Biomarcadores en el diagnóstico de trastornos de depósito lisosomal

BIOMARCADOR

TRASTORNO DEL DEPÓSITO LISOSOMAL

METABOLITOS SIMPLES

PROTEÍNAS COMPLEJAS

MOLÉCULAS SECRETADAS POR LA CÉLULA INVOLUCRADA

TRASTORNO DEL DEPÓSITO LISOSOMAL

ACUMULACIÓN DE METABOLITOS

CÉLULA RECICLAJE VIDA CELULAR

BIOSÍNTESIS DEGRADACIÓN

RIESGO

ENZIMAS LISOSOMAL

70 DIFERENTES ENFERMEDADES

TRASTORNO DEL DEPÓSITO LISOSOMAL

AFECTA 1 / 5000-10000 NACIDOS VIVOS

TDL

PRESENTA

FENOTIPO VARIABLE

DIFERENTE EDAD DE INICIO

VARIABILIDAD EN LA GRAVEDAD DE LOS SÍNTOMAS

DIFERENTE GRADO DE AFECCIÓN DEL SNC

FORMAS MÁS SEVERAS INFANTILES SNC NEUROPÁTICAS

FORMAS MÁS LEVES

MENORES

Y

ADULTOS

ENFERMEDAD

TDL

ENFERMEDAD DE POMPE a-GLUCOCIDASA ÁCIDA

ENFERMEDAD DE GAUCHER b-GLUCOCEREBROSIDASA

ENFERMEDAD DE FABRY a-GALACTOSIDASA A

ENFERMEDAD

GAUCHER

FABRY

POMPE

BIOMARCADORES

CORRECTA DOSIS DEL MEDICAMENTO

CORRECTO ENFOQUE

IMPORTANTE PARA EL DESARROLLO DEL FCO

EN USO DESDE HACE AÑOS

MOLECULAS QUE SE MIDEN EN

PLASMA

ORINA

LCR

MOLECULAS QUE SE ACUMULAN TEJIDOS

FLUIDOS

TRATAMIENTO

DISMINUIR LA CANTIDAD

EXCESIVA DE SUSTRATO

MAYOR DEGRADACION

DEL SUSTRATO MENOR PRODUCCIÓN

DEL SUSTRATO

TRANSPLANTE DE

CELULAS HEMATOPOYÉTICAS

TERAPIA DE

REEMPLAZO ENZIMÁTICO

ENDOCITOSIS

MEDIADA POR

LECTINAS INHIBICIÓN DE

ENZIMAS ESPECÍFICAS

TERAPIA DE REDUCCIÓN

DE SUSTRATO

GLUCOSILCERAMIDA SINTETASA

N-BUTILDEOXINOJIRIMICIN(MIGLUSTAT)

PREPARADOS ENZIMÁTICOS

GLUCOCEREBROSIDASA

MODIFICADA GLICANO PLACENTARIO

GLUCOCEREBROSIDASA

RECOMBINANTE

VEGETAL

TERAPIA GENICA

OBSTÁCULOS

EXPRESIÓN DE TRANSGENES TRANSITORIA

RESPUESTA INMUNOLOGICA

INDUCCIÓN DE TUMORES

Enfermedad de Gaucher

•Hay 3 fenotipos

•Tipo 1 : No neuropáticas: pueden presentar

trastornos neurológicos de ↓ gravedad

•Tipo 2 y 3 : Neuropáticas

Defecto 1:Deficiencia en la actividad enzimática

GLUCOCEREBROSIDASA LISOSOMAL

Acumula sustrato lípidico en los lisosomas de

macrófagos:

Glucoesfingolípidos

Glucoceramidas

Quitotrioxidasa

Anomalías en la permeabilidad de la piel con

consecuencias letales antes o después del

nacimiento.

Enfermedad de Gaucher tipo 1 •Edad de inicio y gravedad: variable

(Se han registrado algunos casos de regresión de la enfermedad espontánea)

•Síntomas característicos

Esplenomegalia con anemia y trombocitopenia

Hepatomegalia

Enfermedad del hueso

Resistencia a insulina

Anemia puede ocasionar:

Fatiga crónica

Trombocitopenia

↑ los tiempos de coagulación, llegando a

hemorragia

Dolores atípicos de los huesos que afecta la

calidad de vida

Necrosis avascular

Fracturas

Común en numerosos grupos étnicos

Frecuentes en judíos

1 c/15 pers. es portadora

1 de c/1ooo pers. presenta la enfermedad

Mutación + común: sustitución en gen que codifica al

AA N370

Heterocigotos se asocian al genotipo 1

Homocigotas se asocian al genotipo 2 y 3

No todos con síntomas clínicos significativos

Diagnostico para la enfermedad de Gaucher

Muestra: lisado de células y orina

Metodología:

Medir la disminución de la E. Glucocerebrosidasa Usando como fluorógeno 4-MLBG

Ac. Monoclonales específicos contra la E. Gluco. Humana detectada por Western Blot

E. Gluco.se encuentra en lisosomas de todas las células de tejidos

Los pacientes con esta enfermedad solo tienen

E.glucosilcerebrosidasa en los macrófagos

Se cree que el almacenamiento proviene de

factores exógenos de lípidos proveniente de células

sanguíneas

Morfología de los macrófagos: parecido a papel

arrugado debido a los cuerpos de inclusión

lisosomal..........células de Gaucher

Estos macrófagos son atacados por otros

macrófagos que eliminan sust. pre y post

inflamatorias

CITOQUINAS

QUIMIOCINAS

HIDROLASA

Desencadenante de las manifestaciones clinicas

Osteopenia

Gamapatias

Mielomas multiples

lipoproteinemias

DETECTABLE EN

PLASMA

Marcadores biologícos Tartrato resistente a fosfatasa ácida(TRAP)

Enzimas convertidoras de angiotensina(ACE)

Hexosamina

Lisosima

Ninguna es especifica y pueden solaparse con valores de pacientes normales......excepto....

Quitotriosidasa→ mayor capacidad para degradar al fluoroforo 4-MLBG

--Macrófagos

--Neutrófilos

De las prot. totales quitotriosidasa secreta 10%

Polimorfismos

Duplicación de 24 pb en el gen de quitotriosidasa

(normal12pb) produciendo ↓de la act. De la E.

1 c/3 pers. sanas llevan esta anomalía

1 c/20 pers. incluidos los enfermos son homocigotas para este rasgo

Sustitución de G102 con poca actividad catalítica hacia el fluóroforo 4-MLBG

El de quitotriosidasa tb.se encuentra en pacientes

con enfermedades lisosomales y no lisosomales

Sarcoidosis

Lepra

Artritis

Talasemia

Esclerosis múltiple

Por lo que se recurrió a la búsqueda de nuevos

marcadores...........

Quimiocinas PARC/CCL18:detectadas por

espectroscopía de masa y cuantificadas por ELISA

Los niveles plasmáticos son 10-40veces mayores

en pacientes sintomáticos

Los niveles en orina son proporcionales a los de

circulación por ser pequeñas y básicas

Proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP) 1 α y 1 β:

Estas quimiocinas están elevadas en plasma de pacientes sintomáticos con enfermedad de Gaucher.

Después de una Terapia de Reemplazo Enzimático (ERT) estos valores en plasma disminuyen.

El valor de MIP-1 β en plasma es utilizado como biomarcador en respuesta a la terapia.

Aplicaciones clínicas:

La medición de Quitotriosidasa se emplea como biomarcador en el diagnóstico de la enfermedad de Gaucher.

Niveles plasmáticos crecientes reflejan la acumulación en las células del paciente.

La utilidad de la medición de la actividad plasmática de Quitotriosidasa evalúa la eficacia del tratamiento.

Pacientes con alta gravedad clínica

Quitotriosidasa > a 20.000 nMol/mL/h

Pacientes con enfermedades menos graves, valores más bajos.

En el tratamiento con la suplementación de la enzima durante 12 meses:

• Promedio de reducción del 32%

• 78% de los pacientes presentaron disminución >15%.

Conclusión Vigilancia radiológica

(médula ósea y esqueleto)

Manejo clínico de pacientes con Gaucher Tipo I

Medición de niveles plasmáticos

(Quitotriosidasa y PARC/CCL18)

Biomarcadores Lípidicos: Aumento plasmático de la concentración de:

No se utiliza como marcador biológico ya que su aumento no es generalmente muy pronunciada.

GLUCOSILCERAMIDA Almacenamiento 1rio

de lípidos

Análisis Las técnicas de espectrometría

de masas permiten un análisis preciso de las proteínas en muestras de plasma y orina.

Recientemente para la cuantificación se han desarrollado métodos de cromatografía líquida de espectrometría de masas (LC-MS).

Enfermedad de Fabry:

Es un trastorno de depósito lisosomal hereditario ligado al cromosoma X, con deficiencias en la actividad en la enzima hidrolasa lisosomal: α- galactosidasa A.

Afecta más a los hombres que a las mujeres, se calcula que 1 en 40.000 varones tienen la enfermedad.

En pacientes varones con formas graves de la enfermedad, por lo general hay falta, muy reducida o completamente de la actividad enzimática.

Una variante leve de la enfermedad , con una actividad enzimática residual, se observó alteraciones cardíacas y hay poca o disfunción renal. Sin embargo muchas mujeres heterocigotas también muestran síntomas, que varía de acuerdo a la inactivación al azar del cromosoma X.

La deficiencia de α-galactosidasa A, resulta en la acumulación de sustratos glicoesfingolípidos en los lisosomas de células endoteliales , células epiteliales, y músculo liso del sistema vascular, así como las células epiteliales renales, las células del miocardio y las células del sistema nervioso autónomo.

La acumulación de glicoesfingolípidos contienen restos de α-galactosil como globotriosilceramida (Gb-3) y galabiosylceramida (Gb-2).

El Gb-3 no puede ser eliminado de las células y con el transcurso del tiempo se acumula y afecta el funcionamiento de las células, y puede conducir eventualmente a problemas que pueden causar la muerte.

Tratamiento:

Hay dos preparados de enzimas:

• Una enzima es producida por ovario de hámster chino: β-galactosidasa.

• Otra enzima es producida por cultivos de fibroblastos de piel humana: α-galactosida.

En pacientes sintomáticos hay un aumento de niveles circulantes de Proteína C Reactiva (PCR), de la mieloperoxidasa, metaloproteasa 9 y quitotriosidasa.

El concepto prevalente en la enfermedad de Fabry es una vasculopatía sistémica, debido al almacenamiento de Gb-3 en las células endoteliales.

Anormalidades de los lípidos como biomarcadores en la enfermedad

Fabry: • Se consideró a Gb3 ( globotriasilceramida) como marcador de la

enfermedad • Se encuentra elevado dentro de las células de almacenamiento,

como así también en plasma y orina. • En pacientes hemicigotos también Gb3 se encontraba elevado

en plasma y orina. • En mujeres portadoras Gb3 urinario es generalmente mayor,

pero los niveles plasmáticos tienden a estar en el rango normal. • Sus valores se cuantifican por medio de espectroscopía de

masa junto con HPLC • Su demostración ya sea en plasma u orina tienen gran valor

diagnóstico especialmente para mujeres portadoras de la mutación Gla.

• Luego se comprobó que los valores de Gb3 urinarios y plasmáticos no se correlacionaban bien con las manifestaciones clínicas, ni con los resultados terapéuticos.

• En los pacientes que carecían de la α-galactosidasa luego de la TRE desarrollaban Ac neutralizantes,Gb3 plasmático disminuían lo cual no está claro.

• En hemicigotos se demostró la acumulación de Gb3 en placenta demostrando que las complicaciones clínicas se producían luego de varios años de depósito.

• Las concentraciones de Gb3 en algunos niños presintomáticos exceden a la de adultos hemicigotas sintomáticos.

• Ausencia de manifestaciones clínicas en pacientes infantiles.

lysoGb3 o globotriosilesfingosina:

• Su concentración en plasma se encuentra muy elevada en los pacientes

hemicigotos y en portadoras, aunque en estas últimas los niveles de Gb3 estaban en límite del rango normal

• Ofreciendo de ésta forma una herramienta diagnóstica para pacientes femeninos.

• Luego por espectroscopía de masa se demostró la presencia de lysoGb3 en orina

• En el caso de los hemicigotos lysoGb3 plamático ya se encuentra aumentado en el nacimiento, por lo tanto no se correlaciona con las síntomas

• En el caso de las portadoras lysoGb3 es bajo al nacer y aumenta gradualmente con la edad

• Entonces se demuestra una cierta correlación de los niveles en las paciente portadoras y las manifestaciones de la enfermedad

• Valores altos de lysoGb3 indicarían un mayor riesgo cerebrovascular en pacientes hombres

• El tiempo de exposición de los niveles plasmáticos del lysoGb3 se correlacionan con la severidad de la enfermedad en hombres como en mujeres

• Esto sugiere, pero no prueba que lysoGb3 jugaría un papel directo en la patogénesis de la enfermedad de Fabry

• Estudios demostraron que lysoGb3 puede tener un papel en la lesión glomerular de la enfermedad, también es capáz de inducir la proliferación de células musculares lisas

• La TRE reduce de manera significativa los niveles plasmáticos de lysoGb3

Inhibodies

• Es una nueva herramienta para el diagnóstico y seguimiento terapéutico para las hidrolasas lisosomales

• Son sondas que tienen adosados una fracción fluorescente que inhibirían el suicidio mediante otra fracción compuesta por condutirol B-epoxido y ciclophellito

• Estas sondas anfifílicas penetran en las células facilmente, permiten monitorear glucocerebrosidasa en células y organismos enteros

• Esta enzimas pueden ser analizadas mediante geles visualizando su fluorescencia, son muy específicas

• Esta sondas pueden ser utilizadas con fines diagnósticos visualizando la glucocerebrosidasas en cultivos de fibroblastos de piel

• Se pretende aplicarlas de forma intravenosas para ver las distribución de la enzima en los tejidos, así como también por medio fluoróforo visualizar glucocerebrosidasa en pacientes

• Gracias a las inhibodies se puede obtener la información sobre la distribución exacta de la glucocerebrosidasa activa en tejido

• Quedan muchos aspectos por dilucidar de la glucocerebrosidasa, uno de ellos sería que se transporta a lisosomas independiente del receptor de manosa-6- fosfato

Resumen • La búsqueda de biomarcadores de la enfermedad de Gaucher

a sido muy productiva, se han encontrado elevaciones de glucosilceramida, gangliósidos como GM3, aumento de quitotriosidasa

• Quitotriosidasa y PARC/CCL18 que derivan de células de almacenamiento ayudan a la toma de decisiones clínicas en pacientes con la enfermedad de Gaucher

• La búsquedas de biomarcadores para la enfermedad de Fabry a sido relativamente decepcionante

• En general parece ser que Gb3 en muestra de orina y plasma sólo sería útil para el diagnóstico y no como herramienta sensible para monitorear la enfermedad de Fabry

• LysoGB3 sería un verdadero biomarcador en pacientes que padecen esta enfermedad y en portadoras sería importante para el diagnóstico.

Biomarcadores

• En el caso de los TDL, las anomalías bioquímicas pueden detectarse en sangre y orina, pero no por eso se deben llamar biomarcadores

• Este término se debe restringir para aquellas anomalías que sean específicas y se correlacionen con las manifestaciones clínicas de la enfermedad

• Ejemplos son proteínas o metabolitos derivados de las células de almacenamiento, como la quitotriosidasa que se utiliza para el monitoreo terapéutico.

Integrantes:

• Luna Curay, María

•Mollá, Cecilia Georgina

•Randazzo, Mariana

•Salvadore, Silvana

Muchas

Gracias !!!!!