biaŁka i kwasy nukleinowe - strona wydziału biologii uw · zakład biologii molekularnej biaŁka...

Zakład Biologii Molekularnej

BIAŁKA i KWASY NUKLEINOWE

Materiały do zajęć dla studentóww roku akademickim 2009/2010

Uniwersytet Warszawskiwersja 1.7

wersja elektroniczna dostępna na www.biol.uw.edu.pl/zbm/

Proszę wpisać w ramkę swoje imię i nazwisko

Spis treści

Regulamin pracowni.........................................................3Wstęp..................................................................................4Literatura ogólna..............................................................6Zespół prowadzący zajęcia..............................................6

Ćwiczenia1. Oczyszczanie białek HMG z grasicy cielęcej...............................72. Oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego białka SF2/ASF z

komórek bakterii Escherichia coli.............................................123. Elektroforeza natywna białek "BN PAGE".................................224. Oznaczanie aktywności ludzkiej topoizomerazy I w ekstraktach

jądrowych komórek HeLa..........................................................25

Appendix1. Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym zawierającym

SDS (SDS-PAGE)......................................................................272. Elektroforeza DNA w żelu agarozowym.....................................303. Po co są te substancje w roztworach stosowanych podczas

ćwiczeń?.....................................................................................32

Uwaga !!! W skrypcie zastosowano następujące oznaczenia:

1. Znakiem oznaczono uwagi dotyczące czynności niebezpiecznych dla zdrowia.

2. Podane w części opisującej wykonanie ćwiczenia numery odczynników (w kwadratowych [ ] nawiasach) odpowiadają numerom stosowanym w spisie odczynników.

© Zakład Biologii Molekularnej UW, 2010 r.

2/33

Regulamin pracowni1. W pracowni należy zachować ostrożność, porządek i czystość.2. W pracowni należy nosić bezpieczne obuwie i fartuch laboratoryjny, a przy

pracy z substancjami szkodliwymi rękawiczki gumowe. Okrycia wierzchnie należy pozostawić w szatni wydziałowej.

3. Opuszczając stanowisko pracy należy sprawdzić czy wszystkie niepotrzebne urządzenia elektryczne, gaz i woda zostały wyłączone, drobny sprzęt odłożony na miejsce, a użyte naczynia laboratoryjne umyte i odłożone do suszenia.

4. Studenci nie mogą pracować w pracowni bez opieki pracownika dydaktycznego.

5. W pracowni nie wolno palić tytoniu, spożywać posiłków i napojów, aplikować kosmetyków. Nie używać do celów spożywczych naczyń laboratoryjnych.

6. Odczynniki należy przechowywać w odpowiednim porządku. Nie wolno trzymać żadnych substancji w niepodpisanych opakowaniach. Łatwopalne rozpuszczalniki, a także stężone kwasy i zasady można przechowywać w pracowniach pod wyciągiem tylko w ilościach zaspokajających bieżące potrzeby.

7. Prace z rozpuszczalnikami organicznymi należy prowadzić przy sprawnie działającej wentylacji. Podczas pracy nie wolno używać otwartego ognia. Etanol używany w pracowni jest skażony.

8. Prace z kwasami i zasadami należy prowadzić pod sprawnie działającym wyciągiem chemicznym.

9. Nigdy nie należy pipetować ustami substancji trujących, żrących lub innych szkodliwych dla zdrowia.

10. Odpadów substancji, które mogą stanowić zagrożenie dla środowiska naturalnego, nie wolno wylewać do zlewów. Należy je zlewać do szczelnych podpisanych butelek i przechowywać pod wyciągiem. Będą okresowo zbierane do zniszczenia.

11. Odpady innych stężonych substancji można wylewać do zlewu po ich znacznym rozcieńczeniu, obficie spłukując wodą z kranu.

12. Okna w pracowni można tylko uchylać w pozycji pionowej. Nie otwierać ich na oścież.

13. W razie zaistnienia nawet najmniejszego wypadku należy niezwłocznie powiadomić opiekującego się pracownią pracownika dydaktycznego.


3/33

WstępSzanowni Państwo,

Witamy na pracowni "Białka i kwasy nukleinowe".

Głównym celem naszych zajęć jest zapoznanie Państwa z metodami oczyszczania i frakcjonowania białek. Wszystkie ćwiczenia wykonują Państwo w parach. Każdy wykona zestaw czterech ćwiczeń. Ćwiczenie pierwsze (Białka HMG) zawiera elementy klasycznej i żmudnej procedury oczyszczania białek (homogenizacja materiału biologicznego i wyodrębnianie frakcji bogatej w oczyszczane białko, ekstrakcja, różnicowe wytrącanie, dializa, chromatografia jonowymienna, przygotowanie próbek do elektroforezy, elektroforeza białek i wizualizacja białek w żelu). Ćwiczenie drugie wykorzystuje natomiast nowoczesne złoża stosowane w chromatografii powinowactwa, umożliwiające oczyszczenie białka w krótkiej, jednoetapowej procedurze. Oczyszczenie ludzkiego SF2/ASF z komórek E. coli opiera się na oddziaływaniu z kompatybilnym złożem dodanego do SF2/ASF metodami inżynierii genetycznej znacznika, który stanowi w jednym przypadku krótka sekwencja aminokwasowa a w drugim określone białko. W przeciwieństwie do pierwszego ćwiczenia, w którym złoże do oczyszczania białek ułożone jest w kolumnie chromatograficznej, ćwiczenie drugie jest przykładem zastosowania złoża bez potrzeby użycia kolumny. Ćwiczenie to jest także przykładem tzw. mikropreparatyki. W ćwiczeniu trzecim zapoznają się Państwo z metodą elektroforetycznego rozdzielenia białek bez ich uprzedniej denaturacji. Ćwiczenie czwarte pozwoli Państwu poznać metodę sporządzania tzw. surowego lizatu komórek HeLa i określenia aktywności topoizomerazy I, która nacina superhelikalny DNA.

Podstawą zaliczenia fakultetu jest wykonanie wszystkich przewidzianych ćwiczeń i uzyskanie oceny pozytywnej ze sprawdzianu. Oceniając Państwa będziemy brać pod uwagę znajomość procedur, organizację pracy, jakość otrzymanych preparatów, zdolność do skomentowania rezultatów eksperymentu oraz wynik sprawdzianu kończącego ćwiczenia. Nie można poprawiać poszczególnych ćwiczeń. W uzasadnionych przypadkach dopuszczalne jest powtórzenie analizy elektroforetycznej uzyskanych preparatów.

Sprawdzian będzie składał się z kilku pytań opisowych. Pytania mogą dotyczyć rozwiązywania problemów laboratoryjnych lub odnosić się do podstaw teoretycznych metod pracy z białkami i DNA.


4/33

Zakres tematyki obowiązujacy do kolokwium zaliczeniowego:1. Izolacja białek ze źródeł „naturalnych” (np. grasicy cielęcej) i białek

rekombinowanych z systemów heterologicznych.2. Metody oczyszczania białek ze szczególnym uwzglednieniem RÓŻNYCH

metod chromatograficznych.3. Elektroforeza białek jako narzędzie analizy preparatów białkowych.

W trakcie całych zajęć prosimy o:1. Bezwzględne przestrzeganie regulaminu pracowni.2. Prowadzenie dziennika laboratoryjnego zawierającego obliczenia i

notatki związane z wykonywanymi ćwiczeniami.3. Wybieranie na każdych ćwiczeniach osoby odpowiedzialnej za

pozostawienie porządku w pracowni.4. Ogólną dbałość o salę.

Życzymy Państwu przyjemnych ćwiczeń,

Zespół prowadzący


5/33

Literatura ogólna1. Hames, B.D., Hooper, N.M. i Houghton, J.D. (1999) Krótkie wykłady:

biochemia. PWN, Warszawa.2. Kłyszejko-Stefanowicz, L., red. (1999) Ćwiczenia z biochemii. PWN,

Warszawa.3. Witwicki, J. i Ardelt, W., red. (1984) Elementy enzymologii. PWN, Warszawa.4. autor anonimowy (1998) Protein purification. handbook. Amersham

Pharmacia Biotech, Uppsala. (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/862381B4A8A84D5DC125726C0002CD93/$file/18114275AC.pdf)

Osobom, które nie uczestniczyły w zajęciach „Biologia molekularna”, zalecamy zapoznanie się z komentarzem do tych ćwiczeń zamieszczonym na stronie: www.biol.uw.edu.pl/zbm/

Zespół prowadzący zajęcia

1. Jan Fronk, pok. 103/D, tel.: (+22) 55-43-1032. Takao Ishikawa, pok. 105/D, tel.: (+22) 55-43-1053. Barbara Kowalska-Loth, pok. 115/D, tel.: (+22) 55-43-1154. Piotr Kozłowski, pok. 108/D, tel.: (+22) 55-43-1085. Joanna Trzcińska-Danielewicz, pok. 108/D, tel.: (+22) 55-43-108


6/33

Ćwiczenie 1Oczyszczanie białek HMG z grasicy

cielęcej

WSTĘPBiałka HMG (High Mobility Group od ich ruchliwości na żelu podczas elektroforezy) należą do grupy białek strukturalnych chromatyny. Białka HMG są związane z chromatyną słabiej niż histony i dają się ekstrahować z chromatyny już 0,35 M chlorkiem sodu. Wszystkie białka HMG są rozpuszczalne w 2% kwasie trójchlorooctowym (TCA), które dzieli się na dwie grupy:

• rozpuszczalne w 10% TCA, małocząsteczkowe (m.cz. ok. 10-12 kDa): HMG 14 i HMG 17,

• nierozpuszczalne w 10% TCA, wielkocząsteczkowe (m.cz. ok. 26 kDa): HMG 1 i HMG 2 (stanowiące dominującą ilościowo grupę wśród białek HMG).

Ćwiczenie polega na wyizolowaniu chromatyny z grasicy cielęcej, ekstrakcji białek HMG 0,35 M chlorkiem sodu i oczyszczeniu białek HMG 1 i HMG 2 przy użyciu chromatografii jonowymiennej na kolumnie z CM-Sephadex C25 (kationit z grupą karboksymetylową).

Frakcje uzyskane w trakcie całej preparatyki zostaną poddane analizie na żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS (ryc. 1).

Ryc. 1. Obraz elektroforetyczny preparatów białek HMG 1 i HMG 2 na poszczególnych etapach oczyszczania. Z lewej strony wzorce masy cząsteczkowej. W czwartej studzience oczyszczone białka HMG 1 i HMG 2.


7/33

PROCEDURAUwagi ogólne:

1. W tym ćwiczeniu wszystkie bufory potrzebne do izolacji należy przygotować samodzielnie w oparciu o stężone roztwory przygotowane przez prowadzących (oznaczone ).

2. Białka HMG bardzo łatwo ulegają degradacji przez obecne w grasicy peptydazy. Dlatego też, izolację białek HMG należy wykonywać zawsze w obecności świeżo dodanego (niestabilny w roztworze wodnym) inhibitora peptydaz fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) oraz w temperaturze poniżej 4oC. Ćwiczenie należy wykonać w pracowni, trzymając próbki w lodzie i używając schłodzonych buforów, z wyjątkiem dializy i kolumny, które należy wykonać w chłodni. Na zajęciach poprzedzających ćwiczenia wymagające użycia wirówki K-23 przygotować probówki szklane wraz z gilzami, wstępnie zrównoważyć i pozostawić w lodówce do następnych zajęć do schłodzenia.

3. PMSF jest groźny dla błon śluzowych, oczu i skóry. Nigdy nie pipetować ustami. W przypadku kontaktu z PMSF należy natychmiast przemyć skórę (oczy) dużą ilością wody.

4. β-merkaptoetanol jest trucizną. Nigdy nie pipetować ustami. Stężonych roztworów używać tylko pod włączonym wyciągiem chemicznym. W przypadku kontaktu z β-merkaptoetanolem należy natychmiast przemyć skórę dużą ilością wody.

Materiał biologiczny:

Zamrożona grasica cielęca.

Odczynniki:

1. 1 M Tris-HCl, pH 7,52. 1 M Tris-HCl, pH 8,03. 0,5 M EDTA, pH 8,04. 5 M NaCl5. 100 mM PMSF w 96 % etanolu6. 14,3 M β-merkaptoetanol


8/33

7. Bufor do homogenizacji: 75 mM NaCl 25 mM EDTA, pH 8,0 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 0,1 mM PMSF (Dodać bezpośrednio przed użyciem odpowiednią ilość roztworu [5])

8. Bufor do ekstrakcji: 0,35 M NaCl 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 0,1 mM PMSF (Dodać bezpośrednio przed użyciem odpowiednią ilość roztworu [5])

9. 100% (w/v) kwas trójchlorooctowy (TCA)10. 70% etanol11. Bufor do dializy:

50 mM NaCl 10 mM β-merkaptoetanol 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,1 mM PMSF (Dodać bezpośrednio przed użyciem odpowiednią ilość roztworu [5])

12. Zawiesina CM-Sephadex C25 (dodać 0,5 g CM-Sephadex C25 do 200 ml buforu do dializy [11])Uwaga !!! Przygotować na ćwiczeniach poprzedzających chromatografię i pozostawić w lodówce do spęcznienia.

13. Bufor do elucji "niska sól": 0,3 M NaCl 10 mM β-merkaptoetanol 10 mM Tris-HCl, pH 8,0

0,1 mM PMSF (Dodać bezpośrednio przed użyciem odpowiednią ilość roztworu [5])14. Bufor do elucji "wysoka sól":

0,5 M NaCl 10 mM β-merkaptoetanol 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,1 mM PMSF (Dodać bezpośrednio przed użyciem odpowiednią ilość roztworu [5])

15. 100 mM Tris-HCl, pH 8,016. Bufor Laemmli'ego 5x (zob. Appendix pkt 1)


9/33

Wykonanie:

1. 2 g drobno pokrojonej grasicy homogenizować w 150 ml buforu homogenizacyjnego [7] (w schłodzonym mikserze 2 razy po 1 minucie przy maksymalnych obrotach).

2. Homogenat rozlać do schłodzonych szklanych probówek wirówkowych na 100 ml i zrównoważyć probówki wraz z zimnymi gilzami.

3. Homogenat wirować przy 3000 rpm przez 10 min. w 4oC w uprzednio schłodzonej wirówce K23.

4. Delikatnie zlać supernatant. Do osadu dodać około 70-100 ml buforu homogenizacyjnego [7], osad zawiesić bagietką i wirować jak wyżej.

5. Powtórzyć przemycie opisane w pkt. 4. Otrzymany osad chromatyny niezwłocznie użyć do izolacji HMG.

6. Do osadu chromatyny dodać 3 ml buforu ekstrakcyjnego [8], zawiesić osad bagietką i odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 min.

7. Supernatant przenieść do nowej szklanej probówki wirówkowej na 100 ml, zaś do osadu dodać kolejne 3 ml buforu ekstrakcyjnego [8], zawiesić osad bagietką i odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 min.

8. Supernatant połączyć z poprzednim supernatantem i wymieszać. Do probówki typu Eppendorf (oznaczonej nr 1) pobrać 200 µl połączonego supernatantu, dodać 50 µl 100% TCA [9], wymieszać i pozostawić w lodówce (nie zamrażać!) jako próbkę do elektroforezy.

9. Zmierzyć objętość pozostałego supernatantu i dodać do niego 100% TCA [9] do końcowego stężenia 2%.

10. Odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 10 min.11. Otrzymany supernatant przenieść do nowej szklanej probówki wirówkowej na

100 ml, dodać 100% TCA [9] do końcowego stężenia 12% i pozostawić do następnych ćwiczeń w lodówce (nie zamrażać!).

12. Odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 15 min. Supernatant odrzucić.Uwaga !!! Przy zlewaniu supernatantu bardzo łatwo zgubić drobny osad!

13. Osad przemyć 5 ml 70% etanolu [10] i odwirować w wirówce K23 przy 3000 rpm przez 15 min.

14. Osad podsuszyć w strumieniu zimnego powietrza z suszarki. W czasie suszenia nie trzymać probówek w lodzie.

15. W trakcie suszenia osadu namoczyć otrzymany od prowadzących woreczek dializacyjny w buforze do dializy [11].

16. Podsuszony osad rozpuścić w 1 - 2 ml buforu do dializy [11] i przenieść do woreczka dializacyjnego. Probówkę przepłukać 0,5 ml buforu do dializy [11] i następnie dodać go do woreczka dializacyjnego.

17. Preparat dializować w chłodni przez 30 min. wobec 250 ml buforu do dializy [11], wymienić bufor do dializy na świeży i prowadzić dializę kolejne 30 min.


10/33

18. W trakcie dializy uformować w chłodni 1 ml kolumnę z przygotowanej wcześniej zawiesiny CM-Sephadex C25 [12], kolumnę zrównoważyć poprzez przemycie 10 ml buforu do dializy [11].

19. Po zakończeniu dializy przenieść preparat z woreczka do 15 ml probówki typu Falcon. Do probówki typu Eppendorf (oznaczonej nr 2) pobrać 200 µl preparatu po dializie, dodać 50 µl 100% TCA [9], wymieszać i pozostawić w lodówce (nie zamrażać!) jako kolejną próbkę do elektroforezy.

20. Nanieść na kolumnę resztę preparatu po dializie i zacząć zbierać wyciek do 15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 3). Kiedy poziom roztworu zrówna się z górną powierzchnią złoża, na złoże delikatnie nawarstwić 10 ml buforu do dializy [11]. Dalej zbierać wyciek do tej samej probówki (nr 3).

21. Przeprowadzić elucję 5 ml buforu do elucji "niska sól" [13]. Zebrać całość wycieku do 15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 4).

22. Przeprowadzić elucję 5 ml buforu elucji "wysoka sól" [14]. Zebrać całość wycieku do 15 ml probówki typu Falcon (oznaczonej nr 5).

23. Zawartość probówek nr 3, 4 i 5 wymieszać, do każdej dodać 100% TCA [9] do końcowego stężenia 20% (po 0,2 ml TCA na każde 0,8 ml wycieku), wymieszać i pozostawić do następnych ćwiczeń w lodówce (nie zamrażać!).

24. Probówki oznaczone nr 1 i 2 odwirować w mikrowirówce przez 10 min., probówki oznaczone nr 3, 4 i 5 odwirować w wirówce Haereus przy 3000 rpm przez 15 min. Supernatanty zlać, zaś otrzymane osady (mogą być słabo widoczne) przemyć 70% etanolem [10] (osady z probówek nr 1 i 2 - 1 ml , a osady z probówek 3, 4 i 5 - 5 ml), odwirować jak wyżej i starannie usunąć supernatanty znad osadów.

25. Osady wysuszyć strumieniem zimnego powietrza z suszarki.26. Przygotować próbki do elektroforezy; wysuszone osady zawiesić w 30 µl

100 mM Tris-HCl [15], następnie do każdej z próbek dodać 7,5 µl buforu Laemmli'ego 5x [16].Uwaga !!! Jeśli po dodaniu buforu Laemmli'ego kolor roztworu zmieni się z fioletowego na pomarańczowy, należy skonsultować się z prowadzącymi. Przygotowane próbki należy przechowywać w temperaturze -20°C.

27. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny przygotowanych próbek w 15% żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS (zob. Appendix pkt. 1), nakładając po 25 µl każdej próbki i zachowując resztę w zamrażalniku na wypadek konieczności powtórzenia elektroforez.

Literatura do ćwiczenia:

1. Goodwin, G.H., Nicolas, R.H. i Johns, E.W. (1975) Biochim. Biophys. Acta 405, 280291.

2. Johns, E.W. (1982) The chromosomal proteins. Academic Press, London.3. Kłyszejko-Stefanowicz, L. (1995) Cytobiochemia. PWN, Warszawa.


11/33

Ćwiczenie 2 Oczyszczanie rekombinowanego ludzkiego

białka SF2/ASF z komórek bakterii Escherichia coli

WSTĘPBiolodzy molekularni chcąc uzyskać interesujące go białko w dużych ilościach sięgają często po techniki izolacji rekombinowanych białek w układzie heterologicznym. W tym celu konstruuje się wektor ekspresyjny niosący cDNA interesującego białka z dołączonym znacznikiem pozwalającym na wydajną izolację rekombinowanego białka metodą chromatografii powinowactwa. Jednak to, czy rekombinowane białko będzie dogodnym modelem do badań, zależy w znacznej mierze od jego naturalnych właściwości. Trudności z izolacją danego białka można ominąć stosując różne warunki hodowli i izolacji, zmieniając docelowe komórki do produkcji, a także dołączając różne rodzaje znaczników. W niektórych wypadkach pomocne może być wyrażanie w systemie heterologicznym skróconego białka, np. pozbawionego "problematycznych" domen białkowych. Niniejsze ćwiczenie ma na celu zbadanie wpływu przyłączonego znacznika i długości wyrażanego polipeptydu na sposób i wydajność izolacji białka. Badanymi znacznikami są: sekwencja sześciu histydyn (6xHis) oraz białko transferazy glutationowej ze Schistosoma japonicum (GST).

Ćwiczenie polega na oczyszczeniu z bakterii Escherichia coli białka ludzkiego czynnika splicingowego 2 (SF2/ASF). W cząsteczce białka SF2/ASF (248 reszt aminokwasowych) można wyróżnić dwie domeny RRM (RNA Recognition Motif), które obejmują aminokwasy [1-194] i domenę SR bogatą w powtórzenia seryna/ arginina (pozostała część białka). Domena SR zmniejsza rozpuszczalność białka SF2/ASF i jej obecność powoduje, że w komórkach ssaków SF2/ASF jest gromadzony w postaci tzw. spekli (z ang. speckles), a w komórkach bakteryjnych jest słabo rozpuszczalny. Dopiero fosforylacja reszt serynowych w powtórzeniach SR zwiększa rozpuszczalność SF2/ASF.

W ćwiczeniu wykorzystane zostaną trzy konstrukty niosące cDNA białka SF2/ASF – jeden z przyłączonym znacznikiem 6xHis, dwa w fuzji z GST, z których jeden niesie sekwencję kodująca pełne białko SF2/ASF, a drugi tylko jego domeny RRM (SF2/ASF[1-194]).

Sporządzenie pierwszego konstruktu zakłada oczyszczanie SF2/ASF z dołączonym znacznikiem 6xHis przy pomocy chromatografii powinowactwa na


12/33

unieruchomionych jonach metali. W przypadku tego ćwiczenia izolacja zostanie przeprowadzona w warunkach denaturujących. W oczyszczaniu w warunkach denaturujących zawartość komórek rozpuszcza się w silnych i stężonych detergentach; 6 M chlorowodorku guanidyny lub 8 M moczniku. Silne detergenty mogą upłynniać także nierozpuszczalne agregaty białek powstające często przy wysokim poziomie ekspresji rekombinowanego białka (np. ciała inkluzyjne w E. coli). Jako złoże użyta będzie agaroza zawierająca jony Ni2+ chelatowane kwasem nitrylotrójoctowym (Ni-NTA agaroza). Białka posiadające rejon bogaty w reszty histydynowe łączą się z Ni-NTA agarozą w neutralnym pH z dużym powinowactwem (Kd = 10-13). Związane ze złożem białka wymywa się buforem o niższym pH (obniżenie pH powoduje uprotonowanie histydyny, a w konsekwencji ich oddysocjowanie od kompleksu Ni-NTA) lub dużym stężeniem imidazolu.

Na oczyszczanie białka SF2/ASF i SF2/ASF[1-194] w fuzji z GST pozwala zastosowanie złoża agarozowego z dołączonym kowalencyjnie zredukowanym glutationem. Zredukowany glutation jest naturalnym substratem dla glutationo-transferazy i wiąże się z dużym powinowactwem w zakresie pH od 6,5 do 9,5. Związane ze złożem białka wymywa się nadmiarem glutationu.

His-SF2/ASF będzie oczyszczany z bakterii E. coli TG1 zawierających wektor ekspresyjny pTRCHis (ryc. 2), kodujący SF2/ASF z dołączoną na jego N-końcu sekwencją sześciu histydyn (His-SF2/ASF) pod kontrolą promotora indukowalnego przez izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG).

GST-SF2/ASF i GST-SF2/ASF[1-194] będą oczyszczane z bakterii E. coli BL21-DE3 zawierających wektor ekspresyjny pGEX-4T (ryc. 3) kodujący GST, do którego wprowadzono fragmenty DNA kodujące SF2/ASF lub SF2/ASF[1-194] tak, aby powstające białko fuzyjne posiadało GST na N-końcu. Gen białka fuzyjnego znajduje się pod kontrolą promotora indukowalnego przez IPTG.

Frakcje uzyskane podczas oczyszczania zostaną poddane analizie na żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS. His-SF2/ASF migruje w żelu poliakryloamidowym z SDS jako białko o masie cząsteczkowej około 35 kDa. GST-SF2/ASF migruje w żelu poliakryloamidowym z SDS jako białko o masie cząsteczkowej około 50 kDa. GST-SF2/ASF[1-194] migruje w żelu poliakryloamidowym z SDS jako białko o masie cząsteczkowej około 45 kDa.


13/33

Ryc. 2. Wektor bakteryjny pTrcHis z kasetą ekspresyjną zawierającą:(i) Regulowany, silny promotor trc z sekwencją operatorową operonu

laktozowego, pozwalający na indukcję ekspresji przez dodanie do hodowli IPTG,

(ii) Antyterminator,(iii) Syntetyczne miejsce wiązania rybosomu,(iv) Kodon "start",(v) Sekwencję kodującą sześć reszt histydynowych,(vi) Miejsce wklonowania pożądanego cDNA,(vii) Terminator transkrypcji.


14/33

Ryc. 3. Wektor bakteryjny pGEX 4T z kasetą ekspresyjną zawierającą:(i) Regulowany, silny promotor tac z sekwencją operatorową operonu

laktozowego, pozwalający na indukcję ekspresji przez dodanie do hodowli IPTG,

(ii) Syntetyczne miejsce wiązania rybosomu,(iii) Kodon "start",(iv) Sekwencję kodującą transferazę glutationową,(v) Miejsce wklonowania pożądanego cDNA,(vi) 2 kodony "stop",(vii) Terminator transkrypcji

Podsumowując, ćwiczenie składa się z trzech części:(a) oczyszczanie rekombinowanego białka His-SF2/ASF w warunkach

denaturujących(b) oczyszcznie rekombinowanego białka GST-SF2/ASF w warunkach

natywnych(c) oczyszczanie rekombinowanego polipeptydu obejmującego domeny RRM

białka SF2/ASF – GST-SF2/ASF[1-194] w warunkach natywnych.


15/33

PROCEDURAUwagi ogólne:

1. Wykonanie ćwiczenia należy podzielić na dwa dni zajęć – jednego dnia wykonać oczyszczanie białka His-SF2/ASF, drugiego oczyszczanie białek w fuzji z GST. GST-SF2/ASF i GST-SF2/ASF[1-194] należy oczyszczać równolegle, w ten sposób, że każda osoba z pary zajmuje się jednym z białek.

2. Próby ze wszystkich trzech części będą analizowane na jednym żelu poliakryloamidowym.

3. Jeśli nie zostało podane inaczej, po pobraniu prób do analizy elektroforetycznej wszystkie frakcje chromatograficzne należy zamrozić i zachować do momentu obejrzenia wyników, na wypadek konieczności wykonania dodatkowej elektroforezy.

5. Wszystkie wirowania należy wykonać w mikrowirówce przy maksymalnych obrotach.

6. W ćwiczeniu używa się małych ilości złóż chromatograficznych, które łatwo zgubić na poszczególnych etapach. Należy postępować z nim ostrożnie, szczególnie uważając, aby po wirowaniu nie wciągnąć pipetą złoża razem z supernatantem.

1. Oczyszczanie rekombinowanego białka His-SF2/ASF (warunki denaturujące)

Uwagi ogólne:

Wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze pokojowej.

Procedura wykonana przed ćwiczeniami:

Do komórek bakterii E. coli, szczep TG1 wprowadzono plazmid pTrcHis niosący sekwencję kodującą białko SF2/ASF. Takie bakterie hodowano w podłożu płynnym w temp. 37°C z wytrząsaniem. Gdy hodowla osiągnęła OD600=0,9 (gęstość optyczna mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 600 nm), pobrano część bakterii jako próbę nieindukowaną a w pozostałej hodowli indukowano ekspresję His-SF2/ASF (0,25 mM IPTG, przez 4 godz.). Po zakończeniu ekspresji bakterie odwirowano, zawieszono w buforze PBS (skład zob. część (b)) i poddano sonikacji. Tak samo postąpiono z bakteriami nieindukowanymi IPTG.


16/33


zamrożona po sonikacji zawiesina bakterii E. coli wyrażających rekombinowane ludzkie białko His-SF2/ASF

Odczynniki:

1. Bufor B:100 mM NaH2PO4 10 mM Tris-HCl pH 8,08 M mocznik

2. 50% zawiesina Ni-NTA agarozy w buforze B (100 µl)3. Bufor do płukania:

bufor B pH 6,44. Bufor do elucji:

bufor B pH 4,05. Bufor Laemmli'ego 5x (zob. Appendix pkt. 1)

Wykonanie:

1. Otrzymaną zawiesinę bakterii odwirować przez 10 min.2. Supernatant zebrać do nowej probówki (wykorzystać probówki 2 ml

otrzymane od prowadzących). Z supernatantu pobrać 5 µl i przenieść do probówki podpisanej A1, zachować do elektroforezy. Supernatant odrzucić a osad zawiesić w 2 ml buforu B [1] i inkubować z mieszaniem przez 40 min.

3. Odwirować przez 10 min. Supernatant zebrać do nowej 2 ml probówki. Z supernatantu pobrać 20 µl i przenieść do probówki podpisanej A2, zachować do elektroforezy.

4. Supernatant przenieść do probówki z zawiesiną Ni-NTA agarozy [2].5. Inkubować ze złożem przez 1 godz. z mieszaniem, następnie odwirować

przez 1 min.6. Pipetą zebrać supernatant (białka niewiążące się do złoża) do nowej

probówki.7. Złoże przepłukać 3×1 ml buforu B [1]. Za każdym razem kilkakrotnie

wstrząsnąć probówką i wirować przez 1 min., następnie zebrać supernatant znad złoża, pierwszą porcję przenieść do nowej probówki, pozostałe można wylać.

8. Złoże przepłukać 1 ml buforu do płukania [3]. Wirować j.w., zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki.

9. Białko eluować 4 razy porcjami po 80 µl buforu elucyjnego [4]. Wirować j.w. i zebrać wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z każdej frakcji elucyjnej pobrać po 5 µl i przenieść do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej A3, zachować do elektroforezy.

10. Następnie do probówek A1, A2 i A3 dodać po 5 µl buforu Laemmli'ego 5×


17/33

[5]. Dodatkowo do elektroforezy przygotować próbkę kontrolną A0, otrzymaną od prowadzących. Próbka zawiera 20 µl odwirowanej po sonikacji zawiesiny bakterii nieindukowanych IPTG i 5µl buforu Laemmli'ego 5x [5]). Próbki do elektroforezy należy przechowywać w temperaturze -20°C. Uwaga !!! Jeśli po dodaniu buforu Laemmli'ego kolor roztworu zmieni się z fioletowego na pomarańczowy, należy dodać kroplę NaOH.

2. Oczyszczanie rekombinowanego białka GST-SF2/ASF (warunki natywne)

Uwagi ogólne:

1. Wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze pokojowej, trzymając próby w lodzie i używając schłodzonych buforów.

2. Zwróć uwagę, że w tej części ćwiczenia stosuje się bufor PBS o dwóch różnych stężeniach: 10× i 1×


Do komórek bakterii E. coli, szczep BL21 wprowadzono plazmid pGEX-4T niosący sekwencję kodującą białko SF2/ASF. Takie bakterie hodowano w podłożu płynnym w temp. 37°C z wytrząsaniem. Gdy hodowla osiągnęła OD600=0,8 (gęstość optyczna mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 600 nm), pobrano część bakterii jako próbę nieindukowaną a w pozostałej hodowli indukowano ekspresję GST-SF2/ASF (0,5 mM IPTG, przez 3 godz.). Po zakończeniu ekspresji bakterie odwirowano, zawieszono w 10 mM β-merkaptoetanolu w H2O i sonikowano. Tak samo postąpiono z bakteriami nieindukowanymi IPTG.


zamrożona po sonikacji zawiesina bakterii E. coli wyrażających rekombinowane ludzkie białko GST-SF2/ASF

Odczynniki:

1. PBS 10×1,4 M NaCl27 mM KCl100 mM Na2HPO4

18 mM KH2PO4, pH 7,3


18/33

2. PBS 1×0,14 M NaCl2,7 mM KCl10 mM Na2HPO4

1,8 mM KH2PO4, pH 7,33. 50% zawiesina glutationo-agarozy w PBS 1× (100 µl)4. Bufor do elucji: 50 mM Tris-HCl pH 7,8 20 mM glutation5. Bufor Laemmli'ego 5x (zob. Appendix pkt. 1)

Wykonanie:

1. Otrzymaną zawiesinę bakterii odwirować przez 10 min.2. Supernatant zebrać do nowej probówki (wykorzystać probówki 2 ml

otrzymane od prowadzących). Z supernatantu pobrać 20 µl i przenieść do probówki podpisanej B1, zachować do elektroforezy. Do pozostałego supernatnatu (ok. 2 ml) dodać 1/10 objętości PBS 10× [1] i wymieszać.

3. Przenieść supernatant do probówki z zawiesiną glutationo-agarozy [3].4. Inkubować ze złożem przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze

pokojowej, następnie odwirować przez 1 min.5. Pipetą zebrać supernatant (białka niewiążące się do złoża) do nowej

probówki.6. Złoże przepłukać 3×1 ml PBS 1× [2]. Za każdym razem kilkakrotnie


7. Białko eluować 2×100 µl buforu elucyjnego [4], Wirować j.w. i zebrać wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z każdej frakcji elucyjnej pobrać po 10 µl i przenieść do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej B2, zachować do elektroforezy.

8. Następnie do probówek B1 i B2 dodać po 5 µl buforu Laemmli'ego 5× [5]. Dodatkowo do elektroforezy przygotować próbkę kontrolną B0, otrzymaną od prowadzących. Próbka zawiera 20 µl odwirowanej po sonikacji zawiesiny bakterii nieindukowanych IPTG i 5µl buforu Laemmli'ego 5x [5]). Próbki do elektroforezy należy przechowywać w temperaturze -20°C.


19/33

3. Oczyszczanie rekombinowanego białka GST-SF2/ASF[1-194] (warunki natywne)

Uwagi ogólne:

Wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze pokojowej, trzymając próby w lodzie i używając schłodzonych buforów.


Do komórek bakterii E. coli, szczep BL21 wprowadzono plazmid pGEX-4T niosący sekwencję nukleotydową kodującą fragment białka SF2/ASF odpowiadający domenom RRM (SF2/ASF[1-194]). Ekspresję prowadzono tak, jak w przypadku pełnego bialka SF2/ASF (zob. część (a)) Po zakończeniu ekspresji bakterie odwirowano, zawieszono w buforze PBS 1× (zob. niżej) i sonikowano.


zamrożona po sonikacji zawiesina bakterii E. coli wyrażających rekombinowane ludzkie białko GST-SF2/ASF[1-194]

Odczynniki:1. PBS 1×2. 50% zawiesina glutationo-agarozy w PBS 1× (100 µl)3. Bufor do elucji: 50 mM Tris-HCl pH 7,8

20 mM glutation4. Bufor Laemmli'ego 5× (zob. Appendix pkt. 1)

Wykonanie:1. Otrzymaną zawiesinę bakterii odwirować przez 10 min.2. Supernatant zebrać do nowej probówki (wykorzystać probówki 2 ml

otrzymane od prowadzących). Z supernatantu pobrać 20 µl i przenieść do probówki podpisanej C1, zachować do elektroforezy.

3. Przenieść supernatant do probówki z zawiesiną glutationo-agarozy [2].4. Inkubować ze złożem przez 1 godzinę z mieszaniem w temperaturze

pokojowej, następnie odwirować przez 1 min.5. Pipetą zebrać supernatant (białka niewiążące się do złoża) do nowej

probówki.6. Złoże przepłukać 3×1 ml PBS 1× [1]. Za każdym razem kilkakrotnie



20/33

7. Białko eluować 2×100 µl buforu elucyjnego [3], Wirować jw. i zebrać wyeluowane frakcje do nowych probówek. Z każdej frakcji elucyjnej pobrać po 10 µl i przenieść do JEDNEJ wspólnej probówki podpisanej C2, zachować do elektroforezy.

8. Następnie do probówek C1 i C2 dodać po 5 µl buforu Laemmli'ego 5× [4]. Próbki do elektroforezy należy przechowywać w temperaturze -20°C.

4. Analiza elektroforetycznaPo wykonaniu wszystkich części ćwiczenia 2 przeprowadzić rozdział elektroforetyczny przygotowanych prób w 12% żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS, nakładając po 20 µl prób A0 – A3, B0 – B2, C1, C2 oraz całość mieszaniny białek wzorcowych otrzymanej od prowadzących (zob. Appendix pkt. 1).


1. Hoffman, A. i Roeder, R.G. (1991) Nucl. Acids Res. 19, 6337-6338.2. autor anonimowy (2003) The QIAexpressionist: a handbook for high-level

expression and purification of 6xHis-tagged proteins. QIAGEN, Hilden. (http://www1.qiagen.com/HB/QIAexpressionist_EN)

3. http://www.sigmaaldrich.com (szukaj opisu dla "N 3158")4. autor anonimowy (2002) GST Gene Fusion Systems – Handbook, Amersham

Biosciences. (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/87478CFA7E09E0C7C1256EB400417E59/$file/18115758.pdf)

5. autor anonimowy (2007) Affinity chromatography. Principles and methods, GE Healthcare (http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/91D3DF5DE303E8B6C1256EB400417F34/$file/18102229AE.pdf)


21/33

http://www1.qiagen.com/HB/QIAexpressionist_EN

http://www1.qiagen.com/HB/QIAexpressionist_EN

http://www.sigmaaldrich.com/

http://www.sigmaaldrich.com/

http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/87478CFA7E09E0C7C1256EB400417E59/$file/18115758.pdf




http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/91D3DF5DE303E8B6C1256EB400417F34/$file/18102229AE.pdf




Ćwiczenie 3Elektroforeza natywna białek- BN-PAGE

(Blue native electrophoresis)

WSTĘPOprócz popularnie stosowanej elektroforezy denaturującej w systemie Laemmlie’go, którą znają Państwo z szeregu wcześniejszych ćwiczeń istnieją też inne systemy rozdziału białek, zarówno denaturujące jak i natywne. To ćwiczenie ma na celu zapoznanie Państwa z jedną z odmian elektroforezy natywnej. Białka w roztworze wodnym, w pH różnym od ich punktu izoelektrycznego (pI), są cząsteczkami wykazującymi ładunek wypadkowy różny od zera, czyli są jonami o przewadze któregoś z ładunków (w pH powyżej pI są anionami, w pH poniżej pI są kationami). Na kierunek migracji ma wpływ znak jonu, zaś na tempo migracji wielkość ładunku oraz wielkość i kształt cząstki. Cząsteczki o większym ładunku i mniejszym promieniu cząstki wędrują szybciej. Problemem w takim systemie jest rozdział białek zasadowych w standardowych aparacikach używanych w laboratorium i w dostępnych systemach buforowych. Rozwiązaniem jest opłaszczenie białek ładunkiem ujemnym bez ich jednoczesnej denaturacji. Uzyskujemy to stosując niebieski barwnik Serva Blue G który jest anionem i łącząc się z białkami nadaje im wypadkowy ujemny ładunek. Elektroforeza BN-PAGE jest prowadzona w obecności tego barwnika.

Elektroforezą natywną można rozdzielać kompleksy białek i sprawdzać obecność form oligomerycznych. Wymaga ona jednakże większych ilości białek niż elektroforeza denaturująca.

Państwa zadaniem będzie rozdzielenie otrzymanych od prowadzących próbek białek za pomocą elektroforezy denaturującej oraz natywnej i porównanie wyników.

Uwagi ogólne:

Elektroforezę natywną należy prowadzić w nieobecności detergentu! Należy dokładnie umyć szybki oraz aparat przed przystąpieniem do wylania żelu i rozdziału. Próbek do rozdzielenia jest 4, więc zarówno elektroforezę natywna jak i denaturującą rozdzielają po 2 pary na każdym żelu.


22/33

Próbki białek otrzymane od prowadzących:

1. białka UP1-TAT, EGFP-TAT, GST, albumina w ilości 5 µg (elektroforeza natywna)

2. białka UP1-TAT, EGFP-TAT, GST, albumina w ilości 0,5 µg (elektroforeza denaturująca)

Do próbek nanoszonych na elektroforezę natywną należy dodać odpowiednią ilość 10 mM Tris-HCl pH 8,0, która ułatwi nanoszenie próbek na żel poliakryloamidowy.

Odczynniki:

1. Przygotowanie żelu natywnego:

Żel rozdzielający 10%: 2 ml mieszaniny monomerów akryloamidu, 0,8 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 3,2 ml wody, 40 µl APS, 5 µl TEMEDŻel zagęszczający 4%: 0,2 ml mieszaniny monomerów akryloamidu, 0,82 ml wody, 0,48 ml 0,625 M Tris-HCl pH 6,8, 20 µl APS, 4 µl TEMED naważka barwnika Serva Blue G

Bufor katodowy (około 100 ml):

100 mM glicyna doprowadzona Tris Base do pH 8,0, po nałożeniu próbek zmieszać z 0,002% Serva Blue G (należy uprzednio rozpuścić w małej ilości buforu katodowego)

Bufor anodowy (około 200 ml): 100 mM Tris-HCl pH 8,8

Barwnik do próbek : 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 40% glicerol, 0,5% Serva Blue G

Wykonanie:

Elektroforeza natywna: 1. Aparat do elektroforezy należy starannie wypłukać z pozostałości SDS,

podobnie szybki i inne przybory.2. Wylać żel.3. Próbki białka wymieszać z barwnikiem do próbek, pozostawić na 10 min. i

nanieść na żel.


23/33

4. Po naniesieniu próbek ostrożnie wymieszać naważkę barwnika z buforem katodowym w aparacie.

5. Rozdzielić białka przy natężeniu prądu około 15 mA. W połowie przebiegu należy przerwać na chwilę rozdział i wymienić bufor katodowy na nową porcję bezbarwnego buforu.

Elektroforeza denaturująca:Rozdzielić próbki metodą denaturującą zgodnie z opisem w Appendix pkt 1. W

pierwszej kieszonce należy nanieść wzorce.


1. Michael Niepmann, Junfeng Zheng , Discontinuous native protein gel, electrophoresis , Electrophoresis 2006, 27, 3949-3951


24/33

Ćwiczenie 4Oznaczanie aktywności ludzkiej

topoizomerazy I w ekstraktach jądrowych komórek HeLa

Ludzka topoizomeraza I jest jądrowym enzymem katalizującym reakcję relaksacji DNA. Oznaczenie aktywności tego enzymu wykonuje się badając zdolność do relaksacji superhelikalnego plazmidu przez kolejne rozcieńczenia preparatu enzymu. W niniejszym ćwiczeniu aktywność enzymu definiujemy jako ilość topoizomerazy I potrzebną do zrelaksowania w ciągu 0,5 godziny w 37oC 0,1µg plazmidu pBR322 w 50 procentach.

Ćwiczenie polega na przygotowaniu ekstraktu jądrowego komórek HeLa i oznaczenie w nim aktywności topoizomerazy I.

Materiał biologiczny: 10 mln komórek HeLa przepłukanych buforem PBS i zamrożonych.

Odczynniki: Bufor P2: 3 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 mM Tris-HCl pH

7,8 10% Triton X-100 w buforze P2 5 M NaCl 100 mM PMSF 1,4% agaroza w buforze TAE bufor TAE preparat plazmidu pBR322 Bufor relaksacyjny: 120 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 10

mM β-merkaptoetanol, 40 mM Tris-HCl pH 7,5 Albumina 10 mg/ml bufor STOP: 27% sacharoza, 0,67% SDS, 67 mM EDTA, Orange G

Uwaga! Wszystkie czynności wykonywać w lodzie używając schłodzonych probówek i wirówki. do buforu P2 dodać bezpośrednio przed użyciem PMSF do stężenia 1 mM.


25/33

Wykonanie:

Przygotowanie ekstraktu jądrowego komórek HeLa

1. Osad komórek HeLa zawiesić w 2 ml buforu P2, dodać 20 µl roztworu Tritonu X-100. Przenieść do małej szklanej zlewki.

2. Homogenizować poprzez przeciąganie roztworu przez strzykawkę z igłą 15 razy.

3. Roztwór przenieść do probówki Eppendorfa 2 ml i wirować przez 5 min. przy 5 tys. obrotów.

4. Supernatant odrzucić a osad przepłukać 1 ml buforu P2. Odwirować j.w.5. Powtórzyć płukanie, odwirować j.w.6. Osad zawiesić w 200 µl buforu P2, starannie zmierzyć objętość próbki i

dodać NaCl do stężenia 0,42M. Ekstrakcję prowadzić 30 min. w lodzie z mieszaniem na kołysce.

7. Odwirować przy 15 tys. obrotów w ciągu 10 min. Zebrać supernatant, który stanowi frakcję ekstraktu jądrowego i zamrozić do następnych ćwiczeń.

Oznaczanie aktywności topoizomerazy I:

1. Pobrać 1 ml buforu reakcyjnego, dodać albuminę do stężenia 0,1 mg/ml.2. Do 10 probówek Eppendorfa odpipetować po 5 µl plazmidu pBR 322. Do

probówki kontrolnej dodać 5 µl buforu reakcyjnego z albuminą.3. W kolejnych probówkach Eppendorfa sporządzić następujace

rozcieńczenia ekstraktu jądrowego w buforze reakcyjnym z albuminą: 100x, 200x, 400x, 800x, 1600x, 3200x, 6400x, 12800x.

4. Do odpowiednio podpisanych probówek z plazmidem dodawać po 5 µl każdego z rozcieńczeń enzymu.

5. Próbki zwirować przez 20 sek. i inkubować przez 30 min. w łaźni wodnej w 37oC. Następnie zwirować ponownie i dodać po 5 µl buforu STOP.

6. Przeprowadzić rozdział elektroforetyczny próbek w 1,4% żelu agarozowym, pozwalając wyjść barwnikowi poza żel, po zakończeniu elektroforezy żel wybarwić w roztworze bromku etydyny, wykonać zdjęcie i ocenić aktywność enzymu.


26/33

Appendix

1. Elektroforeza białek w żelu poliakryloamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE)

Uwagi ogólne:

1. Akryloamid przed polimeryzacją jest silnie trujący. Nigdy nie pipetować ustami. Wszystkie czynności z akryloamidem wykonywać tylko w rękawiczkach.

2. Opary kwasu octowego są trujące. Nigdy nie pipetować ustami stężonego kwasu. Odbarwianie żelu przeprowadzać pod włączonym wyciągiem chemicznym.

Odczynniki:

1. Mieszanina monomerów: 30% (w/v) akryloamid 0,8% (w/v) N,N'-metylenobisakryloamid2. 1,5 M Tris-HCl, pH 8,83. 0,625 M Tris-HCl, pH 6,84. 1% (w/v) SDS5. 10% (w/v) nadsiarczan amonowy (APS)6. N,N,N',N'-tetrametylenodiamina (TEMED)7. Bufor do elektoforezy (pH 8,3):

0,025 M Tris 0,192 M glicyna 0,1% (w/v) SDS8. Mieszanina białek wzorcowych w buforze Laemmli'ego 1x:

220 kDa116 kDa97 kDa66 kDa45 kDa31 kDa21 kDa16 kDa

9. Bufor Laemmli'ego 5x: 0,325 M Tris-HCl, pH 6,8 10% (w/v) SDS


27/33

50% (w/v) glicerol 5% (v/v) β-merkaptoetanol 0,05% (w/v) błękit bromofenolowy 10. Roztwór do barwienia żelu (do wielokrotnego użycia):

0,2% (w/v) błękit Coomassie'go R-250 w roztworze woda:metanol:st. kwas octowy 5:5:1

11. 7,5% (v/v) kwas octowy

Wykonanie:

1. Złożyć ze sobą dwie bardzo czyste (przetarte dodatkowo etanolem) i suche płytki szklane przedzielone szarymi przekładkami. Jedna z płytek powinna być ustawiona wcięciem ku górze, zaś druga z płytek, dwoma zaokrąglonymi rogami na dół. Wokół tej drugiej powinna być owinięta pomarańczowa uszczelka zgrubieniem do środka (między płytki). Krawędzie górne płytek powinny być na tej samej wysokości, ale przekładki i uszczelka mogą wystawać powyżej górnych krawędzi płytek. Tak przygotowany komplet szybek ustabilizować czterema dużymi białymi klamrami (dwie na dole i po jednej na każdym boku). Między szybki włożyć biały grzebyk z 10 ząbkami. Zaznaczyć markerem na szybce punkt ok. 3 mm poniżej dolnej krawędzi ząbków grzebyka. Delikatnie wyciągnąć grzebyk.

2. Przygotować odpowiedni żel (10%-12%) mieszając ze sobą roztwory wg kolejności w tabeli poniżej.

Uwaga !!! TEMED zawsze dodawać na chwilę przed wylaniem żelu.

Roztwór 10%1 żel

10%2 żele

12%1 żel

12%2 żele

4%1 żel

4%2 żele

Mieszanina monomerów [1] 2.00 ml 4.00 ml 2.40 ml 4.80 ml 0.20 ml 0.40 mlWoda dejonizowana 1.90 ml 3.80 ml 1.50 ml 3.00 ml 0.90 ml 1.80 ml1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 [2] 1.50 ml 3.00 ml 1.50 ml 3.00 ml - -0,625 M Tris-HCl, pH 6,8 [3]

- - - - 0.30 ml 0.60 ml

1% SDS [4] 0.60 ml 1.20 ml 0.60 ml 1.20 ml 0.15 ml 0.30 ml10% APS [5] 40 µl 80 µl 40 µl 80 µl 20 µl 40 µlTEMED [6] 5 µl 10 µl 5 µl 10 µl 5 µl 10 µl

3. Mieszaninę wlać między płytki szklane ustawione na plastikowej tacy aż do poziomu zaznaczonego uprzednio na szybce. Na powierzchnię roztworu ostrożnie nawarstwić wodę na wysokość ok. 1 cm. Tak przygotowany 10% lub


28/33

15% żel rozdzielający pozostawić do spolimeryzowania (około 30 min. w temperaturze pokojowej, powinna pojawić się wyrażna granica między spolimeryzowanym żelem a warstwą wody). Następnie zlać wodę znad żelu.

4. Pod koniec polimeryzacji żelu rozdzielającego przygotować 4% żel zagęszczający mieszając ze sobą roztwory wg kolejności w tabeli powyżej. Uwaga !!! TEMED zawsze dodawać na chwilę przed wylaniem żelu.

5. Mieszaninę nawarstwić na żel rozdzielający do krawędzi szybki z wcięciem. Wsunąć grzebień i tak przygotowany żel zatężający pozostawić do spolimeryzowania (około 30 min. w temperaturze pokojowej).

6. Ostrożnie wyciągnąć grzebyk, a następnie trzymając szybki zdjąć klamry i gumową uszczelkę.

7. Umieścić żel w aparacie (szybką z wcięciem do środka aparatu), szybki umocować w aparacie małymi białymi klamrami. Wlać bufor do elektroforezy [7] do dolnego i górnego zbiornika.

8. Kieszonki w żelu przepłukać buforem do elektroforezy [7].9. Próbki do elektroforezy (także mieszaninę białek wzorcowych [8] otrzymaną

od prowadzących) zawierające bufor Laemmli'ego [9] ogrzewać przez 3 min. w 100oC.

10. Po zwirowaniu i schłodzeniu do temperatury pokojowej próbki nanieść na żel.11. Włączyć chłodzenie aparatu do elektroforezy (lekko odkręcić kran) i

podłączyć aparat do zasilacza (elektroda ujemna od strony kieszonek, elektroda dodatnia od dolnej krawędzi żelu).

12. Elektroforezę prowadzić przy napięciu około 100 V do czasu przesunięcia się barwnika do dolnej krawędzi żelu (około 1,5 godz.).

13. Wyjąć szybki z żelem z aparatu, wyciągnąć przekładki i rozłożyć szybki (delikatnie podważając jedną z nich). Obciąć warstwę żelu zagęszczającego (z kieszonkami).

14. Żel umieścić w naczyniu z roztworem do barwienia żeli [10].15. Żel barwić przez 20 min. (lub dłużej) w pudełku na plastikowej tacy. 16. Wyjąć żel z roztworu do barwienia [10] i odbarwiać go poprzez kilkukrotne

płukanie w 7% kwasie octowym [11] na gorąco (około 60-80oC) pod wyciągiem chemicznym.

Literatura:

Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685.


29/33

2. Elektroforeza DNA w żelu agarozowymUwagi ogólne:

1. Bromek etydyny jest silnym mutagenem i umiarkowanie silną trucizną. Należy założyć rękawiczki przed każdą pracą z roztworami zawierającymi bromek etydyny.

2. Promieniowanie ultrafioletowe (UV) jest niebezpieczne i należy go unikać. Żele należy oglądać w UV po przykryciu ich płytką szklaną i po założeniu okularów.

Odczynniki:

1. Agaroza (w proszku)2. Bufor do elektroforezy TAE 1x:

40 mM Tris-octan, pH 7,6 1 mM EDTA3. Barwnik do elektroforezy oranż G 10x

0,4% (w/v) oranż G 50% (w/v) glicerol

4. wzorzec wielkości: DNA, GeneRuler100 bp Plus (14 fragmentów DNA, wielkość w bp: 3000, 2000, 1500, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 i 100 pz)

5. bromek etydyny (1 µg/ml)

Wykonanie:

1. Odważyć 0,5 g agarozy [1] potrzebne do przygotowania 50 ml 1% żelu.2. Do odważonej agarozy [1] dodać bufor do elektroforezy TAE 1x [2] i ogrzać

w kuchence mikrofalowej do rozpuszczenia się agarozy.3. Złożyć aparacik do elektroforezy (włożyć przekładki i grzebień).4. Po lekkim schłodzeniu agarozy, wylać żel o grubości około 0,5 cm (około

40 ml agarozy) i pozostawić go do zastygnięcia.5. Usunąć przekładki i grzebień, zalać żel buforem. Podłączyć aparat do

zasilacza (elektroda ujemna od strony kieszonek, elektroda dodatnia od dolnej krawędzi żelu) i sprawdzić, czy płynie prąd.

6. Odłączyć aparat od zasilacza. Próbki zawierające barwnik do elektroforezy oranż G [3] oraz wzorce wielkości DNA [4] nanieść na żel i ponownie podłączyć aparat.

7. Prowadzić elektroforezę przy napięciu 100 V do momentu przesunięcia się pomarańczowego barwnika do dolnej krawędzi żelu.

8. Wyjąć żel z aparatu i włożyć do naczynia z roztworem bromku etydyny [5].


30/33

Żel barwić przez około 15 min.9. Żel obejrzeć w świetle UV, korzystając z transiluminatora. Jeśli potrzeba (gdy

żel mocno świeci) odbarwić go płucząc w wodzie destylowanej.

Literatura:

Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2. wyd. CSHLP, Cold Spring Harbor.


31/33

3. Po co są te substancje w roztworach stosowanych podczas ćwiczeń?

woda – podstawowy rozpuszczalnik stosowany w biologii molekularnejTris (w formie Tris-HCl, Tris-octan, Tris-glicyna) – substancja buforująca, utrzymuje pH roztworu (7-8)glicyna (w formie glicyna-HCl) – substancja buforująca, utrzymuje pH roztworu (2-3)NaH2PO4 – substancja buforująca, utrzymuje pH roztworu (7-8)NaCl – substancja zapewniająca siłę jonową roztworu (także ciśnienie osmotyczne)SDS – mocny anionowy detergent, upłynniający wszystkie błony komórkowe i denaturujący białka, nadający im ujemny ładunek wypadkowyβ-merkaptoetanol (β-ME) – substancja redukująca, m.in. mostki dwusiarczkowe w białkachditiotreitol (DTT) – substancja redukująca, m. in. mostki dwusiarczkowe w białkachfluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) – nieodwracalny inhibitor peptydaz serynowychEDTA – substancja hamująca nukleazy poprzez wymiareczkowanie z roztworu ich kofaktorów – kationów dwuwartościowych, np. Mg2+

imidazol – substancja współzawodnicząca z histydyną o miejsca wiążące na Ni-NTA agaroziemocznik – substancja lizująca komórki i denaturująca białkaakryloamid (i N,N'-metylenobisakryloamid) – substancje wytwarzające w wyniku polimeryzacji ze sobą usieciowany poliakryloamidnadsiarczan amonowy (APS) – przeciwutleniacz używany przy polimeryzacji akryloamiduN,N,N',N'-tetrametylenodiamina (TEMED) – katalizator polimeryzacji akryloamidu i N,N'-metylenobisakryloamidukwas trójchlorooctowy (TCA) – substancja wytrącająca białka z roztworu, może przy okazji niestety nieodwracalnie zniszczyć ich aktywność biologicznąNaOH – substancja do zobojętnienia mocno zakwaszonych próbek przed elektroforeząglicerol – substancja obciążająca próbkę do elektroforezybłękit bromofenolowy – ciemnofioletowy barwnik migrujący do anody w trakcie SDS-PAGEbłękit Coomassie'go R-250 – barwnik tworzący niebieskie kompleksy z białkamikwas octowy – substancja do usuwania nadmiaru barwnika po barwieniu białka w żelu akryloamidowymetanol – substancja do odpłukiwania TCA z osadu białekagaroza – substancja wytwarzająca, po utworzeniu na gorąco roztworu i


32/33

ostudzeniu, usieciowany żeloranż G – pomarańczowy barwnik migrujący do anody w trakcie elektoforezy w żelu agarozowymbromek etydyny – barwnik tworzący z DNA kompleksy świecące w UV na pomarańczowoIPTG – izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozyd, analog laktozy, induktor ekspresji genów będących pod kontrolą promotora laktozowegoX-gal – 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd, substrat β-galaktozydazy, po hydrolizie dający niebieską pochodną indygo


33/33

biaŁka i kwasy nukleinowe - strona wydziału biologii uw · zakład biologii molekularnej biaŁka...

Documents