bcr e immunoglobuline
TRANSCRIPT
Cellula B
I B attivati si differenziano in plasmacellule
Plasmacellula
Morfologia della plasmacellula
La plasmacellula matura ha un nucleo eccentrico ed un abbondante citoplasma basofilo.
Immunoglobuline o anticorpi(proteine che legano l’Ag)
•Effettori specifici della RI adattativa umorale
Immunoglobuline o anticorpi(proteine che legano l’Ag)
• Glicoproteine multimeriche• Di membrana o secrete
Immunoglobuline o anticorpi(proteine che legano l’Ag)
Anticorpo: termine coniato da Karl Landsteiner nel 1900 per definire la sostanza che reagiva in maniera specifica con i batteri
•Esiste componente nel siero in grado di precipitare le tossine ed agglutinare i batteri: (antitossina, agglutinina, precipitina)
• siero di conigli precedentemente immunizzati per la tossina tetanica potevano trasferire la loro immunità ad animali non immunizzati
• Paul Ehrilich studio analogo sulla difterite • Emile Roux (Istituto Pasteur) dimostra
efficacia dell’antitossina nel trattamento dei bambini esposti al contagio da bacillo difterico
Emil Von Behring (premio Nobel 1901) e Shibasaburo KitasatoBerlino
Elettroforesi su carta
Molecole con carica netta positiva → catodo (-)
Molecole con carica netta negativa → anodo (+)
La mobilità elettroforetica dipende da:
• Intensità del campo elettrico
• Coefficiente frizionale (dimensione e carica della particella)
1939 A. Tiselius E.A. Kabat•Misero a punto un metodo elettroforetico per separare le
diverse proteine del siero.
Volendo effettuare in siero-elettroforesi si
impiega un tampone a pH alcalino il quale
conferisce alle molecole proteiche una carica negativa rendendole
solubili senza sottoporle a denaturazione.
Elettroforesi delle proteine del siero
Siero, non plasma, per eliminare l’interferenza del fibrinogeno
Separazione delle proteine in base alla loro carica
• Questa tecnica ha permesso di separare le albumine e le altre frazioni del siero, le alfa, beta e gamma globuline
in ordinata i valori
dell'assorbanza ed in ascissa la posizione delle
bande.
1939 A. Tiselius E.A. Kabat
• La frazione delle gamma globuline era presente in quantità più elevata nei sieri di animali immunizzati.
Le immunoglobuline sono presenti nella frazione delle gamma globuline del siero
Bande α , β e γ
•Gli anticorpi presenti in questa frazione di globuline immuni sono stati chiamati
immunoglobuline
Separazione delle proteine plasmatiche
Harvard University, Cohn e alcuni colleghi intrapresero una ricerca finalizzata a individuare il metodo migliore per la separazione delle proteine plasmatiche in frazioni stabili dotate delle loro
proprietà biologiche naturali,
(la tecnica più efficiente consisteva nel sottoporre il plasma a centrifugazione e poi a raffreddamento a 0°C. Dopo aggiunta di etanolo e tampone, la temperatura andava ridotta ulteriormente fin quasi al punto di congelamento; poi si aumentava il contenuto di etanolo fino a raggiungere il livello dell’8% in volume, si portava la temperatura a –3°C, il pH a 7,2 e la forza ionica a 0,14. In questa maniera si otteneva la precipitazione di tutte le componenti biologiche del sangue in quattro frazioni, in una sola delle quali (la seconda) si localizzava la quantità maggiore di gamma-immunoglobuline, nel 1964 ridenominate IgG.)
Gli anticorpi possono essere separati in base al PM
Ultracentrifugazione delle immunoglobuline su gradiente di saccarosio
ha permesso di risalire al peso delle immunoglobuline rappresentato come coefficiente di sedimentazione S
(maggiore è il peso della molecola più è elevato il valore di S)
La porzione gamma globulinica venne separata in due frazioni al elevato coefficiente di sedimentazione a 20°C in acqua:19S (PM 950.000 dal)7S (PM 150.000 dal)
Purificazione con resina a scambio anionico di carbossimetilcellulosa che consente di separare le proteine in base alla loro carica
Proteina purificata: 150.000 dal
Digestione proteolitica con papaina
Le frazioni I e II erano in grado di legare l’antigene ma non di ma non di precipitarlo
o agglutinarlo mentre la frazione III di formare cristalli a bassa forza ionica e a
pH neutro
50kDa 50kDa
50kDa
Rodney Porter Gerald Edelman (anni ’50-’60) (Premio Nobel 1972)Digestione proteolitica della frazione 7s (150.000) con papaina (enzima
derivato dalla papaya oggi usata come tenerizzatore della carne)
Rodney Porter Gerald Edelman (anni ’50-’60) (Premio Nobel 1972)
Alfred Nisonoff( 1923-2001)
continua il lavoro di Rodney Porter
Proteina purificata: 150.000 dal
Digestione proteolitica con pepsina
Prodotto di 2/3 delle gamma globuline totali in grado di precipitare l’antigene
indicando che doveva essere almeno bivalente
F(ab)’2
F(ab)’2 = frammento dimerico dell’Ig in contenente i due siti di legame dell’antigene
La digestione delle IgG con papaina o pepsina, ha permesso di costruire un modello di struttura delle Ig, perchéa determinati frammenti proteolitici corrispondono funzioni ben definite
Proteolytic fragments of an IgG molecule. IgG molecules are cleaved by the enzymes papain (A) and pepsin (B) at the sites indicated by arrows. Papain digestion allows separation of two antigen-binding regions (the Fab fragments) from the portion of the IgG molecule that binds to complement and Fc receptors (the Fc fragment). Pepsin generates a single bivalent antigen-binding fragment, F(ab¢)2.
Proteina purificata: 150.000 dal
gel filtrazione: 50.000 dal + 25.000 dal
Riduzione e alchilazione per rompere ponti disolfuro
Per rompere la struttura
quaternaria (dissociare le
subunità)
• 2 Catene leggere 25kD• 2 Catene pesanti 50-70kD
capra
capra
Ab riconoscevano solo catene H
Ab riconoscevano catene H e catene L
coniglio
Rodney Porter
Anticorpi prodotti contro il frammento fab riconoscevano sia le catene L che le catene H mentre anticorpi prodotti
contro il frammento fc riconoscevano solo le catene H
• 2 Catene leggere 25kD• 2 Catene pesanti 50-70kD
Sequenza aa di tutti i mielomi disponibili
Tutte le catene leggere variano tra di loro nella
parte NH3+ terminale ma non nella COO- terminale
Mieloma multiploNeoplasia plasmacellule secernenti
anticorpi
Proteine di Bence-jones
(<65000dal)
VL
CL
NH3+
COO-
VL
CL
NH3+
COO-
K (60%)
λ(40%)
Sequenza aa
Plasmacitomi coltivati in vitroNeoplasia plasmacellule
secernenti anticorpi
VH
CH
NH3+
COO-
δ , γ , α
(330aa)
1) Sequenza aa
2) Produzione di anticorpi monoclonali per determinare la classe diversa o isotipo
CH
CH
µ , ε(440aa) ISOTIPO
classe Catena pesante
sottoclassi Catena leggera
IgG γ γ 1, γ 2, γ 3, γ 4
κ , λ
IgM µ κ , λ
IgA α α 1, α 2 κ , λ
IgE ε κ , λ
IgD δ κ , λ
Classi (o isotipi) anticorpali
Markers isotipici:• permettono di classificare le
catene pesanti di una specie animale in classi e sottoclassi e quelle leggere in tipi e sottotipi.
• Se iniettati in un’altra specie si
creano Ab.
Markers allotipici:• esistono alleli multipli di
geni isotipici, piccole differenze aa. Non si creano Ab in animali.
• Politrasfusi e poligravide vedono queste piccole differenze.
• 2 Catene leggere 25kD• 2 Catene pesanti 50-70kD
Sito di legame con l’antigene
Sito di legame con l’antigene
Regioni variabili o cornice (FR1, FR2, FR3, FR4) ed ipervariabili (CDR1, CDR2, CDR3)
Markers idiotipici:• determinanti antigenici
presenti sulle regioni variabili ed ipervariabili.
• Noi stessi fabbrichiamo Ab che riconoscono questi siti.
• Rete idiotipica.
• Ab anti zona cornice (inducono una modificazione
conformazione: azione inibitoria o nulla)
• Ab anti parte ipervariabile (competono con Ag, possono inibire il
legame)
Network idiotipico
Flessibilità della regione cerniera
• Conferisce l’adattabilità della molecola alle diverse strutture antigeniche
IgA, IgD, IgG IgE, IgM
CH1/ CH1 CH1/ CH1
Regione cerniera CH2/ CH2
CH2/ CH2 CH3/ CH3
CH3/ CH3 CH4/ CH4
Regione cerniera
Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc: Fissazione del complemento
Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc:opsonizzazione
Funzioni effettrici mediate dal frammento Fc:ADCC (antibody dependent cell cytotoxicity)
Recettori Fc dei leucociti
MASTCELLULE
BASOFILI
sCD23 induce un aumento della produzione di IgE da parte di B linfociti
classe Catena pesante
sottoclassi Catena leggera
IgG γ γ 1, γ 2, γ 3, γ 4
κ , λ
IgM µ κ , λ
IgA α α 1, α 2 κ , λ
IgE ε κ , λ
IgD δ κ , λ
Struttura delle classi (o isotipi) anticorpali
180.000 Da
(Catena J = 15kDa)
• Primo isotipo secreto nel corso della RI primaria e prime ad essere espresse come Ig di membrana dai linfociti B che maturano nel fegato fetale e nel midollo osseo
• Concentrazione sierica 1 mg/ml• Bassa affinità ed elevata avidità• Molto efficaci nell’attivare il C• Mucose e latte materno• Esameri molto più potenti nell’attivare il
C
PM 900.000Da (19s)
IgG
• PM 150.000 (7s)• Concentrazione sierica 10 mg/ml • 1/3 territori extravascolari• Attivano il C• Poco avide ma molto affini • (rimuovono tossine e virus)
Concentrazione sierica: 3mg/ml (monomeriche 160.000-170.000 Dal 8% zuccheri)
latte, saliva, lacrime, muco(dimeri 400.000 Dal o tetrameri 600.000 Dal)
70.000Dal
IgA2 circa 20aa in meno nella zona cerniera di IgA1
Endocitosi R-dip
30µ g/ml
Nessuna funzione effetrice nota
Zona cerniera
1u internazionale = 2,4 ng/ml
80-100IU
Difesa contro i parassiti
Allergie
IgG 10 mg/ml
IgA 3 mg/ml
IgM 1 mg/ml
IgE 100IU1 IU=2,4ng/ml
IgD 30µ g/ml
Glicosilazione
• Importante per l’EMIVITA
• CITOFILIA• Mantengono la
conformazione allosterica
Superfamiglia delle immunoglobuline
CH1
CH2
CH3
CH4
I CINQUE ISOTIPI (O
CLASSI)DELLE
IMMUNO-GLOBULINE
nella forma di membrana
IgM
CH2
CH3
CH1
IgD
CH1
CH2
CH3
CH4
IgE
CH2
CH3
CH1
IgAIgG
CH2
CH3
CH1
• è necessaria la presenza di più fattori sierici per uccidere i batteri
• Il siero immune fresco contro il Vibrio Cholerae era in grado di distruggere i batteri ma se preriscaldato a 58°C non era più in grado di eliminare il patogeno
• L’aggiunta di siero fresco non immune ricostituiva l’attività litica• (gli anticorpi prendono parte alla fase di riconoscimento
specifico mentre la funzione effettrice dipende dal reclutamento di altre proteine sieriche)
Jules Bordet 1890