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Mikroskopie
griechischμικροσ = mikros = klein
σκοπειν = skopein = betrachten
“Kleines betrachten”
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Mikroskoptypen
Auflicht
Aufrechte Mikroskope Inverse Mikroskope
Durchlicht
Stereomikroskope
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3 Kernpunkte der Mikroskopie
• Um „Kleines betrachten“ zu können, müssen 3 Kernpunkte unbedingt beachtet werden
1. Vergrößerung
2. Auflösung
3. Kontrast
• Nur wenn diese 3 Kernpunkte beachtet werden, wird die Information eines Objektes wirklichkeitsnah in ein mikroskopisches Bild des Objekts übersetzt
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Gesamtvergrößerung am Mikroskop
• Vergrößerung =Maßstabszahl des Objektivs x Okularvergrößerung (z.B. Objektiv 10x und Okular 10x=>Gesamtvergrößerung 100fach)
MObjektiv x VOkular
Vergrößerung:Zweistufige Abbildung
Gegenstandsweite Bildweite
BildGegenstand
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Auflösung:Numerische Apertur
• Je größer der Öffnungswinkel des Objektives (2)• desto stärker gebeugtes
Licht wird eingefangen• desto kleinere Strukturen (1)
werden aufgelöst• Maß für Öffnungswinkel:
Numerische Apertur = N. A. = n x sin α• n = Brechzahl des Mediums
zwischen Präparat und ObjektivnLuft = 1, nGlas = 1,51
• α = halber Öffnungswinkel des Objektivs
1α
2
α
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Auflösung:Maximales Auflösungsvermögen
Prof. Ernst Abbe(1840 - 1905)
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Kontrast in Präparaten
Amplitudenobjekte• gefärbte Präparate oder
Präparate mit Eigenfärbung• Verringern der Amplitude =
Intensität aller oder einiger Wellenlängen des Lichts durch Absorption
A A
Phasenobjekte• ungefärbte Präparate • Verlangsamung der Licht-
geschwindigkeit in Präparat-struktur mit höherer Brechzahl als Umgebung (nP > nU). Keine Amplitudenverringerung
I λA
xA A
nU
I
I
nP
Präparatgrau farbig
x = Phasenverschiebung
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• Name:Dunkle Präparatstrukturen vor hellem Hintergrund
• Präparate:• Amplitudenobjekte
Transparente, gefärbte Präparate
• Mikroskopaufbau:• klassischer Strahlengang
Kontrast:Hellfeld
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Dunkelfeld
• Name:Helle Präparatstrukturen vor dunklem Hintergrund
• Amplitudenobjekte und Phasenobjekte
• Ungebeugtes Licht trifft nicht ins Objektiv • dunkler Hintergrund
• An Präparatstrukturen gebeugtes und gestreutes Licht trifft ins Objektiv • helle Präparatstrukturen
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Dunkelfeld im Durchlicht
• Präparate• Zellen, Bakterien,
Blutplättchen, Staub, lichtbeugende Strukturen und Partikel unterhalb der Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops(Ultramikroskopie)
• Mikroskopaufbau• Kondensor mit Ringblende• Licht bildet Hohlkegel, der das
Präparat unter großem Winkel beleuchtet
• N.A.Objektiv < N.A.Kondensor
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Kontrast:Phasenkontrast
• Prinzip des Phasenkontrasts: Phasenverschiebung wird in sichtbare Intensitätsdifferenz umgewandelt
• Resultat: Objektstrukturen dunkel auf grauem Hintergrund
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Phasenkontrast Aufbau
• Ringblende im Kondensor in vorderer Brennebene, Präparat durch Ringblende beleuchtet
• Phasenring in Austrittspupille des Objektivs aufgedampft
• Ringblende wird auf Phasenring abgebildet, unbeeinflusstes Licht geht nur durch Phasenring und wird um 90° phasen-gedreht und abgeschwächt
• Von Präparatstrukturen gebeugtes und phasenverscho-benes Licht trifft Phasenring nicht: keine Schwächung und zusätzlich noch weiter phasenverschoben
OkularZwischenbild
Phasenring inObjektivpupille
Objektiv
Präparat
Kondensor
Ringblende
Leuchtfeldblende
Kollektor
Lampe
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Kontrast:Einstellung des Phasenkontrasts
• Kondensor mit Ringblenden, Objektive mit Phasenringen
• Ringblende wird in Objektivpu-pille auf Phasenring abgebildet
• Ringblende und Phasenring durch Zentrierschrauben am Kondensor zur Deckung bringen
• Blick in den Tubus in hintere Brennebene des Objektivs bei entferntem Okular
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Köhlersche Beleuchtung
Prof. August Köhler (1866 - 1948)
• Optimale, homogene Ausleuchtung des Präparatsdurch Kondensor und Leuchtfeldblende
• Optimale Einstellung von Kontrast und Auflösungdurch Kondensor und Aperturblende
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Der Weg der Lichtstrahlen - von der Leuchte bis zum Auge
1 = Lampenwendel2 = Aperturblende 3 = Objektivpupille4 = Pupille des Beobachterauges
A = LeuchtfeldblendeB = PräparatebeneC = Zwischenbild im OkularD = Netzhaut im Beobachterauge
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Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?
• Einschalten der Lichtquelle und Prüfen, ob Licht sichtbar wird
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Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?
• Einstellen des richtigen Augenabstandes über Knickbrücke des Binokulartubus
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Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?
• Präparat scharf einstellen durch Bewegen des Fokussiertriebs
• Abgleich der Fokussebenen mittels fokussierbarem Okular
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Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?
Optimierung der Ausleuchtung des Präparats (“Köhlern“):
• Verkleinern der Leuchtfeldblende
• Scharfes Abbilden der Leuchtfeldblende durch Bewegen des Kondensortriebs
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Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?
• unscharfes Abbild der Leuchtfeldblende in der Präparatebene
• scharfes Abbild der Leuchtfeldblende
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Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?
• Zentrieren des Bildes mittels Zentrierschrauben am Kondensorträger
• Öffnen der Leuchtfeldblende
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Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?
• Leuchtfeldblende geschlossen und zenriert
• Leuchtfeldblende soweit geöffnet, dass ihr Rand das Sehfeld nicht mehr begrenzt
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Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?
Optimierung des Kontrasts durch Veränderung der Aperturblende:
• Zum Betrachten der Aperturblende wird ein Okular herausgenommen.
• Justierung der Aperturblende (Maximale Auflösung wenn die Aperturblende auf 66% bis 80% des Pupillendurchmessers eingestellt ist)
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.