BIODIVERSIDAD Y BIODEGRADACIÓN

Introducción

Mecanismos de evolución y adaptación

Ejemplos

PROCARIOTAS en la biosfera

Hay de 4-6 x 1030 células de procariotas

Su biomasa es muy superior a la biomasa de eucariotas

90% de los procariotas se encuentran en el SUBSUELO

10% en SUELOS, SEDIMENTOS, MASAS DE AGUA, AIRE, EUCARIOTAS

Mucha BIODIVERSIDAD

Estimación del nº de especies bacterianas: entre 10.000 y > 1 billón (109) Existen desde hace cerca de 3,5 G-años (las plantas existen desde hace 600 millones de años)

Woese, 1994

4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0

Homo sapiens

Caballo

Dinosaurios

Trilobitesprocariotas

Formación de la tierra

Estabilización de la corteza Atmósfera de oxígeno

Billones de años

• Sin embargo, sólo unas 6000 especies descritas, frente a más de 1 millón entre animales y plantas, o ca. 1 millón de especies de insectos.

¿PORQUÉ? Pequeños, simples, dificultad cultivo puro, pocos estudios taxonómicos, ...

Número de procariotas en habitats acuáticos

Hábitat Volumen, Celulas/ml Nº total de celulas cm3 × 105 × 1026

Marino Plataforma continental 2.03 × 1020 5 1.0 Océano abierto Agua, por encima de 200 m 7.2 × 1022 5 360 Agua, por debajo de 200 m 1.3 × 1024 0.5 650 Sedimento, 0-10 cm 3.6 × 1019 4600 170 Dulce Lagos 1.25 × 1020 10 1.3 Rios 1.2 × 1018 10 0.012

Lagos salinos 1.04 × 1020 10 1.0

Total 1180 x 1026

Whitman et al., 1998

Número de procariotas en el suelo

Tipo de ecosistema Area, No. of cells,

× 1012 m2 × 1027

Selva tropical lluviosa 17.0 1.0 Selva tropical pluviestacional 7.5 0.5 Bosque templado esclerófilo 5.0 0.3 Bosque templado caducifolio 7.0 0.4 Bosque boreal (taiga) 12.0 0.6 Bosques y arbustedas 8.0 28.1 Sabana 15.0 52.7 Praderas templadas 9.0 31.6 Matorral desértico 18.0 63.2 Tierras cultivadas 14.0 49.1 Tundra y vegetación alpina 8.0 20.8 Pantanos y zonas húmedas 2.0 7.3 Total 123.0 255.6 x 1027

Número total de procariotas en sedimentos subsuperficiales no consolidados (por debajo de 10 m)

Nº de células, × 1028

Intervalos de Cells/cm3 Océanos Plataforma Planiciesprofundidad (m) × 106 profundos continental costeras

0.1 220.0 66.0 14.5 4.4 10 45.0 121.5 26.6 8.1 100 6.2 18.6 4.1 1.2 200 19.0 57.0 12.5 3.8 300 4.0 12.0 2.6 0.8 400 7.8 10.1 3.2 600 0.95 3.7 1.2 1200 0.61 3.2 1.0 2000 0.44 2.6 0.9 3000 0.34 0.7

Total 275.1 79.9 25.3 Grand Total: 380 × 1028 = 3.8 × 1030

¿Quién está ahí?

CULTIVOS (puros)ESTUDIO DE COMUNIDADESOBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

CULTIVOS (puros)

Estudios fenotípicos: muy limitadosSecuencias grandes cambios en la taxonomía bacteriana%GC16S Árboles filogenéticosAnálisis de fosfolípidos u otros marcadores

Inconvenientes: Hay que cultivar! (VNC)Es posible que sólo detectemos el 1% de los presentes< 5000 especies en colecciones

APROXIMACIONES AL ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD BACTERIANA

OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO

Muestras fijadasTinción general

Inconvenientes:Información sobre ABUNDANCIA de microorganismos. NO sobre tiposTinción específica (sondas) controles muy difíciles

Métodos moleculares: aislamiento de ADN totalPCR + clonaciónAnálisis de secuencias conservadas (16S)

Inconvenientes:Información de secuencia 16S puede NO ser suficiente para delimitar especies< 5000 secuencias de ARNr 16S en bases de datos

Se recomienda utilizar una combinación de todas las aproximaciones.

ESTUDIO DE COMUNIDADES

Microorganismos presentes en la naturaleza pero que NO somos capaces de cultivar en el laboratorio.

V. cholerae en habitats “puros” incubadas en agua de mar artificial, permanecían viables pero PERDÍAN la capacidad de formar colonias en medios de cultivo

Muchas especies pueden alcanzar un estado de VIABLE, NO CULTIVABLEFallan los medios de cultivo. ¿Por qué?

“Desacoplamiento” entre metabolismo y división celular (daño oxidativo)

(atracón)

(suicidio microbiológico)

SOLUCIÓN: cultivos con restricciones nutricionales

VIABLES PERO NO CULTIVABLES

Biodiversidad y biodegradación de aromáticos

¿Por qué existen bacterias capaces de degradar tolueno y otros compuestos aromáticos, incluso xenobióticos?

¿Cómo son?

¿Cómo se originan?

CH3

tolueno

LigninaCH3

tolueno

Meter aquí transparencia 15 de Biodiversidadvamos a hablar de dioxigenasas del anillo

OH

OH

COOH

CH3

OH

OH

3-metilcatecol

OHOH

COOH

protocatecuato

OH

COOH

OH

protocatecuato

nahAa ndoAB C

cbdA B C

bphA1 A2 A3 A4 B C E G F D

tcbAaAbAcAd BIS IStcbF E D C R

cbaA B CIS IS

Mcat D F I C B benD C B AA

H I K Q J F G E T L Z Y XxylR S N B A M C

ISP

ISPß

Fd Rasa

Fd

DHDH

Rasa

C2, 3O

DIOXIGENASA DEL ANILLO

Van der Meer, 1997

Generalidades-Conclusiones

Patrones muy conservados de organización cromosómicas de las rutas,aunque se observan reorganizaciones.

Flanqueadas por secuencias de inserción en algunos casos.

La mayoría son operones.

La mayoría están reguladas.

En muchos casos se puede predecir la ruta por les genes presentes.

Toma de muestra

Carretera

Aguas subterráneasMancha alquitrán

U

DL

50 m

¿Ocurre Biodegradación en la naturaleza? (Madsen et al., 1991)

Se ha producido una adaptación de las poblaciones autóctonas a hidrocarburos poliaromáticos Ha habido crecimiento estimulado por el contaminante

Capacidad biodegradadorafenantreno

naftaleno

OH

COOH

p-HB

100

p-HB NAF FEN

50

0

D

D

D UU

U

L

L L% M

iner

aliz

ació

n

Abundancia microbiológica

D

D

D

U

U

U

L

L

L

109

0

106

103Lo

g c

fu

viables totales protozoos

Evolución natural: RESPUESTA ADAPTATIVACon frecuencia, se observa:

Compuesto xenobiótico

Comunidad microbiana incapaz de degradarlo.

Incubación en presencia del compuesto

Pasado un tiempo, se produce mineralización total del compuesto.

Ha habido un CAMBIO en la comunidad bacteriana

MECANISMOS POSIBLES:

inducción de enzimas

crecimiento de una subpoblación de la comunidad

SELECCIÓN de una subpoblación con propiedades nuevas (adaptación genética)

Lleva más tiempoNo es reproducible

Mutación /Selección

Mutaciones ocurren AL AZAREl medio selecciona las favorables.

MECANISMOS NATURALES DE EVOLUCIÓN

Transferencia genéticaPaso de ADN de una bacteria a otra

Elementos de inserciónPueden tener consecuencias varias

Duplicaciones.(de uno o varios genes, generalmente por recombinación o slippage)Suponen grandes ventajas

Recombinación y transposiciónPueden producir reorganización genética.

Mutaciones puntualesOcurren al azar, constantemente (dependen de la tasa de crecimiento)Cambio de una base en el ADN

Mutaciones puntuales- mutaciones silenciosas (se acumulan).- mutaciones con efecto fenotípico (numerosos ejemplos en el laboratorio)Son la fuente principal de biodiversidad.

ATG TTC GGA GGC ACC TTG.... . Gly: GGNMet Phe Gly Gly Thr Leu ...... Proteína A Phe: TTC, TTT

Leu: TTG, TTA

ATG TTC GGT GGC TTG.... . ATG TTA GGA GGC TTG.... . Met Phe Gly Gly Leu ...... Met Leu Gly Gly Leu ......

Proteína A*

Mutación silenciosaMutación no silenciosa

bphA1 A2 A3 A4 B C E G F D

benD C B A

Recombinación y transposiciónSe observa en rutas conocidas.

Duplicaciones.Se observan con frecuenciaMecanismo importante de evolución: no se pierde ninguna función

gen A

Duplicación

gen AMutación

gen A

Acumulación de mutaciones

gen A

gen A

gen A gen B

Etc...

Elementos de inserción.

gen A

“salto” de un elemento de inserción

gen A DESTRUIDO

IS

IS

A

gen A

genB

“salto” de un elemento de inserciónque lleva gen de interés

genBB

GANANCIA DE FUNCIÓN

gen A EXPRESADO CONSTITUTIVAMENTE

“salto” de un elemento de inserciónque lleva secuencia promotora

CPx

Transferencia genética

Paso de ADN de una bacteria a otraMuy útil en ingeniería de rutas

Vehículos:

Plásmidos (TOL, NAH, SAL) unidad de replicación independienteTransposonesFagos

Existe transferencia génica en la naturaleza

- entre poblaciones naturales

- entre organismos introducidos y organismos indígenas

- ¿Retrotransferencia?

H I K Q J F G E T L Z Y XxylR S N B A M C

gen

Elementos que intervienen en la evolución molecular de procariotas

Fuente de diversidad

Estrategias de variación

Fuentes de mutación

Cambios locales de secuencia

Reorganizaciones

Adquisición de ADN

Errores Polimerasa

Agentes mutagénicos

Recombinación “Reshuffling”

Transferencia horizontal

Diversidad genética

Limitaciones a la diversidad

Aislamiento

Reparación

Selección naturalCondiciones de vida Entorno fisico-químico Entorno biológicoTamaño de la biosfera(ca. 1030 células)

INTERCAMBIO DE GENES EN LA NATURALEZA

A.- En microcosmos, entre organismos conocidos

B.- Entre organismos indígenas y organismos introducidos

C.- Entre poblaciones naturales, in situ

Lodos industriales Pseusomonas EB62 Plásmido TOL modificado. Crece en 4-Etilbenzoato.

Pseusomonas UWC1 RifR

Transferencia de genes entre Pseusomonas en microcosmos

Inocular lodos con las dos cepasMedir supervivencia de las poblacionesAparición de transconjugantes

0

104

108

Lo

g c

fu/m

l

Tiempo (días)

0 6 12

IndígenaUWC1

EB62

UWC1/EB62

Indígena

0

104

108

Lo

g c

fu/m

l

Tiempo (días)

0 6 12

UWC1

EB62

UWC1/EB62

Añadir 4EB (4 mM)

Transferencia de genes en el suelo:Obtención de organismos “recombinantes” in situ.

Buscamos degradadores de Bifenilos policlorinados (PCBs)Es normal encontrar en la naturaleza degradadores de bifenilo.NO es normal encontrar degradadores de clorobenzoato en la naturaleza.Tenemos Pseudomonas aeruginosa JB2, capaz de degradar clorobenzoato. Queremos ver si esta cepa le puede transferir sus genes a alguna cepa del suelo, o vice versa.

Cln Cln

COOH

Cln

Muestra de suelo

+BifeniloAroclor1242P. aeruginosa JB2

Tomar muestrasSembrar en medios selectivos

¿Ocurre en la naturaleza?

”INOCULAR” CON EL GEN QUE FALTA

Tomar muestras y conteo de dos poblaciones:

Degradadores de bifenilo

Degradadores de clorobenzoato Picar a bifenilo

ClnOH

OH

PCBs

Cln Cln

Ciclo de Krebs

bph

COOH

Ciclo de Krebs

clc

Cln

Esto se ha conseguido en el laboratorio

Estrategia

P. aeruginosa JB2

Cepa indígena

Tiempo (días)

0 25 50

Log

CF

U/g

de

suel

o

5

7

8

5

6

9

Después de 15 días, empiezan a aparecer cepas capaces de degradar los dos compuestos.

8 son P. aeruginosa JB2 (BIOLOG)

Se analizar algunos recombinantes: son INESTABLES

1 es diferente JB2-M (<78%)

La cepa indígena: Pseudomonas sp. AW

C.- Entre poblaciones naturales, in situ

Sitio contaminado con alquitrán (N.Y.)Análisis de la población:

Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno

Se analiza la población con respecto al gen nahAc

Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S

transparencia

C.- Entre poblaciones naturales, in situ

Sitio contaminado con alquitrán (N.Y.)Análisis de la población:

Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno

Se analiza la población con respecto al gen nahAc

Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S

Se observa que hay mucha más distancia evolutiva al analizar secuencias 16S que al analizar el gen nahAc

Se deduce TRANFERENCIA HORIZONTAL (reciente).

Datos sugieren que la transferencia de genes también ha ocurrido a grandes distancias (dispersión).

Todas las cepas aisladas llevan un megaplásmido. nahAc se encuentra tanto en plásmido como en cromosoma, o en ambos.

¿Puede mejorar el laboratorio a la

naturaleza?