biotechnologia w medycynie regeneracyjnej i reprodukcyjnej

Biotechnologia w medycynieregeneracyjnej i reprodukcyjnej

Kinga Kamieniarz1, Robert Nawrot1, Katarzyna Grajek2,Anna GoŸdzicka-Józefiak1

1Zak³ad Wirusologii Molekularnej, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza,Poznañ2Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ¯ywnoœci, Akademia Rolniczaim. Augusta Cieszkowskiego, Poznañ

Biotechnology in regenerative and reproductive medicine

S u m m a r y

Rapid progress in molecular biology, genetics, and mammalian biotechnol-ogy has revolutionized diagnostic, therapeutic and reproductive cloning inmammals. Recently, several human gene products have been able to be pharma-ceutically explored in transgenic organisms and employed for medical applica-tions.

When organs or tissues are irreparably damaged, they may be also replacedwith an artificial device or donor organ. Promising and also controversial appli-cation for therapeutic and regenerative medicine is stem cells engineering.

Key words:

regenerative medicine, stem cells, diagnosis.

1. Wstêp

Gwa³towny rozwój w ostatnim dwudziestoleciu biologii mo-lekularnej, genetyki, technik in¿ynierii genetycznej i biotechno-logii, stworzy³ doskona³e podstawy do rozwoju diagnostyki i te-rapii szeregu schorzeñ cz³owieka. Wywar³o to tak¿e ogromnywp³yw na rozwój przemys³u farmaceutycznego. Na uwagê za-s³uguje doskonalenie, na drodze in¿ynierii genetycznej, licznychmikroorganizmów, zdolnych do produkcji substancji o dzia³aniufarmakologicznym, np. antybiotyków czy cytostatyków. Mo¿liwe

P R A C E P R Z E G L ¥ D O W E

Adres do korespondencji

Anna GoŸdzicka-Józefiak,Zak³ad WirusologiiMolekularnej,Instytut BiologiiEksperymentalnej,Uniwersytetim. Adama Mickiewicza,ul. Miêdzychodzka 5,60-371 Poznañ.

2 (73) 31–48 2006

sta³o siê tak¿e konstruowanie organizmów transgenicznych zawieraj¹cych geny,których produkty maj¹ w³aœciwoœci lecznicze, jak np. bakterie zdolne do syntezyludzkiej insuliny czy zwierzêta transgeniczne wykorzystywane jako bioreaktory doprodukcji bia³ek cz³owieka (1). W ten sposób uzyskano np. krowy wytwarzaj¹cewraz z mlekiem bia³ka cz³owieka (erytropoetynê i laktoferynê), czy owce wytwa-rzaj¹ce mleko z czynnikami krzepliwoœci krwi (2). Produkowane zwi¹zki próbuje siêtak¿e tak modyfikowaæ, z u¿yciem metod in¿ynierii genetycznej, aby polepszyæ ichw³aœciwoœci farmakologiczne. Wprowadzane modyfikacje przed³u¿aj¹ trwa³oœæ wie-lu leków, umo¿liwiaj¹ specyficzne kierowanie ich do miejsc w organizmie, gdzie za-chodzi proces chorobowy, zwiêkszaj¹ zdolnoœæ ich pobierania przez w³aœciwe ko-mórki oraz zmniejszaj¹ ich toksyczne dzia³anie wzglêdem prawid³owych komórekorganizmu (1,2). W wyniku rozwoju genomiki oraz bioinformatyki powsta³a rów-nie¿ nowa ga³¹Ÿ w farmacji – farmakogenomika, pozwalaj¹ca na programowaniei opracowanie nowych leków oraz testów genetycznych, umo¿liwiaj¹cych wczesnerozpoznanie wielu chorób i ich leczenie na drodze terapii genowej (3).

Osi¹gniêcia w biologii molekularnej i biotechnologii maj¹ równie¿ ogromnywp³yw na postêp w rozwoju medycyny regeneracyjnej (4,5).

2. Medycyna regeneracyjna

Regeneracja komórek krwi czy komórek nab³onkowych zachodzi podczas ca³ego¿ycia cz³owieka. Ze znacznie mniejsz¹ czêstoœci¹ ulegaj¹ regeneracji koœci, w¹tro-ba, miêœnie, naczynia krwionoœne, natomiast bardzo ograniczone mo¿liwoœci maj¹komórki mózgu. Niekiedy w wyniku choroby uszkodzenie narz¹dów bywa jednaktak du¿e, ¿e organizm nie jest zdolny do ich regeneracji i musz¹ byæ zast¹pione po-przez transplantacjê – komórek, czêœci tkanek lub ca³ych narz¹dów. Sta³o siê topodstaw¹ do poszukiwania nowych sposobów ich odbudowy. Rozwój medycyny re-generacyjnej zachodzi na ró¿nych p³aszczyznach, które obejmuj¹:

– poszukiwanie czynników stymuluj¹cych organizm do samonaprawy;– implantacjê komórek, tkanek lub narz¹dów (przeszczepy autologiczne i allo-

geniczne oraz ksenotransplantacje);– poszukiwanie metod pozwalaj¹cych na regeneracjê starych tkanek;– zastêpowanie brakuj¹cych tkanek lub narz¹dów materia³ami sztucznymi (4-7).

2.1. Czynniki stymuluj¹ce organizm do samonaprawy

Dla medycyny regeneracyjnej wa¿ne znaczenie ma poznanie czynników odpo-wiedzialnych za proliferacjê komórek, ich wzrost i ró¿nicowanie. Na podstawie wy-ników dotychczasowych badañ wskazuje siê, ¿e zdolnoœæ komórek do ró¿nicowaniasiê w komórki ró¿nych typów i samoodtwarzania tkanek zale¿y od œrodowiska w ja-

Kinga Kamieniarz i inni

32 PRACE PRZEGL¥DOWE

kim siê one znajduj¹ i obecnych tam licznych czynników tworz¹cych specyficzn¹„niszê”. Charakter tych czynników jest s³abo poznany. Niewiele wiadomo o ich wza-jemnym oddzia³ywaniu i wspó³dzia³aniu. Wa¿ne znaczenie przypisuje siê czynni-kom wzrostu, bia³kom bior¹cym udzia³ w przekazie sygna³u do komórki i w komór-ce oraz bia³kom macierzy zewn¹trzkomórkowej (8). Wykazano np., ¿e oddzia³ywa-nie bia³ek komórkowych z bia³kami macierzy zewn¹trzkomórkowej za poœrednic-twem integryn wp³ywa na ekspresjê cz¹steczek sygna³owych BMP-4 (ang. bone mor-phogenic protein 4) i Wnt-1 (od nazw ang. wingless i int). Z kolei podwy¿szona ekspre-sja Wnt-1, a obni¿ona BMP-4 sprzyja ró¿nicowaniu siê komórek w komórki nerwo-we, natomiast wysoka ekspresja BMP-4, a niska Wnt-1 w komórki miêœniowe (8), na-tomiast angiogeneza mo¿e byæ regulowana przez FGF2 (ang. fibroblast growth fac-tor), TGF beta 1 (ang. transforming growth factor beta 1), Flk1 (ang. fetal liver kinase 1),VEGF (ang. vascular endothelial growth factor) (9,10). Czynnikiem, którego wp³yw nawzrost i mineralizacjê koœci jest stosunkowo dobrze poznany jest ludzki hormonwzrostu hGH (ang. human growth hormone). Wykazano, ¿e stymuluje on chondrocytydo proliferacji przez uwalnianie insulinopodobnych czynników wzrostu oraz synte-zê bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej (g³ównie kolagenu). Ponadto ma wp³yw nametabolizm i dynamikê miêœnia sercowego, oddzia³uje na uk³ad endokrynny i roz-wój narz¹dów p³ciowych (11). Dlatego GH próbowano stosowaæ jako czynnik przy-œpieszaj¹cy regeneracjê koœci, skóry, neuronów, naczyñ krwionoœnych oraz w bada-niach nad ró¿nicowaniem siê komórek macierzystych w komórki ro¿nych typów.Hormon ten z uwagi na wa¿ne znaczenie farmakologiczne by³ jednym z pierwszychpeptydów produkowanych metodami biotechnologicznymi na potrzeby medycynyregeneracyjnej (2,12-14). hGH uda³o siê tak¿e otrzymaæ z wykorzystaniem transge-nicznych zwierz¹t. Swój udzia³ maj¹ w tym równie¿ polscy naukowcy, którzy uzy-skali transgenicznego królika, produkuj¹cego ten hormon i wydzielaj¹cego go wrazz mlekiem (15). Nastêpnie wykazano, ¿e inne czynniki, w tym BMP (ang. bone mor-phogenic proteins), odpowiedzialne za morfogenezê koœci oraz podobny do nich OP-1(ang. osteogenic protein-1), stymuluj¹ gojenie siê z³amañ koœci z takim samym powo-dzeniem jak przeszczep koœci, a czynnik 2 wzrostu keratynocytów (Repifermin)znacznie przyspiesza gojenie siê wrzodów na nogach (16). Z kolei, bia³ko MPIF (ang.myeloid progenitor inhibitory factor) odpowiedzialne za kontrolê produkcji komórekkrwi w organizmie cz³owieka okaza³o siê doskona³ym czynnikiem redukuj¹cym tok-syczny wp³yw chemioterapii na komórki krwi (2,17). Obecnie bia³ka te oraz inneczynniki o wa¿nym znaczeniu farmakologicznym s¹ produkowane metodami bio-technologicznymi (tab. 1). Ich podawanie reguluje funkcjonowanie organizmu i znacz-nie przyspiesza regeneracjê wielu tkanek.

Biotechnologia w medycynie regeneracyjnej i reprodukcyjnej

BIOTECHNOLOGIA 2 (73) 31-48 2006 33

T a b e l a 1

Leki produkowane metodami biotechnologicznymi (wg 2)

Produkt Zastosowanie w leczeniu

alfa1-antytrypsyna mukowiscydoza, rozedma

bia³ko CFTR mukowiscydoza

alfa glukozydaza zaburzenia w magazynowaniu glikogenu

antytrombina III zator

kolagen reumatyzm

hemoglobina talasemia

czynnik VIII I IX hemofilia

bia³ko C regulator krzepliwoœci krwi

tPA zawa³ serca, niedokrwistoœæ

fibrynogen zapalenia

LDL-receptor hipercholesterolemia

dystrofina dystrofia miêœniowa (Duchenne’a)

laktoferyna dodatek do pokarmów dla dzieci

przeciwcia³a terapie antynowotworowe

antygeny niedobory immunologiczne

enzymy (alfa galaktozydaza, glukocerebrozydaza, alfa idu-ronidaza, beta heksoaminidaza)

niedobory enzymatyczne

hGH terapie hormonalne

2.2. Regeneracja tkanek

Niekiedy ubytek komórek i tkanek jest tak du¿y, ¿e wymaga transplantacji czêœcitkanek lub ca³ych organów. Dlatego jednym z celów medycyny regeneracyjnej jestposzukiwanie sposobów syntetyzowania nowych tkanek cz³owieka poza organi-zmem – ex vivo. Badania takie rozpoczêto od próby syntezy skóry, tak bardzo po-trzebnej do leczenia oparzeñ, czy wrzodów powsta³ych wskutek zaka¿enia bakte-riami, uszkodzonych i ulegaj¹cych martwicy tkanek, czêsto wystêpuj¹cych u diabe-tyków. Skóra jest tkank¹ bardzo z³o¿on¹. Sk³ada siê z komórek ró¿nych typów, bu-duj¹cych skórê w³aœciw¹ (dermis) oraz naskórek (epidermis). Ponadto jest trudna dotransplantacji, poniewa¿ ma w³asny uk³ad odpornoœciowy. Badania nad jej pozyska-niem poza organizmem rozpoczêto od namna¿ania w hodowli ludzkich fibrobla-stów, które przenoszono nastêpnie na pod³o¿e sztuczne (z³o¿one np. z polimerówkwasu mlekowego) lub naturalne (np. ¿ele kolagenowe) zawieraj¹ce dodatkowocz¹steczki stymuluj¹ce wzrost i namna¿anie siê komórek, po czym hodowanow bioreaktorze. Hodowlê tak¹ prowadzono przez kilka tygodni a¿ do uzyskania



tkanki przypominaj¹cej wewnêtrzn¹ warstwê skóry (dermis), któr¹ nastêpnie zamra-¿ano i stosowano jako opatrunki w leczeniu uszkodzeñ skóry. Zamra¿anie takiegoproduktu znacznie u³atwia³o jego dalsz¹ obróbkê.

Drugi z produktów skórnych jaki uda³o siê otrzymaæ zawiera³ nie tylko komórkiskóry w³aœciwej, ale tak¿e naskórka. W tym przypadku skórne fibroblasty zanurzonow kolagenowym ¿elu, wzbogaconym w czynniki wspomagaj¹ce wzrost komórek,który pokryto warstw¹ komórek naskórka – keratynocytów. Produkt taki implanto-wany w uszkodzone miejsce w skórze znacznie przyspiesza³ gojenie siê rany i stop-niowo by³ zastêpowany przez zregenerowan¹ skórê chorego. W procesie tym bior¹udzia³ czynniki wytwarzane przez zawarte w nim komórki skóry. Ponadto chroni onuszkodzone miejsce przed infekcj¹.

Fibroblasty, keratenocyty, jak równie¿ fragmenty tkanek pobiera siê do hodowliw warunkach sterylnych oraz przeprowadza siê ich badania w celu wykluczeniatych, które zainfekowane s¹ czynnikami chorobotwórczymi. Nie mog¹ byæ one tak-¿e toksyczne dla organizmu i wywo³ywaæ odpowiedzi uk³adu odpornoœciowego(18).

W efekcie próby uzyskania skóry ludzkiej poza organizmem zakoñczy³y siê zsyn-tetyzowaniem w roku 1997 pó³syntetycznej skóry – TransCyte, stosowanej do le-czenia oparzeñ, oraz Dermagraftu, wykorzystywanych w próbach klinicznych do lecze-nia wrzodów skóry u diabetyków. TransCyte stanowi polimerow¹ b³onê, na którejhodowane s¹ ludzkie fibroblasty. Dermagraft, podobnie jak TransCyte, otrzymanoz fibroblastów pochodz¹cych z ludzkiej skóry, które hodowano na odpowiednimrusztowaniu, utworzonym z porowatego materia³u bioabsorbuj¹cego. Z kolei z ko-mórek ludzkiej skóry oraz komórek nab³onkowych napletka utworzono sztuczn¹skórê, tzw. Apligraf, który zawiera komórki skóry w³aœciwej i naskórka, natomiastbrak w nim komórek uk³adu odpornoœciowego. Dlatego w trakcie leczenia nie wy-stêpuj¹ problemy z odrzuceniem przeszczepu (7,19,20). Stworzono tak¿e po³synte-tyczn¹ skórê o nazwie INTEGRA, gdzie jako pod³o¿e do hodowli komórek skóry wy-korzystano ¿el kolagenowy zawieraj¹cy siarczan chondroityny. Ponadto taki pro-dukt jest dodatkowo pokryty polimerow¹ b³on¹ zapobiegaj¹c¹ jego wysychaniuw trakcie leczenia (21). W dalszych badaniach nad hodowl¹ ludzkich komórek i tka-nek poza organizmem doprowadzono do stworzenia syntetycznej tkanki, o nazwieCorticel. Zawiera ona ludzkie chondrocyty, pobrane ze z³amanych koœci, które ho-duje siê na odpowiednim polimerowym pod³o¿u. Corticel planuje siê wykorzystaædo leczenia pêcherza moczowego, we wrodzonych defektach pêcherza u dziecii w chorobach nietrzymania moczu u doros³ych. Podobnym produktem jak Corticeljest Chondrogel, który stanowi mieszaninê autologicznych chondrocytów hodowa-nych na hydro¿elowym pod³o¿u. Preparaty te znajduj¹ siê obecnie w II lub III faziebadañ klinicznych (7), a próby ich produkcji podjêto w licznych firmach biotechnolo-gicznych na œwiecie (tab. 2).



T a b e l a 2

Preparaty produkowane przez firmy biotechnologiczne na potrzeby medycyny regeneracyjnej

Nazwa firmy biotechnologicznej Regenerowana tkanka / organ Produkt / nazwa produktu

tkanki i organy cz³owieka

Advanced Tissue Sciences (La Jolla, CA) skóra TransCyte, Dermagraft

Organogenesis (Canton, MA) skóra Apligraf

LifeCell (Branchburg, NJ) skóra Alloderm

GenzymeBioSurgery (Cambridge, MA) chrz¹stka Corticel

Curis (Cambridge) chrz¹stka Chondrogel (III faza badañ)

czynniki wzrostu

Human Genome Sciences (Rockville, MD) uk³ad krwionoœny i immunologiczny Repiferm (II faza badañ)

The Genetics Institute (Cambridge, MA) regeneracja koœci rhBMP-2 (I faza badañ)

Curis (Cambridge, MA) regeneracja koœci OP-1

komórki macierzyste

– badania przedkliniczne

Geron (Menio Park, CA) ró¿ne tkanki –

Layton Bioscience (Sunnyvale, CA) komórki nerwowe –

Aegera Therapeutics (Montreal, PQ, Kanada) skóra komórki macierzyste skóry

Ixion Biotechnologies (Alachua, FL) trzustka komórki macierzyste wysp trzustki

MorphoGen Pharmaceutical (SanDiego, CA) ró¿ne tkanki komórki pluripotencjalne („wielo-potencjalne”)

Cell Based Delivery (Providence, RI) serce komórki do regeneracji miêœnia ser-cowego

ksenotransplantacje

PPL Therapeutics (Edinburgh, UKoraz Blacksburg, VA)

– komórki i tkanki transgenicznych œwiñ

Biotransplant (Charlestown, MA) – komórki i tkanki œwiñ transgenicz-nych wolne od wirusów RERV

macierze i biomateria³y

do hodowli

Advanced Materials Design (New York) miêœnie i koœci polimery do hodowli miêœni i koœci

Interpore International (Irvine, CA) koœci ProOsteon – szkielety korali do ho-dowli koœci

Protein Polymer Technologies (SanDiego, CA) – rekombinowane polimery, hydro¿ele

Selective Genetics (SanDiego, CA) – macierze do przenoszenia DNA i in-nych zastosowañ

Jako pod³o¿e do hodowli komórek i tkanek cz³owieka najczêœciej stosuje siêpoza wspomnianymi ¿elami kolagenowymi i hydro¿elami zbudowanymi z cyklicz-nych dimerów kwasu mlekowego (polilaktyd):



– polimery kwasu glikolowego (poliglid);– polimery kwasu alginowego (algininian)oraz ró¿ne kopolimery;– np. polietylenoglikol-poliekaprolakton-polietylenoglikol (PEG-PCL-PEG) (22-26).Dodatkowym sk³adnikiem pod³o¿y s¹ bia³ka i czynniki wzrostu pochodz¹ce

z macierzy zewn¹trzkomórkowej tkanki ³¹cznej, krwionoœnej, nab³onka jelit (27-33).Doskona³ym pod³o¿em do wzrostu komórek skóry jest chitozan – polikationo-

wy biopolimer, otrzymany w wyniku N-deacylacji chityny. Chityna jako homopoli-mer jest zbudowana z N-acetyl-D-glukozoaminowych cz¹steczek po³¹czonych wi¹za-niami beta 1-4 glikozoaminowymi (31). Chitozan ulega biodegradacji i jest nietok-syczny dla cz³owieka i zwierz¹t.

Trójwymiarowe pod³o¿a porowate stosowane w hodowli tkankowej stanowi¹nie tylko rusztowanie do wzrostu komórek, ale równie¿ zapewniaj¹ im dostêp czyn-ników do tego niezbêdnych. Ponadto umo¿liwiaj¹ ró¿nicowanie siê komórek i ichorganizowanie siê w tkanki, sprzyjaj¹ rozwojowi naczyñ krwionoœnych i nie wy-wo³uj¹ reakcji immunologicznej.

Ostatnio do regeneracji z³amañ koœci próbuje siê tak¿e wykorzystaæ szkieletykorali lub g¹bek, wszczepianych w miejsce z³amania wraz z komórkami zrêbowymichorego, które wydzielaj¹ czynniki stymuluj¹ce proliferacjê i ró¿nicowanie siê ko-mórek kostnych, przyspieszaj¹c regeneracjê koœci. Koralowe protezy s¹ po kilku ty-godniach wch³aniane przez organizm cz³owieka i zastêpowane w³aœciwymi komór-kami buduj¹cymi koœci. Trójwymiarowe pod³o¿a utworzone ze szkieletów g¹bekczy w³ókien kolagenowych wykorzystano równie¿ jako „pu³apki” dla wektorów (pla-zmidowych lub wirusowych) zawieraj¹cych gen terapeutyczny – GAM (ang. gene ac-tivated matrix), oraz leków i bia³ek, wstrzykiwanych w miejsce, które ma byæ zrege-nerowane (34-37). Do przenoszenia leków oraz cz¹steczek DNA do komórek ssakówwykorzystuje siê tak¿e ich mikrokapsu³kowanie chitozanem. Wydajnoœæ przenosze-nia jest jednak bardzo niska i zale¿y od typu komórki (38). Z ró¿nymi sposobamiprzenoszenia leków i genów terapeutycznych do komórek mo¿na zapoznaæ siêw oddzielnym opracowaniu (3).

2.3. Pozyskiwanie komórek i tkanek do przeszczepów

Jeden z wa¿kich problemów w medycynie regeneracyjnej polega na pozyskaniudo przeszczepu odpowiednich komórek czy tkanek. �ród³em takich implantów s¹komórki i tkanki w³asne biorcy (autologiczne) (39-41) lub pobrane od dawcy wyka-zuj¹cego zgodnoœæ antygenów tkankowych z biorc¹ (przeszczepy allogeniczne) (42-44).Du¿e nadzieje, z uwagi na trudnoœci z pozyskaniem w³aœciwego przeszczepu, wi¹¿esiê z ksenotransplantacjami, czyli przeszczepianiem choremu cz³owiekowi komó-rek, tkanek i organów zwierzêcych. Tkanki zwierzêce do przeszczepu po raz pierw-szy wykorzystano w XVII w., kiedy ubytek koœci w czaszce cz³owieka zast¹piono



fragmentem koœci psa. Nastêpnie próbowano cz³owiekowi przeszczepiæ tak¿e skórê¿aby, nerki i serce szympansów, w¹trobê oraz komórki odpornoœciowe pawiana czyneurony œwini. Zabiegi te nie powiod³y siê w wyniku reakcji odrzucenia przeszcze-pu oraz infekcji. Najd³u¿ej w ciele cz³owieka utrzymywa³y siê przeszczepione neu-rony pobrane od œwini (do 7 miesiêcy), natomiast œwiñskie serce i nerki przeszcze-pione ma³pom – odpowiednio 35 i 78 dni (45-49). Z tego te¿ wzglêdu dla kseno-transplantacji wa¿ne znaczenie mog¹ mieæ zwierzêta transgeniczne.

Ostatnio du¿o uwagi poœwiêca siê genetycznie modyfikowanym œwiniom, którychkomórki pozbawione s¹ na powierzchni alfa 1,3 galaktozylo-galaktozy (6,50). Komór-ki takie uk³ad odpornoœciowy cz³owieka traktuje jako w³asne. Odrzucaniu przeszcze-pów mo¿e tak¿e zapobiec zidentyfikowanie na komórkach œwiñ innych specyficz-nych antygenów, rozpoznawanych przez ludzkie przeciwcia³a. Ich poznanie pozwolina wprowadzenie do genomu œwini genów, które u œwini zast¹pione bêd¹ ludzkimantygenem lub na ich wyeliminowaniu, wprowadzaj¹c np. niszcz¹ce je enzymy. Jed-nym ze sposobów zapobiegania odrzutom jest okrywanie przeszczepianych komó-rek lub tkanek syntetyczn¹ b³on¹, pó³przepuszczaln¹, przez któr¹ mog¹ przedosta-waæ siê do organizmu substancje przez nie produkowane w celu terapeutycznym, na-tomiast jest ona nieprzepuszczalna dla komórek uk³adu odpornoœciowego biorcy.W ten sposób komórki w¹trobowe cz³owieka (Hep G2), jak równie¿ œledziony, do-starczaj¹ce w³aœciwych enzymów, otoczono polimerem alginino-poliL-lizyny (ALP)przed ich wprowadzeniem do organizmu (51). Z kolei, do leczenia glejaka próbujesiê wykorzystaæ endostatynê. Jest ona produkowana przez komórki zarodkowe nerkicz³owieka, które otoczone ¿elem algininowym usieciowanym jonami wapnia wstrzyk-niêto do guza mózgu u szczura i wykazano znaczny spadek jego masy oraz regresjênowotworu (52). Komórki jajnika chomika (CHO, ang. chamster ovary cell), wydzie-laj¹ce apolipoproteinê E (apoE3), otoczone polimerem algininy z polilizyn¹ lub poli-etylenoimin¹, zamierza siê zastosowaæ do leczenia mia¿d¿ycy u ludzi (53). Polimeryte s¹ równie¿ wykorzystywane do mikrokapsu³kowania komórek zwierzêcych wy-twarzaj¹cych insulinê, w celu leczenia cukrzycy u ludzi (54,55). Innym ze sposobówzapobiegania odrzucaniu ksenotransplantów jest tworzenie chimerycznego uk³aduodpornoœciowego. Polega to na wprowadzeniu do organizmu cz³owieka komórekszpiku kostnego pobranego od zwierz¹t, odpowiednio przygotowanego. Ze szpikuusuwa siê przede wszystkim limfocyty T, krwinki czerwone oraz osocze. Dodatko-wym problemem przy ksenotransplantacjach s¹ endogenne wirusy, które w organi-zmach zwierzêcych nie wywo³uj¹ infekcji, natomiast po przeszczepie z ksenotrans-plantem mog¹ byæ przyczyn¹ silnego zaka¿enia u biorcy (56-58).

W tym przypadku istotne znaczenie ma produkowanie zwierz¹t transgenicznychwolnych od patogenów. Wa¿na jest tak¿e odpowiednia diagnostyka, pozwalaj¹ca naszybk¹ identyfikacjê patogenów u zwierz¹t i wyeliminowanie z ksenotransplantacjitych, które s¹ ich nosicielami.

Wiele emocji towarzyszy perspektywie zastosowania w medycynie regeneracyj-nej komórek macierzystych (59).



3. Komórki macierzyste

Komórki macierzyste s¹ to totipotencjalne komórki, zdolne do podzia³ów, samo-odtwarzania i ró¿nicowania siê w komórki ró¿nych tkanek organizmu. Wyró¿nia siêdwa ich rodzaje:

– zarodkowe, pierwotne komórki macierzyste – wystêpuj¹ce na etapie ¿yciap³odowego;

– komórki macierzyste tkanek – obecne w tkankach doros³ego organizmu cz³o-wieka (m.in. w szpiku, jelitach, naskórku, tkance nerwowej, krwi, siatkówce oka)oraz we krwi pêpowinowej.

Najmniej ukierunkowane s¹, a przez to maj¹ najwiêcej mo¿liwoœci ró¿nicowania,zarodkowe komórki macierzyste. W póŸniejszym okresie ¿ycia komórki macierzystewystêpuj¹ g³ównie w tych tkankach, w których istnieje potrzeba ci¹g³ego wytwarza-nia nowych komórek i regeneracji tkanek.

3.1. Zarodkowe komórki macierzyste

Zarodkowe komórki macierzyste – komórki ES (ang. embryonic stem cells) mo¿nauzyskaæ z wewnêtrznej masy komórek ICM (ang. inner cell mass) blastocysty podczasgastrulacji. Po wyizolowaniu ICM od reszty blastocysty mo¿na j¹ utrzymywaæ w od-powiednich po¿ywkach w niezró¿nicowanym stanie. Linie ludzkich komórek ES mo¿-na otrzymaæ poprzez selekcjê i namno¿enie indywidualnych kolonii ICM o jedno-rodnej i niezró¿nicowanej morfologii. Komórki ES pozostaj¹ diploidalne oraz zacho-wuj¹ swój zarodkowy i proliferacyjny charakter w czasie wielu podzia³ów komórko-wych w hodowli. Maj¹ one praktycznie nieograniczone zdolnoœci do samoodnowyi ró¿nicowania, bêd¹c prekursorami wszystkich linii komórkowych doros³ego orga-nizmu.

Zarodki potrzebne do wyhodowania komórek ES mo¿na pozyskaæ dwiema dro-gami: w wyniku zap³odnienia komórki jajowej plemnikiem poza organizmem –in vitro, lub metod¹ klonowania somatycznego. Klonowanie somatyczne wykonujesiê technik¹ transplantacji j¹der komórkowych. W tym przypadku do komórki jajo-wej, pozbawionej j¹dra komórkowego, wprowadza siê j¹dro z komórki somatycz-nej. Otrzymane obu sposobami zarodki hoduje siê wstêpnie na odpowiednich po-¿ywkach do stadium blastocysty, z której mo¿na nastêpnie izolowaæ wewnêtrzn¹masê komórek (ICM) do celów terapeutycznych (klonowanie terapeutyczne). Zarod-ki wyhodowane do stadium blastocysty w przypadku klonowania reprodukcyjnegowprowadza siê do macicy odpowiedniej matki biorczyni w celu ich dalszego rozwo-ju prenatalnego. Transfer j¹drowy umo¿liwia teoretycznie otrzymanie autologiczne-go Ÿród³a w³asnych komórek ES o pe³nej zgodnoœci immunologicznej, idealnych doterapii regeneracyjnej. We wstêpnych badaniach wykazano, ¿e izolowane z blasto-cyst komórki macierzyste hodowane in vitro maj¹ takie same antygeny uk³adu zgod-



noœci tkankowej jak komórki osobnika, od którego pochodzi³y j¹dra komórkowe.Stwarza to realn¹ szansê ich wykorzystania w przysz³oœci do celów terapeutycz-nych. Wydajnoœæ tego typu klonowania jest jednak bardzo niska, a koszty ca³ej pro-cedury bardzo wysokie. Na przyk³ad przy wykorzystaniu ok. 200 oocytów rozwijasiê najwy¿ej 30 blastocyst. Trudnoœci wynikaj¹ równie¿ ze sposobu pozyskiwaniasamych oocytów. Kobiety, dawczynie oocytów, poddawane s¹ silnej stymulacji hor-monalnej, która mo¿e byæ przyczyn¹ wielu schorzeñ w¹troby, udaru mózgu, a na-wet nowotworów. Do koñca nie wiadomo tak¿e jakie komórki s¹ optymalne do po-bierania j¹der komórkowych do transplantacji. Dodatkowym czynnikiem jest s³abopoznane piêtno genomowe, warunkuj¹ce prawid³owe ró¿nicowanie siê komóreki rozwój zarodka. Dlatego pod znakiem zapytania stoi jakoœæ otrzymywanych w tensposób komórek macierzystych. Ponadto klonowanie zarodków ludzkich budzi wie-le w¹tpliwoœci i problemów natury etycznej (2,59).

3.2. Komórki macierzyste tkanek

W odró¿nieniu od komórek zarodkowych, stosowanie komórek macierzystychuzyskiwanych od doros³ego cz³owieka w celach terapeutycznych spotyka siê z po-wszechn¹ akceptacj¹. Wiêkszoœæ tkanek, jak wspomniano, zawiera niewielk¹ liczbêniezró¿nicowanych komórek macierzystych, funkcjonuj¹cych jako komórki rodzi-cielskie dla bardziej wyspecjalizowanych komórek danej tkanki. Najlepiej poznanes¹ komórki macierzyste szpiku kostnego. Przeszczepianie szpiku jest szeroko sto-sowanym leczeniem w wielu schorzeniach uk³adu krwiotwórczego. Do niedawna s¹-dzono, ¿e ró¿nicowanie siê komórek jest procesem nieodwracalnym. W ostatniejserii odkryæ podwa¿a siê jednak ten pogl¹d, wykazuj¹c, ¿e niektóre populacje ko-mórek mog¹ siê ró¿nicowaæ w komórki swoiste dla innych tkanek. Tak na przyk³adz komórek szpiku kostnego uda³o siê otrzymaæ tak ró¿norodne komórki, jak: neuro-ny, hepatocyty, komórki miêœnia sercowego czy miêœni szkieletowych (60).

Chocia¿ wiêkszoœæ badañ prowadzi siê obecnie nad komórkami macierzystymiszpiku kostnego (g³ównie krwiotwórczymi i mezenchymalnymi), du¿ym zaintereso-waniem ciesz¹ siê równie¿ komórki macierzyste innych tkanek (m.in. miêœni szkiele-towych, tkanki nerwowej oraz uzyskane z krwi pêpowinowej). Spoœród komórek ma-cierzystych tkanek najbardziej pierwotne s¹ komórki macierzyste krwi pêpowino-wej. Do ich zalet nale¿y te¿ niskie ryzyko zanieczyszczenia patogenami i wyst¹pieniareakcji immunologicznej oraz mo¿liwoœæ pobrania bez ryzyka dla dawcy. Z tegowzglêdu próbuje siê leczyæ nimi bia³aczki oraz niektóre inne choroby nowotworowe,a tak¿e anemiê aplastyczn¹ i sierpowat¹ oraz ciê¿kie niedobory odpornoœci. G³ówn¹wad¹ krwi pêpowinowej jest stosunkowo niska liczba otrzymywanych z niej komó-rek macierzystych, co utrudnia ich zastosowanie w leczeniu (60-63).



3.3. Wykorzystanie komórek macierzystych w terapii chorób cz³owieka

Mimo ¿e nasza wiedza dotycz¹ca rozwoju i ró¿nicowania siê komórek macierzy-stych jest niewystarczaj¹ca, w wielu klinikach na ca³ym œwiecie, w tym tak¿e w Pol-sce, przeprowadza siê ju¿ zabiegi, które maj¹ na celu regeneracjê miêœnia sercowe-go z udzia³em tych komórek (64). Nie ma jednej procedury, ani nawet jednegookreœlonego typu komórek stosowanych ogólnie; nikt nie potrafi te¿ do koñcawyjaœniæ, na czym polega ich terapeutyczne dzia³anie.

Komórki miêœnia sercowego nie dziel¹ siê, dlatego obumar³e w wyniku zawa³ulub choroby wieñcowej serca nie s¹ zastêpowane nowymi i tworz¹ tkankê nekro-tyczn¹. Obecnie stosowane s¹ dwie g³ówne metody terapii komórkowej serca: bez-poœrednie wstrzykiwanie komórek macierzystych do serca oraz podawanie lekówpowoduj¹cych namna¿anie siê komórek macierzystych w szpiku i ich przekazywa-nie do krwiobiegu chorego (m.in. G-CSF, stosowany równie¿ w Polsce) (65,66).

W innej proponowanej terapii komórkowej pacjentom próbuje siê wszczepiæ douszkodzonego miêœnia sercowego niedojrza³e komórki jego w³asnych miêœni szkie-letowych. W przeciwieñstwie do miêœnia sercowego, miêœnie szkieletowe maj¹ zdol-noœæ odnowy po uszkodzeniu, poniewa¿ posiadaj¹ komórki prekursorowe – mio-blasty. Terapia komórkowa z u¿yciem mioblastów by³a poprzedzona kilkunastolet-nimi badaniami nad zwierzêtami i zapowiada³a siê obiecuj¹co. Po zastosowaniu tejterapii u ludzi nastêpowa³a poprawa kondycji miêœnia sercowego. W kilku przypad-kach stwierdzono jednak, ¿e we wczesnym okresie pooperacyjnym wyst¹pi³a aryt-mia serca. Istniej¹ przypuszczenia, ¿e komórki pochodz¹ce z miêœnia szkieletowegomog¹ mieæ inny rytm kurczenia siê w stosunku do komórek serca (64,66-68).

Ze wzglêdów etycznych, w leczeniu pozawa³owym nie stosuje siê ludzkich za-rodkowych i p³odowych komórek macierzystych, jakkolwiek w modelach zwierzê-cych daj¹ one obiecuj¹ce wyniki. Wobec dostêpnoœci ró¿nych komórek ksenoge-nicznych oraz mniejszych zagadnieñ natury etycznej towarzysz¹cych ich zastosowa-niu, alternatywnym podejœciem w regeneracji miêœnia sercowego mo¿e byæ kseno-transplantacja komórkowa. W tym przypadku g³ówn¹ przeszkod¹ jest jednak odpo-wiedŸ uk³adu odpornoœciowego przeciw przeszczepowi, i aby temu zapobiec ko-niecznoœæ zastosowania immunosupresji (61).

Zastosowanie komórek macierzystych nie ogranicza siê do leczenia pozawa-³owego. Komórki te maj¹ bowiem potencjalnie zdolnoœæ regeneracji wszelkich tka-nek i narz¹dów. Terapiê komórkow¹ próbuje siê zastosowaæ pomocniczo w lecze-niu nowotworów (np. choroby Hodgkina) lub nawet jako podstawê leczenia prze-ciwnowotworowego (np. w z³oœliwym raku nerki) (69,70). Mezenchymalne komórkimacierzyste mog¹ byæ wszczepiane lokalnie, w celu wspomagania zrostu z³amanejkoœci, w leczeniu osteoporozy oraz w przeszczepach koœci (60,71). Z kolei komplek-sowa terapia genowo-komórkowa, z u¿yciem czynników neurotroficznych, jest jed-n¹ ze strategii stosowanych w celu regeneracji uszkodzeñ rdzenia krêgowego orazmózgu w licznych schorzeniach neurodegeneracyjnych (np. choroba Parkinsona,



Alzheimera, stwardnienie rozsiane) (71). Prowadzone s¹ tak¿e intensywne badanianad sposobem regeneracji wysp trzustkowych uszkodzonych u chorych z cukrzyc¹(72).

Komórki macierzyste maj¹ niew¹tpliwie ogromny potencja³ terapeutyczny i bêd¹odgrywaæ znacz¹c¹ rolê w medycynie przysz³oœci. Zanim jednak bêdziemy mogliw pe³ni korzystaæ z ich mo¿liwoœci, nale¿y wykonaæ jeszcze wiele podstawowychbadañ.

4. Biotechnologia w medycynie reprodukcyjnej

Rozwój biologii molekularnej, genetyki oraz technik zap³odnienia in vitro stwo-rzy³ tak¿e mo¿liwoœci otrzymywania nowych organizmów na drodze klonowania.W wielu badaniach wskazuje siê jednak, ¿e klonowane zarodki ssacze mog¹ byæobarczone licznymi wadami. Wady te mo¿na wykryæ stosuj¹c przedimplantacyjn¹diagnostykê genetyczn¹ PGD (ang. preimplantation genetic diagnosis) klonowanych za-rodków. Dziêki tej metodzie mo¿liwe jest sprawdzenie, czy w zarodku nie wystêpuj¹wady genetyczne, jeszcze przed wprowadzeniem go do macicy przysz³ej matki (75).Szczególnie wa¿ne jest to w klonowaniu reprodukcyjnym dla par obarczonych wro-dzonymi anomaliami chromosomowymi i chorobami genetycznymi (76). PGD mo¿ete¿ okazaæ siê pomocna dla starszych kobiet planuj¹cych macierzyñstwo, u którychznacznie zwiêkszone jest ryzyko wyst¹pienia w oocytach aneuploidii chromosomo-wej (76). W ostatnio przeprowadzonych badaniach wskazuje siê, ¿e metoda ta po-zwala tak¿e na wykrycie dziedzicznych predyspozycji do zapadania na nowotwory,na przyk³ad zwi¹zanych z mutacj¹ genu supresora nowotworów – p53 (76).

Pe³en cykl PGD obejmuje kilka etapów. Pierwszym jest wywiad genetyka klinicz-nego z przysz³ymi rodzicami i przeprowadzenie odpowiednich badañ ich DNA, wy-izolowanego z komórek krwi obwodowej. Badanie to umo¿liwia ustalenie stopnia ry-zyka obci¹¿enia schorzeniem genetycznym przysz³ego potomstwa badanej pary. Ko-lejnym krokiem jest pobór oocytów od kobiety poddanej hiperstymulacji hormonal-nej i ich zap³odnienie poza ustrojem. Aktualnie stosowane s¹ dwie techniki wspo-maganego rozrodu. Pierwsza z nich zwana IVF (ang. in vitro fertilization) polega nazap³odnieniu komórki jajowej plemnikiem w warunkach in vitro, odpowiadaj¹cychœrodowisku naturalnemu. Druga z metod ICSI (ang. intracytoplasmic sperm injection) tobezpoœrednie wprowadzenie plemnika do cytoplazmy komórki jajowej. W metodzietej pominiête zostaj¹ procesy zwi¹zane z zap³odnieniem takie jak kapacytacja, reak-cja akrosomalna, czy reakcja os³onki przejrzystej. W obu przypadkach trzeciego dniapo zap³odnieniu, kiedy zarodki osi¹gaj¹ wielkoœæ 8-12 komórek, pobiera siê z nich,metod¹ mikromanipulacji, jedn¹ lub dwie komórki, w celu wykonania analiz gene-tycznych. Zarodki tymczasem dalej rozwijaj¹ siê w inkubatorze. Pobranie jednej lubdwóch komórek zarodka na tym etapie rozwoju nie ma wp³ywu na jego ¿ywotnoœæ,tempo podzia³ów, czy rozwój do stadium blastocysty (74). Po wykonaniu testów ge-



netycznych wybierane s¹ te z zarodków, które nie maj¹ wad genetycznych i wprowa-dza siê je do macicy przysz³ej matki, maksymalnie po dwa z nich.

Obecnie PGD jest oferowana w ponad 20. krajach. Dziêki niej wykrywa siê znaczn¹liczbê defektów pojedynczych genów oraz aberracje chromosomowe (tab. 3). Mo¿liwejest tak¿e zbadanie p³ci zarodka, jeœli istnieje ryzyko choroby zwi¹zanej z p³ci¹ (2). Do-tychczas urodzi³o siê ponad 1000 zdrowych dzieci po zabiegach PGD, co poœredniopotwierdza skutecznoœæ i bezpieczeñstwo stosowanych procedur (77).

T a b e l a 3

Niektóre choroby dziedziczne wykrywane w preimplantacyjnej diagnostyce genetycznej PGD (2)

Choroba dziedziczna Nieprawid³owy gen Mutacja Metody detekcji

Autosomalna recesywna

mukowiscydoza transb³onowy regulator mu-kowiscydozy (CFTR)

delecja 3 nt �F508 w ekso-nie 10 genu CFTR

analiza heterodupleksów

choroba Tay-Sachsa heksoaminidaza A insercja 4 nt w eksonie 11 trawienie restrykcyjne; ana-liza heterodupleksów

zespó³ Lesch-Nyhana fosforybozylotransferaza hi-poksantyny (HPRT)

punktowa mutacja w ekso-nie 3

trawienie restrykcyjne

�-talasemia �-globina ró¿ne

punktowa mutacja w ekso-nie 5

polimorfizm konformacjipojedynczej nici (SSCP);

allelospecyficzna hybrydyza-cja oligonukleotydów

rdzeniowy zanik miêœni(SMN, ang. spinal muscu-

lar atrophy)

kilka prawdopodobnych ge-nów

delecja eksonów 7 i 8-telo-merowej kopii SMN

trawienie restrykcyjne

Autosomalna dominuj¹ca

syndrom Marfana fibrilina (FBN1) nie wykryto mutacji RT-PCR

dystrofia miotoniczna kinaza bia³kowa miotoniny powtórzenia CTG i powi¹za-ny polimorfizm

elektroforeza w ¿elu i trawie-nie restrykcyjne

pl¹sawica Huntigtona huntingtina powtórzenia tripletowe fluorescencyjny PCR i anali-za automatyczna

rodzinna polipowatoœæ gru-czolakowata jelita grubego

APC insercja T w eksonie 15Bi powi¹zany polimorfizm

amplifikacja ca³ego genomupoprzez PEP, nastêpnie SSCP

Zwi¹zana z chromoso-

mem X recesywna

dystrofia miêœniowa Duchen-ne’a

dystrofina delecja eksonów 3-18 detekcja produktów eksonu17

Zwi¹zana z chromoso-

mem X dominuj¹ca

zespó³ kruchego chromoso-mu X

FMR1 powtórzenia CGG zmodyfikowany nested PCRi denaturuj¹cy ¿el sekwen-cyjny



W badaniach korzysta siê z metod biologii molekularnej, genetyki i biotechnolo-gii. Umo¿liwia to analizê kariotypów, identyfikowanie w nich zmian zarówno w licz-bie jak i strukturze chromosomów. Najczêœciej stosowan¹ technik¹ jest porównaw-cza hybrydyzacja genomowa CGH (ang. comparative genomic hybrydisation). W meto-dzie tej testowany DNA oraz DNA zdrowej komórki znakuje s¹ ró¿nymi fluorochro-mami, (np. czerwonym i zielonym), i hybrydyzuje z DNA chromosomów metafazo-wych z komórki prawid³owej. Analiza powsta³ych hybrydów pozwala na ocenêzmian w ca³ym zestawie chromosomów równoczeœnie (74,78).

W celu zbadania p³ci oraz wad chromosomowych w PGD stosowana jest równie¿metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ-FISH (ang. fluorescence in situ hybridisa-tion), z u¿yciem sond molekularnych znakowanych fluorochromami, specyficznychdla okreœlonych chromosomów lub sekwencji DNA na danym chromosomie (73). Dobadania mutacji w pojedynczych genach, odpowiadaj¹cych za powstawanie dzie-dzicznych chorób genetycznych, u¿ywana jest metoda ³añcuchowej reakcji polime-razy PCR (ang. polymerase chain reaction) wraz z analiz¹ heterodupleksów oraz SSCP(ang. single-strand conformation polymorphism) i RFLP (ang. restriction fragment lengthpolymorphism) (tab. 3).

Obecnie opisano prawie 600 chorób genetycznych (2).W przypadku choroby zwi¹zanej z chromosomem matczynym X, efekt fenotypo-

wy pojawia siê tylko u p³ci mêskiej (XY), natomiast zdrowe s¹ zarodki ¿eñskie,maj¹ce jeden prawid³owy allel ojcowski i drugi obarczony wad¹ genetyczn¹ od mat-ki (XX), jednak s¹ one nosicielami nieprawid³owego allelu. W takim przypadku domacicy przenoszone s¹ tylko zarodki p³ci ¿eñskiej.

Poznano tak¿e wiele chorób zwi¹zanych z nieprawid³ow¹ struktur¹ genów zlo-kalizowanych na chromosomach autosomalnych.

Pierwszym takim defektem genowym, który uda³o siê z sukcesem wykryæ, by³atrójnukleotydowa delecja �F508 w eksonie 10. genu koduj¹cego bia³ko kana³u chlor-kowego komórek nab³onkowych – CFTR (ang. cystic fibrosis transmembrane regula-tor), bêd¹cego przyczyn¹ najczêstszej choroby autosomalnie recesywnej – muko-wiscydozy (tab. 3). Metod¹ u¿yt¹ w tym przypadku by³a analiza heterodupleksów(74).

Diagnostykê przedimplantacyjn¹ nale¿y odró¿niæ od konwencjonalnych badañprenatalnych, podczas których badania genetyczne wykonuje siê na komórkach p³o-du pobranych wraz z p³ynem owodniowym podczas zabiegu amniocentezy dopierooko³o 15. tygodnia ci¹¿y lub z komórek pobranych z kosmków kosmówki CVS (ang.chorionic villus sampling) oko³o 11. tygodnia (2). Uwa¿a siê, ¿e dziêki PGD wiele parmo¿e unikn¹æ dylematów i cierpieñ wywo³anych trudn¹ decyzj¹ przerwania lub po-zostawienia zaawansowanej ci¹¿y, gdzie u p³odu wykryto wadê genetyczn¹. Prze-dimplantacyjna diagnostyka genetyczna wzbudza jednak wiele w¹tpliwoœci etycz-nych. Chrzeœcijanie uwa¿aj¹, ¿e ¿ycie ludzkie rozpoczyna siê w chwili zap³odnienia,st¹d niedopuszczalne jest odrzucanie zarodków, nawet tych z wykryt¹ wad¹ gene-tyczn¹. W wielu krajach europejskich sugeruje siê, ¿e technika ta mo¿e byæ u¿yta



w celach eugenicznych. Prowadzi to do uchwalania restrykcyjnych aktów prawnychi moratoriów na u¿ycie PGD (61,74).

Innymi czynnikami ograniczaj¹cymi rozwój PGD s¹ wysokie koszty przeprowa-dzenia zap³odnienia in vitro oraz stosunkowo niski wspó³czynnik ci¹¿ po transferzeprawid³owych zarodków do macicy (61). Wydaje siê jednak, ¿e rozwój przedimplan-tacyjnej diagnostyki genetycznej bêdzie postêpowa³ wraz z coraz wiêkszym jej upo-wszechnieniem oraz zwiêkszeniem liczby centrów, w których mo¿e byæ wykonywa-na, przez co ma szansê staæ siê alternatywnym podejœciem do diagnostyki prenatal-nej (74,79).

5. Uwagi koñcowe

Postêp w rozwoju metod biotechnologii oraz in¿ynierii genetycznej, zabiegi ge-netyczne na oocytach, jak równie¿ mo¿liwoœci ich zap³odnienia pozaustrojowegostworzy³y tak¿e podstawy do podjêcia prób nad klonowaniem komórek cz³owieka.Badania takie ze wzglêdów etycznych budz¹ du¿y sprzeciw spo³eczny i wiele krajówzabroni³o prawnie ich prowadzenia. Mimo to w kilku krajach próby takie, w celu po-zyskania nie tylko ludzkich komórek macierzystych do celów terapeutycznych, alerównie¿ w celach reprodukcyjnych, by³y podejmowane.

Dlatego wa¿nym zagadnieniem dla medycyny regeneracyjnej sta³o siê poznanieczynników stymuluj¹cych komórki tkanek do samoodnowy oraz opóŸniaj¹ce processtarzenia siê organizmu cz³owieka. Jednym ze sposobów, jakie w tym celu próbujesiê wykorzystaæ, jest podawanie czynników, których produkcja zaczyna z wiekiemzanikaæ. W tym celu stosuje siê ludzki hormon wzrostu, insulinopodobny czynnikwzrostu, zastêpcz¹ terapiê hormonaln¹ dla kobiet, jak równie¿ podawanie testoste-ronu i jego pochodnych.

Mimo ogromnego postêpu biotechnologii w medycynie, wiele tkanek i narz¹-dów cz³owieka nie da siê jednak usprawniæ z u¿yciem opisanych metod, tote¿ po-mocne s¹ w tym przypadku sztuczne implanty. O ile jednak z du¿ym powodzeniemstosuje siê sztuczne têtnice z poliestru czy endoprotezy z tytanu lub ceramiki, tozast¹pienie implantami w¹troby b¹dŸ œledziony jest niemo¿liwe. W sytuacjach ta-kich uszkodzone narz¹dy bêdzie mo¿na, zapewne, w przysz³oœci odbudowaæ, sto-suj¹c podawanie komórek macierzystych. Niewykluczone, ¿e w podobny sposób zo-stanie podjêta regeneracja tak¿e innych narz¹dów i tkanek.

Literatura

1. Chmiel A., (2002), Biotechnologia, 4, (59), 56-78.2. Illmensee K., (2002), Differentiation, 69, 167-173.3. Szala S., (2003), Terapia genowa, PWN, Warszawa.4. Stocum D. L., (2002), J. Musculoskelet. Neuronal Interact., 2(3), 270-273.



5. Petit-Zeman S., (2001), Nature Biotechnology, 3 (19), 201-206.6. Fodor W. L., (2003), Reprod. Biol. Endocrinol., 13 (1), 102-113.7. Mironov V., Visconti R. P., Markwald R. R., (2004), Expert Opin. Biol. Ther., 4(6), 73-81.8. Czy¿ J., Wobus A. M., (2001), Differentiation, 68, 167-174.9. Conconi M. T., Nico B., Mangieri D., Tommasini M., di Liddo R., Parnigotto P. P, Nussdoref G. G., Ri-

batti D., (2004), Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cel. Evol. Biol., 281(2), 1303-1307.10. Yamashita J., Itoh H., Hirashima M., Ogaw M., Nishikawa S., Yurugi T., Naito M., Nakao K., Nishika-

wa S., (2000), Nature, 2(408), 92-96.11. Obrêpalska-Stêplowska A., Durzyñski £., GoŸdzicka-Józefiak A., (2005), Postêpy Biochemii, 1(51),

69-79.12. Knematsu A., Yamamoto S., Ozeki M., Noguchi T., Kanatani I., Ogara T., Tabata Y., (2004), Biomate-

rials, 25 (18), 4513-4520.13. Salgado A. J., Coutinho O. P., Reis R. L., (2004), Macromol. Biosci., 4 (8), 743-765.14. Ripamonti U., Tasker J. R., (2000), Curr. Pharm. Biotechnol., (1), 47-55.15. Lipinski D., Jura J., Kalak R., Plawski A., Kala M., Szalata M., Jarmus M., Korcz A., S³omska K., Jura J.,

Gronek P., Smorag Z., Pienkowski M., S³omski R., (2003), J. App. Genet., 44(2), 165-174.16. Saito N., Takaoka K., (2003), Biomaterials, 24(13), 2287-2293.17. Nardelli B., Morahan D. K., Bomg G. W., Semenuk M. A., Kreider B. L., Garotta G., (1999), J. Leukoc.

Biol., 65(6), 822-828.18. Griffith L. G., Naughton G., (2002), Science, 295, 1009-1013.19. Eaglstein W. H., Falanga V., (1998), Adv. Wound Care, 11, 1-8.20. Bello Y. M., Falabella A. F., Eeaglstein W. H., (2001), Am. J. Clin. Dermatol., 2(5), 305-313.21. Kremer M., Lang E., Berger A. C., (200), Br. J. Plast. Sur., 5396, 459-465.22. Kim J. H., Bac Y. H., (2004), Eur. J. Pharm. Sci., 23(3), 245-251.23. Hwang M. J., Suh J. M., Bac Y. H., Kim S. W., Jeony B., (2005), Biomacromolecules, 6(2), 885-890.24. Najafi F., Sarbolouki M. N., (2003), Biomaterials, 24(7), 1175-1182.25. Chu C. R., Coutts R. D., Yoshioka M., Harwood F. L., Monosow A. Z., Amiel D., (1995), J. Biomater.

Res., 29 (9), 1147-1154.26. Takezawa T., Ozaki K., Nitani A., Takabayashi Ch., Shimo-Oka T., (2004), Cell Transplant, 13,

463-473.27. Jeringan T. W., Croce M. A., Cagiannos C., Shell D. H., Handorf C. R., Fabian T. C., (2004), Ann.

Surg., 239(5), 733-738.28. Compton C. C., Butler C. E., Yannas I. V., Warland G., Orgill D. P., (1998), J. Invest. Dermatol.,

110(6), 908-916.29. Butler C. E., Yannas I. V., Compton C. A., Orgill D. P., (1999), Br. J. Plast. Surg., 52(2), 127-132.30. McDevitt C. A., Wildey G. M., Cutrone R. M., (2003), J. Biomed. Mater. Res. A., 67(2), 637-640.31. Berger J., Reist M., Mayer J. M., Felt O., Gurny R., (2004), Eur. J. Pharm. Biopharm., 57(1), 35-52.32. Haque T., Chen H., Ouyang W., Martoni C., Lawuyi B., Urbanska A. M., Prakash S., (2005), Mol.

Pharm., 2(1), 29-36.33. Varshosaz J., Sadrai H., Alingari R., (2004), J. Microencapsul., 21(7), 761-774.34. Pratt A. B., Weber F. E., Schmoekel H. G., Muller R., Hubbell J. A., (2004), Biotechnol. Bioeng., 86(1),

27-36.35. Tieliewuhan Y., Hirata I., Sasaki A., Minagi H., Okazaki M., (2004), Dent Mater J., 23(3), 258-264.36. Gu D. L., Nguyen T., Gonzalez A. M., Printz M. A., Pierce G. F., Sosnowski B. A., Phillips M. L., Chan-

dler L. A., (2004), Mol. Ther., 9(5), 699-711.37. Backstrom K. C., Bertone A. L., Wisner E. R., Weisbrode S. E., (2004), Am. J. Vet. Res., 65(9),

1223-1232.38. Daston T., Turank K., (2004), J. Pharm Sci., 7(2), 205-214.39. Grande D. A., Pitman M. J., Peterson L., Menche D., Klein M., (1999), J. Orthop. Res., 7, 208-218.40. King P. J., Bryant T., Minas T., (2002), J. Knee Sur., 15, 177-184.41. Peterson L., Brittberg M., Kiviranta J., Akerlund E. L., Lindahl A., (2002), Am. J. Sports. Med., 30,

2-12.



42. Pereti G. H., Caruso E. M., Randolph M. A., Zaleske D. J., (2001), J. Orthop. Res., 19, 278-285.43. Briscoe D. M., Dharnidharka V. R., Isaacs C., Downing G., Prasky S., Shew P., Parentean N. L., Hardin

Young J., (1999), Transplantation, 67, 1590-1599.44. Watanabe T., Kawano Y., Watanabe A., Tahane Y., (1999), Haematology, 7, 137-143.45. Moscos I., Hermida-Prieto M., Manez R., Lopez-Pelaez E., Centeno A., Diaz T. M., Domenech N.,

(2005), Transplantation, 29(7), 777-782.46. Platt I. J., (2000), Transpl. Int. Suppl., 1.S, 7-10.47. Dai Y., Vaught T. D., Booke J., Chen S. H., Phelps C. J., Ball S., Monahan J. A., Jobst P. M., McCreath

K. J., Lambom A. E., Cowell-Lucero J. L., Wells K. D., Odman A., Polejaeva I. A., Agares D. L., (2002),Nature Biotechnol., 20, 251-255.

48. Fodor W. L., Williams B. L., Matis L. A., Madri J. A., Rollins S. A., Knight J. W., Velander W., (1994),Proc. Natl. Acad. Sci., 94, 11153-11157.

49. Lai L., Kolberg-Simonds D., Park K. W., Cheong H. T., Greenstein J. L., Im G. S., Samuel M., Bonk A.,Murphy C. N., Carter D. B., Hawley R. J., Prather R. S., (2002), Science, 295, 1089-1092.

50. Yu L., Miao H., Guol L., (2005), DNA Cell Biol., 24 (3) 180-188.51. Aoki T., Umekara Y., Ferraresso C., Sugiyama N., Middleton Y. A., Inderbritzin D., Demetrion A. A.,

Rozga J., (2002), Cell Transplant., 11(6), 553-561.52. Bjerkvig R., Read T. A., Vajkoczy P., Aebiscer P., Pralony W., Pratt S., Melvik J. E., Hagen A., Dornish

H., (2002), Acta Neurochir. Suppl., 88, 131-141.53. Tagalakis A. D., Diakonov J. A., Graham I. R., Heald K. A., Harris J. D., Mulcaty J. V., Dickson G.,

Owen J. S., (2005), Biochim. Biophys. Acta, 1686(3), 190-199.54. Schaffellner S., Stadlbauer V., Stiegler P., Hauser D., Halwachs G., Lackner C., Iberer F., Tsche-

liessnigy K. H., (2005), Transplant. Proc., (3791), 248-252.55. Or³owski T. M., Godlewska E., Tarchalska M., Kiniasiewicz J., Antosiak M., Sabbat M., (2005), Arch.

Immunol. Ther. Exp., 53(2), 180-184.56. Levy M. F., Crippin J., Sutton S., Netto G., McCormack J., Curiel T., Goldstein R. M., Newman J., Dia-

mond L. E., Byrne G., Logan J., Klintmalm G. B., (2000), Transplantation, 69, 272-280.57. Switzer W. M., Steinhoff G., Kiessig V., Chikobava M., Anssar M., Morschheuser T, Lapin B., (1998),

Transpl. Int., 11, 247-251.58. Martin V., Steinhoff G., Kiessig V., Chikobava M., Anssar M., Morschheuser T., Lapin B., (1998),

Transpl. Int., 11, 247-251.59. Malcom R. A., Poulsom R., Forbes S., Wright N. A., (2002), J. Pathol., 197, 419-423.60. Sylvester K. G., Longaker M. T., (2004), Arch. Surg., 139, 93-99.61. Xia Y., Min J., Morgan J. P., (2004), Annals Thor. Surg., 77, 737-744.62. Kyba M., Daley G. Q., (2003), Exp. Hematology, 31, 994-1006.63. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson S. M., Li B., Pickel J., McKay R., Nadal-Ginard

B., Bodine D. M., Leri A., Anversa P., (2001), Nature, 410, 701-701.64. Siminiak T., Kurpisz M., (2003), Circulation, 108, 1167-1171.65. Balsam L. B., Wagers A. J, Christensen J. L, Kofidis T., Weissman I. L, Robbins R. C., (2004), Nature,

428, 668-673.66. Murry C. E., Soonpaa M. H., Reinecke H., Nakajima H., Nakajima H. O., Rubart M., Pasumarthi K. B.,

Virag J. I., Bartelmez S. H., Poppa V., Bradford G., Dowell J. D., Williams D. A., Field L. J., (2004), Na-ture, 428, 664-668.

67. Chien K. R., (2004), Nature, 428, 607-608.68. Couzin J., Vogel G., (2004), Science, 304, 192-194.69. Schmitz N., Sureda A., (2004), Semin. Oncol., 31, 27-32.70. Fishman M. N., Antonia S. J., (2003), Expert Rev. Anticancer Ther., 3(6) 837-849.71. Gamradt S. C., Lieberman J. R., (2003), Clin Orthop., 417, 183-194.72. Hendriks W. T., Ruitenberg M. J., Blits B., Boer G. J., Verhagen J., (2004), Prog. Brain Res., 146,

451-476.73. Soria B., (2001), Differentiation, 68, 205-219.74. Brown K., (2001), Genomy, Wyd. Nauk. PWN, Warszawa.



75. Handyside A. H., Delhanty J. D., (1997), Trends Genet., 13(7), 270-275.76. Kuliev A., Verlinsky Y., (2003), Curr. Opin. Obstet. Gynecol., 15(3), 233-238.77. Rechitsky S., Verlinsky O., Chistokhina A., Sharapova T., Ozen S., Masciangelo C., Kuliev A., Verlin-

sky Y., (2002), Reprod. Biomed. Online, 5(2), 148-155.78. Wells D., Sherlock J. K., Handyside A. H., Delhanty J. D. A., (1997), Nucleic Acids Res., 27(4),

1214-1218.79. Kuliev A., Verlinsky Y., (2004), Reprod. Biomed. Online, 8(2), 229-235.80. Kuliev A., Verlinsky Y., (2002), Reprod. Biomed. Online, 5(3), 294-299.



biotechnologia w medycynie regeneracyjnej i reprodukcyjnej

Documents