Bakterilerin

Üretilmesi

Dr. Banu SANCAK

Mikrobiyal Üreme

Üreme = Hücrelerin sayısında artma

Bakteri üremesi icin gerekli olan faktörler

nelerdir?

BAKTERİ ÜREMESİ İCİN GEREKLİ

OLAN FAKTÖRLER

A.Fiziksel faktörler: 1. Sıcaklık

2. pH

3.Ozmotik basınç

B. Kimyasal faktörler 1. Karbon

2. Nitrojen, sülfür, fosfor

3. Oksijen

4. Mineraller: K, Mg, Ca…

5. Büyüme fakterleri: vitaminler,

a.a.ler, pürin, pirimidin

Bakterileri laboratuvar koşullarında

üretebiliyor muyuz? Neden?

1. Canlı Ortamlar

1) Deney hayvanları: Kobay, fare, sıçan, hamster, tavşan ve maymun.

2) Embryonlu yumurta: Sarı kese, amniyotik zar, allantoik boşluk,

embryo.

3) Hücre kültürleri: Hep-2, HeLa, Vero

2. Cansız Ortamlar

Besiyerleri

Fiziksel özelliklerine göre Besiyerleri

Katı besiyerleri

Yarıkatı besiyerleri

Sıvı besiyerleri

Agar

Experimented with medium to grow bacteria on.

He tried gelatin, but it did not work.

Wife of colleague recommended agar (a gelatin-like product derived from seaweed).

Didn’t melt, and bacteria couldn’t digest it.

He could also add various nutrients necessary to grow certain organisms.

Koch (pronounced Coke) originated use of a two part dish for growing bacteria (______ ______ named after Julius Petri, a German bacteriologist), and a technique for isolating pure bacterial colonies.

1843 – 1910

ROBERT KOCH

Agar

• Kompleks polisakkarit

• 100°C :sıvı, ~40°C katılaşır

Katı (%2-3 agar)

Yarıkatı (%0.3-0.5 agar)

Fiziksel özelliklerine göre Besiyerleri

Katı (%2-3 agar) : Koloni oluşumu

Yarıkatı (%0.3-0.5 agar): Hareket

Sıvı:Tortu, zar oluşması, bulanıklık

Besiyerleri

Katı besiyeri

• Kolonilerin değerlendirilmesi

Yarı-katı besiyeri Hareket özelliği

• Non motile bacteria will only be found at the site of inoculation

• Motile bacteria swim around go everywhere

Sıvı Besiyeri

It is used as

• enrichment media

• biochemical testing media

• Blood culture media

1. Temel (basit) 2. Zenginleştirici 3. Seçici 5. Ayırt edici 6. Transport 7. Saklama

Amaçlarına göre besiyerleri

1. Temel/Basit besiyeri

♪ Buyyon (nutrient broth) Pepton %1, et suyu %1, NaCl %0.05

♪ Adi agar (nutrient agar) %2-3 agar eklenmiş buyyon

İstenmeyen bakterilerin inhibisyonu

Antibiyotik, safra tuzu, boya …

2. Seçici besiyeri

Salmonella-Shigella agar

Mc Conkey agar, EMB agar, Endo agar

2. Seçici besiyeri

Salmonella-Shigella agar

gr/L Sığır eti özütü:……… 5 Pepton:……………………. 5 Laktoz:……………………. 10 Safra tuzları…………. 8.5 Sodyum sitrat………. 8.5 Sodyum tiyosülfat… 8.5 Ferrik sitrat:…………. 1 Nötral kırmızısı:…… 0.025 Brillant yeşili:………. 0.33 mg Agar………………………… 13.5

Lactose Lactose fermenter

Acid Neutral red

Pink colonies

Ferrous sulfide Black precipitate

H2S + Ferric ammonium citrate

EMB (Eosin Methylene Blue) dyes inhibit Gram (+) bacteria

selects for Gram (-) bacteria

G.I. Tract infections caused by Gram (-) bacteria

2. Seçici besiyeri

Gram negatif bakterileri üretir

Belli özelliklere göre bakterilerin

birbirinden ayırt edilmesini sağlar

3. Ayırt edici besiyeri

gr/L Pepton: …………………… 10

Laktoz: ……………. 10 K2HPO4: …………………. 2 Eozin Y:…………………… 0.4 Metilen mavisi:……… 0.06 Agar: ……………………… 15 pH:6.8

Eosin Methylene Blue (EMB) Agar

http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/

labmanua/lab3/embeacolony.html E. aerogenes

S. Typhimurium

P. aeruginosa

E. coli

ASİT oluşumu: pembe koloni (Enterobacter aerogenes)

ASİT: metalik refle (E. coli)

Laktoz fermentasyonu (-): renksiz (S. typhimurium)

MacConkey's (MAC)

MacConkey’s media is both selective & differential.

1. Selective because it only grows Gram-negative bacteria. Inhibits the growth of Gram-positive bacteria. 2. Differential because neutral red (pH-sensitive

dye) and lactose (type of sugar) have been added to media.

- Bacteria that use lactose for food (lactose fermenters), produce acidic metabolites that trigger the pH sensitive dye to turn pink.

- So lactose fermenting bacteria will grow in bright pink colonies while non-lactose fermenters will be colorless and clear. Enteric bacteria are the most frequently encountered

bacteria isolated from many types of clinical specimens. They are most commonly lactose fermenters.

3. Ayırt edici besiyeri

EMB, Endo by: Laktoz (+) ve (-) bakterilerin ayrımı

3. Ayırt edici besiyeri

27

Kanlı agar: Hemoliz özelliği kullanılarak beta ve alfa hemolitik Streptokokların ayrımı

Blood agar (BAP)

Most specimens received in a clinical microbiology lab are plated onto Blood Agar. It is an enriched medium that will grow even fastidious bacteria.

Also contains 5% sheep blood.

This media is not selective. It is enriched and differential: Certain bacteria produce enzymes called ___________that

act on red cells to produce either:

* ______ hemolysis: Enzymes lyse the blood cells completely, producing a clear area around the colony.

* _______ hemolysis: Incomplete hemolysis produces a greenish discoloration around the colony.

* _______ hemolysis: No effect on the red cells. Blood agar is usually inoculated from a patient’s throat swab. Microbiologist are trying to detect Group A beta hemolytic

Streptococcus pyogenes (a Gram-positive cocci-shaped bacteria that causes Beta hemolysis on blood agar.)

29

selective &

differential

media

4. Zenginleştirici besiyeri

30

Üreyebilmek için kan, serum gibi maddelere ihtiyaç gösteren

Özellikle nazlı bakteriler için

Kanlı agar Çikolata agar: Haemophilus influenzae, Neisseria spp

Kanlı agar (%5 kan) Selenit F besiyeri

Çikolata agar

5. Transport besiyeri

Amies besiyeri Stuart besiyeri Cary- Blair besiyeri

gr/L

Sodyum tiyoglikolat…… 1.5

Sodyum Klorür……………. 5

Disodyum Fosfat……….. 1.1

Agar……………………………… 5

pH: 8.5 V.cholerae transportunda kullanılabilir

Amies

Stuart

gr/L Pepton……………………… 10 Sodyum Klorür……….. 10 pH: 8.5

Kültür gecikecekse (> 6 saat) Cary Blair

tercih edilmeli

6. Saklama besiyerleri

Gliserollü triptik soy buyyon

Gliserollü beyin kalp infüzyon buyyon

Major Contribution to Culture

Media

Besiyerlerine ekim yöntemleri

nelerdir?

Ekim Yöntemleri

• Plak üzerine tek koloni ekim yöntemi

• Tüpte sıvı besiyerine ekim yöntemi

• Tüpte yarıkatı besiyerine ekim yöntemi

• Tüpte katı besiyerine ekim yöntemi

İnokulasyonda kullanılan araçlar

Öze – Yuvarlak (Katı besiyerine ekim)

– İğne (tüpte sıvı ve katı besiyerlerine ekim)

– Çengel (küf cinsi mantar ekimi)

Eküvyon

Streak Plate

Tek koloni ekim yöntemi

Tek koloni ekim yöntemi

Tek koloni ekim yöntemi

1. Aerop ve fakültatif anaerop kültür yöntemleri

• Etüv (normal atmosfer)

• Karbondioksitli etüv (%5-10CO2)

• Mumlu kavanoz (%5-10 CO2)

– 18-24 saat, 37 °C’de

2. Mikroaerofilik bakterilerin üretilmesi

Mumlu kavanoz

Grow best under reduced O2 levels and increased CO2 levels Normal Atmosphere:21 % O2, 0.3 to .03 % CO2

%1-4 O2

%5-10 CO2 (KAPNOFİLİK)

Mikroaerofiller Brucella abortus Campylobacter jejuni

1 .Redükleyici madde

(Tiyoglikolatlı besiyeri)

2. Anaerobik kavanoz

3. Anaerobik kabin

3. Anaerobik Kültür Metodları

• O2 girişini önlemek için redükleyici ajanlar içerir – Tiyoglikolik asit, sistein,

– Birçok mikroorg.nın üremesi için zengin besiyeri

• O2 tüpün 1/3 üst kısmına kadar penetre olmaktadır

• Tiyoglikolik asit (TGA): organik bir bileşik: HSCH2CO2H.

• thiol (mercaptan) + carboxylic acid ‘den mg.

• HAVA VARLIĞINDA okside olur:[SCH2CO2H]2.

3. Anaerobik Kültür Metodları

Tiyoglikolatlı besiyeri

Anaerobik kabin

3. Anaerobik Kültür Metodları

3. Anaerobik Kültür Metodları

Anaerobik kavanoz

Üreme Özellikleri

Sıvı besiyerinde üreme özellikleri 1. Yüzeyde halka ya da

zar (ring or pellicle) oluşumu

2. Flokülent (küçük parçalar)

3. Bulanıklık

4. Sediment

Katı besiyerinde üreme özellikleri

nedir?

Koloni Özellikleri

• Koloni büyüklüğü

• Koloni biçimi

• Koloni yapısı

• Koloni rengi

• Koloni kokusu

• Hemolitik aktivitesi

FYI

54

Colonial Morphology

Shape

Edge

Elevation

Size

Chromogenesis

Opacity

Surface

Consistency

Emulsifiability

Odor

55

Shape Edge Elevation

Koloni Tipleri S (Smooth) düzgün koloni

– Düzgün kenarlı, yuvarlak, homojen görünümlü, hafif kabarık koloniler.

– Örnek: Staphylococcus aureus

Koloni Tipleri

R (Rough) kaba koloni – Düzgün olmayan, kenarları girintili, yüzeyi

buruşuk veya granüllü koloniler

– Örnek: Mycobacterium tuberculosis

Koloni Tipleri

M (Mucoid) koloni – Düzgün,yapışkan, parlak koloniler

– Örnek: Klebsiella pneumoniae

59

• Bacillus subtilis – Colony shape and size: irregular

Margin (edge): undulate (wavy)

Elevation: umbonate

Color: white, dull

Texture: dry (or rough).

• Staphylococcus aureus – Colony shape and size: circular

Margin (edge): entire

Elevation: corvex

Color: yellow

Texture: butyrous (buttery)

Bakterilerin hemoliz özelliği

• Alfa hemoliz – Koloni çevresinde yeşilimsi renk değişikliği

• Beta hemoliz – Koloni çevresinde şeffaf

renk değişikliği

Bakterilerin hemoliz özelliği

• Gama hemoliz – Koloni çevresinde renk değişikliği

görülmemesi

Crystal violet

Gram's iodine

Decolorise with acetone

Counterstain with e.g. methyl red

Gram-positives appear purple

Gram-negatives appear pink

The Gram Stain

Gram boyama

Etil alkol ile dekolorizasyon

Preparat hazırlama

Tüm hücreler boyayı alırlar

Tüm hücreler mavi-siyah boyanır

Lugol ile boyama

Kristal viyole ile boyama

Karşıt boya ile boyama-

Sulu fuksin

Gram pozitif Gram negatif

Gram Staining Steps

1. Crystal violet acts as the primary stain. Crystal violet may

also be used as a simple stain because it dyes the cell wall of any bacteria.

2. Gram’s iodine acts as a mordant (Helps to fix the primary dye to the cell wall).

3. Decolorizer is used next to remove the primary stain (crystal violet) from Gram Negative bacteria (those with LPS imbedded in their cell walls). Decolorizer is composed of an organic solvent, such as, acetone or ethanol or a combination of both.)

4. Finally, a counter stain (Safranin), is applied to stain those cells (Gram Negative) that have lost the primary stain as a result of decolorization 67 Dr.T.V.Rao MD

Gram staining

• Named after Hans

Christian Gram,

differentiates

between Gram-

positive purple and

Gram-negative

pink stains and is

used to identify

certain pathogens. 68 Dr.T.V.Rao MD

69

Staining

• cationic dyes - basic, with positive charges on the chromophore

• anionic dyes - acidic, with negative charges on the chromophore

• surfaces of microbes are negatively charged and attract basic dyes – positive staining.

• negative staining – microbe repels dye & it stains the background