biotechnology 2012-01

DNA sequencing

Смирнов Арсений

ДНК ndash наиболее laquoосвоеннаяraquo биологическая макромолекула

Методики работы с ДНК

1 Выделение

2 Электрофорез

3 Рестрикция

4 Лигирование

5 Гибридизация

6 Полимеразная цепная реакция

7 Секвенирование

8 ДНК-микрочипы

Electrophoresis

Ethidium bromide

CTGGCCTCAAGTTATCCTCCCACTCAGTCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTAAGCCACCTCACCCTGTCAGCCTAAAGACAGTGCTTAATGAAGAGAAATATAAGTGCTTTGAGCAATGGAAGTATAATTAAAATTATACTATGAAAGATTTATAAAGATGACCATTTTGAATGGGACCACACTTATTTGGTTATATAAATTATGATACACTATTAAAAATTCATCATGATGATTTTGTATTTACATTTTATTTACATGTTTGCAATTTGTGAGGAAAGCTAAAATTATGGCTAAGCCATAAATATTTTTGCAGTTTGTTGAGGGTGTTTGTAAAAGTGTTGCCAAGGAAGACCAGTTGGCTACCCAAACAAGGGTTTAGTCTAGGTCTGATCAATACATACACATTATCTCAGGTTTGTCTATCAGAAAAACCTTAGGTTATCCAAATCAAAATAAAATAGATGCATAAAACAAAGGCCAATATGTGTTGAACAATTATATTGTGATATACAACTGCCAAGCATTCCCGATTACCATGACTCCATTTAGTCAGTCCATGGGCAAATGCCATCAATGAGGACAGCCCAGGGTTTCCATATTCTCTCTTGGCTTTACATCCTATAGGAATTGGAGGGGC

Севенирование ДНК - анализ первичной структуры ДНК

(прочтение последовательности нуклеотидов)

Классические методы bull Максам-Гилберт (химическое)

bull Сэнгер (энзиматическое)

Химическое секвенирование (Максам-Гилберт)

Четыре группы химических реагентов разрезающих молекулу ДНК перед нуклеотидами

bull G (DMS ndash dimethylsulphate диметилсульфат)

bull A или G (FA ndash formic acid муравьиная кислота)

bull T или C (H ndash hydrazine гидразин)

bull C (H+S ndash гидразин+соль)

Секвенирование (Максам-Гилберт)

DNA structure

DNA replication

Chemistry of DNA synthesis

DNA synthesis catalized by DNA polymerase

Энзиматическое секвенирование (Сэнгер)

Исскуственный синтез ДНК в пробирке

Секвенирование (Сэнгер)

Сравнение секвенирования по Максаму-Гилберту и по Сэнгеру

Капиллярный электрофорез

Автоматическое секвенирование


Полногеномное секвенирование

1 Геном разбивается на небольшие перекрывающиеся фрагменты

2 Фрагменты секвенируются 3 Сиквенсы собираются в итоговую последовательность

bull картирование bull перекрывание

Проект laquoГеном человекаraquo 1990-2003

Джеймс Уотсон и Крейг Вентер ndash первые люди с индивидуальными прочитанными геномами

Международный консорциум Celera Genomics

Метод Hierarchical shotgun Whole-genome shotgun

Планируемые сроки 1990 ndash 2005 1998 ndash раньше гос проекта

Планируемый бюджет 3 млрд $ 300 млн $

Доступность результатов

Полностью доступны Полностью запатентованы

laquoГеном человекаraquo Государственный проект vs частная компания


Полногеномное секвенирование подход основанный на картировании

Библиотеки ДНК

- большое число молекул векторной ДНК со встроенными фрагментами чужеродной (анализируемой) ДНК

Полногеномное секвенирование подход основанный на перекрывании

1990 1995 2000 2003

3 500 000 000 $

laquoГеном человекаraquo

Стоимость секвенирования одного генома

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

ldquoSangerrdquo ldquoNGSrdquo

1 000 000 000 $

1 000 000 $

100 000 000 $

10 000 000 $

100 000 $

10 000 $

Next-generation sequencing = High-throughput sequencing =

Massive parallel sequencing

34

Стоимость секвениорвания

Sanger NGS NNGS 35

Накопление данных

bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation

Template preparation

Sequencing

39

NGS approaches

bull Sequencing by synthesis

ndash Pyrosequencing

ndash Semiconductor sequencing

ndash Sequencing by reversible termination

ndash Phospholinked Fluorescent Nucleotides or Real-time sequencing

bull Sequencing by ligation

40

41

ldquoBenchtoprdquo sequencers

42

ДНК ndash наиболее laquoосвоеннаяraquo биологическая макромолекула










Electrophoresis

Ethidium bromide













DNA structure

DNA replication




























1990 1995 2000 2003

3 500 000 000 $



2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010


1 000 000 000 $

1 000 000 $

100 000 000 $

10 000 000 $

100 000 $

10 000 $



34


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42










Electrophoresis

Ethidium bromide













DNA structure

DNA replication




























1990 1995 2000 2003

3 500 000 000 $



2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010


1 000 000 000 $

1 000 000 $

100 000 000 $

10 000 000 $

100 000 $

10 000 $



34


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42

Ethidium bromide













DNA structure

DNA replication




























1990 1995 2000 2003

3 500 000 000 $



2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010


1 000 000 000 $

1 000 000 $

100 000 000 $

10 000 000 $

100 000 $

10 000 $



34


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42













DNA structure

DNA replication




























1990 1995 2000 2003

3 500 000 000 $



2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010


1 000 000 000 $

1 000 000 $

100 000 000 $

10 000 000 $

100 000 $

10 000 $



34


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42

DNA replication




























1990 1995 2000 2003

3 500 000 000 $



2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010


1 000 000 000 $

1 000 000 $

100 000 000 $

10 000 000 $

100 000 $

10 000 $



34


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42




























1990 1995 2000 2003

3 500 000 000 $



2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010


1 000 000 000 $

1 000 000 $

100 000 000 $

10 000 000 $

100 000 $

10 000 $



34


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42


2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010


1 000 000 000 $

1 000 000 $

100 000 000 $

10 000 000 $

100 000 $

10 000 $



34


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42



34


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42


Sanger NGS NNGS 35


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42


bases bytes 36


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42


37

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42

38

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42

Sanger NGS

Library preparation


Sequencing

39

NGS approaches







40

41


42

NGS approaches







40

41


42

41


42


42

biotechnology 2012-01

Documents