Biosynthesis and utilization of gamma-polyglutamic acid in natto, soybeans fermented by Bacillus subtilis

Asam gamma- polyglutamic ( PGA ) , sebuah polimer asam amino yang terdiri dari D - dan asam L -glutamat dipolimerisasi melalui obligasi gamma - glutamil , merupakan konstituen utama dari bahan lengket di natto , makanan tradisional Jepang yang terbuat dari kacang kedelai yang telah dikukus dan kemudian difermentasi oleh Bacillus subtilis . Karena PGA merupakan polimer yang larut dalam air dan biodegradable , pemanfaatannya di bidang makanan, kosmetik , atau obat-obatan telah diusulkan dan serat biodegradable dan hidrogel telah dibuat dari PGA . Dalam pertemuan itu , saya menyebutkan karakterisasi enzim yang terlibat dalam biosintesis PGA dan degradasi . Gen-gen yang diperlukan untuk produksi PGA diklon dari B. subtilis IF016449 , strain terisolasi dari natto . Ada empat frame membaca terbuka di kloning 4.2 - kb fragmen DNA , dan mereka hampir identik dengan yang di gen ywsC dan ywtABC B. subtlis 168 . Analisis blot Utara menunjukkan bahwa empat gen merupakan suatu operon . Tiga gen , ywsC , ywtA dan ywtB , terganggu untuk menentukan gen memainkan peran sentral dalam PGA biosintesis . Tidak PGA telah diproduksi dalam ywsC dan strain ywtA -cacat , menunjukkan bahwa kedua gen yang penting untuk produksi PGA . Untuk memperjelas fungsi dari protein YwsC , histidin - tag YwsC diproduksi di strain ywsC -cacat dan dimurnikan dari lisat lisozim yang diobati dari transforman dengan kromatografi afinitas Ni - NTA . Analisis Western blot menunjukkan bahwa protein YwsC terdiri dari dua subunit , 44 - K dan protein 33 - K , yang dikodekan oleh tumpang tindih dalam gen ywsC . 14C - Berlabel PGA disintesis oleh protein dimurnikan dari 14C - L - glutamat dengan adanya ATP dan MnCI2 , melalui perantara asil - fosfat , yang menunjukkan bahwa gen ywsC mengkodekan PGA sintetase [ EC 6.3.2 ] , enzim penting dalam PGA biosintesis [ Urushibata , Tokuyama , dan Tahara , 2002 , J. Bacteriol , 184 : . 337-343 ) . The ywtD gen, yang mengkode enzim yang mendegradasi PGA , dikloning dari jenis yang sama . Gen ini terletak segera hilir ywsC dan ywtABC , dan itu menunjukkan kesamaan parsial gen coding untuk DL - endopeptidase , enzim peptidoglikan - merendahkan . Gen ywtD dimasukkan ke pET15b , dan plasmid rekombinan kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli . Histidin - tag YwtD dimurnikan dari sel sonicated dari transforman . The dimurnikan YwtD terdegradasi PGA untuk menghasilkan dua terhidrolisis .

Produk: Salah satunya adalah produk high- molekul - massa ( 490 kDa dengan hampir 100 % asam L-glutamat ) dan yang lainnya adalah produk - 11 kDa ( dengan D - dan asam L -glutamat dalam rasio 80:20 ) . Temuan ini dan hasil analisis enzimatik dari dua produk dengan carboxypeptidase G menunjukkan bahwa YwtD adalah enzim baru membelah gamma -mengenyangkan amyl ikatan hanya antara asam D - dan L -glutamat dari PGA , dan mungkin disebut gamma - DL glut amil hidrolase