BİR GRUP SENTETİK VE BİTKİSEL SEKONDER BİLEŞİĞİN MEMELİ UBİKİTİN

PROTEAZOM SİSTEMİ ÜZERİNE ETKİLERİNİN HÜCRE VE MOLEKÜLER

BİYOLOJİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI

Genel Bilgiler

Ubikitin Proteazom Sistemi

• UPS ökaryotik hücrelerde istenmeyen proteinlerin yıkımından sorumlu olan temel yolaklardan birisidir.

• Ubikitin Proteazom Sistemi

• Otofaji

UPS vs Otofaji

Ubikitin Proteazom Sistemi OtofajiÇözünebilir sitoplazmik ve nükleer

protein Sitoplazmik kargo / lizozom

Kısa ömürlü ve yanlış katlanmış proteinler

Uzun ömürlü proteinler ve dejenere organeller

Birçok hücresel kompartmanda Sadece sitoplazmada

UPS

• Hücre içi proteinlerin büyük kısmı UPS tarafından yıkılır.

• Hem normal regülator proteinlerin hem de yanlış katlanmış proteinlerin kontrollü proteolizi

• Sinyal iletimi, hücre siklüs kontrolü, hücre farklılaşması, gelişme, DNA tamiri ve apoptozis gibi birçok temel hücresel prosesleri etkiler.

UBİKİTİN

• Ubikitin, tüm ökaryotik hücrelerde bulunan, primer yapısı yüksek oranda korunmuş, ısıya dayanıklı, 76 amino asitlik, 8kDA ağırlığında bir polipeptittir.

• Yapısında 7 adet lizin bulundurur. Poliubikitin zincir oluşumlar bu noktalardan kaynaklanır.

• Karboksi ucundaki iki adet glisin, hedef proteinlere bağlanma sonrası ubikitinin hareketliliğini sağlar.

K K K K K GGKK

6 11 27 29 33 48 63

C-N-

Ubikitinasyon

• Ubikitinin C-ucundaki glisin ile substratdaki lizinin epsilon amino grubu arasındaki izopeptid bağı oluşumu.

• E1, ubikitin aktifleyici enzim• E2, ubikitin konjuge edici enzim• E3, ubikitin ligaz enzimi

E1, E2, E3 Substrat Substrat

ub

De-ubikitinasyon enzimleri

PROTEAZOM

1) Ub Ligazların (E3) Hedeflenmesi

• Ubikitin ligazlar spesifik substratların yıkımına aracılık eder.

• Kanser tedavisi için ilaç geliştirmede bu enzimlerin aktif kısımlarının veya bu kısımların substratlarla etkileşmesinin hedeflenmesinin, daha az yan etkiye sahip selektif ilaçlar oluşturacağı düşünülerek bu yönde çalışmalar yapılmaktadır.

Kanser Tedavisinde UPS’nin Hedef Alınması

2) Deubikitinasyon Enzimlerinin Hedeflenmesi• DUB, ubikitine edilmiş proteinleri tanıyarak ubikitin

eklentilerini kaldırır ve bu sayede sistemi geri dönüşlü kılar.

• İnsan DUB’ları onkojenik veya tümör baskılayıcı E3 ligazların direk antagonistleridir ve artan şekilde kanser tedavisinde potansiyel hedefler olarak görülmektedir.

• Kanserle ilgili süreçleri kontrol eden nükleer DUB’lar umut vadeden adaylardır.

3) Proteazomun Hedeflenmesi• Ubikitine olmuş proteinler, hücre içi proteinlerin büyük

bir kısmının yıkımından sorumlu sorumlu olan dev protein kompleksine, proteazoma yönlendirilirler.

• Proteazomdaki değişiklikler insanlardaki birçok rahatsızlıkla ilişkilendirilmiştir. Bunlara örnek olarak kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kistik fibröz verilebilir.

3)Proteazomun Hedeflenmesi• Proteazom inhibitorü ilaçlar, özellikle hızla prolifere

olan hücrelerde etkildir.• Bu kanser hücrelerinin proteazomu kendi faydaları

için kullanıyor olabileceğini göstermektedir.• Virüslerin, MHC sınıf antikorları hücreyi ele geçirmek

için proteazoma sevk etmelerine benzer şekilde, kanserli hücrelerde de tümör süpresan proteinlerin yıkımı özellikle artmıştır.

3)Proteazomun Hedeflenmesi• NPI-0052 ve bortezomib gibi düşük dozda proteazom

inhibitörlerinin kombinasyonlarının in vitro ortamda kanser hücreleri üzerine sinerjist etkileri önemli gelişmelerdir.

• Ayrıca belirgin substrat seçiciliğine sahip proteazom inhibitörlerinin gelişimi biyoyararlanımı arttırıp, toksisiteyi azaltmış ve inatçı tümörlerde geniş kullanımı için kapıyı açmıştır.

Kanser Tedavisinde Ubikitin Açısından Çözülmesi Gereken Sorunlar• Hücre kültüründen gelen verilerin büyük

çoğunluğunun doğruluğu klinik uygulamalarda kanıtlanmış ve ubikitin sistemini hedef alan stratejilerin gelişimine izin vermiştir.

• Henüz hücre kültürü çalışmalarından elde edilen sonuçlar her zaman için in vivo modellerdeki bulguları yansıtmamakta olup hasta tümör örneklerini ve fare modellerini analiz etmek gerekli olacaktır

• Ubikitin sinyal yolakları hücre transformasyonu veya metastazı esnasında diğer onkojenik kaskatlar ile birlikte hareket etmektedir.

• Bu gibi olayların dinamiğini ve kompleksliğini in vivo ortamda anlamak için fazla sayıda hastadan alınan primer tümör materyali ile geniş kapsamlı proteomik ve genomik çalışmalar başlatılması gerekecektir.

Kanser Tedavisinde Ubikitin Açısından Çözülmesi Gereken Sorunlar

• Tümörlerde ubikitin sisteminin anormal bileşenlerine daha ileri müdahaleler için, ubikitin konjugatları ve lizatlarının inhibisyonu, substrat tanımlanmasının önlenmesi, ubikitine bağlanımın engellenmesi ve yeni proteazom inhibitörlerinin geliştirilmesini içeren yaklaşımlar geliştirilmektedir.

• Özellikle spesifik ubikitin ligaz inhibitörlerinin geliştirilmesine yönelik çabalar gibi bazı durumlarda sonuçlar hayal kırıklığı yaratmaktadır. Diğer taraftan yeni proteazom inhibitörleri geliştirmeye yönelik çabalar daha verimli olmaktadır.

Kanser Tedavisinde Ubikitin Açısından Çözülmesi Gereken Sorunlar

Gereçler ve Yöntemler

Hücre Kültürü• Çalışmalarda MCF-7 meme kanseri (breast cancer)

hücre hattı kullanılmıştır. PCR-tabanlı mikoplazma kontrolü ile hücre hattının kontaminasyonsuz olduğu konfirme edilmiştir.

• 1X105 sayısındaki MCF-7 hücreleri 12 kuyucuklu petrilere ekilmiştir. Bir gün sonra, DMSO’da çözünmüş bileşenler eklenmiş ve 24 saat inkübe edilmiştir.

• Bu işlem sonunda hücreler tripsinize edilip iki defa 1’er ml 4C’deki PBS ile yıkandı. 10.000 rpm’de birer dakika 4C’de santrifüj edilerek hücreler toplandı.

Hücrelerin Hazırlanması ve Protein Miktar Tayini• Hücreler, lizatlama tamponuna proteazom inhibitör

kompleks eklenerek 5 dakikada bir vortekslemek yoluyla 20 dakika süreyle lizatlanmıştır.

• Hücre pelletini uzaklaştırmak için 14.000 rpm’de 10 dakika boyunca 4C’de santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatantlar temiz mikrosantrifüj tüplerine transfer edilmiştir.

• BCA-protein deney kiti (Pierce) kullanılarak toplam protein miktarlarına bakılmıştır.

Western Blotlama• Elektroforez işlemiyle poliakrilamid jelde göç ettirilen

proteinler, PVDF membrana transfer ile immobilize edilmiş ve membrandaki proteinlerin tayini immünolojik metotlarla yapılmıştır.

• Primer antikor olarak anti-poliubikitin ve anti-aktin antikorları; sekonder antikor olarak goat-anti-mouse antikoru kullanılmıştır.

BULGULAR

İzole edilmiş sekonder metobolitlerin antiproteazomal aktivitesinin incelenmesi

• MCF-7 hücreleri 1 ml besiyeri içerecek şekilde incelenecek maddelerin ilavesinden 24 saat önce ekildi. Ertesi gün, hücrelere 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonu olacak şekilde maddeler uygulandı.

• Elde edilen verilere göre sadece B2, B12, B13 ve B14 anlamlı bir şekilde (2.5 kattan fazla) proteazomu inhibe etmiştir.

• Belirtilen dozlarda en yüksek aktivite, kontrole göre 6.1 oranında ubikitine protein birikimi göstererek 100 M konsantrasyonda B12 kod numaralı 3,5-dihidroksifenetil alkol-3-O-β-D-glukopiranozit olmuştur.

B2

• B2 kod numaralı hispidulin-7-O-β-D-metilglukuronopiranozit’in antiproteasomal aktivitesinin 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonunda incelenmesi

B12 – B13 – B14• B12 kod numaralı 3,5-dihidroksifenetil alkol-3-O-β-D-glukopiranozit, B13 kod

numaralı salidrozit ve B14 kod numaralı eriyodiktiyol-7-O--D-glukuronopiranozit‘in antiproteasomal aktivitesinin 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonunda incelenmesi

• İncelenen 14 sekonder bileşikten bazılarının belirtilen konsantrasyonlarda yüksek aktivite göstermesi, bazılarının ise miktarlarının az olması nedeniyle sekonder bileşiklerden 0.05 ve 0.5 mM konsantrasyonlarında yeni stok çözeltiler hazırlanmıştır.

• İkinci tur çalışmalarda 0.05, 0.5 ve 2 M final konsantrasyondaki sekonder bileşikler MCF-7 hücrelerine uygulanmıştır.

• Bu düşük doz uygulamada B1, B3, B4 ve B8 kod numaralı bileşikler dışındaki tüm bileşikler anlamlı derecede antiproteazomal aktivite göstermiştir.

• Belirtilen düşük dozlarda en yüksek aktivite, kontrole göre 11.8 oranında ubikitine protein birikimi göstererek 0.5 M konsantrasyonda B6 kod numaralı kamferol olmuştur.

kamferol

Sentezlenmiş maddelerin antiproteazomal aktivitesinin incelenmesi• 14 adet sentezlenmiş madde 50 mM konsantrasyonunda

DMSO’da çözülerek stok çözeltileri hazırlandı.• MCF-7 hücreleri 1 ml besiyeri içerecek şekilde incelenecek

maddelerin ilavesinden 24 saat önce ekildi. Ertesi gün, hücrelere 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonu olacak şekilde maddeler uygulandı.

• Doğal bileşiklere göre incelenen sentetik bileşiklerin antiproteazomal aktiviteleri oldukça düşük bulunmuştur.

K14• K14 kod numaralı N- (2-klorofenil)-2-(1,3-diokso-1,3-dihidro-2H-

izoindol-2-il)etansülfonamit‘in antiproteasomal aktivitesinin 5, 25, 50 ve 100 M final konsantrasyonunda incelenmesi.

poliubikitin aktin

LICOR ODYSSEY

Ahmet Uygar Örs tarafından yapılmıştır.

C K11 K13 Mg C K11 K13 Mg

TARTIŞMA

• Apigenin-7-O-β-D-metilglukuronopiranosid, naringenin-7-O-β-D-glukuronopiranosid ve hispidulin-7-O-β-D-glukuronopiranosid dışındaki incelenen tüm bitkisel sekonder bileşikler, değişen oranlarda total poliubikitine protein miktarında artışa neden olmuştur.

• İmmünoblotlama sonuçlarına göre incelenen örnekler arasında kamferol en aktif proteazom inhibitörü bileşiktir.

• kamferol > apigenin > eriyodiktiyol-7-O-β-D-glukuronopiranosid > 3,5-dihidroksifenetil alkol-3-O-β-D-glukopiranozid > salidrosid

• Kamferolün çeşitli meme kanser hücre hatlarında apoptozu indüklediği birçok çalışma ile gösterilmiştir.

• Salidrosid ve glukopiranozidin antiproteazomal etkileri ilk kez bu çalışma ile rapor edilmiştir.

• İlginç olarak luteolin ve hidroksikamferol glukuronopiranozid; kullanılan konsantrasyona bağımlı olarak hem proteazomal aktivasyon hem de inhibisyon göstermektedir

GELECEKTEKİ ÇALIŞMALAR

• Söz konusu bileşiklerin antiproteazomal etkilerinin meme kanserine spesifik olup olmadığı, diğer kanserlerdeki etkinliği tespit edilerek

• Antiproteazomal etkinliğinin tüm proteazom substratlarda mı etkin olduğu yoksa bazı spesifik substratlara mı etki ettiği,

• Ayrıca proteazomun hangi enzimatik aktivitesinin inhibe edildiği incelenecektir.

İleride Yapılacak Çalışmalar İle

TEŞEKKÜRLER

Yrd. Doç. Dr. Petek Ballar

Prof. Dr. Aysun Pabuçcuoğlu

Arş. Gör. Ahmet Uygar Örs

Doç. Dr. Canan Karaalp

Yrd. Doç. Dr. Zeynep Soyer

Prof. Dr. Metiner Tosun