i o n s1 ,2 , 4 ,a n d 7 )w e r es t a i n e db y T H - 1a n t i b o d y( F i g .2 C )a n d w e r e h y d r o l y z e db y a - N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n i d a s et o ac o m p o n e n tw i t h a s l o w e rTLC m o b i l i t yt h a n H 2 ( F i g .2 D )t h a tw a ss t r o n g l yr e a c t i v ew i t hM B r la n t i b o d y 2( 1 3 )( F i g .2 F )b u t w a s n o t r e a c t i v ew i t h B E - 2( F i g .2 E ) .O t h e r f r a c t i o n s( f r a c t i o n s3 a n d 5 )w e r eo n l y w e a k l ys t a i n e db y T H - 1a n t i -b o d y( F i g .2 C ) a n d w e r ec o n v e r t e db y a - N - a c e t y l g a l a c t o s a -m i n i d a s et o t h ec o m p o n e n tc l a s s i c a l l yk n o w na s H 2 ( F i g .2 D ) ,w h i c hi s r e a c t i v ew i t hB E - 2a n t i b o d y( F i g .2 E ) ,b u t n o tw i t hM B r la n t i b o dy . F r a c t i o n s6 a n d 8w e r er e v e a l e dt ob e am i x t u r eo ft y p e2 c h a i nA ba n d t y p e 3 c h a i nA b ,a n d r e p e a t e dTL C p u r i f i c a t i o nw a s n e ed edt o o b t a i na p u r e s u b s t a n c e .C om p l e t es e p a r a t i o no f t h eA b f r a c t i o n swas d e m o n s t r a t e db y t w o - d im e n s i o n a lHPTLC f o l l ow e db y i n s i t ud e a c e t y l a -t i o na n d i mmu n o s t a i n i n g .E i g h tc o m p o n e n t sw e r e c l e a r l ys e p a r a t e d( F i g .3 A ) ,f o u r o f w h i c hw e r er e a c t i v ew i t h T H - 1a n df o u ro fw h i c hw e r en o t r e a c t i v ew i t hT H - 1( F i g .3 B ) .T h e

f o u rc o m p o n e n t st h a tw e r e r e a c t i v ew i t h T H - 1a n t i b o d y( f r a c t i o n s1 , 2 , 4 , a n d 7 )g a v ee s s e n t i a l l yt h es a m e1 HNMRs p e c t r u m ,a n d t h e i rs e p a r a t i o no n HPTLC a s a c e t a t e sm u s tb e d u e t od i f f e r e n c e si nc e r a m i d ec o m p o s i t i o n ;t h e s ec o m p o -n e n t sa r eh e r e b yc a l l e dt y p e 3 c h a i nA b ( s e eD i s c u s s i o n ) .S i m i l a r l y ,t h eo t h e rf o u rc o m p o n e n t s( f r a c t i o n s3 , 5 ,6 ,a n d8 )s h o u l dh a v et h es a m ec a r b o h y d r a t ec h a i n ,c l a s s i c a l l yk n o w na st y p e2 c h ai n A b ,b e c a u s ef r a c t i o n s3 a n d5 g a v ee s s e n t i a l l yt h es a m e1 HNMR s p e c t r u m .

S t r u c t u r a lCh a r a c t e r i z a t i o no f t h eA - A c t i v eG l y c o l i p i d( Ty p e 3C h a i nA b )D e f i n e db y A l - S p e c i f i cT H - 1An t i b o d y.T h e s t r u c t u r eo f t h e A 1 - a s s o c i a t e dt y p e 3 c h a i nA bw a sd e -t e r m i n e dt o h a v ea r e p e t i t i v eA e p i t op e ( T a b l e1 ) ,b a s e do nt h ef o l l o w i n gr e s u l t s :( i )T h e 1 HNMR s p e c t r u mo f t y p e 3 c h a i nA bwas c h a r a c -

t e r i z e db y t h eu n u s u a lp r e s e n c eo f f o u ra a n om e r i cr e s o -n a n c e sa n d f i v e8 a n o m e r i cr e s o n a n c e se a c h o fw h i c hi s a s -s i g n e da s s h o w ni nF i g .4 .( i i )T h es t r u c t u r ed e s c r i b e da b o v ei sf u l l ys u p p o r t e db y t h e

r e s u l t so fm e t h y l a t i o na n a l y s i s( F i g .5 ) .( i i i )Ty p e3 c h a i nA bwas h y d r o l y z e db y a - N - a c e t y l g a l a

t o s a m i n i d a s eo f C h a r o n i al a m p a st o a n H -a ct i v ep r e c u r s o r ,d e f i n e db y t h eMBr1 a n t i b o d y( F i g .2 F ) ,w h i c h h a da s l o w e rTL C m o b i l i t yt h a n t h eH 2g l y c o l i p i d .S i n c et h i sf i r s ts t e po fd e g r a d a t i o nw a ss o s l u g g i s h ,a n d t h ep r o d u c twas d i f f i c u l tt oo b t a i ni n s u f f i c i e n tq u a n t i t y ,t h es ame p r e c u r s o rg l y c o l i p i dr e a c t i v ew i t hMBrl a n t i b o d y ,w h i c hi s p r e s e n t i nA b u t n o ti nB o r 0 e r y t h r o c y t e s ,w a si s o l a t e df r o mA e r y t h r o c y t e sf o rf u r t h e rd e g r a d a t i o na n a l y s i s .T hi s H -a c t i vep r e c u r s o rwasd e g r a d e dt oa n A - a c t i v eg l y c o l i p i dh a v i n gt h es a m eTLC m o -b i l i t ya s A ' g l y c o l i p i db y s u c c e s s i v eh y d r o l y s i sw i t h a - L - f u -c o s i d a s e( b o v i n el i v e r )a n d / 3 - g a l a c t o s i d a s e( C .l amp a s )( 1 6 ) .R e a c t i v i t yo fVa r i o u sA -A c t i v eG l y c o l i p i d sw i t hA l - S p e c i f i c

Mon o c l o n a lA n t i b o d yT H - l .T o c o n f i r mt h es p e c i f i c i t yo f t h eA 1 - s p e c i f i cT H - 1a n t i b o d y ,i t sr e a c t i v i t yw i t h v a r i o u sA - a c -t i v eg l y c o l i p i d sw a st e s t e d .On l yt y p e 3 c h a i nA bw a sh i g h l yr e a c t i v ei n s o l i d - p h a s er a d i o i mm u n o a s s a y ,a s s h o w ni nF i g .6 ,a n d o n l y t y p e 3 c h a i nA w a si m m u n o s t a i n e do n TL C ( d a t an o t s h o w n ) .A w e a kc r o s s - r e a c t i o nw i t h g l o b o - A( t y p e4c h a i nA ; Ta b l e 1 ,p a r tD ) w a s o b s e r v e d .

F I G .5 . S e l e c t e di o nc h r o m a t o g r a mo f p a r t i a l l y0 -m e t h y l a t e da l d i t o la n d h e x o s am i n i t o la c e t a t e sf r o m t h eh y dr o ly z at e o f t y p e3 c h a i nAbg l y c o l i p i d .P a r t i a l l ym e t h y l a t e ds u g a r a c e t a t e sw e r e s e p a r a t e do n a D B - 5c a p i l l a r yc o l u m n( t e m p e r a t u r ep r o g r a m m e df r o m 1 4 0 t o 2 5 0 T Ca t4 0 C / m i n )a n d i d e n t i f i e db ym e t h a n ec h em i c a li o n i z a t i o nm a s ss p e c t ro me t r y w i t hs e l e c t e di o nmo n i t o r i n go n a F i nn i ga n3 3 0 0g a s c h r om a t o g r a p h ym a s ss p e c tr o me t e r w i t h a6 1 1 0D a t aS y s t e m( 1 6 , 1 9 ) .O r d i n a t e ,i n t e n s i t yo f e a c hi o na t t h em a s sn u m b e ri n d i c a t e d .Ab s c i s s a ,s c a n n u m b e r ;e a c hs m a l l e s tu n i tr e p r e s e n t sf i v es c a n s ,1 s e c p e r s c a n .P e a k si d e n t i f i e dw e r ea sf o l l o w s :( 1 )2 , 3 , 4 - t r i - O - M e - F u c ;( 2 )2 , 3 , 6 - t r i - O - M e - G l c ;( 3 )2 , 4 , 6 - t r i -0 - M e - G a l ;( 4 )4 , 6 - d i - O -M e - G a l ;( 5 )3 , 4 , 6 - T r i - O - M e - G a l N A c M e ;( 6 )3 , 6 - d i - 0 -M e - G l c NA cM e ;a n d ( 7 )4 , 6 - d i - O - M e - G a l N A cM e .( I n s e t )P a t t e r no fd i - O - M e - h e x o s a m i n i t o l sc o - i n j e c t e dw i t h4 , 6 - d i - 0 - M e - G l c N A cM e( 8 )i s s h o w n( m / z 3 3 3 ,3 9 3 ) ,i n d i c a t i n gt h es e p a r a t i o nb e t w e e n4 , 6 - D i - 0 -Me-GlcNAcMe a n d 4 , 6 - d i - O -M e - G a l N A cM e .

P r o c . N a t LA c a d .S c i .USA 8 2 ( 1 9 8 5 )

8/3/2019 Blood Imp2

5/6

P r o c . N a t l .A c a d .S c i .USA 8 2 ( 1 9 8 5 ) 1 2 0 3

1 0

8

I 0

0 o

c L

6

4

2

1 0

1 0 f

r ~ e )

0 T

8

6

2

0

A

la

1 4 1 6 64 2 5 6 1 0 2 4R e c i p r o c a lo fA n t i b o d yD i l u t i o n

\ B

' \ ~ ~ ~ ~ ~

1 4 1 6 6 4 2 5 6 1 0 2 4

R e c i p r o c a lo fG l y c o l i p i dA n t i g e nD i l u t i o n

F I G .6 . B i n d i n gs p e c i f i c i t yo f T H - 1a n t i b o d yt o p u r i f i e dg l y c o l i p -i d s a c c o r d i n g t o t h em e t h o dp r e v i o u s l yd e s c r i b e d ( 1 4 ) ,b u t w i t hom i s s i o no f s e c o n d a r ya n t i b o d ys i n c e' 2 5 I - l a b e l e dp r o t e i nA c o m -b i n e dd i r e c t l yw i t hT H - 1a n t i b o d y( I g G 2 a ) .( A )B i n d i n ga c t i v i t yw i t ha n t i b o d yd i l u t i o n .E a c hw e l lc o n t a i n s1 0 n g o f g l y c o l i p i d a n t i g en ,3 0n g o f c h o l e s t e r o l ,a n d 5 0 n g o f l e t h i c i n .( B )B i n d i n ga c t i v i t yo f a n t i -b o d yw i t ha n t i g e nd i l u t i o n .T h e i n i t i a lg l y c o l i p i dc o n c e n t r a t i o nwas1 0 0n g w i t h 3 0 0n g o f c h o l e s t e r o la n d 5 0 0ng o f l e c i t h i n .Co n c e n t r a -t i o no f a n t i b o d ya p p l i e dt o e a c h w e l la s a 1 : 1 0d i l u t i o no f c u l t u r es u p e r n a t a n to f T H - 1 .e, A b t y p e 3 c h a i n ;o , A b t y p e 2 c h a i n ;o, A 't y p e 2 c h a i n ;A , A x ( g l o b o - A ) ;A, H 2 t y p e 3 c h a i n .A d d i t i o n a lg l y c o -l i p i d st e s t e d ,w h i c hgave n e g a t i v er e su l ts ( r )w e r e H 2 t y p e 2 c h a i n ,A L e b ,L e y ,F o r s s m a n ,A L e y ,a n d A a t y p e 1 c h a i n .ALeb a n d ALeyw e r e d o n a t e db y J . M . M c K i b b i n( f o rs t r u c t u r e , s e e r e f .2 0 ) .

DISCUSSION

T h ec h e m i c a lb a s i so f b l o odg r o u p A l s p e c i f i c i t y ,i f i t e x i s t s ,h a s n o t b e e n d e m o n s t r a t e du n e q u i v o c a l l y( 3 - 6 ) .A s i n g l eg l y c o l i p i dc a r b o h y d r a t ec h a i nd i s p l a y i n ga s p e c i f i c r e a c t i v i t yw i t h t h eA l - s p e c i f i cm o n o c l o n a la n t i b o d ywas i s o l a t e da n dc h a r a c t e r i z e du n e q u i v o c a l l ya s d e s c r i b e di nR e s u l t s .Th e A 1 -s p e c i f i cs t r u c t u r e i d e n t i f i e di s a r e p e t i t i v eA d e t e r m i n a n ts h o w nb e l o w :

GalNAcal -* 3 G a l , ( 1 -* 3GalNAcal -- 3 G a l l 8 14GlcNAc2 2

F u c a l F u c a l1 3 1-* 3 G a l , 8 1-* 4 G l c

S i n c e t h e i n t e r n a l l yl o c a t e d h e x o s a m i n eo f t h e t e r m i n a lAd e t e r m i n a n ti s a - G a l N A c ,i t i s h e r e b yc a l l e dt y p e 3 c h a i nA ,i n c o n t r a s t t o t y p e 1 a n d t y p e 2 c h a i n A ( f o rr e v i e w s , s e er e f s .2 0 a n d 2 1 ) .P r e v i o u s l y ,t h e t e r m t y p e 3 c h a i nwas u s e db y D o n a l d( 2 2 )f o ra n A - a c t i v es h o r t c h a i n o l i g o s a c c h a r i d e ,GalNAcal -* 3 [ F u c a l / 2 ] G a l , 1-k 3GalNAcal -- R, linkedd i r e c t l yt o s e r i n eo r t h r e o n i n eo f p r o t e i n .A l t h o u g hn o c l e a rc u t d i f f e r e n c ewas f o u n db e t w e e nA l a n d A2 , t h i so l i g o s a c -c h a r i d ew a s f o u n d i n a h i g h e rc o n c e n t r a t i o ni nA l t h a n i nA 2g l y c o p r o t e i n s( 2 2 ) .R e c e n t l y , we f o u n d g l o b o - As t r u c t u r e( Ta b l e1 ,p a r t D ) t o b e p r e s e n te x c l u s i v e l yi nA l b u t n o t i nA 2e r y t h r o c y t e s( 1 0 ) .More r e c e n t l y ,S a m u e l s s o na n d c o - w o r k -

e r s to b s e r v e da c o n v e r s i o no f g l o b o - Ht o g l o b o - Ab y t h e A lt r a n s f e r a s e ,b u t n o t b y t h e A 2 t r a n s f e r a s e .T h e s t r u c t u r eo fo n e o f t h eA - a c t i v eg l y c o l i p i d s ( A X )c o n t a i n s t h es e q u e n c eG a l N A c a l-* 3 [ F u c a l- 1 2 ] G a l f 8 1- - 3 G a l N A c f 3 1-* 3 G a l a ,a l t h o u g ht h ei n t e r n a lGalNAc r e s i d u ei sa , 3 - s t r u c t u r ei nc o n -t r a s tt o a n a - s t r u c t u r e i n t y p e 3 c h a i nA . I n t h i sr e g a r d ,weh e r e b yc l a s s i f yA x a s g l o b o - Ao r t y p e 4 c h a i n A ( Ta b l e 1 ,p a r t D ) .I n t e r e s t i n g l y ,t h eA l - s p e c i f i ca n t i b o d yTH-1 d o e sn o t r e a c t w i t h t h i ss t r u c t u r e ,a l t h o u g ht h ei n t e r n a lG a l f 1 -*3 G a l N A ci s s i m i l a rt o t y p e 3 c h a i nA . S i n c e g l o b o - Ai s a ne x t r e m e l ym i n o r c o m p o n e n to f human e r y t h r o c y t e s ( 1 0 ) ,c o n t r i b u t i o no f t h i ss t r u c t u r e t o A l s p e c i f i c i t yc o u l d b e o fs e c on d ar y i m p o r t a nc ea s c o m p a r e dt o t h e t y p e 3 c h a i n As t r u c t u r ed e s c r i b e di n t h i sp a p e r . T h u s ,t h e e s s e n t i a l q u a l i t at i v ed i f f e r e n c eb e t w e e nA l a n d A 2 s t a t u sc o u l d b e a s c r i b e dt o t h ea b i l i t yo f t h eA l e n z y m e ,a n d t h ei n a b i l i t yo f t h eA 2e n z y m e ,t o c on v e r t t y p e3 c h a i nH t o t y p e 3 c ha in A .

t B r e im e r ,M . , J a c o b s s o n ,A . ,La r s o n , G . & S a m u e l s s o n ,B . E .( 1 9 8 4 )P r o c e e d i n g so f t h e1 8 t hCo n g r e s so f t h eI n t e r n a t i o n a lS o c i e -t y o fB l o o dT r a n s f u s i o n ,J u l y2 2 - 2 7 ,1 9 8 4 ,Mu n i c h .

T h i si n v e s t i g a t i o nw a s s u p p o r t e db y R e s e a r c hG r a n t sCA 1 9 2 2 4a n dCA 2 0 0 2 6f r o mt h eNa t i o n a lI n s t i t u t e so f H e a l t h .H . C .w a ss u p -p o r t e db y a f e l l o w s h i pf r o m I ng e bo r g o gL e oD a n n i nF o n d e na n dVe r a o g C a r lJ o h a nM i c h a e l s o n sL e g a t ,D e n m a r k .

1 . v o n D u n g e r n ,E . & H i r s z f e l d ,L . ( 1 9 1 1 )Z . I m m u n i t a t s f o r s c h8 , 5 2 6 - 5 6 2 .

2 . R a c e ,R . R . & S an ge r , R .( 1 9 7 5 )B l o o dG r o u p si nM a n ,( B l a c k -w e l lS c i e n t i f i c ,O x f o r d ) ,6 t hEd .

3 . Ma k e l a ,O . ,R u o s l a h t i ,E . & E h n h o l m ,C. ( 1 9 6 9 )J . I mm u n o l .1 0 2 ,7 6 3 - 7 7 1 .

4 . M o h n ,J . F . ,C u n n i n g h a m ,R . K . & B a t e s ,J . F . ( 19 7 7 )i nH u -man B l o o dG r o u p s ,e d s .M o h n ,J . , P l u n k e t t ,R . ,C u n n i n g h a m ,R . & L amb e r t ,R . ( K a r g e r ,New Yo r k ) , p p .3 1 6 - 3 2 5 .

5 . K i s a i l u s ,E . C . & K a b a t ,E . A . ( 1 9 7 8 )J . Ex p .M e d .1 4 7 ,8 3 0 -8 4 3 .

6 . H a k o m o r i ,S . ( 1 9 8 1 )S e m i n .H em a t o l .1 8 ,3 9 - 6 2 .7 . K o h l e r ,G . & M i l s t e i n ,C . ( 1 9 7 5 )N a t u r e ( L o n d o n )2 5 6 ,4 9 5 -

4 9 7 .8 . F u k u d a ,M . N . & H a k o m o r i ,S . ( 1 9 8 2 )J . B i o l .C h e m .2 5 7 ,

4 4 6 - 4 5 5 .9 . A b e ,K . ,L e v e r y ,S . B . & H a k om o r i ,S . ( 1 9 8 4 )J . I mm u n o l .1 3 2 ,1 9 5 1 - 1 9 5 4 .

1 0 . C l a u s e n ,H . ,Wa t a n a b e ,K. , K a n n a g i ,R . ,L e v e r y ,S .B . ,Nu -d e lma n ,E . , A r a o - To m o n o ,Y. & H a k o m o r i ,S . ( 1 9 8 4 )B i o -c h e m .B i o p h y s .R e s . Commun . 1 2 4 ,5 2 3 - 5 2 9 .

1 1 . B r e m e r ,E .G . ,L e v e r y ,S .B . ,S o n n i n o ,S . ,Gh i d o n i ,R . ,C a n e -v a r i ,S . ,K a n n a g i ,R . & H a k o m o r i ,S . ( 1 9 8 4 )J . B i o l .C h e m .2 5 9 ,1 4 7 7 3 - 1 4 7 7 7 .

1 2 . Yo u n g ,W. W . , J r . ,P o r t o u k a l i a n ,J . & H a k o m o r i ,S . ( 1 9 8 1 )J .B i o l .C h e m .2 5 6 ,1 0 9 6 7 - 1 0 9 7 2 .

1 3 . Mag n a n i ,J . L . ,S m i t h ,D . F .& G i n s b u r g ,V. ( 1 9 8 0 )An a l .B i o -c h e m .1 0 9 ,3 9 9 - 4 0 2 .

1 4 . Ka n n a g i ,R . , S t r o u p ,R . , C o c h r a n ,N . A . , U r d a l , D . L . ,Yo u n g ,W. W . , J r . , & H a k o m o r i ,S . ( 1 9 8 3 )C a n c e rR e s . 4 3 ,4 9 9 7 - 5 0 0 5 .

1 5 . To w b i n ,H . ,S t a e h e l i n ,T . & G o r d o n ,J . ( 1 9 7 9 )P r o c . N a t I .A c a d .S c i .USA 7 6 ,4 3 5 0 - 4 3 5 4 .

1 6 . Kan n a g i ,R . ,L e v e r y ,S . B . ,I s h i g a m i ,F . ,H a k om o r i ,S . ,S h e -v i n s k y ,L . H . ,K n o w l e s ,B . B . & S o l t e r ,D . ( 1 9 8 3 )J . B i o l .C h e m .2 5 8 ,8 9 3 4 - 8 9 4 2 .

1 7 . S k i p s k i ,V. P . ( 1 9 7 5 )M e t h o d sEn z ymo l .3 5 ,3 9 6 - 4 2 5 .1 8 . D a b r o w s k i ,J . ,H a n f l a n d ,P . & Egge , H . ( 1 9 8 0 )B i o c h e m i s t r y

1 9 ,5 6 5 2 - 5 6 5 8 .1 9 . Kan n a g i ,R . ,L e v e r y , S . B . & H a k om o r i ,5 . ( 1 9 8 4 )J . B i o l .

C h e m .2 5 9 ,8 4 4 4 - 8 4 5 1 .2 0 . Wa t k i n s ,W. M. ( 1 9 8 0 )i nA d v a n c e si nH um a nG e n e t i c s ,e d s .

H a r r i s ,H . & H i r s c h h o r n ,K . ( P l e n u m ,New Yo r k ) ,Vo l .1 0 ,p p .1 - 1 3 6 .

2 1 . L l o y d , K . 0 . & K a b a t ,E. A . ( 1 9 6 8 )P r o c . N a t I .A c a d .S c i .USA 6 1 ,1 4 7 0 - 1 4 7 7 .

2 2 . D o n a l d ,A . S .R .( 1 9 8 1 )E u r .J . B i o c h e m .1 2 0 ,2 4 3 - 2 4 9 .

I mm u n o l o g y :C l a u s e ne t a L

8/3/2019 Blood Imp2

6/6

3 9 4 8 C o r r e c t i o n P r o c . N a t L A c a dS c i USA 8 2 ( 1 9 8 5 )

C o r r e c t i o n .I n t h ea r t i c l e" R e p e t i t i v eA e p i t o p e( t y p e3 c h a i nA ) d e f i n e db y b l o o dg r o u pA 1 - s p e c i f i cm o n o c l o n a la n t i b o d yT H - 1 :C h e m i c a lb a s i so f q u a l i t a t i v eA l a n d A 2 d i s t i n c t i o n "b y H e n r i kC l a u s e n ,S t e v e nB . L e v e r y ,E d w a r dN u d e l m a n ,S h i g e r uTs u c h i y a ,a n dS e n - i t i r o hH a k o m o r i , w h i c ha p p e a r e di n n u m b e r4 , F e b r u a r y1 9 8 5 ,o f P r o c . N a t l .A c a d . S c i .USA( 8 2 ,1 1 9 9 - 1 2 0 3 ) ,t h ea u t h o r sr e q u e s t t h a tt h e f o l l o w i n ge r r o rb e n o t e d :I nF i g .4 o n p a g e 1 2 0 1( 1 HNMR) , t h ea s s i g n m e n t sf o r t h e r e s o n a n c e si n t h e u pp e r s p ec t r um( C )d e s i g n a t e dV I I I - 1a n dV - 1a r e t h er e v e r s e o f t h o s ei n d i c a t e d . I n t h el o w -e r s p e c t r u m( A )o n t h e b o t t o mr i g h t ,R - 3 s h ou ldb e d e s i g n a t -e d R - 2 .