Dott. Giorgio PorteraDott. Giorgio PorteraDott. Giorgio PorteraDott. Giorgio PorteraDipDipDipDip. di Biologia e Genetica per le . di Biologia e Genetica per le . di Biologia e Genetica per le . di Biologia e Genetica per le

Scienze MedicheScienze MedicheScienze MedicheScienze MedicheUniversitUniversitUniversitUniversitàààà degli Studi di Milanodegli Studi di Milanodegli Studi di Milanodegli Studi di Milano

““““Biologia e genetica di popolazioni in ambito Biologia e genetica di popolazioni in ambito Biologia e genetica di popolazioni in ambito Biologia e genetica di popolazioni in ambito forense, dalla tracciaforense, dalla tracciaforense, dalla tracciaforense, dalla traccia

biologica allo studio dei polimorfismi STR'sbiologica allo studio dei polimorfismi STR'sbiologica allo studio dei polimorfismi STR'sbiologica allo studio dei polimorfismi STR's””””

Laboratorio di Biologia ForenseLaboratorio di Biologia ForenseLaboratorio di Biologia ForenseLaboratorio di Biologia Forense

• Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,capellicapellicapellicapelli………….).).).)

• Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)

• Quantificazione (Quantificazione (Quantificazione (Quantificazione (rtrtrtrt----pcrpcrpcrpcr))))

• Amplificazione (Amplificazione (Amplificazione (Amplificazione (multiplexmultiplexmultiplexmultiplex))))

• Tipizzazione (310Tipizzazione (310Tipizzazione (310Tipizzazione (310----3130XL)3130XL)3130XL)3130XL)

PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA DINAMICA DELITTUOSADINAMICA DELITTUOSADINAMICA DELITTUOSADINAMICA DELITTUOSA

Tipologia dei repertiTipologia dei repertiTipologia dei repertiTipologia dei reperti

Vestiti con evidenti Vestiti con evidenti Vestiti con evidenti Vestiti con evidenti tracce ematichetracce ematichetracce ematichetracce ematiche

Vestiti con minime Vestiti con minime Vestiti con minime Vestiti con minime tracce ematichetracce ematichetracce ematichetracce ematiche

Ricerca di tracce ematiche da reperti Ricerca di tracce ematiche da reperti Ricerca di tracce ematiche da reperti Ricerca di tracce ematiche da reperti ripuliti dopo il crimineripuliti dopo il crimineripuliti dopo il crimineripuliti dopo il crimine

Indumenti usati per Indumenti usati per Indumenti usati per Indumenti usati per travisare il viso,investigati travisare il viso,investigati travisare il viso,investigati travisare il viso,investigati per la ricerca di saliva e per la ricerca di saliva e per la ricerca di saliva e per la ricerca di saliva e

residui epitelialiresidui epitelialiresidui epitelialiresidui epiteliali

Ricostruzioni parentali daRicostruzioni parentali daRicostruzioni parentali daRicostruzioni parentali da

resti cadaverici o osseiresti cadaverici o osseiresti cadaverici o osseiresti cadaverici o ossei

TEST GENERICI E DI SPECIETEST GENERICI E DI SPECIETEST GENERICI E DI SPECIETEST GENERICI E DI SPECIE

Utili nellUtili nellUtili nellUtili nell’’’’identificazione del tipo di fluido biologico in fase di identificazione del tipo di fluido biologico in fase di identificazione del tipo di fluido biologico in fase di identificazione del tipo di fluido biologico in fase di

ispezioneispezioneispezioneispezione

TEST GENERICITEST GENERICITEST GENERICITEST GENERICI

• comburcomburcomburcombur test test test test ���� sangue (test colorimetrico)sangue (test colorimetrico)sangue (test colorimetrico)sangue (test colorimetrico)

• amilasi amilasi amilasi amilasi ���� saliva (test colorimetrico)saliva (test colorimetrico)saliva (test colorimetrico)saliva (test colorimetrico)

• psapsapsapsa ���� sperma (sperma (sperma (sperma (immunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatografico))))

TEST DI SPECIE TEST DI SPECIE TEST DI SPECIE TEST DI SPECIE

• obti test: specifico per sangue di primate obti test: specifico per sangue di primate obti test: specifico per sangue di primate obti test: specifico per sangue di primate ((((immunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatografico))))

• semelogeninasemelogeninasemelogeninasemelogenina: specifico per sperma umano (proteina secreta in : specifico per sperma umano (proteina secreta in : specifico per sperma umano (proteina secreta in : specifico per sperma umano (proteina secreta in

vescicole seminali, vescicole seminali, vescicole seminali, vescicole seminali, immunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatografico))))

COMBUR TEST COMBUR TEST COMBUR TEST COMBUR TEST ---- ComburComburComburCombur3333 TestTestTestTest®®®®EEEE (ROCHE)(ROCHE)(ROCHE)(ROCHE)

Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine,

saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine

e eritrocitie eritrocitie eritrocitie eritrociti

sostanza: tetrametilbenzidinasostanza: tetrametilbenzidinasostanza: tetrametilbenzidinasostanza: tetrametilbenzidina

il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza

di attivitdi attivitdi attivitdi attivitàààà perossidasica dellperossidasica dellperossidasica dellperossidasica dell’’’’emoglobinaemoglobinaemoglobinaemoglobina

FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,

ruggine, ossidanti vari, ecc.ruggine, ossidanti vari, ecc.ruggine, ossidanti vari, ecc.ruggine, ossidanti vari, ecc.

COMBUR TEST COMBUR TEST COMBUR TEST COMBUR TEST ---- ComburComburComburCombur3333 TestTestTestTest®®®®EEEE (ROCHE)(ROCHE)(ROCHE)(ROCHE)

AMILASI TESTAMILASI TESTAMILASI TESTAMILASI TEST

test per diagnosi clinica della test per diagnosi clinica della test per diagnosi clinica della test per diagnosi clinica della pancreatitepancreatitepancreatitepancreatite acutaacutaacutaacuta

• sostanza: 2sostanza: 2sostanza: 2sostanza: 2----clorocloroclorocloro----4444----nitrofenolo legato a nitrofenolo legato a nitrofenolo legato a nitrofenolo legato a

maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce

con lcon lcon lcon l’’’’α----amilasi della saliva,in presenza di saliva si amilasi della saliva,in presenza di saliva si amilasi della saliva,in presenza di saliva si amilasi della saliva,in presenza di saliva si

colora di giallocolora di giallocolora di giallocolora di giallo

• FALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporeiFALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporeiFALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporeiFALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporei

AMILASI TESTAMILASI TESTAMILASI TESTAMILASI TEST

PSA TESTPSA TESTPSA TESTPSA TEST

• test per diagnosi clinica del tumore alla prostata, delltest per diagnosi clinica del tumore alla prostata, delltest per diagnosi clinica del tumore alla prostata, delltest per diagnosi clinica del tumore alla prostata, dell’’’’iperplasia iperplasia iperplasia iperplasia

prostatica benigna (prostatica benigna (prostatica benigna (prostatica benigna (bphbphbphbph) e delle infezioni alla prostata; saggio ) e delle infezioni alla prostata; saggio ) e delle infezioni alla prostata; saggio ) e delle infezioni alla prostata; saggio

immunologico semiquantitativo per la determinazione dellimmunologico semiquantitativo per la determinazione dellimmunologico semiquantitativo per la determinazione dellimmunologico semiquantitativo per la determinazione dell’’’’antigene antigene antigene antigene

specifico prostatico nel sangue, siero e plasmaspecifico prostatico nel sangue, siero e plasmaspecifico prostatico nel sangue, siero e plasmaspecifico prostatico nel sangue, siero e plasma

•sostanza: anticorpi sostanza: anticorpi sostanza: anticorpi sostanza: anticorpi antiantiantianti antigene antigene antigene antigene psapsapsapsa coniugati a oro colloidaleconiugati a oro colloidaleconiugati a oro colloidaleconiugati a oro colloidale

utilizzato per identificare tracce di spermautilizzato per identificare tracce di spermautilizzato per identificare tracce di spermautilizzato per identificare tracce di sperma

•falsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionafalsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionafalsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionafalsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionalililili

OBTI TEST OBTI TEST OBTI TEST OBTI TEST ---- HEXAGON OBTIHEXAGON OBTIHEXAGON OBTIHEXAGON OBTI (HUMAN) : anticorpi anticorpi anticorpi anticorpi antiantiantianti hbhbhbhb umani umani umani umani

coniugati a particelle coniugati a particelle coniugati a particelle coniugati a particelle cromogenecromogenecromogenecromogene (blu)(blu)(blu)(blu)

utilizzato per la diagnosi specie utilizzato per la diagnosi specie utilizzato per la diagnosi specie utilizzato per la diagnosi specie ---- specifico per il sangue dei primati specifico per il sangue dei primati specifico per il sangue dei primati specifico per il sangue dei primati

superiori.superiori.superiori.superiori.

TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (α-

semelogeninasemelogeninasemelogeninasemelogenina ,proteina secreta in vescicole seminali)proteina secreta in vescicole seminali)proteina secreta in vescicole seminali)proteina secreta in vescicole seminali)

TEST SPECIFICI TEST SPECIFICI TEST SPECIFICI TEST SPECIFICI

LAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPElampada con luce monocromatica a lunghezza dlampada con luce monocromatica a lunghezza dlampada con luce monocromatica a lunghezza dlampada con luce monocromatica a lunghezza d’’’’

onda variabile (415onda variabile (415onda variabile (415onda variabile (415----650 nm)650 nm)650 nm)650 nm)

Principio: differente emissione assorbimento tra Principio: differente emissione assorbimento tra Principio: differente emissione assorbimento tra Principio: differente emissione assorbimento tra fluidi biologici e substratifluidi biologici e substratifluidi biologici e substratifluidi biologici e substrati

SLIP con tracce di SLIP con tracce di SLIP con tracce di SLIP con tracce di spermaspermaspermasperma

FODERA di una giacca FODERA di una giacca FODERA di una giacca FODERA di una giacca con tracce di sudorecon tracce di sudorecon tracce di sudorecon tracce di sudore

Aree positive al Aree positive al Aree positive al Aree positive al test delltest delltest delltest dell’’’’AmilasiAmilasiAmilasiAmilasi

Aree luminescenti Aree luminescenti Aree luminescenti Aree luminescenti Crimescope C16Crimescope C16Crimescope C16Crimescope C16

22R

22 O

22Q

22N

22P

22I

22L

22M

Esempio di un reperto con numerose aree Esempio di un reperto con numerose aree Esempio di un reperto con numerose aree Esempio di un reperto con numerose aree luminescentiluminescentiluminescentiluminescenti

ESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNA

• FENOLOFENOLOFENOLOFENOLO----CLOROFORMIO CLOROFORMIO CLOROFORMIO CLOROFORMIO –––– solventi organici immiscibili con acqua: solventi organici immiscibili con acqua: solventi organici immiscibili con acqua: solventi organici immiscibili con acqua: si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella organicaorganicaorganicaorganica

• RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA –––– DNA affine alla DNA affine alla DNA affine alla DNA affine alla resina, rimane legato nella membrana della colonna, resina, rimane legato nella membrana della colonna, resina, rimane legato nella membrana della colonna, resina, rimane legato nella membrana della colonna, successivamente viene eluitosuccessivamente viene eluitosuccessivamente viene eluitosuccessivamente viene eluito

• RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE –––– stessa stessa stessa stessa chimica del precedente metodo, ma la resina chimica del precedente metodo, ma la resina chimica del precedente metodo, ma la resina chimica del precedente metodo, ma la resina èèèè libera in soluzione. libera in soluzione. libera in soluzione. libera in soluzione. Viene poi recuperata con un magnete e il DNA eluitoViene poi recuperata con un magnete e il DNA eluitoViene poi recuperata con un magnete e il DNA eluitoViene poi recuperata con un magnete e il DNA eluito

• RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del pHpHpHpH della della della della soluzionesoluzionesoluzionesoluzione

ESTRAZIONE CON ESTRAZIONE CON ESTRAZIONE CON ESTRAZIONE CON RESINA MAGNETICARESINA MAGNETICARESINA MAGNETICARESINA MAGNETICA

• metodo di estrazione del DNA che metodo di estrazione del DNA che metodo di estrazione del DNA che metodo di estrazione del DNA che ne sfrutta la carica negativane sfrutta la carica negativane sfrutta la carica negativane sfrutta la carica negativa

• metodica veloce e modulabile a metodica veloce e modulabile a metodica veloce e modulabile a metodica veloce e modulabile a seconda del tipo di traccia seconda del tipo di traccia seconda del tipo di traccia seconda del tipo di traccia ((((possibilitpossibilitpossibilitpossibilitàààà di aumentare il numero di aumentare il numero di aumentare il numero di aumentare il numero dei lavaggi, estrazione da diversi dei lavaggi, estrazione da diversi dei lavaggi, estrazione da diversi dei lavaggi, estrazione da diversi volumivolumivolumivolumi) ) ) )

• estrazione estrazione estrazione estrazione automatizzabileautomatizzabileautomatizzabileautomatizzabile

resina +resina +resina +resina +

DNA DNA DNA DNA ----

resina resina resina resina ----DNA DNA DNA DNA ----

AUTOMAZIONEAUTOMAZIONEAUTOMAZIONEAUTOMAZIONE

ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ATTRAVERSO LATTRAVERSO LATTRAVERSO LATTRAVERSO L’’’’UTILIZZO DI ROBOT UTILIZZO DI ROBOT UTILIZZO DI ROBOT UTILIZZO DI ROBOT

(MICRO(MICRO(MICRO(MICRO----PIPETTATORI)PIPETTATORI)PIPETTATORI)PIPETTATORI)

uniche fasi compiute dalluniche fasi compiute dalluniche fasi compiute dalluniche fasi compiute dall’’’’operatore: operatore: operatore: operatore: posizionamento dei campioni e reagenti posizionamento dei campioni e reagenti posizionamento dei campioni e reagenti posizionamento dei campioni e reagenti

VANTAGGIVANTAGGIVANTAGGIVANTAGGI

• possibilitpossibilitpossibilitpossibilitàààà di estrarre in meno di 2h di estrarre in meno di 2h di estrarre in meno di 2h di estrarre in meno di 2h fino a 96 traccefino a 96 traccefino a 96 traccefino a 96 tracce

•riduzione rischio di errori riduzione rischio di errori riduzione rischio di errori riduzione rischio di errori delldelldelldell’’’’operatoreoperatoreoperatoreoperatore

•alta precisione nel dosaggio dei alta precisione nel dosaggio dei alta precisione nel dosaggio dei alta precisione nel dosaggio dei reagentireagentireagentireagenti

TRACCIABILITTRACCIABILITTRACCIABILITTRACCIABILITÀÀÀÀ DEI CAMPIONIDEI CAMPIONIDEI CAMPIONIDEI CAMPIONI

• possibilitpossibilitpossibilitpossibilitàààà di poter attribuire un di poter attribuire un di poter attribuire un di poter attribuire un indicativo (codice a barre classico o indicativo (codice a barre classico o indicativo (codice a barre classico o indicativo (codice a barre classico o bidimensionale) dalla prima fase del bidimensionale) dalla prima fase del bidimensionale) dalla prima fase del bidimensionale) dalla prima fase del prelievo della traccia alla prelievo della traccia alla prelievo della traccia alla prelievo della traccia alla conservazione dellconservazione dellconservazione dellconservazione dell’’’’estrattoestrattoestrattoestratto

• i codici delle diverse fasi di lavorazione i codici delle diverse fasi di lavorazione i codici delle diverse fasi di lavorazione i codici delle diverse fasi di lavorazione (ispezione, estrazione (ispezione, estrazione (ispezione, estrazione (ispezione, estrazione …………) vengono ) vengono ) vengono ) vengono collegati attraverso lettori ottici collegati attraverso lettori ottici collegati attraverso lettori ottici collegati attraverso lettori ottici

CODICE A BARRE

COLLEGAMENTO CON LETTORE OTTICO

QUANTIFICAZIONE CON REAL TIME

• I campioni vengono quantificati con STANDARD con DNA noto e privo di inibizione (da 50ng/µl a 23 pg/µl)

• importanza dell’IPC nella lettura della quantificazione dei campioni per valutare la qualità del DNA estratto (eventuale PURIFICAZIONE)

INIBIZIONE: non è possibile valutare la presenza o

assenza di DNA

PURIFICAZIONE

RealRealRealReal ----TimeTimeTimeTime

IPC campioni + standard, curva molto simile

IPC inibito

0.9 ± 30%45 ± 30%25 ± 30%Condom6-int

--124 ± 10%Condom6-ext

0.9 ± 10%1633 ± 10%1534 ± 10%Condom5-int

1.9 ± 10%201 ± 10%390 ± 10%Condom5-ext

0.4 ± 10%12060 ± 10%4239 ± 10%Condom4-int

4.5 ± 30%13 ± 30%59 ± 20%Condom4-ext

1.2 ± 10%18572 ± 10%21364 ± 10%Condom3-int

0.5 ± 10%348 ± 10%180 ± 10%Condom3-ext

110 ± 30%10 ± 30%Condom2-int

3 ± 30%15 ± 30%44 ± 30%Condom2-ext

0.6 ± 30%69 ± 20%44 ± 30%Condom1-int

1.5 ± 20%60 ± 20%91± 20%Condom1-ext

Ratio H/YY Maschile (pg/ul)

Umano (pg/ul)REPERTO

POSSIBILITPOSSIBILITPOSSIBILITPOSSIBILITÀÀÀÀ DI QUANTIFICARE NELLA STESSA DI QUANTIFICARE NELLA STESSA DI QUANTIFICARE NELLA STESSA DI QUANTIFICARE NELLA STESSA REAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILEREAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILEREAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILEREAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILE

• Amplificare e tipizzare lAmplificare e tipizzare lAmplificare e tipizzare lAmplificare e tipizzare l’’’’intero intero intero intero genomagenomagenomagenoma sarebbe improponibile sarebbe improponibile sarebbe improponibile sarebbe improponibile per costi e tempoper costi e tempoper costi e tempoper costi e tempo

• Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori con le seguenti caratteristiche:con le seguenti caratteristiche:con le seguenti caratteristiche:con le seguenti caratteristiche:

1.1.1.1. POLIMORFICI POLIMORFICI POLIMORFICI POLIMORFICI anche in popolazioni isolate (lo stesso marcatore deve presentare diverse varianti nella popolazione)

2.2.2.2. STABILISTABILISTABILISTABILI alle mutazioni (importanza della scelta dei primers)

3.3.3.3. EQUILIBRIOEQUILIBRIOEQUILIBRIOEQUILIBRIO con la legge di Hardy-Weinberg

4.4.4.4. INDIPENDENTIINDIPENDENTIINDIPENDENTIINDIPENDENTI

AMPLIFICAZIONE AMPLIFICAZIONE AMPLIFICAZIONE AMPLIFICAZIONE caratteristiche di un marcatore forense

MicrosatellitiMicrosatellitiMicrosatellitiMicrosatelliti STR (Short Tandem Repeat)STR (Short Tandem Repeat)STR (Short Tandem Repeat)STR (Short Tandem Repeat)

•GATA è la sequenza del core-repeat

•Il microsatellite in questione è un tetranucleotidico

•Le varianti (allelialleliallelialleli) hanno un numero diverso di repeat

...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...

8 ripetizioni

...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...

9 ripetizioni

...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...

10 ripetizioni

STRUTTURA DI UN STRSTRUTTURA DI UN STRSTRUTTURA DI UN STRSTRUTTURA DI UN STR

...ACAGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGT..

Per convenzione gli alleli degli STR vengono chiamati in base al numero di repeat

NOME DEL MARCATORE

POTENZIALI ALLELI; IDENTIFICATI CON IL NUMERO DI RIPETIZIONI DEL CORE REPEAT

SCELTA DEGLI STRSCELTA DEGLI STRSCELTA DEGLI STRSCELTA DEGLI STR

Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 specifici marcatori STR, denominati Loci specifici marcatori STR, denominati Loci specifici marcatori STR, denominati Loci specifici marcatori STR, denominati Loci CodisCodisCodisCodis

CSF1PO

D5S818

D21S11

TH01

TPOX

D13S317

D7S820

D16S539 D18S51

D8S1179

D3S1358

FGA

VWA

AMEL

AMEL

Studi di popolazione 13 Loci Studi di popolazione 13 Loci Studi di popolazione 13 Loci Studi di popolazione 13 Loci CodisCodisCodisCodis

MULTIPLEX

• I 13 loci Codis vengono amplificati in un’unica reazione di PCR, spesso con aggiunta di altri loci per aumentarne il potere discriminante

• gli attuali kit di amplificazione caratterizzano contemporaneamente 15 loci STR (Multiplex)

• le attuali multiplex permettono di amplificare concentrazioni di estratto inferiori ai 50 pg/µl

• DNA nucleare cellula diploide ~ 6 pg, 50/6= 8 cellule/µl

20 cellule x reazione!!!20 cellule x reazione!!!20 cellule x reazione!!!20 cellule x reazione!!!

TIPIZZAZIONE

I frammenti vengono separati e caratterizzati tramite elettroforesi capillare utilizzando un sequenziatore automatico

(310, 3100, 3130XL), leggendo i segnali dei diversi DYE che discriminano i frammenti overlappanti

RAW DATA – DATO GREZZO

PROFILO GENETICO ELABORATOPROFILO GENETICO ELABORATOPROFILO GENETICO ELABORATOPROFILO GENETICO ELABORATO

•un profilo secondo gli standard FBI (codis) e’ formato da 13 marcatori

•poniamo che ogni marcatore presenti alleli la cui frequenza e’ pari a 0,1

nella popolazione di riferimento

•poniamo che ogni marcatore presenti lo stesso allele su entrambi i

cromosomi (omozigosi)

•la probabilita’ di ottenere la combinazione data per ogni marcatore e’ pari a

0,1*0,1=0,01

•la probabilita’ di ottenere la combinazione data per tutto il profilo e’

0,01*0,01*…0,01 (13 volte) ovvero 10-26, 1 su miliardi di miliardi di

individui……..

DIMOSTRAZIONE D’IDENTITA’’’’

IL PROFILO PUO’ ESSERE RITENUTO UNICO

VIOLENZA SESSUALEVIOLENZA SESSUALEVIOLENZA SESSUALEVIOLENZA SESSUALE

RepertiRepertiRepertiReperti Foto vetrinoFoto vetrinoFoto vetrinoFoto vetrino

indiziato

vittima

sperma vestaglia

tampone vaginale

tampone vaginale

indiziato

vittima

vestaglia

tampone vaginale

indiziato

vittima

vestaglia

tampone vaginale

indiziato

vittima

vestaglia

Nuove applicazioni e possibilitNuove applicazioni e possibilitNuove applicazioni e possibilitNuove applicazioni e possibilitàààà di sviluppo in di sviluppo in di sviluppo in di sviluppo in biologia forensebiologia forensebiologia forensebiologia forense

• Studio DNA degradato (“tracce stressate” e residui epiteliali)

• Ricerca mRNA su tracce forensi

La cLa cLa cLa caratterizzazione di ampliconi più corti (loci Mini-STR), permette di analizzare estratti molto degradati come quelli di sudore e residui epiteliali

Tracce attaccate da batteri, muffe, stress ambientale

DNA DEGRADATODNA DEGRADATODNA DEGRADATODNA DEGRADATO

miniSTR

Primers per STR

Primers per miniSTR

DegradazioneDegradazione

Locus

Amplificazione con kit Identifiler (16 sistemi STR)

25pg/ul

Amplificazione con kit Minifiler (9 sistemi

mini-STR)

300<x<350300<x<350300<x<350300<x<350

80<x<13080<x<13080<x<13080<x<130

250<x<300250<x<300250<x<300250<x<300

140<x<190140<x<190140<x<190140<x<190

110<x<180110<x<180110<x<180110<x<180

70<x<12070<x<12070<x<12070<x<120

300<x<350300<x<350300<x<350300<x<350250<x<300250<x<300250<x<300250<x<300

10 cellule

Possibilità di DATARE la traccia in base alla quantità di messaggero ancora presente, ma soprattutto stabilire l’ORIGINE TISSUTALE, in modo da eliminare i limiti delle diagnosi specifiche e generiche e valutazioni ispettive.

Esempio: luminescenza alla crimescope di urina molto simile a secrezioni vaginali, distinzione tra perdite ematiche da trauma o perdite sangue mestruale

RICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSIRICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSIRICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSIRICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSI

In passato la diagnosi di sangue mestruale veniva fatta attraverso la ricerca microscopica di cellule dell’endometrio, dosaggio ormonale o rapporto tra degradazione fibrina/fibrinogeno.

SVANTAGGISVANTAGGISVANTAGGISVANTAGGI

• necessità di elevate tracce di sangue

• non applicabilità in tracce forensi (sporche e non sempre ben repertate)

• in alcuni casi di violenza sessuale o omicidio è importante determinare l’origine delle tracce ematiche

PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?

INDAGINI SU SANGUE MESTRUALEINDAGINI SU SANGUE MESTRUALEINDAGINI SU SANGUE MESTRUALEINDAGINI SU SANGUE MESTRUALE

CASEWORK CASEWORK CASEWORK CASEWORK scomparsa e rinvenimento cadavere di una donna di circa 30 anni

• il sopralluogo dell’abitazione consente di rinvenire un lenzuolo con consistenti tracce ematiche, poi tipizzate ed appartenenti alla donna

• viene accusato di omicidio il marito, che giustifica le abbondanti tracce ematiche del lenzuolo come perdite mestruali

…. vengono raccolti vari campioni:

• campioni autoptici di vari tessuti, tra cui cellule della mucosa dell’endometrio

• sangue mestruale di volontarie

• sangue da traumi vari

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