biofarmacia expo

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

POR: LARA ALMAZÁN NANCY

RETOS EN VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR LC/MS/MS. SUPRESIÓN IÓNICA,

CONTAMINACIÓN, EFECTO DE MATRIZ.

Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento

• La cromatografía es un procedimiento no destructivo, para resolver una mezcla de múltiples componentes traza, se puede aplicar tanto cuantitativa como cualitativamente.

• HPLC, es una técnica analítica usada para separar y determinar solutos

orgánicos e inorgánicos en cualquier muestra, especialmente biológica, farmacéutica, alimentaria, medioambiental, e industriales.

• No se limita a muestras volátiles y térmicamente estables, y la elección de la fase móvil y la fase estacionaria es más ancha.

Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

• Espectrómetros de masas tándem (MS-MS) : son instrumentos que tienen más de un analizador, se utilizan para estudios estructurales y de secuencia. Los analizadores no son necesariamente del mismo tipo, en cuyo caso el instrumento es un híbrido. Los más populares incluyen: cuadrupolo-cuadrupolo, sector magnético-cuadrupolo, y, más recientemente, las geometrías cuádruple-tiempo de vuelo.

Espectrometría de masas

Técnica analítica que produce iones

a partir de compuestos que se separan en base a su relación (m / z)

Permite establecer rutas

de fragmentación en muestras de

alta complejidad

ALTA resolución, elevada

sensibilidad, incluso hasta

niveles de pg/L, debido a su alta especificidad.

Por lo general se usan

espectrómetros de masas en

tándem.

Funcionamiento: a) ionización,

b)separación y el análisis de la masa de los iones, c)Medida,

amplificación y creación de espectros

de masas


LC/MS/MS

Mejor método; sensible y especifico

Combina la capacidad de

separación física CL con el análisis

de masas MS.

Puede hacerse un análisis en

minuto o menos

El detector puede ser

programado para seleccionar

ciertos iones a fragmento

Detección específica e identificación

potencial de productos químicos en la presencia de

otro productos.


Aplicaciones de LC/MS/MS en bioanálisis

• Identificación y / o cuantificación de drogas ilícitas en muestras biológicas .

• Pruebas de veneno en usos toxicológico s y forenses.

• Análisis de elementos traza y sustancias tóxicas en las ciencias naturales y la investigación ambiental.

• Monitoreo en la concentración de fármacos y sus metabolitos en tejidos, sangre, plasma, suero y muestras de orina, para una mejor comprensión de la farmacología y la toxicidad de los fármacos.

• Monitorización terapéutica en la gestión del tratamiento farmacológico en pacientes.

• Estudios farmacocinéticos: técnica más frecuentemente usada en el bioanálisis, siempre y cuando el analito sea adecuadamente ionizado, y sea un corto tiempo DE análisis


Puntos Críticos en Bioanálisis con LC-MS/MS

• ¿Cuáles serían las condiciones exactas cromatográficas incluyendo la selección de la columna, fase móvil, las condiciones de flujo, el método de preparación de la muestra y el sistema de detección?

• ¿Es el método desarrollado preciso, exacto y reproducible? ¿Es robusto con respecto a la columna, la máquina y analista?

• Para resolver estos problemas, hay que validar el método desarrollado en relación con el fármaco parental y metabolito.


Desventaja de LC-MS/MS

Los compuestos co-liberadores

pueden suprimir o mejorar la

ionización de los analitos de interés.

Tales efectos, pueden afectar

considerablemente los parámetros de rendimiento del

método.

Límite de detección (LOD),

límite de cuantificación (LC),

linealidad, exactitud y precisión.

Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res.

RETOS EN VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS POR LC/MS/MS.

• EFECTO DE MATRIZ• SUPRESIÓN IÓNICA• CONTAMINACIÓN

EFECTO DE MATRIZ

Matriz: componentes de un muestra que no son el analito.

Efecto de matriz : efecto combinado de todos los componentes de la muestra que no son el analito sobre la forma en que se realizó el análisis y la calidad de los resultados. Hay una supresión o mejora de la ionización del analito .

El efecto de la matriz cambia la respuesta de un analito, ya sea positiva o negativamente , causada por coeluir compuestos de matriz, relativa a una inyección de un estándar puro.

Para contabilizar los efectos de matriz se construye una curva de calibración utilizando muestras estándar con la concentración de analito conocida y la que se intenta aproximar a la matriz de la muestra.

• Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res.

• Ganesh N Sharma, et al. (2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

• En el análisis de analitos:

Medicamentos pesticidas, biomoléculas matrices diversas: sangre, tejido animal suave, tejido de planta.

• La medida cuantitativa de los efectos de matriz es el factor de matriz (MF) y se define por la siguiente ecuación:

• Si MF= 1 indica que no hay efecto de matriz • MF<1 indica supresión ionica• MF>1 indica exaltación de iones

EFECTO DE MATRIZ¿DONDE?

𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒𝑀𝑎𝑡𝑟𝑖𝑧(𝑀𝐹)=(𝑃𝑖𝑐𝑜𝑑𝑒𝑟𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎𝑒𝑛𝑝𝑟𝑒𝑠𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑑𝑒 𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠𝑑𝑒 𝑙𝑎𝑚𝑎𝑡𝑟𝑖𝑧 )

(𝑃𝑖𝑐𝑜𝑑𝑒𝑟𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎𝑒𝑛𝑙𝑎𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎𝑎𝑐𝑢𝑜𝑠𝑎 )


EFECTO DE MATRIZ¿CAUSAS?

Documentos de orientación actuales de la FDA requieren que estos efectos se evaluen como una parte del desarrollo del método cuantitativo y validación del LC / MS / MS .

Estos efectos pueden ser agravados por impurezas o productos de degradación y puede ocasionar importantes errores en la exactitud y precisión de métodos bioanalíticos. Así como:IDENTIFICACIÓN ERRONEA (FALSOS POSITIVOS/NEGATIVOS), INCORRECTA

CUANTIFICACIÓN, DISMINUCIÓN DE LA SENSIBILIDAD y CONTAMINACIÓN DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO

Estos efectos pueden ocurrir principalmente cuando otros compuestos co-eluyen con el analito de interés

Fosfolípidos endógenos Aditivos tales como ácido trifluoroacético (TFA) Medios de dosificación Formulación de agentes Modificadores de fase

móvil.

Pueden ser muy variables y difícil de controlar o predecirProcedimiento de preparación de

muestra

Calidad de separación cromatografíca Aditivos de fase móvil Estándar Interno (SI)

tipo de ionización: Ionización por electrospray (ESI) es más propenso a tales efectos que

la presión atmosférica de ionización química (APCI).

Compuestos exogenos: drogas y / o sus metabolitos


La principal estrategia para determinar el grado de EM es correr una muestra de matriz y determinar por LC-MS comparar la respuesta con la de una muestra que contenga el analito pos-extracción

Comparan las respuestas entre una disolución patrón de referencia en solvente y el extracto blanco forticado con el patrón (a la misma concentración).

A partir de las respuestas obtenidas se puede calcular el porcentaje de respuesta del analito en la matriz estudiada frente al patrón en solvente sin matriz.

Se hace un supuesto de recobro, y si el % es por debajo del 100% se trata de una supresión y si esta por encima es una exaltación de respuesta.

EFECTO DE MATRIZ:IDENTIFICACIÓN


Recobro (%) = pico del area del extracto de matriz / pico del area de la muestra post-extracción * 100

EFECTO DE MATRIZ:IDENTIFICACIÓN

Terence G. Hall, et al. Identifying and Overcoming Matrix Effects in Drug Discovery and Development. ArQule Inc. USA

Adición del analito post-columna

Continua adición del compuesto, o de un patrón interno, en modo post-columna mediante una bomba de

jeringa

Mientras que el inyector automático introduce una muestra blanco,

monitorizando en el detector MS la transición del analito.

Se observara si el analito se ve afectado constantemente por la

matriz conforme esta va eluyendo de la columna, dando información sobre

la evolución del EM en función del tiempo.

Esta aproximación no da información sobre los interferentes causantes del

eecto.

Inyección del extracto en modo full scan

Se visualiza el EM mediante la realización de un cromatograma en full scan de la

matriz blanco.

Se asume que todos los compuestos causantes del EM van a competir con el

analito por la ionización, por lo que deben compartir el mismo modo de ionización

que el analito

Al tiempo cromatográfico en el que eluyen mas compuestos de la matriz, el EM será

mayor.

Desventaja: no tiene presente que habrán otros compuestos que no se ionizan pero si

producen EM.

Ventaja: Es posible obtener información estructural los interferentes, y por tanto

dar una idea de como eliminarlos.

Otras alternativas de identificación.

Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Instituto Universitario de Plaguicidas y Aguas.

EFECTO DE MATRIZPREVENCIÓN

SELECCIÓN DEL ION/IONES DE

CUANTIFICACIÓN

PREPARACIÓN DE ESTANDARS EN

MATRIZ

CLEAN-UP DE LAS MUESTRAS

METODOS DE CUANTIFICACIÓN ALTERNATIVOS

VALIDACIÓN DEL MÉTODO Y/O

REVISIÓN.

La guía de la US-FDA para la industria sobre la validación de métodos bioanalíticos requiere la evaluación de efecto de la matriz durante la validación del método para los métodos bioanalíticos cuantitativos LC-MS/MS.Este paso es generalmente necesario para eliminar los componentes de la matriz tales como proteínas, sales y otros compuestos orgánicos en matrices biológicas que de otro modo pueden imponer interferencias o supresiones de ionización para los analitos.


EFECTO DE MATRIZ:PREVENCIÓN

Efectos de la matriz que pudieran derivarse de compuestos

endógeno extraídos de la matriz de la muestra, por lo general pueden

eliminarse de dos formas.

Optimizar condiciones cromatográficas para separar el

pico del analito a partir de l pico de la matriz causando la supresión iónica / mejora,y / o limpieza de las

muestras

cambiando el método de preparación de la muestra de

inyección directa o extracción en fase sólida por la precipitación de

proteínas.

Dilución parece ser otra manera de reducir los efectos de la matriz.


EFECTO DE MATRIZAlternativas para corregir el efecto matriz

en la cuantificación en LC-MS

1. Uso de patrones internos2. Calibrado en matriz3. Dilución del extracto de la muestra4. Pre-tratamiento de la muestra


EFECTO DE MATRIZ:1.Uso de patrón interno


La estructura del patrón interno debe ser lo mas parecida posible a la del analito, por ello el patrón

ideal para corregir el EM es el mismo analito marcado isotópicamente.

Ventaja: permite la minimización de la etapa de procesamiento de la muestra, permitiendo incluso la

inyección directa de extractos crudos.

Limitación de uso de compuestos marcados isotópicamente como patrones internos: no

encontrarse en ocasiones disponible comercialmente o que su coste sea excesivamente alto.

EFECTO DE MATRIZ:3.Calibrado en Matriz


Calibración del extracto blanco de la

matriz

• De esta forma se iguala el efecto matriz al mismo nivel en los patrones y en las muestras consiguiendo una calibración adecuada para la correcta cuantificación de la concentración en las muestras

Inconveniente:

• Disponer de una muestra blanco que comparta las mismas características que la matriz de análisis.

• Este tipo de alternativa solo corrige el EM para la correcta cuantificacion, pero no lo elimina, por lo que puede ser inadecuado en casos donde se de una supresion muy alta, generando perdida de la sensibilidad.

• Ventaja:– La minimización de la presencia de otros componentes de la matriz mediante su dilución en el extracto

puede conseguir que estos sean comparables a los patrones en solvente en LC-MS.

• Por ejemplo: en la determinación de fosetil en extracto de naranjas mediante cromatografía de pares iónicos, presenta una mejor forma de pico al diluirse cinco veces el extracto crudo, mejorando también la retención cromatografía, ya que en este caso la formación del par iónico se veía favorecido al no encontrar tantos interferentes de la matriz.

EFECTO DE MATRIZ:4.Dilución del extracto de la muestra


EFECTO DE MATRIZ:Pre-tratamiento de la muestra


Objetivo: disminuir la presencia de posibles interferentes haciendo uso de los procedimientos de tratamiento de muestra, que purifiquen el extracto de muestra eliminando el máximo numero de componentes que puedan interferir.

Inconveniente: gasto económico y de tiempo, además de la probabilidad de introducción de una mayor cantidad de errores.

En algunos casos, en los que se desea pre-concentrar el analito para aumentar la sensibilidad, se puede dar una pre-concentración de interferentes de la misma magnitud que el analito generándose incluso un mayor efecto matriz.

EFECTO DE MATRIZ:Ejemplo

Terence G. Hall, et al. Identifying and Overcoming Matrix Effects in Drug Discovery and Development. ArQule Inc. USA

SUPRESIÓN IÓICA

Ocurre, cuando un compuesto que co-eluye suprime la ionización de las moléculas de la muestra, en la fuente de un espectrómetro de masas .

• teóricamente, puede ocurrir tanto en la fase de solución o de la fase gas.

Esta supresión de iones es análogo al del pico de basura grande para el material no retenido común al comienzo de cromatogramas por detección UV.

La supresión de iones, como otras interferencias cromatográficas, en análisis cuantitativo, puede variar de muestra a muestra.

También puede ser dependiente de la concentración del analito que se controla, se refiere a la relación de matriz / analito.


SUPRESIÓN IÓNICA¿CAUSAS?

Ganesh N Sharma, et al. (2010). Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

Experimentos de extractos biologicos que implican (ESI), ha demostrado que la principal causa de supresión de iones es un cambio en las propiedades de la solución para formar gotitas, causados por la presencia de solutos no volátiles o menos volátiles .

Estos materiales no volátiles (por ejemplo, sales, agentes de emparejamiento de iones, compuestos endógenos, fármacos / metabolitos) cambian la eficiencia de formación de gotitas o evaporación de la gotita, que a su vez afecta a la cantidad de iones cargados en la fase gas que finalmente alcanzan el detector.

Se ha demostrado que las moléculas de mayor masa suprimen la señal de moléculas más pequeñas y que los analitos más polares son más susceptibles a la supresión.

SUPRESIÓN IÓNICA:EVALUACIÓN (COMPARACIONES)

(a) la respuesta del instrumento para calibradores

(incluyendo cualquier patrones internos) inyectados directamente en la fase móvil.

(b) la misma cantidad de compuesto añadido a las muestras pre-extraidas.

(c) la misma cantidad de compuesto añadido al

espécimen matriz antes de la extracción

Proporcionan un valor

relativo de respuesta 100%

muestran el efecto de la matriz de la

muestra en respuesta MS (supresión de

iones)

puede resaltar si cualquier pérdida de señal es atribuible al

proceso de extracción o a la supresión ionica


• Modificar la fase móvil.

• Modificar las condiciones cromatográficas de modo que el compuesto de interés eluya en una región donde la supresión de iones no se observa. Esto implica generalmente aumentando el tiempo de cromatografía, pero no siempre .

• Modificar la cromatografía de manera que el compuesto de interés y el patrón interno coeluyan debido a que la mayoría de los ensayos de HPLC incluyen un patrón interno. La supresión de iones para los dos compuestos deben ser iguales si los picos cromatográficamente coinciden, por lo tanto "corrección" para el grado de supresión. Si un isótopo estable patrón interno está disponible, la supresión de iones sería idéntica para el analito y el patrón interno.

• El uso de un estándar interno no podría resolver completamente los problemas de exactitud o precisión con el ensayo si la supresión de iones exite. Si la supresión de iones reduce significativamente la señal del analito o estándar interno, la señal--ruido puede estar comprometida a un punto donde se vuelve negativa exactitud o precisión afectado. Es por esta razón que la supresión de iones debe ser evaluado incluso si un patrón interno está incluido en el ensayo

SUPRESIÓN IÓNICA¿CÓMO CONTRARRESTAR?


• Una solución diluida de paclitaxel fue infundida en LC-MS/MS y el blanco extraído del plasma fue inyectado para obtener el diagrama de arriba.

• La señal de estado estacionario para paclitaxel disminuyó cuando la ionización fue suprimida por el ajuste de retención, de modo que los analitos de interés eluyen después de la supresión de esta región, el riesgo de pérdida de señal debido a supresión de la ionización se reduce considerablemente.

SUPRESIÓN IÓNICA:EJEMPLO

Courtesy of James Little, Eastman Kodak. J Chromatogr. B (2006) submitted for publication.

• Ejemplo de cómo la supresión puede aparecer durante el análisis de la muestra.

• La precipitación en Plasma es un método popular y fácil de limpiar las muestras antes de la inyección.

• Este ejemplo muestra que aunque las proteínas plasmáticas pueden ser removidos para que la muestra sea mas clara, los materiales restantes pueden causar la supresión iónica grave.

• Arriba: plasma de rata precipitado que contiene prednisolona, difenhidramina, betametasona, amitriptilina, naproxin y ibuprofeno.

• Abajo:los estándares en disolvente.

SUPRESIÓN IÓNICA:EJEMPLO

C.R. Mallet, Z. Lu, and J.R. Mazzio, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18 (2004) 49-58.

CONTAMINACIÓN

• La contaminación puede afectar negativamente a la exactitud y precisión.

• Si el pico en las muestras del blanco es mayor del 20% que la respuesta del LLOQ, la contaminación es significativa y debe ser investigado

Fuentes de contaminación

Derrames, salpicaduras, aerosoles, mezcla y goteo

durante los pasos de transferencia de líquidos.

Extracción en fase sólida

Posibilidad de contaminación es mayor

durante las etapas de dilución, la elución y la

evaporación

Extracción líquido-líquido y precipitación de proteínas

La contaminación puede ocurrir durante la dilución, mezcla de

disolventes orgánicos, transferencia de sobrenadante o pasos de

evaporación

Prevención

Contenedores secundarios desechables deben utilizarse

siempre que sea posible.

Recipientes de vidrio deberán limpiarse a fondo

antes de su uso.

Banco de trabajo, pipetas, tubos de vacío, y las agujas de evaporación, etc, deben ser limpiados antes de su

uso.

Los guantes deben ser cambiados con frecuencia

durante la preparación de la muestra.

Whitmire Monica , et al. (2011) LC-MS/MS Bioanalysis Method Development, Validation, and Sample Analysis. Analytical & Bioanalytical

• Ann Van Eeckhaut, Katrien Lanckmans, Sophie Sarre, Ilse Smolders, Yvette Michotte (2009).∗ Validation of bioanalytical LC–MS/MS assays: Evaluation of matrix effects. Journal of Chromatography B.

• Ganesh N Sharma, Man Mohan Singhal, KK Sharma, Jyotsana Sanadya(2010) Trouble shooting during bioanalytical estimation of drug and metabolites using LC-MS/MS: A review. J Pharm Adv Technol Res.

• Grimalt Brea Susana (2009). Tesis Dotoral. Nuevas aportaciones de LC-MS con analizadores de triple cuadrupolo y tiempo de vuelo en el análisis de residuos de plaguicidas y metabolitos en alimentos de origen vegetal.Intituto Universitario de Plaguicidas y Aguas.

• Yogesh Modhave (2012). Matrix Effect in Bioanalysis: An Overview. Int.J.Pharm.Phytopharmacol.Res.

• Thomas M. Annesley (2003). Ion Suppression in Mass Spectrometry. Clinical Chemistry• C.R. Mallet, Z. Lu, and J.R. Mazzio, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18 (2004) 49-58.• Courtesy of James Little, Eastman Kodak. J Chromatogr. B (2006) submitted for publication.• Monica Whitmire, Jennifer Ammerman, Patricia de Lisio, Jacqueline Killmer, Devon Kyle, Emily

Mainstone, Lynann Porter and Tianyi Zhang. (2011) LC-MS/MS Bioanalysis Method Development, Validation, and Sample Analysis: Points to Consider When Conducting Nonclinical and Clinical Studies in Accordance with Current Regulatory Guidances. Analytical & Bioanalytical

REFERENCIAS

biofarmacia expo

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