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Biologia Strutturale: dai sincrotroni ai FEL
Roma, 22 aprile 2014
Francesco Stellato
I.N.F.N. – Sezione di Roma ‘Tor Vergata’
Biologia strutturale e radiazione X
Sincrotroni e FEL
Imaging con radiazione coerente
Cristallografia seriale: dai sincrotroni ai FEL e viceversa
Prospettive future
Luci di Sincrotrone
CNR – Roma, 22 Aprile 2014
Sommario
Biologia strutturale e radiazione X
1E+001E+031E+061E+091E+121E+151E+181E+211E+241E+271E+301E+331E+36
1880 1910 1940 1970 2000 2030
Year
Sourc
e P
eak B
rilli
ance
Röntgen
Bragg & Bragg
reflections
von Laue
crystal diffraction
Hodgkin
penicillin,
B12
Perutz & Kendrew
myoglobin Franklin,
Crick,
Watson
DNA
MacKinnon
Potassium
channel
Kornberg
RNA
polymerase
Jacobsen
Holography
Kirz &
Schmahl
Microscopy
Luci di Sincrotrone
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Sincrotroni e FEL
-Simile brillanza media, diversa brillanza di picco
1012 fotoni in ~0.05 μm2
Frequenza impulsi FEL: 100 Hz
-Diversa lunghezza degli impulsi: 10 -100 fs FEL
10-100 ps sincrotroni
-Piccola lunghezza d’onda: Fino a 10 keV FELs
Fino a 100 keV sincrotroni
Luci di Sincrotrone
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Diffrazione prima della distruzione
Pattern di diffrazione
Impulso FEL
Iniezione di particelle
Un impulso,
una misura
R. Neutze et al, Nature 406 (2000)
E’ necessario ottenere
un segnale sufficiente
prima che il campione
si distrugga
Luci di Sincrotrone
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Imaging con radiazione coerente
Diffrazione prima della distruzione
Primo impulso
Secondo Impulso
1 micron
Immagine SEM della struttura incisa
su una membrana di Si3N4
Chapman et al. Nature Physics (2006)
Immagine ricostruita
con risoluzione di 32 nm
1 micron
FLASH
Pattern di diffrazione Pattern di diffrazione
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Imaging con radiazione coerente
Ricostruzioni 2D – Campioni riproducibili e non
Mimivirus: uno dei virus più grandi
~500 nm diametro
200 nm
Impulso LCLS:
10 to 300 fs,1.8 keV (0.68 nm) Focalizzato a 7 μm 1016 W/cm2
Seibert et al. Nature 470 (2011)
Ricostruzione 2D
Luci di Sincrotrone
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Imaging con radiazione coerente
Ricostruzioni 3D – Campioni riproducibili
Tomografia X al sincrotrone
Uno (o pochi) campioni
Misure da diverse angolazioni
Temperatura criogenica Larabell et al. Mol Biol Cell (2004)
J. Miao, Hodgson, Sayre, PNAS 98 (2001)
Molti (106) campioni
Misure da angolazioni casuali
Temperatura ambiente
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Imaging con radiazione coerente
Misure analoghe possibili a
DiProI@FERMI
nel prossimo futuro
Yoon et al. Optics Express (2014)
Luci di Sincrotrone
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Cristallografia seriale
- Misura di pattern di diffrazione da
singoli cristalli (tipicamente >104)
- Indicizzazione di ciascun pattern
- Media dei fattori di struttura
- Metodi standard (e non) per la
fasazione
Studio di cristalli piccoli.
Studi risolti in tempo.
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
1972 1976 1980 1984 1988 1992 1996 2000 2004 2008
Electron
NMR
X-ray
Sono necessari cristalli
sufficientemente grandi
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Cristallografia seriale al FEL
Setup sperimentale
Chapman et al. Nature 470, (2011)
Struttura del Fotosistema I con
risoluzione di 7Å
(limitata dalla lunghezza d’onda
del FEL)
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Cristallografia seriale al FEL
Catapsina B
Proteina coinvolta nelle tripanosomiasi
Struttura della forma glicosilata ignota
Comparsa di cristalli
aghiformi in cellule
di insetto che over-
esprimono la
proteina
10
μm
Immagine SEM di
alcuni cristalli
purificati
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Cristallografia seriale al FEL
Pattern di diffrazione di un singolo
microcristallo di catapsina B Proiezione delle intensità misurate
su un piano dello spazio reciproco
Luci di Sincrotrone
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Cristallografia seriale al FEL
Struttura tridimensionale della
forma glicosilata della proteina
Redecke et al., Science
2013
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Applicazioni di drug-design
Cristallografia seriale – Sviluppi e Applicazioni
Misure pump-probe risolte in tempo Lipidic Cubic Phase su GPCR
Aquila et al. Optics Express 470 (2011) A breve Fotosistema I e II ad alta risoluzione
Liu et al. Science (2013) Johanssonn et al. Nature Methods (2012)
Sponge phase su centri di
reazione fotosintetici
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Scattering & spettroscopie
Emissione di raggi X (XES)
Assorbimento di raggi X (XAS)
Scattering a piccolo angolo (SAXS)
Scattering a grande angolo (WAXS)
Luci di Sincrotrone
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Cristallografia seriale al sincrotrone
La metodologia seriale ‘spinta’ può essere re-importata ai sincrotroni
500 patterns da microcristalli di
catapsina B a temperatura
criogenica
Gati et al., IUCrJ 2014
40,000 patterns di microcristalli di lisozima
a temperatura ambiente
Stellato et al., to be published
Riduzione del danno da radiazione
Misure a temperatura ambiente
Misure risolte in tempo
Luci di Sincrotrone
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Prospettive future
FEL con repetition rates più elevate (XFEL)
Sincrotroni con brillanza più elevata (ESRF, PETRA III)
Migliori sistemi di iniezione del campione
FEL con brillanza di picco più elevata Brillanze maggiori consentiranno di
spingersi verso l’imaging di singola
molecola ad alta risoluzione
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Prospettive future
avrà una
repetition rate
di 27 kHz
I sistemi di iniezione del campione
devono essere ottimizzati in funzione
della repetition rate della sorgente
E’ necessario un hardware in grado
di archiviare tipicamente 8 Mb x 106
pattern/ dataset = 8 Tb / dataset
Sono necessari computer paralleli in
grado di processare in tempo breve
questa mole di dati.
E’ necessario avere detector in
grado di registrare pattern di
diffrazione ad alta frequenza
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Grazie per l’attenzione
Contatti
Francesco Stellato
I.N.F.N. Sezione di Roma Tor Vergata
Via della Ricerca Scientifica, 1
Tel: 0039 06 7259 4284
Luci di Sincrotrone
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