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Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

Coordinador: José Elías García SánchezAutores: Luis Alcalá

Carmen BetriuJosé Elías García SánchezMilagros Reig

ISBN: 84-609-2291-X

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INDICE:INDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO

1. Introducción2. Consideraciones microbiológicas3. Cambios taxonómicos recientes4. Consideraciones clínicas5. Toma de muestras6. Transporte al laboratorio7. Recepción y procesamiento de las muestras

7.1 Recepción de la muestra7.2 Procesamiento

7.2.1 Preparación 7.2.2 Inoculación de la muestra

7.2.3 Examen directo7.2.3.1. Examen macroscópico7.2.3.2. Examen microscópico

7.2.4. Medios de cultivo7.2.5. Sistemas de incubación en anaerobiosis.7.2.6. Tiempo de incubación

7.2.7. Otros procedimientos7.2.7.1 Procesamiento de los líquidos orgánicos7.2.7.2 Procesamiento del catéter telescopado7.2.7.3 Procesamiento del lavado broncoalveolar

8. Examen de los cultivos y aislamiento9. Identificación

9.1 Identificación preliminar9.2 Identificación final

9.2.1 Capacidad de producir indol y de descomponer el H2O29.2.2 Capacidad sacarolítica y/o proteolítica9.2.3 Detección de la dotación enzimática9.2.4 Detección de los productos finales del metabolismo bacteriano mediante cromatografía9.2.5 Recomendaciones9.2.6 Interpretación de los resultados

9.2.6.1 Interpretación de los resultados obtenidos con micrométodos comerciales9.2.6.2 Interpretación de los resultados de las pruebas individuales complementarias realizadas

en casos concretos10. Pruebas de determinación de la sensibilidad

10.1 Indicaciones10.2 Métodos

10.2.1 Dilución en agar10.2.2 Microdilución en caldo10.2.3 Sistemas comercializados10.2.4 E-test10.2.5 Controles de calidad10.2.6 Detección de β-lactamasas

11. Procedimientos a realizar en situaciones especiales.11.1 Botulismo11.2 Diarrea y colitis por Clostridium difficile asociadas al uso de antibióticos11.3 Toxiinfección por Clostridium perfringens11.4 Angina de Vincent11.5 Actinomicosis11.6 Infecciones endometriales11.7 Enterocolitis del paciente con neutropenia11.8 Técnicas rápidas de diagnóstico

12. Bibliografía

III

INDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES POR ANAEROBIOS1. Propósito y alcance2. Fundamento3. Documentación de consulta4. Recogida y transporte de las muestras

4.1 Selección de la muestra4.2 Obtención de la muestra4.3 Transporte de la muestra4.4 Recepción y registro de las muestras4.5 Criterios de aceptación y rechazo de las muestras. Acciones a tomar

5. Medios de cultivo, reactivos y productos5.1 Medios de cultivo5.2 Soluciones y reactivos

6. Aparatos y material7. Procesamiento

7.1 Preparación de la muestra7.2 Inoculación de la muestra7.3 Examen directo

7.3.1 Examen macroscópico7.3.2 Examen microscópico

7.4 Cultivo de la muestra7.5 Incubación de la muestra7.6 Procesamientos especiales

7.6.1 Líquidos orgánicos7.6.2 Catéter telescopado7.6.3 Lavado broncoalveolar7.6.4 Heces para el diagnóstico de toxiinfeccion de Clostridium perfringens7.6.5 Diagnóstico de botulismo7.6.6 Diagnóstico de angina de Vincent7.6.7 Diagnóstico de actinomicosis7.6.8 Diagnóstico de las infecciones endometriales

7.6.9 Diagnóstico de la enterocolitis del neutropénico7.7 Examen de los cultivos y aislamiento7.8 Identificación de los aislados anaerobios

7.8.1 Identificación preliminar7.8.2 Identificación final

8. Obtención y expresión de resultados 9. Responsabilidades 10. Anotaciones al procedimiento 11. Limitaciones 12. Bibliografía

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PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE DIARREA O COLITIS ASOCIADA AClostridium difficile

1. Propósito y alcance2. Fundamento3. Documentación de consulta4. Recogida y transporte de las muestras

4.1 Selección y obtención de la muestra4.2 Transporte de la muestra4.3 Recepción y registro de las muestras4.4 Criterios de aceptación y rechazo de las muestras. Acciones a tomar

5. Medios de cultivo, reactivos y productos5.1 Medios de cultivo5.2 Reactivos

6. Aparatos y material 7. Procesamiento

7.1 Preparación de la muestra7.2 Cultivo toxigénico

7.2.1 Pretratamiento de las muestras7.2.2 Siembra de las muestras7.2.3 Aislamiento e identificación7.2.4 Ensayo de citotoxicidad

7.3 Citotoxicidad directa7.4 Métodos de detección rápida de C.difficile toxigénico

7.4.1 Técnicas que detectan glutamato deshidrogenasa7.4.2 Técnicas que detectan toxina A7.4.3 Técnicas que detectan toxinas A y B

8. Obtención y expresión de resultados 9. Responsabilidades 10. Anotaciones al procedimiento 11. Limitaciones 12. Bibliografía

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Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

16. BACTERIAS ANAEROBIAS. 2004

Coordinador: José Elías García Sánchez

Autores: Luis Alcalá Carmen Betriu

José Elías García SánchezMilagros Reig

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1. INTRODUCCIÓN Aunque las bacterias anaerobias fuerondescubiertas a finales del siglo XIX, en la épocadorada de la microbiología, no fue hasta los años 70cuando se sentaron las bases del conocimientoactual. El grupo del Instituto Politécnico de Virginiaen los Estados Unidos estableció los principios de lamoderna taxonomía y clasificación y desarrolló unsistema que permitía el aislamiento de las especiesmás sensibles al oxígeno. Los investigadores delLaboratorio Wadsworth de la UCLA pusieron enmarcha una metodología más sencilla, al alcance demuchos laboratorios de microbiología, e investigaronel papel de estos microorganismos en diversasinfecciones humanas. Otros equipos, americanos yde otros países, contribuyeron a ampliar suconocimiento. En el momento actual el interés por lasbacterias anaerobias ha disminuido, sin duda porqueen el pasado se sobredimensionó su importanciaclínica, porque su conocimiento ha permitido elestablecimiento de pautas de quimioprofilaxiseficaces para las infecciones con un origenquirúrgico, porque se estudia sistemáticamente lasensibilidad a los antimicrobianos de las especiesmás resistentes y esto permite tener datos paraestablecer terapias empíricas con altos porcentajesde éxito y porque el trabajo con anaerobios siguesiendo lento e incluso desesperante cuando seintenta llegar a un diagnóstico de especie. Es deagradecer que la Sociedad Española deEnfermedades Infecciosas y Microbiología Clínicahaya decidido incluir dentro de sus Procedimientosde Microbiología Clínica uno dedicado a las bacteriasanaerobias, cuya pretensión es brindar a losmicrobiólogos una sistemática sencilla, práctica y útilpara su quehacer diario con estas bacterias.

2. CONSIDERACIONES MICROBIOLÓGICASDesde un punto de vista simplista, pero muy útil,

se puede definir a las bacterias anaerobias comoaquellas que para crecer en la superficie de unmedio de cultivo necesitan una atmósfera sinoxígeno, ya que este elemento es tóxico para ellas.Con estos dos conceptos se puede inferir que existeun amplio abanico de microorganismos, desde losmuy tolerantes y resistentes hasta losextremadamente lábiles a este gas.

El hábitat de las bacterias anaerobias estalimitado a zonas corporales del hombre y de losanimales donde la tensión de oxígeno es baja.Forman parte de la microbiota normal comocomensales y mutualistas, jugando un importantepapel en la resistencia inespecífica a la infección.Son particularmente frecuentes en la boca(especialmente en la placa dental sobre todo en suporción subgingival) y en las vías respiratorias altas,vagina e intestino (en especial en colon, recto y enlas heces, donde superan a los aerobios y a losmicroorganismos facultativos). A partir de aquípueden contaminar de forma pasajera la piel, sobretodo la del periné. La piel es pobre en anaerobiospermanentes, el más significativo esPropionibacterium acnes que vive en las glándulas

sebáceas. Desde estas localizaciones,particularmente del tubo digestivo, son eliminadosmuriendo en el ambiente, con la excepción de losclostridios que sobreviven gracias a la formación deesporas y que por ellas forman parte de la floratelúrica y ambiental. La colonización inicial se realizapor transmisión directa, aunque no necesariamenteen el caso de los clostridios. Las infecciones lasproducen a partir de estos hábitats.

Su �aversión� por el oxígeno también condicionauna metodología microbiológica especial. Para eltransporte de las muestras, particularmente si sequieren aislar las especies más sensibles, serequiere el empleo de medios adecuados queproporcionen un ambiente con un bajo poder deóxido-reducción. Los medios de cultivo, a parte deser frescos, deben estar, en lo posible, libres deoxígeno e incubarse en una atmósfera anaerobia.Esta se puede conseguir bien por procedimientoscatalíticos, en los que el oxígeno es eliminadocombinándolo con hidrógeno en presencia de uncatalizador, siendo las jarras de anaerobios elprototipo de este sistema, o por sustitución de laatmósfera normal por una mezcla de gases sinoxígeno, como ocurre en las cámaras de anaerobiosy en ocasiones en las jarras.

Para la obtención de energía emplean comodonantes y aceptores de electrones sustanciasorgánicas. Por ello dan lugar, como productos finalesde su metabolismo, a ácidos grasos de cadena corta.Su detección, por cromatografía, es esencial paraidentificarlas correctamente, pues muchas sonmetabólicamente muy inactivas. Por esta necesidadmetodológica no todos los laboratorios puedenidentificar las bacterias anaerobias a nivel deespecie, aunque hay que señalar que las másimportantes en clínica tienen una actividadmetabólica mayor y algunas pueden sercaracterizadas con diferentes sistemas comerciales.Algunas tienen un tiempo de generación que permiteobtener crecimiento visible en placas en 24 ó 48horas, pero otras necesitan varios días para crecer opara observar algunas propiedades, como lapigmentación negra de algunas especies dePrevotella spp. y Porphyromonas spp., esenciales ensu caracterización. Esto obliga a prolongar laincubación y, por eficacia y utilidad, informar a losclínicos de acuerdo con datos presuntivos deinfección anaerobia: mal olor de las muestras,localización de la infección en las proximidades demucosas colonizadas, cuadros relacionados conmordeduras, presencia de gas, morfotipos en latinción de Gram, ausencia de leucocitos en lasinfecciones tóxicas-tisulares por Clostridiumperfringens, no crecimiento en condiciones deaerobiosis, etc.

3. CAMBIOS TAXONOMICOS RECIENTESEl desarrollo de la genética ha determinado

importantes cambios en la clasificación y taxonomíabacteriana que, en caso de los anaerobios, han sidoenormes. Se han descrito nuevos géneros yespecies y algunas, al conocerse sus relaciones

DOCUMENTO CIENTÍFICO

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filogenéticas, se han transferido a otros géneros,quedando por situar, todavía, varias que estánincorrectamente posicionadas, particularmentedentro de los microorganismos gramnegativos.

En clínica y dentro de los bacilos gramnegativosson importantes los géneros:

1 Bacteroides, que ha quedado restringido a lasespecies sacarolíticas resistentes a la bilisincluidas en el grupo de Bacteroides fragilis que,además de frecuentes, son las más virulentas yresistentes a los antibióticos. Otras especieshan sido trasferidas a otros géneros o estánpendientes de que se realice

2 Porphyromonas, cuyos miembros producencolonias pigmentadas de negro tras varios díasde incubación, son asacarolíticos y no tolerantesa la bilis

3 Prevotella, con especies pigmentadas o nopigmentadas, sacarolíticas y no tolerantes a labilis

4 Fusobacterium, caracterizado por incluirbacterias que producen ácido butírico sinisobutírico e isovalérico

5 Bilophila y algunos géneros microaerófilosque necesitan para su crecimiento formato yfumarato

Entre los cocos gramnegativos destaca Veillonellay entre los grampositivos los desgajados dePeptostreptococcus, incluyendo Anaerococcus,Finegoldia, Micromonas, Peptoniphilus, Schleiferellay el propio Peptostreptococcus. Actinomyces,Propionibacterium, Eggertella y Eubacterium sonimportantes entre los bacilos grampositivos noesporulados y Clostridium entre los esporulados. Enlas tablas 1, 2 y 3 se muestran los cambios másimportantes acaecidos en la taxonomÍa yclasificación de las bacterias anaerobias noesporuladas.

4. CONSIDERACIONES CLINICASLas bacterias anaerobias producen infecciones

con al menos dos patrones en cuanto a sufisiopatología o patogenia.

El primero es el de los cuadros ocasionados porla acción de diferentes toxinas producidas pordiversas especies del género Clostridium. Soninfecciones específicas, de origen habitualmenteexógeno -del ambiente- con frecuencia a partir deesporas, y en ocasiones oportunistas, pues puedenrequerir una puerta de entrada traumática. Incluyenel tétanos, las diversas formas del botulismo -intoxicación, de heridas, del lactante (porcolonización intestinal), indeterminado (porcolonización intestinal del adulto consecuencia dealteraciones digestivas producidas por cirugíagastrointestinal o por el consumo de antimicrobianos)e inhalatorio (accidentes de laboratorio o por posiblebioterrorismo)- gangrena gaseosa (producida pordiversas especies, especialmente por C. perfringens,y las relacionadas con C. septicum que suelenaparecer en pacientes con cáncer colorectal,leucemias, linfomas y otras inmunodeficiencias),celulitis anaerobias, enteritis necrotizante

producida por C. perfringens tipo C (en pacientes condietas hipoproteicas que condicionan un déficit detripsina de forma que no se destruye la toxina beta),intoxicación alimentaria (por ingestión de alimentoscárnicos con elevado número de formas vegetativasde C. perfringens tipo A que al esporular en elintestino delgado producen una enterotoxina) y lasdiversas formas clínicas de diarrea asociada aantimicrobianos producida por las toxinas de C.difficile, con un importante impacto nosocomial y conposible transmisión cruzada; o en algunos casos porcepas de C. perfringens tipo A productoras deenterotoxina.

El segundo patrón es el resultado de la actuaciónde mecanismos patogénicos no exotóxicos,diferentes según las bacterias implicadas y amenudo aún no caracterizados. El resultado es laaparición de diferentes infecciones inespecíficas, enlas que los síntomas y signos no permiten identificaral/a los agente/s etiológico/s. Su origen es endógenoa partir de componentes de la propia flora, exceptolas derivadas de mordeduras (exógeno a partir deflora endógena por transmisión directa). Sólo unlimitado número de géneros y especies son capacesde producir infecciones, incluídos los clostridioscuando no actúan con exotoxinas. En cualquier caso,requieren circunstancias favorecedoras por parte delhospedador (oportunistas): roturas traumáticas de lasbarreras cutáneomucosas de las localizaciones quelas albergan, llegada a zonas lejanas de sus hábitats,junto con situaciones favorecedoras específicas(circunstancias que bajan el potencial de óxido-reducción) o generales. Como su origen está en lapropia flora del huésped es habitual que sean deetiología polimicrobiana y mixta. La presencia debacterias aerobias y facultativas además favorece alas anaerobias pues consumen el oxígeno existente.

Muchas de estas infecciones son piogénicas y lapresencia de abscesos es característica. Numerosasinfecciones, como bacteriemias -con una moderadaimplicación-, abscesos cerebrales, empiemassubdurales y abscesos epidurales, endoftalmitis,sinusitis y otitis crónicas, abscesos periamigdalares,diversos procesos relacionados con las cariesdentales y periodontitis del adulto, neumonías poraspiración, abscesos de pulmón, bronquiectasias yempiemas pleurales, peritonitis secundarias yabscesos intraabdominales, infecciones de la paredabdominal y otras intraabdominales, de vías biliaresy abscesos hepáticos, numerosos procesosinfecciosos obstetro-ginecológicos, artritis yosteomielitis, y multitud de infecciones de piel ytejidos blandos como el acné, celulitis, infeccionestras mordeduras, del diabético (pie diabético ygangrena), de úlceras por presión, etc., pueden estarcausadas por estas bacterias.

Existe un tercer patrón, que se puede definircomo de desequilibrio o sobrecrecimiento debacterias anaerobias cuyo mejor exponente es la

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Tabla 1.- Cambios taxonómicos recientes en los microorganismos gramnegativos anaerobiosActuales Antiguos y/o posición taxonómica

Bacilos gramnegativos- Anaerobiospirillum thomasii- Bacteroides distasonis- Bacteroides forsythus*- Bacteroides fursosus- Bacteroides putredinis- Bacteroides pyogenes*- Bacteroides splanchnicus- Bacteroides tectus- Butyrivibrio species- Campylobacter gracilis- Campylobacter hominis- Campylobcter showae- Capnocytophaga granulosa- Capnocytophaga haemolytica- Catonella morbi- Centipeda periodontii- Dialister pneumosintes- Fusobacterium varium- Johnsonella innava- Leptotrichia sanguinegens- Mitsoukella multiacida- Porphyromonas cangingivalis*- Porphyromonas canoris*- Porphyromonas cansulci*- Porphyromonas catoniae- Porphyromonas crevioricanis*- Porphyromonas gingivicanis*- Porphyromonas gulae*- Porphyromonas levii*- Porphyromonas macacae*- Prevotella albensis*

- Prevotella brevis*

- Prevotella bryantii*

- Prevotella dentalis- Prevotella enoeca- Prevotella heparinolytica- Prevotella nigrescens- Prevotella pallens- Prevotella ruminicola*- Prevotella tannerae- Prevotella zoogleolformans- Selenomonas spp.- Sutterella wadsworthensis

- Tissierella praeacuta

Nueva especieRelacionado con el grupo PorphyromonasRelacionado con el grupo PorphyromonasRelacionado con el grupo PorphyromonasPosiblemente relacionado con RikenellaGrupo II de Bacteroides tectum (algunas especies)Posiblemente pertenece a un nuevo géneroBacteroides tectum. Relacionado con B. fragilisRelacionado con ClostridiumBacteroides gracilis (algunas especies)Nueva especieNueva especieNueva especieNueva especieRelacionado con ClostridiumRelacionado con Selenomonas.Relacionado con Sporomusa, rama de ClostridiumFusobacterium pseudonecrophorumRelacionado con ClostridiumNueva especieRelacionado con Sporomusa, rama de Clostridium,Nueva especieNueva especieNueva especieOribaculum catoniaeNueva especieNueva especieNueva especieBacteroides leviiBacteroides macacae, Porphyromonas salivosaBacteroides ruminicola subesp. ruminicola biovar 7, Prevotella ruminicola (algunas especie)Bacteroides ruminicola subesp. brevis biovars 1,2, Prevotella ruminicola (algunas especies)B. ruminicola suespec. brevis biovar 3, Prevotella ruminicola (algunas especies)Mitsuokella dentalis, Hanella seregensNueva especieRelacionado con el grupo de Bacteroides fragilisNueva especie; P. intermedia (algunas especies)Nueva especieB. ruminicola subesp. ruminicola biovar 1Nueva especieRelacionado con el grupo de Bacteroides fragilisRelacionado con Sporomusa rama de CostridiumNuevo genero y especie, Campylobacter(Bacteroides) gracilis (algunas especies)Relacionado con Clostridium

Cocos gramnegativos- Acidaminococcus fermentans- Megasphaera elsdenii- Veillonella spp.

Relacionado con Sporomusa rama de ClostridiumRelacionado con Sporomusa rama de ClostridiumRelacionado con Sporomusa rama de Clostridium

* De origen animalTomado de Jousimies-Somer HR, Summanen P, Citron DM, Baron EJ, Wexler y HM, Finegold SM. Wadsworth �KTL Anaerobic Bacteriology Manual. Star Publishing Company. Belmont, C.A. 2002.

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Tabla 2.- Cambios taxonómicos recientes en los cocos grampositivos anaerobiosActuales Antiguos

Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus anaerobius

Schleiferella asaccharolytica* o Peptoniphilusasaccharolyticus

Peptostreptococcus asaccharolyticus

Gallicola barnesae Peptostreptococcus barnesae

Schleiferella harei* o Peptoniphilus harei Peptostreptococcus harei

Slackia heliotrinireducens Peptostreptococcus heliotrinireducens

Anaerococcus hydrogenalis Peptostreptococcus hydrogenalis

Schleiferella indolica* o Peptoniphilus indolicus Peptostreptococcus indolicus

Peptoniphilus ivorii Peptostreptococcus ivorii

Schleiferella lacrimalis* o Peptoniphilus lacrimalis Peptostreptococcus lacrimalis

Anaerococcus lactolyticus Peptostreptococcus lactolyticus

Finegoldia magna Peptostreptococcus magnus

Micromonas micros Peptostreptococcus micros

Anaerococcus octavius Peptostreptococcus octavius

Anaerococcus prevotii Peptostreptococcus prevotii

Peptostreptococcus productus Peptostreptococcus productus

Anaerococcus tetradius Peptostreptococcus tetradius

Anaerococcus vaginalis Peptostreptococcus vaginalis

Peptococcus Níger

*Taxonómicamente Schleiferella tiene prioridad Tomado de Moncla BJ, Hillier SL. Peptostreptococcus, Propionibacterium, Lactobacillus, Actinomyces, and other non-spore-forming anaerobic gram-positive bacteria. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH editores. Manual of Clinical Microbiology, Eighth Edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C.; 2003. p. 857-879.

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Tabla 3.- Cambios taxonómicos recientes en los bacilos grampositivos anaerobiosActuales Antiguos

Actinobaculum schaalii *Actinobaculum suis Actinomyces suisArcanobacterium bernardiae Actinomyces bernardiaeActinomyces bowdenii *Actinomyces canis *Actinomyces catuli *Actinomyces funkei *Actinomyces pyogenes Arcanobacterium pyogenesActinomyces radicidentis *Actinomyces urogenitales *Atopobium fossor Eubacterium fossorAtopobium minutum Lactobacillus minutumAtopobium parvulum Streptococcus parvulumAtopobium rimae Lactobacillus rimae, Lactobacillus D02Atopobium vaginae *Bulleidia extracta *Catenibacterium mitsuokai *Cellulomonas humilata Actinomyces humiferusCollinsella aerofaciens Eubacterium aerofaciensCollinsella intestinales *Collinsella stercoris *Cryptobacterium curtum *Eggerthella lenta Eubacterium lentumEggerthella minutum Eubacterium tardumEubacterium sulci Fusobacterium sulciMogibacterium timidum Eubacterium timidumHoldemania filiformis *Lactobacillus uli *Mogibacterium pumilum *Mogibacterium vescum *Slackia exigua Eubacterium exiguum (Eubacterium D-6)

*Especies nuevas Tomado de Moncla BJ, Hillier SL. Peptostreptococcus, Propionibacterium, Lactobacillus, Actinomyces, and other non-spore-forming anaerobic gram-positive bacteria. En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH editores. Manual of Clinical Microbiology, Eighth Edition. American Society for Microbiology, Washington, D.C.; 2003. p. 857-879.

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vaginosis bacteriana (no vaginitis), que es un cuadrocaracterizado por un aumento de flujo vaginal, de pHmás elevado (pH >4,5) y con aminas volátiles perosin leucocitos polimorfonucleares. Por microscopíaes característica la presencia de células dedescamación en las que hay adheridas bacterias conmorfotipos de Gardnerella vaginalis y de otrasespecies (�células clue�). Algunos de estosmicroorganismos, como C. difficile, soneminentemente nosocomiales y emergentes.

La búsqueda de bacterias anaerobias sólo sedebe hacer cuando se pueda discernir su papel ytenga interés etiológico y terapéutico. Estosmicroorganismos son resistentes a aminoglicósidos(carecen de los sistemas necesarios para supenetración) y monobactámicos y pueden desarrollarresistencia a otros antimicrobianos habitualmenteeficaces, particularmente el grupo de Bacteroidesfragilis. Suelen presentar alta actividad lasasociaciones de beta lactámico/inhibidor de beta-lactamasa (amoxicilina/ácido clavulánico ypiperacilina/tazobactam), las carbapenemas(imipenema, meropenema y ertapenema), elmetronidazol y el cloranfenicol. La resistencia delgrupo de Bacteroides fragilis a la cefoxitina y a laclindamicina es elevada, como lo es aún más a lapenicilina, situación compartida por otros bacilosgramnegativos.

5. TOMA DE MUESTRASComo las especies encontradas en las diferentes

infecciones son, con la excepción de algunosclostridios, las mismas que se hallan en la microflorahabitual, para que los estudios microbiológicostengan valor es necesario que las muestras seantomadas de forma que la flora normal no lascontamine. Por ello que no se deben estudiarmuestras nasales, orales, de vías respiratorias bajasrecogidas por procedimientos que no impidan sucontacto con bacterias de otras localizaciones,cutáneas, vaginales, urinarias tomadas por micción osondaje o digestivas, salvo para procesos muyconcretos, como botulismo, diarrea asociada aantimicrobianos y toxiinfección por C. perfringens. En los abscesos cerrados, empiemas, infeccionesde cavidades cerradas y líquidos habitualmenteestériles las muestras se deben tomar, si es posible,por punción percutánea-aspiración, empleando lasmedidas de desinfección preconizadas para loshemocultivos, o en el transcurso de prácticasquirúrgicas. En estas y en otras situaciones se desaconsejael uso de torundas. Las muestras de sangre se deben sembrar enfrascos de hemocultivos para anaerobiossiguiendo las directrices marcadas en elprocedimiento correspondiente para este análisismicrobiológico. Las muestras quirúrgicas y las biopsiastambién son idóneas para la investigación debacterias anaerobias. En las infecciones abiertas es necesario recurrir amuestras representativas, que deben ser de la

parte profunda, tomadas quirúrgicamente poraspiración percutánea o tras la eliminación de lostejidos necróticos superficiales por curetaje o poraspiración. En su defecto, se puede tomar la muestracon un hisopo de la base de la lesión. El uso del broncofibroscopio ha mejorado lastomas en neumonías (catéter telescopado protegidoo lavado broncoalveolar) y la punción transtraquealha caído en desuso. Otras muestras respiratoriasválidas son la punción pulmonar directa y latoracocentesis (tabla 4).6. TRANSPORTE AL LABORATORIO

En el transporte de una muestra para la búsquedade bacterias anaerobias se debe evitar la presenciade oxígeno, aunque estas pueden sobrevivir variashoras, incluso días, en un medio de transporteadecuado, dependiendo de su naturaleza. Engeneral, en las muestras purulentas puedensobrevivir más tiempo que en los líquidos claros.Para el transporte en anaerobiosis se encuentrandisponibles en el mercado tubos, frascos y viales conuna atmósfera anaerobia que contienen un medio detransporte reducido y resarzurina como indicador dela presencia de oxígeno (Port-A-Cul , BectonDickinson).

Las jeringas utilizadas en la aspiración de pus nodeben utilizarse como transporte debido al riesgo depinchazos y la posible expulsión accidental de sucontenido; además, el oxígeno difunde a través de laestructura de plástico de sus paredes. Una vezrealizada la aspiración se debe expulsar el posiblecontenido gaseoso, tapando la aguja con una gasaestéril impregnada en alcohol para eliminar el riesgode aerosoles. A continuación, se cambia la aguja porotra estéril y se inocula el contenido, previadesinfección del tapón de goma, en la superficie delagar de un vial de transporte para anaerobios.

Las muestras de tejidos y biopsias quirúrgicas seremitirán en un frasco estéril que se puede introduciren una bolsa de anaerobiosis de plásticotransparente y flexible (ver más adelante sistemas deanaerobiosis). Además, existen frascos de transportepara muestras de tejido y biopsias que contienen unabase de agar y un indicador de anaerobiosis. Eltejido se introduce aproximadamente a 5 mm de labase e inmediatamente después se enrosca el tapón.

En los casos en que solamente sea posibleobtener la muestra mediante torunda, se utilizaránpara su envío tubos adecuados, con un medio detransporte para anaerobios, donde se introduce latorunda hasta aproximadamente 5 mm del fondo, serompe el palillo a la altura de la tapa del tubo y secierra rápidamente. Existen tubos de plástico deescaso calibre con un estrechamiento en la parteinferior a la superficie del agar con el fin de dificultarla difusión del oxígeno hacia la base de la torunda. Elenvío de las muestras al laboratorio de microbiologíadebe ser inmediato. Se deben transportarmanteniéndolas a temperatura ambiente. Lastemperaturas de incubación pueden ocasionar elsobrecrecimiento de especies poco exigentes,

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Tabla 4.- Infecciones por anaerobios y tomas adecuadasInfecciones Muestras

SNC (abscesos y empiemas) AspiraciónBiopsias

Cabeza y cuello AspiradosBiopsias

Oculares - Endoftalmitis Aspiración intraocularORL

- Sinusitis

- Otitis media crónica

Aspiración percutanea o por rinoscopia ymaterial quirúrgico de los senos. Torunda

Tracto respiratorio inferior- Neumonías

- Empiema pleural

Catéter telescopado protegidoLavado broncoalveolarPunción pulmonar percutaneaToracocentesis

Aparato circulatorio- Bacteriemia- Endocarditis- Pericarditis

HemocultivoVálvula, verrugaLíquido pericárdico

Intraabdominales- Peritonitis y abscesos- Colecistitis- Heridas laparotómicas

Aspiración y cirugíaBilis tomada quirúrgicamenteTomas en profundidad

Tubo digestivo- Diarrea asociada a antimicrobianos- Intoxicación por C. perfringens

Heces

Heces para toxina y recuentoGenitales femeninas Cirugía

CuldocentesisAspiración (absceso Bartholino)Aspiración endometrial protegidaDIUs (actinomicosis)

Urinarias Punción suprapubicaOsteoarticulares

-9 Artritis-10 Osteomielitis

AspiraciónAspiración, cirugía, biopsia.

Tejidos blandos Aspiración percutaneaCirugíaTomas en profundidad

Relacionadas con alimentos- Intoxicación por C. perfringens- Botulismo

Alimento sospechoso (recuento)Alimento sospechoso(toxina, bacteria)

Botulismo Alimento sospechoso (toxinas, cultivo)Suero (detección de las toxinas, no sueleser positiva en el lactante)Contenido gástrico y vómitos (toxinas)Heces (toxinas y cultivo)Material de heridas (cultivo)Muestras ambientales (bioterrorismo)Torundas nasales (bioterrorismo)

Tétanos Material de la presunta puerta de entrada

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fundamentalmente facultativas, y la pérdida dealgunas más sensibles, mientras que lastemperaturas bajas permiten un aumento de ladifusión del oxígeno.

En la tabla 5 se resumen los diferentes sistemasutilizables para el transporte de muestras para labúsqueda de anaerobios, así como los tiemposóptimos para su recepción en el laboratorio. Despuésde su procesamiento se recomienda conservar lasmuestras a temperatura ambiente hasta 24 h, encaso de que hubiera algún problema y fueranecesario recuperarlas para un nuevoprocesamiento.

7. RECEPCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LASMUESTRAS7.1 RECEPCIÓNUna vez recibida la muestra en el laboratorio seanota la fecha y hora de recepción y se compruebaque cumple los requisitos para su aceptación(correcta identificación, muestra adecuada,condiciones de transporte, etc.). Una informaciónmás detallada sobre la recepción aparece en elProcedimiento 1a de la SEIMC (Recogida, transportey procesamiento general de las muestras en ellaboratorio de microbiología).

7.2 PROCESAMIENTOEl procesamiento inicial incluye su preparación,examen directo e inoculación en los medios decultivo apropiados (figura 1).7.2.1 Preparación. Tras el examen inicial, la muestrase procesa con las máximas precauciones y lo antesposible, siendo aconsejable que no transcurran másde 15 minutos desde su recepción. Si es posible, lapreparación se deberá hacer en una cámara deanaerobiosis para minimizar su oxigenación. Elmaterial purulento se mezcla bien con la ayuda delagitador Vortex. Las muestras de tejido o de biopsiase homogeneizan, ya sea con un bisturí, cortandotrozos muy finos hasta obtener una consistenciahomogénea, o en un mortero estéril añadiendo 1mililitro de caldo. En el caso de que la muestra sehaya obtenido con torunda, se exprime en unpequeño volumen de caldo mediante movimientosrotatorios sobre las paredes del tubo y este caldo seprocesa como una muestra líquida. Cuando seinvestiga la presencia de Clostridium se puederealizar un enriquecimiento, que consiste en eliminartodas las formas vegetativas y conservar las esporastratando la muestra con calor o alcohol (ver másadelante en el apartado 11.2).7.2.2 Inoculación de la muestra. Una vezhomogeneizada con la ayuda de una pipeta Pasteurse deposita una gota, si la muestra es purulenta, o 2-3 gotas, si no lo es, en cada uno de los medios decultivo utilizados, una gota en un portaobjetos para latinción de Gram y el resto en un medio líquido deenriquecimiento.7.2.3 Exámen directo. Proporciona de formainmediata información semicuantitativa acerca de losmicroorganismos presentes y un diagnósticopresuntivo de la existencia de bacterias anaerobias,

lo cual es importante para establecer una terapiainicial, ya que el proceso de aislamiento eidentificación puede demorarse varios días.

7.2.3.1 Exámen macroscópico. Consiste en laobservación de los siguientes datos: mal olor(productos finales del metabolismo de bacteriasanaerobias), fluorescencia roja a la luz ultravioleta(producción de protoporfirina por las especiespigmentadas de Prevotella y Porphyromonas),exudados sanguinolentos, exudados de colornegruzco (presencia de bacilos gramnegativospigmentados), existencia de tejidos necróticos, gasen los tejidos, existencia de gránulos de "azufre" enel exudado (presencia de Actinomyces spp. yPropionibacterium propionicus), exudadospurulentos, etc.

7.2.3.2 Exámen microscópico. La tinción de Grames de una gran utilidad en el diagnósticomicrobiológico presuntivo, ya que proporcionainformación acerca de los tipos de bacteriasexistentes, cantidad relativa de las mismas,presencia de leucocitos, etc. Por otra parte, es unelemento importante para el control de calidad dellaboratorio. Si no se consigue aislar todos losmorfotipos observados esto puede ser debido,probablemente, a algún fallo en los distintos pasosdel diagnóstico de los anaerobios (recolección de lamuestra, transporte o procesamiento), o bien setrata, aunque es menos común, de una inhibición delmicroorganismo por un antibiótico residual.

La morfología y afinidad tintorial de los bacilosanaerobios gramnegativos varía según las diferentesespecies. Las de Bacteroides, por lo general,aparecen como bacilos pleomórficos que se tiñendébilmente con la tinción de Gram; las formascocobacilares son sugestivas de especiespigmentadas de Prevotella o Porphyromonas.Fusobacterium nucleatum suele presentarse comoun bacilo gramnegativo fino y fusiforme y a menudodispuesto en parejas, unidos por un extremo. Hayque señalar que también Fusobacteriumperiodonticum, y las especies microaerófilas deCapnocytophaga muestran estas características.Fusobacterium mortiferum se presenta como unbacilo muy pleomórfico, con filamentos quecontienen zonas hinchadas, o formas redondas y detinción irregular. Este tipo de morfología se puedeobservar asimismo en Fusobacterium ulcerans y,ocasionalmente, en Fusobacterium necrophorum. Lapresencia de pequeños cocos gramnegativos sonindicativos de Veillonella. Los bacilos grampositivosanaerobios adoptan múltiples formas y puedenaparecer grampositivos o "gramvariables". Lasesporas de Clostridium se ven raramente en lastinciones de los exudados. Un bacilo grampositivogrueso, de forma rectangular y sin esporas essugestivo de Clostridium perfringens. Un bacilogrampositivo ramificado es sugestivo de Actinomyceso Propionibacterium.

Para establecer un diagnóstico presuntivo de unainfección por anaerobios es importante que elmicrobiólogo correlacione el origen de la muestra conlos morfotipos observados en la tinción de Gram.

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Tabla 5.- Sistemas de transporte de muestras para anaerobiosMuestra Sistema de transporte Tiempo óptimo de transporte

al LaboratorioMaterial obtenido poraspiración

Viales con atmósfera anaerobia ≤ 2 � 3 h (hasta 8-24 h)

Tejido o biopsia Contenedores estérilesFrascos con atmósfera anaerobiaContenedores en bolsas deanaerobiosis

≤ 30 min≤ 2 � 3 h

≤ 2 � 3 hTorundas Tubos con atmósfera anaerobia ≤ 2 � 3 h

Además, la presencia de tipos morfológicosmúltiples en la tinción de Gram sugiereespecíficamente este diagnóstico puesto que lamayoría de las infecciones en las que estánimplicados los anaerobios son polimicrobianas.7.2.4 Medios de cultivo. Para conseguir unarecuperación óptima de bacterias anaerobias esfundamental elegir correctamente los medios decultivo primarios. La mayoría de estas bacteriasrequieren para su crecimiento vitamina K1 y hemina.Para su aislamiento e identificación presuntiva seaconseja utilizar una combinación de mediosenriquecidos no selectivos, selectivos y diferenciales,entre los que se incluyen:- Un medio de agar sangre para anaerobios comoagar Brucella o agar Schaedler con un 5% desangre de carnero, a los que se añaden vitamina K1(1 µg/ml) y hemina (5 µg/ml). En estos medioscrecen tanto las bacterias anaerobias facultativascomo las anaerobias obligadas.- Agar Bacteroides bilis esculina con amicacina(BBE). Es un medio selectivo para Bacteroides delgrupo fragilis y Bilophilia spp. Contiene amicacina(100 µg/ml) que inhibe la mayoría de facultativos,bilis (20%) que con casi exclusividad sólo permite elcrecimiento de las especies citadas y esculina que alser hidrolizada en presencia de un indicador (citratoférrico) vira el medio a color negro. Permite una fácildetección de las especies de Bacteroides del grupofragilis al ser esculina positivas. A veces, puedencrecer otras especies, como Fusobacteriummortiferum, Fusobacterium varium, algunasenterobacterias, Pseudomonas aeruginosa,enterococos, levaduras, etc., aunque se distinguende los Bacteroides del grupo fragilis por el tamaño desus colonias, que normalmente es inferior a 1 mm dediámetro.- Agar con alcohol fenil-etílico (PEA) con un 5% desangre de carnero. El alcohol inhibe el crecimientode bacilos gramnegativos facultativos, principalmenteel crecimiento en velo de las especies de Proteus.También evita el crecimiento en velo de algunasespecies de Clostridium como Clostridium septicum,facilitando de este modo su aislamiento. Se aconsejasembrar en este medio las muestras purulentas ocuando sea previsible una infección mixta.- Un agar sangre selectivo, como agar Schaedler conneomicina (75 µg/ml) y vancomicina (7,5 µg/ml)(SNV) o con kanamicina (75 µg/ml) y vancomicina

(7,5 µg/ml) (SKV) o el clásico agar Brucella conkanamicina, vancomicina y en este caso sangrelacada (ASLKV). Son medios selectivos para bacilosgramnegativos como el grupo de Bacteroides fragilisy especies de Prevotella. La presencia de neomicinao de kanamicina inhibe a la mayor parte de losaerobios facultativos y la presencia de vancomicinainhibe la mayoría de los grampositivos y especies dePorphyromonas. A veces pueden crecer en estosmedios levaduras y anaerobios facultativosresistentes a estos aminoglicósidos por lo quesiempre debe realizarse una tinción de Gram y unensayo de aerotolerancia a todos los aislados.- Agar con yema de huevo (AYE). Cuando sesospecha la presencia de clostridios, para detectar laproducción de lipasa y/o lecitinasa.- Un agar selectivo para Clostridium difficile, cuandose investigue la presencia de esta especie, comoagar fructosa-cicloserina-cefoxitina (CCFA) o agaryema de huevo-cicloserina-cefoxitina (CCEY).

Como medio líquido de enriquecimiento o demantenimiento se recomienda usar caldo detioglicolato sin indicador, suplementado con vitaminaK1 (200 µl) y hemina (20 µl). Este medio se utilizapara recuperar las bacterias anaerobias en caso deque falle la anaerobiosis en la incubación de loscultivos primarios, haya una inhibición delcrecimiento debido a antibióticos o a otros factores, obien cuando las bacterias se encuentran encantidades muy pequeñas.7.2.5 Sistemas de incubación en anaerobiosis. Suelección viene determinada por el coste, número decultivos y limitaciones de espacio. Los más comunesson las cámaras, jarras o cajas y bolsas deanaerobiosis.Con independencia del sistema utilizado esimportante monitorizar el ambiente anaerobio conuna tira indicadora de azul de metileno o deresarzurina, y la temperatura de incubación.

Existen diferentes modelos de cámaras paraanaerobios, en las que se consigue una atmósferaanaerobia mediante una mezcla de gases quecontiene 5% de H2, 5-10% de CO2 y 85-90% de N2.Poseen un sistema de intercambio que consiste enun compartimento rígido con una puerta interior yotra exterior. Las jarras son recipientes cilíndricos, demetal o de plástico rígido, que deben cerrarseherméticamente y en los que la atmósfera anaerobiase obtiene entre 1 y 2 horas después de introducirunos sobres (GasPak , Becton Dickinson) en los

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que, al añadir H2O se libera H2 y CO2. El H2 secombina con el oxígeno existente formando aguagracias a la presencia de un catalizador. Actualmenteexisten sistemas en los que no hace falta añadir H2Oo introducir el catalizador (Anaerogen , Oxoid).Mediante una técnica automatizada, Anoxomat ,también se puede lograr una atmósfera anaerobia enlas jarras. Como ya se ha señalado debe introducirseun indicador de oxígeno, que suelen ser tiras depapel con azul de metileno, que se decoloran aldesaparecer la presencia del oxígeno.

También se encuentran disponibles en elmercado diferentes sistemas de bolsas deanaerobiosis de plástico transparente y flexible comoGasPack Pouch (Becton Dickinson) oAnaerogenCompact (Oxoid) con generadores eindicadores adecuados. Se pueden utilizar tanto parael transporte de muestras al laboratorio como para laincubación de cultivos.7.2.6 Tiempo de incubación. Inmediatamentedespués de su siembra las placas de cultivo seincuban a 35-37ºC en el sistema de anaerobiosisdisponible. Si se utiliza una cámara se puedenexaminar a las 24 h, puesto que no es necesariosacarlas, mientras que si se emplean jarras o bolsashay que esperar 48 h, a no ser que se busquenmicroorganismos de crecimiento rápido y se empleenmedios selectivos como el BBE para el grupo deBacteroides fragilis o el EYA para clostridios, en cuyocaso se pueden examinar a las 24 h.

Si en las placas no se observa ningún crecimientose deben reincubar hasta completar 7 días, al menoslas de agar sangre no selectivo, ya que algunosanaerobios requieren este tiempo para formarcolonias visibles (Actinomyces, Porphyromonas,Propionibacterium, Bilophila, ...). Se aconsejamantener la incubación del medio líquido deenriquecimiento entre 7 y 10 días y se deben realizarsubcultivos, si se aprecia turbidez u otro signo decrecimiento, en agar sangre y agar chocolate que seincubarán en una atmósfera con 10% de CO2, y enagar sangre para anaerobios incubado enanaerobiosis. Este mismo proceder se realiza al finaldel periodo de incubación si no se ha detectadocrecimiento para considerarlo definitivamente estéril.

En el diagnóstico de la actinomicosis el tiempo deincubación debe ser mayor, generalmente entre 2 y 4semanas.7.2.7 Otros procedimientos

7.2.7.1 Procesamiento de los líquidos orgánicos.Los líquidos corporales habitualmente estériles,como ascítico, de diálisis peritoneal, articular,pericárdico, amniótico, pleural, sinovial, intraocular,etc. se inoculan en frascos de hemocultivo paraaerobios y anaerobios, reservando un pequeñovolumen para hacer una tinción de Gram. Adiferencia de otros líquidos, el amniótico y loslíquidos obtenidos por culdocentesis no necesitancentrifugarse antes de realizar esta tinción. Lalectura se realiza diariamente durante 7 días. En elcaso de que haya crecimiento, se extrae unamuestra del frasco aerobio mediante jeringa yaguja para realizar subcultivos en medios sólidospara aerobios y facultativos (agar sangre, agar

chocolate, agar sangre con colistina y ácidonalidíxico y agar MacConkey, por ejemplo). Delfrasco anaerobio se hacen subcultivos en agarsangre, agar chocolate y agar sangre paraanaerobios.

Las bacterias anaerobias raramente causanmeningitis, por lo que el cultivo de rutina del líquidocefalorraquídeo no es necesario. Los anaerobiospueden estar implicados en la formación deabscesos cerebrales, empiema subdural y abscesoepidural y en estos casos no es útil el examen dellíquido cefalorraquídeo.

Las muestras de sangre se procesan tal como seindica en el Procedimiento 3a de la SEIMC(Hemocultivos).

7.2.7.2 Procesamiento del catéter telescopado(CT). Se corta el cepillo y se coloca en un tuboque contenga 1 ml de solución estéril de Ringerlactato. Se agita en el Vortex durante 30segundos y se preparan dos diluciones seriadasal 1/100 a partir de la inicial en Ringer lactato; sesiembran partes alícuotas de 0,1 ml de cada unade las diluciones en medios para aerobios yfacultativos (agar sangre, agar chocolate y agarMacConkey) que se incuban en 10% de CO2durante 24-48 horas y para anaerobios (agarsangre y agar sangre selectivo) que se incubanen anaerobiosis hasta 5 días.7.2.7.3 Procesamiento del lavado broncoalveolar(LBA). Se preparan dos diluciones seriadas al1/100 de la muestra inicial y se siembran en losmismos medios que el catéter telescopado.

8. EXAMEN DE LOS CULTIVOS Y AISLAMIENTOEn el análisis microbiológico de una muestra

clínica se pueden distinguir, al menos teóricamente,dos etapas. La primera esta dedicada a �buscar� losanaerobios que pueda contener, obtenerlos encultivo puro, identificarlos de forma preliminar (a nivelde género o �grupo�), e informar al clínico lo antesposible. En una segunda etapa se debe intentarconseguir una identificación más precisa y estudiar lasensibilidad a los antibióticos que habitualmentetienen actividad sobre estas bacterias. Seríadeseable que la primera etapa se realizara en todoslos laboratorios de microbiología, mientras que lasegunda puede quedar restringida a unos pocos,cuya experiencia debe servir de base para elconocimiento general de las bacterias anaerobiasque se pueden encontrar en muestras clínicascorrectamente obtenidas y su sensibilidad/resistencia a los antibióticos habitualmente utilizadospara su tratamiento.

Los medios con crecimiento deben observarsecuidadosamente para detectar todas las coloniasdiferentes, independientemente de su tamaño, yproceder a su subcultivo. Algunos anaerobiospueden formar colonias morfológicamentesemejantes a las de los facultativos. Lossubcultivos se realizan siempre a partir de unaúnica colonia. Esta se inocula en una placa de agarsangre no selectivo para anaerobios (ver el apartado7.2.4 Medios de cultivo) y en una de agar chocolateque se incuban en una atmósfera anaerobia y

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aerobia con 10% de CO2, respectivamente. Debenrealizarse los reaislamientos necesarios para podersubcultivar colonias únicas de todos los tiposmorfológicos. Las colonias subcultivadas que nocrezcan en agar chocolate incubado en CO2 seconsideraran en principio anaerobios estrictos y seprocede a su estudio. Hay que tener en cuenta quealgunos bacilos grampositivos (Actinomyces spp.,Propionibacterium spp., Bifidobacterium spp., eincluso algunas especies de Clostridium) pueden serlo bastante aerotolerantes como para crecer en CO2y sin embargo se deben considerar comoanaerobias. Por el contrario algunos estreptococospueden aparecer como anaerobios estrictos en elprimer subcultivo y mostrarse como perfectamentefacultativos tras un periodo más o menos largo deadaptación. Confirmado el carácter de anaerobioestricto de la bacteria aislada se comunica elhallazgo lo antes posible al clínico, aunque sólo se lede una información muy general e inespecífica.

9 IDENTIFICACIÓN9.1 IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR

El primer paso, el más básico peroimprescindible, es la observación detallada de lascaracterísticas de la colonia y de la tinción de Gram.Dado que entre los anaerobios hay especies queretienen de forma variable el colorante principal(cristal violeta), en ocasiones puede ser de granayuda un subcultivo con un disco de vancomicina de5 µg para determinar el carácter de grampositividado gramnegatividad. Con los datos obtenidos de estasobservaciones ya se puede informar sobre: cocosgrampositivos anaerobios, Clostridium spp. (visiónadicional de esporas o morfología típica de C.perfringens) o bacilos grampositivos anaerobios, (eneste último caso si la morfología es dePropionibacterium se puede notificar como tal si sedetecta la producción de catalasa). Los cocosgramnegativos anaerobios se informan como tales ocomo Veillonella spp., puesto que este es el géneromás frecuentemente hallado en muestras clínicas.En el caso de los bacilos gramnegativos anaerobioses aconsejable informar de ellos una vezencuadrados en ciertos �grupos�: grupo Bacteroidesfragilis, Bacteroides/Prevotella, Prevotella/Porphyromonas, Bacteroides ureolyticus/Campylobacter, Fusobacterium, o Bilophila/Sutterella. Este encuadre preliminar se puede lograrcon algunas pruebas adicionales como: capacidadpara crecer en presencia de un 20% de bilis(resistencia a la bilis u oxgall), y su sensibilidad (S) oresistencia (R) (halos de inhibición) por el método dedifusión con discos a vancomicina (con carga de 5µg), kanamicina (de 1000 µg), y colistina (de 10 µg).La interpretación de estas observaciones es lasiguiente:

1 Crecimiento en bilis (+), vancomicina R,kanamicina R, colistina R = grupo Bacteroidesfragilis.2 Crecimiento en bilis (+), vancomicina R,kanamicina S, colistina S = grupoBilophila/Sutterella.3 Crecimiento en bilis (-), vancomicina variable

(V), kanamicina R, colistina V = grupoPrevotella/Porphyromonas.4 Crecimiento en bilis (-/+),vancomicina R,kanamicina S, colistina S = Fusobacterium spp.(dos especies bilis+).5 Crecimiento en bilis (-), vancomicina R,kanamicina S, colistina S = grupo Bacteroidesureolyticus/Campylobacter (la diferenciaciónpresuntiva entre este grupo y Fusobacteriumtendría que basarse en las característicasmorfológicas de la cepa). También estaría eneste grupo el género Leptotrichia.Aunque la sensibilidad a la vancomicina puede

diferenciar los géneros Prevotella (vancomicina R) yPorphyromonas (vancomicina S), se sugiere laagrupación imprecisa de �grupoPrevotella/Porphyromonas� para los bacilosgramnegativos anaerobios que dan colonias negras,dada la dificultad que puede existir para conseguirlosen cultivo puro a pesar de su fácil detección por lapigmentación de sus colonias.

9.2 IDENTIFICACIÓN FINAL¿Hasta donde debería llegar la identificación de

los aislamientos anaerobios en un laboratorio demicrobiología clínica?. Probablemente es deseableuna identificación lo más precisa posible. Laidentificación a nivel de género y especie de todoslos aislamientos clínicos ayudaría a conocer conprecisión su implicación en diferentes enfermedadesinfecciosas, su sensibilidad a los antibióticos y losposibles mecanismos de resistencia existentes. Sinembargo conseguir identificar la especie (e inclusoen ocasiones el género) de todos los aislamientos esuna tarea prácticamente imposible y seguramente nisiquiera necesaria. No obstante sería convenienteque al menos en algunos laboratorios con mayorcapacidad se intentara su identificación con la mayorprecisión posible.

La dificultad en la identificación de la totalidad delas bacterias anaerobias aisladas tiene un dobleorigen. En primer lugar taxonómico, ya que lasclasificaciones utilizadas cambian constantementedebido a la introducción de estudios geonómicos.Los análisis del RNA 16S han demostrado quemuchos de los géneros definidos por caracteresfenotípicos eran muy heterogéneos y conteníangéneros diversos, y que muchas especies, definidasigualmente sobre bases fenotípicas, estaban malencuadradas en el esquema taxonómico. Ensegundo lugar la gran dificultad de los laboratorios demicrobiología clínica estriba en el alto coste y tiemporequeridos para asignar sus aislamientos, por mediode caracteres fenotípicos, a géneros y especiesdefinidos sobre bases genéticas, ya que es imposiblerecurrir de forma ordinaria a estudios del RNA 16S ya técnicas de amplificación geonómica concebadores específicos. Cada laboratorio debeintentar estudiar tantos caracteres fenotípicos comole sea posible y que le permitan llegar a unaidentificación adecuada. Los caracteres fenotípicoshabitualmente estudiados, aparte de los morfológicosy de sensibilidad citados, son los derivados de laactividad metabólica: producción de indol,

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descomposición del H2O2 (catalasa), capacidadsacarolítica y/o proteolítica, detección dedeterminados enzimas y caracterización deproductos finales de su metabolismo.9.2.1 El estudio de la capacidad de producir indoly de descomponer el H2O2 están al alcance decualquier laboratorio de microbiología, por lo quedeberían incluirse en todo esquema de identificación.9.2.2 El estudio de la capacidad sacarolítica y/oproteolítica ha constituido la base de laidentificación bacteriana desde los tiempos másremotos y aún hoy es el que se ofrece en todas lasdescripciones y/o redefiniciones de géneros yespecies. La puesta en práctica de este estudioanalizando un gran número de substratos conmétodos clásicos es larga, farragosa y costosa. Unabuena alternativa es la utilización de sistemascomerciales, en los que se ofrecen, en pequeñascúpulas o pocillos de plástico, un gran número desubstratos liofilizados que se rehidratan con el propioinóculo. En estos sistemas (por ejemplo, el api 20A ) la bacteria tiene que crecer y ejercer su actividadmetabólica, por lo que tienen que incubarse enanaerobiosis durante 24 a 48 horas.9.2.3 La detección de la dotación enzimática deuna bacteria puede, igualmente, hacerse pormétodos clásicos o utilizando sistemas comerciales(api ZIM , ID 32A ...) similares a los anteriormentedescritos, pero con los substratos adecuados. Estosmicrométodos detectan solamente enzimaspreformados, por ello no es necesario que crezca labacteria, se rehidratan con un inóculo bacterianomuy denso y se incuban en aerobiosis durante 4horas. También se dispone de preparadosindividuales de algunos substratos. La detección dela lecitinasa y la lipasa se hace fácilmenteobservando el crecimiento de las bacterias enmedios sólidos que contengan yema de huevo.9.2.4 La detección de los productos finales delmetabolismo bacteriano mediante cromatografíagas-líquido sólo es asequible para los laboratoriosque dispongan del cromatógrafo adecuado. En estoscasos es una técnica de fácil realización y escasocoste, aunque exige cultivar y obtener un buencrecimiento en un medio líquido, preferentementerico en glucosa (como el PRAS PYG). Este estudio,incluso después de los cambios taxonómicosmencionados, asociado a las característicasmicroscópicas (morfología cocoide o bacilar,grampositividad o gramnegatividad) continúadefiniendo, en algunos casos, el género(Fusobacterium, Leptotrichia, Veillonella,Acidaminococcus, Megasphaera, Propionibacterium), en otros casos presta una gran ayuda paraestablecer diferencias entre determinados géneros(Actinomyces y Bifidobacterium, Lactobacillus yEubacterium...) y en otros muchos permite �separar�géneros recientemente definidos (cocosgrampositivos) y especies dentro de géneros muyamplios y heterogéneos (Clostridium). Su utilizaciónfacilita la identificación con los resultados de las otraspruebas bioquímicas (anexo 1).9.2.5 Recomendaciones. Teniendo en cuenta todasestas técnicas que pueden estar al alcance de

muchos laboratorios de microbiología clínica, unabuena práctica podría ser:

1 Realizar en todo aislamiento anaerobioestricto la identificación preliminar tal y como seha descrito.2 Añadir en todos los casos el estudio de lacapacidad de descomponer el H2O2 o de producirindol (aunque esto último suele estar incluido enlas galerías de micrométodos, puede ser másrápido y más fiable comprobarlo individualmentemediante el paradimetilaminocinamaldeido o encualquier caldo rico en triptófano).3 Estudiar la actividad metabólica con algunade las galerías de micrométodos disponibles, bienlas que detectan enzimas preformados o las quenos muestran la actividad sacarolítica oproteolítica, teniendo en cuenta que estas últimassólo serán útiles en el caso de bacterias queposean una cierta actividad sacarolítica y quesean capaces de crecer bien en las condicionesproporcionadas por el micrométodo.Si se considera necesario y es posible completar,

se debe comprobar o confirmar la informaciónobtenida realizando individualmente las siguientespruebas, indicadas en cada caso:- Reducción de nitratos en un caldo que los posea(Veillonella, grupo B. ureolyticus/Campylobacter,Propionibacterium, Eggerthella...).- Detección de lecitinasa y/o lipasa (Clostridium,Fusobacterium, Prevotella, pigmentadas).- Detección de ureasa (grupos B. ureolyticus/Campylobacter, Bilophila/ Sutterella, Clostridium).- Estímulo del crecimiento por determinadossuplementos: (formato/ fumarato en el grupo B.ureolyticus/ Campylobacter, arginina enEggerthella...)- Detección de los productos finales del metabolismo(Fusobacterium, cocos gramnegativos ygrampositivos, bacilos grampositivos no esporuladosy Clostridium.9.2.6 Interpretación de los resultadosLa interpretación de los resultados obtenidos en laspruebas practicadas conduce a una identificaciónmás o menos específica de la bacteria en estudio. Aldescribir las observaciones y pruebas necesariaspara una identificación preliminar ya se han dadounas orientaciones para su interpretación. Respectoa todas las demás que se pueden realizar no sedetalla aquí el resultado a obtener en cada una deellas para llegar a la identificación de cada uno de losposibles anaerobios, pudiéndose encontrar estainterpretación detallada en las publicacionesoriginales en las que se describen o redefinengéneros y especies y en manuales de referencia(Wadsworth-KTL Anaerobic Bacteriology Manual oManual of Clinical Microbiology, Eighth Edition). Aquísólo se señalan algunas observaciones osugerencias.9.2.6.1 Interpretación de los resultados obtenidoscon micrométodos comerciales. La realización einterpretación se hará siguiendo las instrucciones delfabricante. Todos vienen acompañados de tablas deidentificación y de una base de datos queproporcionan la identificación de la cepa estudiada,

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señalando, además, la precisión y fiabilidad de esta.Son de gran ayuda, aunque estos métodos tambiénpresentan ciertos problemas a tener en cuenta: - La lectura de las galerías, tanto si se hacemanualmente como si la realiza un lector automáticono es siempre clara y definida, con lo que condeterminadas cepas se obtienen, para algunaspruebas, resultados dudosos o difíciles deinterpretar. - La inercia de estos sistemas suele ser grande porlo que sus bases de datos no se actualizan confacilidad y no se adaptan a los frecuentes cambiostaxonómicos. Cuando alguno de esos cambiosconsiste en que una determinada especie estransferida a otro género y/o recalificada el problemase limita a utilizar la denominación correcta cada vezque se de esa identificación (por ejemplo,Peptostreptococcus magnus → Finegoldia magna,Peptostreptococcus micros→ Micromonas micros,Eubacterium lentum→ Eggerthella lenta). Elproblema es mayor cuando el cambio supone lacreación de nuevas especies, muchas veces a partirde una anteriormente descrita (por ejemplo,Peptostreptococcus prevotii→ P. prevotii, P.vaginalis, P. lacrimalis, P. lactolyticus). - Las bases de datos suelen ser amplias y fiablespero lógicamente limitadas, no incluyen algunasespecies que aún no siendo muy frecuentes puedenencontrarse en clínica (Campylobacter spp.,Bilophila/Sutterella, Acidaminococcus, ....), por ellocon estos sistemas una cepa perteneciente a algunade estas especies puede o no ser identificada o serloerróneamente.

Cuando la lectura de las pruebas no proporcionaninguna identificación, esta es calificada por el propiosistema de poco fiable o de escasa discriminación,en estos casos o cuando este en clara contradiccióncon las observaciones realizadas para laidentificación preliminar, es de gran ayuda disponerde alguna prueba complementaria cuyo resultadocentre la identificación.

9.2.6.2 Interpretación de los resultados de laspruebas individuales complementarias realizadas encasos concretos:- Ante una identificación preliminar de bacilosgramnegativos anaerobios con crecimiento en bilis (-), vancomicina R, kanamicina S y colistina S, laproducción de ácido butírico como producto finaldel metabolismo indica sin ninguna duda que setrata de Fusobacterium. Una reducción de nitratospositiva sitúa en el grupo Bacteroidesureolyticus/Campylobacter. En las bases de datos delos micrométodos más utilizados F. nucleatum, laespecie más frecuente, se identifica bien pero conescasa discriminación, sólo una prueba positiva, ydel grupo Bacteroides ureolyticus/Campylobactersólo B. ureolyticus esta contemplado. - Una prueba de lipasa (+) en Fusobacteriumconfirma su identificación como F. necrophorum,especie que con las galerías de micrométodoscomerciales se identifica bien pero con escasadiscriminación (sólo dos pruebas positivas).- Ante una identificación preliminar de bacilosgramnegativos anaerobios crecimiento en bilis (-),

vancomicina R, kanamicina S y colistina S, laproducción de ácido láctico como producto finaldel metabolismo indica su pertenencia al géneroLeptotrichia. - Ante una identificación preliminar de bacilosgramnegativos anaerobios crecimiento en bilis (+),vancomicina R, kanamicina S, y colistina S, unaprueba de catalasa (+) o (-) indica Bilophilawadsworthia o Sutterella wadsworthensis. - Una identificación preliminar de cocosgramnegativos anaerobios nitratos (+) separa elgénero Veillonella, y los productos finales delmetabolismo definen perfectamente los tres géneros:Veillonella (ácido propiónico), Acidaminococcus(ácido butírico) y Megasphaera (ácido caproico).- Ante una identificación preliminar de bacilosgrampositivos anaerobios, que morfológicamenteaparecen como Propionibacterium, la detección deácido propiónico como producto final delmetabolismo confirma el diagnóstico de género. Sise añaden las pruebas de catalasa (+), indol (+) ynitratos (+), esta prácticamente identificada laespecie Propionibacterium acnes.- La identificación de un bacilo grampositivoanaerobio como Eggerthella lenta (antesEubacterium lentum) con los micrométodoshabituales, tanto con los que estudian la capacidadsacarolítica como con los que detectan enzimaspreformados, es de escasa discriminación: resultadonegativo en todas las pruebas en el primer caso (api20 A ) y con sólo un resultado positivo, el ADH(arginina dehidrolasa), en el segundo caso (ID 32A ).La reducción de nitratos (+), la estimulación delcrecimiento con arginina y la producción de SH2en medio de TSI (triple sugar iron) confirmanplenamente el diagnóstico. - Ante una identificación preliminar de cocosgrampositivos anaerobios, la sensibilidad mediante latécnica de disco-placa a polianetol sulfonatosódico (SPS) indica la identificación dePeptostreptococcus anaerobius o, con menosprobabilidad, Micromonas micros. Aparte de la fácildiferenciación de este último por su morfologíamicroscópica (tamaño) y porque se identifica muybien con los micrométodos que detectan enzimaspreformados, un cromatograma abigarrado,incluyendo hasta ácido isocaproico en los productosfinales del metabolismo orienta claramente haciaP. anaerobius.- En el taxonómicamente complicado grupo de loscocos grampositivos anaerobios la detección de losproductos finales del metabolismo delimita gruposmás reducidos:- Los que producen ácido acético:

Finegoldia magnaMicromonas micros

- Los que producen ácido butírico: Indol (-):Peptostreptococcus prevotii → Anaerococcus prevotiiPeptostreptococcus tetradius → Anaerococcus tetradiusPeptostreptococcus lactolyticus→ Anaerococcus

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lactolyticusPeptostreptococcus vaginalis → Anaerococcus vaginalisPeptostreptococcus lacrimalis → Peptoniphilus lacrimalis o Schleiferella lacrimalisPeptostreptococcus ivorii → Peptoniphilus ivorii

Indol (+):Peptostreptococcus indolicus → Peptoniphilus indolicus o Schleiferella indolicaPeptostreptococcus asaccharolyticus → Peptoniphilus asaccharolyticus o Schleiferella asaccharolyticaPeptostreptococcus harei → Peptoniphilus harei o Schleiferella harei

Peptostreptococcus vaginalis → Anaerococcus vaginalisPeptostreptococcus hydrogenalis → Anaerococcus hydrogenalis

- Los que producen diversos ácidos orgánicos yhasta ácido isocaproico:

Peptostreptococcus anaerobius- Los que producen diversos ácidos orgánicos y

hasta ácido caproico:Peptostreptococcus octavius → Anaerococcus octaviusPeptococcus Níger

Únicamente en el caso de P. anaerobius lacromatografía separa un género y una especieconcreta, en el resto, y según los últimos cambiostaxonómicos, los productos finales del metabolismoson los mismos para los distintos géneros. Aquí seda la paradoja de que con los caracteres fenotípicosusualmente estudiados, hay que llegar al diagnósticode especie para poder llegar al género adecuado.Cuando esto no sea posible, quizás sea buenoconocer en que grupo se está.- Ante el amplio género Clostridium, definido por lacapacidad de producir esporas, las pruebascomplementarias como la detección de lecitinasa ylipasa pueden definir tres grupos:

- Clostridium lecitinasa (+), entre los que seencuentran especies tan frecuentes como C.perfringens, C. novyi A [ambos indol (-) yademás C. novyi A productor también delipasa], C. bifermentans y C. sordellii [ambosindol (+) y además C. sordellii productortambién de ureasa].- Clostridium lipasa (+), incluyen además de C.novyi A, todos los biotipos de C. botulinum y C.sporogenes.- Clostridium lecitinasa (-) y lipasa (-). A estegrupo pertenecen multitud de especies quepueden a su vez agruparse por los productosfinales de su metabolismo: - Los que producen sólo ácido acético (comoC. ramosum y C. clostridioforme). - Los que producen ácido butírico, queconstituyen un grupo con un elevado número deespecies importantes en clínica (entre ellas C.tetani, C. septicum, C. butyricum, .....).

- Los que producen una gran variedad de

productos finales en su metabolismo. En estegrupo, con muy pocas especies y en generalpoco frecuentes en clínica, se encuentra C.difficile que produce de forma característicaácido isocaproico, de forma que esta especiepodría identificarse con mucha fiabilidad por suscaracterísticas morfológicas, inoculación de unaplaca de agar-yema de huevo y cromatografíade los productos finales de su metabolismo.

10. PRUEBAS DE DETERMINACIÓN DE LASENSIBILIDAD10. 1 INDICACIONESNo se recomienda realizar, de una forma rutinaria,ensayos de sensibilidad a todos los aislamientos debacterias anaerobias. La comunicación con el clínicoes importante para decidir la realización de dichaspruebas. En la actualidad, se consideran lassiguientes indicaciones para realizar estudios desensibilidad:1) Estudios periódicos de vigilancia y seguimiento encada centro hospitalario, con el fin de conocer lospatrones locales de resistencia y de esta forma tenerinformación útil para seleccionar la terapiaantimicrobiana empírica más adecuada y detectarposibles cambios en la sensibilidad o aparición deresistencias.2) Casos individuales de pacientes que noresponden a la terapia empírica, o que presentaninfecciones graves o infecciones que requieranterapia prolongada (absceso cerebral, endocarditis,osteomielitis, infección articular, de prótesis, deinjertos vasculares, y bacteriemias recurrentes).3) Estudios de la actividad in vitro de nuevosantimicrobianos frente a bacterias anaerobias.4) Infecciones producidas por especies deBacteroides, Prevotella, Fusobacterium, Clostridium,Bilophila y Sutterella, que son más virulentas y/o conuna sensibilidad poco predictible a los antibióticoscomúnmente utilizados para el tratamiento de lasinfecciones por anaerobios.

10.2 MÉTODOSPara una información más completa sobre lametodología de los ensayos de sensibilidad de lasbacterias anaerobias es conveniente consultar elProcedimiento en Microbiología Clínica nº 11 de laSEIMC (Métodos básicos para el estudio de lasensibilidad a los antimicrobianos). En el presentedocumento se incluyen, especialmente, lasmodificaciones que se han producido ulteriormente,especialmente en los últimos documentos delNCCLS (M11-A5, 2001 y M11-A6, 2004). El métodode difusión con discos en agar no está aprobadopara las bacterias anaerobias y el de dilución en agares el de referencia para todos los anaerobios. Encuanto al método de microdilución en caldo elNCCLS solamente lo ha aprobado para el ensayo deaislamientos pertenecientes al grupo de Bacteroidesfragilis y a un número limitado de antibióticos, ya quediversas especies anaerobias crecen poco o no lohacen en los pocillos y, además, hay pocos estudioscomparativos con el método de referencia. Cuandose realizan estudios amplios, ya sea para ensayar

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nuevos antimicrobianos o para conocer los patronesactuales de resistencia, la técnica de dilución en agares el método más eficaz, ya que permite elcrecimiento de una gran variedad demicroorganismos anaerobios. El método demicrodilución así como la utilización de tiras de E-test, son alternativas recomendadas para casosindividuales.10.2.1 Dilución en agar.Medios de cultivo: En sus últimos documentos elNCCLS recomienda utilizar agar Brucellaenriquecido con 5% de sangre de carnero lacada,vitamina K1 (5 µg/ml) y hemina (5 µg/ml), en lugar delmedio recomendado anteriormente, agar Wilkins-Chalgren, al comprobar que en el primero crecenmejor las bacterias anaerobias.Preparación del inóculo: A partir de un cultivo enplacas de agar Brucella enriquecido para anaerobios,de 24 horas o del tiempo necesario para conseguircolonias de por lo menos 1 milímetro de diámetro, sesuspenden de 3 a 5 colonias en un caldo detioglicolato enriquecido sin indicador, que se incubaentre 6 y 24 horas o hasta que alcance una turbidezadecuada. Posteriormente, se ajusta la turbidez auna densidad equivalente al 0,5 de la escalaturbidométrica de McFarland mediante la adición decaldo Brucella u otro caldo previamente reducido, ohervido y enfriado para eliminar el oxígeno. Tambiénse puede preparar el inóculo directamente haciendouna emulsión de las colonias y ajustándola a laturbidez mencionada partiendo del cultivo, medioscitados y según el procedimiento anteriomenteindicado. Las placas con medio de agar Brucella conantibióticos no deben dejarse en aerobiosis untiempo superior a 30 minutos.La inoculación en la superficie del agar se hace conla ayuda de un replicador de Steers. El inóculo finaldebe ser, aproximadamente, de 105 UFC por puntode inoculación. Se recomienda, tanto al principiocomo al final de cada serie, inocular dos placascontrol sin antibiótico, una se incuba en unaatmósfera con un 5% de CO2 y la otra enanaerobiosis, durante 42-48 h, con el fin decomprobar la viabilidad y pureza del inóculo. Se debeempezar a inocular siempre por la concentraciónmás pequeña de cada antibiótico. A las 42-48 h deincubación en anaerobiosis a 35-37ºC, se lleva acabo la lectura examinando en primer lugar lasplacas control. La CMI (concentración mínimainhibitoria) se considera como aquella concentraciónde antibiótico en la que se observa una reducciónmarcada en el crecimiento de la bacteria alcompararlo con el crecimiento de la placa control,como es el cambio a una fina película, o anumerosas colonias pequeñas, o bien a una o variascolonias de tamaño normal.La interpretación de los valores de CMI obtenidospara cada antibiótico se realiza según los criterios deldocumento M11-A6 del NCCLS.10.2.2. Microdilución en caldo. Como se hamencionado solamente está aceptado por el NCCLSpara las especies del grupo de Bacteroides fragilis ypara ampicilina-sulbactam, cefoxitina, clindamicina,ertapenem, metronidazol, piperacilina y

trovafloxacino. Para su realización se recomiendausar caldo Brucella suplementado con hemina (5µg/ml), vitamina K1 (1 µg/ml) y sangre lacada decaballo (5%). El inóculo puede preparase siguiendouno de los procedimientos descritos en el método dedilución en agar y debe ser de 1x105 UFC/pocillo. Seaconseja realizar un control de pureza de lasuspensión del inóculo, haciendo un subcultivo deuna parte alícuota en un medio enriquecido y noselectivo para incubar en aerobiosis y enanaerobiosis.

A las 48 horas de incubación en atmósferaanaerobia a 35-37ºC, se realiza la lectura en unfondo oscuro, con luz indirecta o mediante un espejo.Se considera como CMI aquella concentración delantibiótico en la que se observa una reducciónsignificativa del crecimiento bacteriano al compararlocon el crecimiento del pocillo control, ya sea unainhibición completa del crecimiento o un botón decrecimiento muy tenue.10.2.3. Sistemas comercializados. Se encuentrandisponibles microplacas con diferentes antibióticoscon actividad frente a bacterias anaerobias(Sensititre , Trek Diagnostic Systems). Los panelesde Sensititre contienen el sustrato antibióticodesecado, se pueden almacenar a temperaturaambiente y presentan larga caducidad (18-24meses). El autoinoculador Sensititre permite suinoculación automática. Como medio de cultivo seutiliza, siguiendo las normas del NCCLS, caldoBrucella con sangre lacada de caballo (5%) queproporciona la casa comercial.

Otro micrométodo de dilución en caldocomercializado son las galerías de sensibilidad parabacterias anaerobias ATB ANA (bioMérieux).Contienen 16 pares de pocillos con diferentesantibióticos que se ensayan a dos concentracionesdeterminadas. La lectura se realiza mediante unlector automatizado.10.2.4 E-test. Las tiras de E-test (AB Biodisk)consisten en unas tiras de plástico impregnadas conun gradiente exponencial continuo del antimicrobianoy una escala de valores de CMI. Siguiendo lasnormas de los fabricantes del producto, se preparacomo inóculo una suspensión del microorganismo aensayar en caldo Brucella hasta alcanzar unaturbidez correspondiente al nº 1 de la escala deMcFarland, que se aplica en placas de agar Brucellaenriquecidas con 5% de sangre de carnero, vitaminaK1 (1 µg/ml) y hemina (5 µg/ml). Una vez secas lasplacas se aplican las tiras sobre la superficie del agarcon la escala hacia arriba y evitando la formación deburbujas bajo ella. Se incuban en anaerobiosisdurante 24-48h. La lectura de la CMI se realiza en elpunto de intersección de la escala de la tira y la zonade inhibición del crecimiento del microorganismo,que tiene forma de elipse. Para el metronidazol esimportante alcanzar la atmósfera anaerobia en 1 ó 2horas. Con la clindamicina se debe confirmar lalectura a las 48 horas.10.2.5 Controles de calidad. Con cualquiera de losmétodos utilizados se deben realizar ensayos decontrol de calidad con las cepas de referencia de la

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colección americana de cultivos tipo ATCC

(Bacteroides fragilis ATCC 25285, Bacteroidesthetaiotaomicron ATCC 29741 y Eubacterium lentumATCC 43055). El NCCLS recomienda efectuar losensayos de control de calidad en la dilución en agar,con al menos 2 de las cepas ATCC indicadas y en lamicrodilución en caldo, con 1 o más cepas ATCC.Los intervalos aceptables de los valores de CIM decada uno de los 3 microorganismos ATCC y para losdiferentes antibióticos se pueden obtenerconsultando el mencionado documento M11-A6 delNCCLS.10.2.6 Detección de ββββ-lactamasas. La presencia deβ-lactamasas se puede investigar con el método dela cefalosporina cromogénica utilizando comosustrato nitrocefin (Cefinase , Becton Dickinson). Eldisco de nitrocefin se humedece con agua estéril ysobre el mismo se extienden varias colonias. Elcambio de color amarillo a rojo indica una reacciónpositiva. La reacción suele ser positiva a los 5-10minutos. En algunas cepas la reacción puede sermás lenta, pero no debe observarse tras un periodode tiempo superior a 30 minutos.

Dado que la mayoría del grupo Bacteroidesfragilis son productores de β-lactamasas, seconsideran de forma natural resistentes a penicilina,por lo que no es necesario ensayar de rutina laproducción de β-lactamasas en este grupo. Cualquierotra bacteria anaerobia que sea productora de β-lactamasas se debe considerar resistente a penicilinay ampicilina e informar como tal, independientementede los resultados de los estudios de sensibilidad invitro. Una prueba de detección de β-lactamasasnegativa no implica necesariamente que la bacteriasea sensible a la penicilina, ya que puede ocurrir quela bacteria sea resistente a los β-lactámicos por otrosmecanismos diferentes a la producción de β-lactamasas.

11. PROCEDIMIENTOS A REALIZAR ENSITUACIONES ESPECIALES11.1 BOTULISMO

Se trata de una enfermedad que es cada vezmenos frecuente en los países desarrollados por laimplantación de medidas preventivas en laelaboración y conservación de los alimentosenvasados. Se reconocen cinco tipos depresentaciones clínicas: intoxicación alimentaria,botulismo de las heridas, botulismo del lactante,botulismo por colonización intestinal y botulismoinhalatorio. Está provocada por las neurotoxinas deC. botulinum, y, puntualmente, por las de C.butyricum y C. baratii. El diagnóstico se realizademostrando las neurotoxinas y/o el agenteetiológico en muestras del paciente. En laintoxicación alimentaria deben obtenerse 15-20mililitros de suero, 25-50 gramos de heces y elalimento sospechoso de contener el agenteinfeccioso. En el botulismo de las heridas debeobtenerse suero, heces y material tisular o exudativode la herida infectada. En el del lactante y en elproducido por colonización intestinal se recomiendaobtener suero, heces y contenido gástrico del

paciente, y en el botulismo inhalatorio, suero,contenido gástrico, heces, torundas nasales y elmaterial sospechoso. Debido a la gran toxicidad delas neurotoxinas, todas las muestras sospechosasdeben enviarse al laboratorio de referencia delInstituto de Salud Carlos III para su posteriorprocesamiento.

11.2 DIARREA Y COLITIS POR CLOSTRIDIUMDIFFICILE ASOCIADAS AL USO DEANTIBIÓTICOS

Clostridium difficile es la causa más frecuente dediarrea y colitis asociada al uso previo de antibióticosen el ambiente hospitalario. Su incidencia estáalrededor de los 10 casos por 1.000 ingresos. Lastoxinas implicadas son la A o enterotoxina y la B ocitotoxina. El diagnóstico se basa esencialmente enla detección de las toxinas a partir de hecesdiarreicas frescas por ensayos de citotoxicidad. Nose recomienda el análisis sobre heces sólidas ya quehay una importante disminución de la sensibilidad yademás existen portadores sanos de C. difficiletoxigénico. El procedimiento diagnóstico mássensible es el denominado cultivo toxigénico, esdecir, el ensayo de citotoxicidad de la toxina B enlíneas celulares de los aislados de C. difficilerecuperados del cultivo. Sin embargo, esrecomendable realizar a la vez un ensayo decitotoxicidad directa de las heces ya que aumentala sensibilidad de la técnica en un 5% y reduce eltiempo necesario para el diagnóstico de laenfermedad. El ensayo de citotoxicidad se basa en ladetección del efecto citopático especifico de lacitotoxina de C. difficile en ciertas líneas celulares demamíferos como: fibroblastos humanos, célulasMRC-5 o células K-1 de ovario de hámster chino. Elensayo del cultivo toxigénico consiste en inocular enun caldo de enriquecimiento, como cado de infusiónde cerebro y corazón (BHI), varias coloniassospechosas de C. difficile, incubarlo enanaerobiosis a 37ºC durante 24 horas, filtrar elcultivo con un filtro de membrana, diluir el filtrado,añadir la dilución al cultivo celular elegido e incubareste a 37ºC durante 48 horas. Se recomienda leerlos cultivos a las 24 y 48 horas. La especificidad delefecto citopático se comprueba realizando el mismoensayo en paralelo en un cultivo celular quecontenga la antitoxina de la toxina B. Si se produceel efecto citopático en el cultivo sin antitoxina y no seproduce en el que sí la contiene, entonces ladetección es positiva. En el ensayo de citotoxicidaddirecta se parte de un filtrado de la muestra de hecesque se procesa de forma idéntica al realizado con lascolonias.

El cultivo de las heces puede realizarse enmedios de cultivo selectivos como el agar fructosa-cicloserina-cefoxitina (CCFA) o el agar yema dehuevo-cicloserina-cefoxitina (CCEY), o bien, enmedios no selectivos, como el agar sangre paraanaerobios, con un pretratamiento de las heces conalcohol absoluto durante 30-60 minutos o mediantechoque térmico a 80ºC durante 10 minutos. Tras 24-48 horas de incubación en anaerobiosis, las coloniasson no hemolíticas, mates, planas, grandes e

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irregulares, de color amarillento a grisáceo, con unaestructura interna que se asemeja a un mosaico decristales, y con olor a cuadra debido a la producciónde p-cresol. Aunque el cultivo es muy sensible, espoco específico ya que permite crecer a las cepas notoxigénicas de C. difficile y a otros clostridios.

11.3 TOXIINFECCIÓN POR CLOSTRIDIUMPERFRINGENSEsta toxiinfección se produce por la enterotoxina deC. perfringens del tipo A. Esta especie posee cincogrupos toxigénicos (A, B, C, D y E), según laproducción de las cuatro toxinas consideradasprincipales y la enterotoxina. Suele aparecer enforma de brotes, más frecuentes en restaurantes ycolegios, debido a cocciones inadecuadas deproductos cárnicos y, a veces, vegetales, quecontienen esporas de C. perfringens, y a un ulteriorenfriamiento lento. Las esporas supervivientes delcocinado germinan dando lugar a las formasvegetativas que se multiplican activamente por elenfriamiento lento. Tras la ingestión, las formasvegetativas producen endosporas debido al ambientealcalino del intestino delgado. Este proceso deesporulación también da lugar a la elaboración yliberación de una enterotoxina que es la responsabledel cuadro. Se estima que son necesarias 108

células vegetativas viables para que aparezcansíntomas. El periodo de incubación es de 6-24 horas.Los síntomas más frecuentes son diarrea acuosa(90%), calambres abdominales (80%), náuseas(25%), fiebre (24%) y vómitos (9%). Los síntomassuelen remitir espontáneamente en pocas horas. Elcultivo de heces (>105 UFC/gramo) y del alimentosospechoso (>106 UFC/gramo) en mediosespecíficos para clostridios tiene una altasensibilidad pero la especificidad no es buena. Serecomienda la detección de la enterotoxina en hecesmediante técnicas de aglutinación pasiva reversamediante látex (Oxoid®) o enzimoinmunoensayo(TechLab®), o bien, mediante ensayos específicos decitotoxicidad en cultivos celulares de células Vero.No está recomendada la detección parcial o total delgen de la enterotoxina en aislados de C. perfringensmediante técnicas de PCR o sondas marcadas condigoxigenina ya que su presencia no implica que lascepas tengan la capacidad de producir laenterotoxina durante la esporulación en un ambientesimilar al intestinal (condición imprescindible paraproducir la enfermedad).

11.4 ANGINA DE VINCENTEs una infección de la cavidad oral caracterizada porfaringitis, presencia de exudado membranoso, alientofétido y úlceras orales. Esta causada por ciertasespecies aerobias como Borrelia spp. o anaerobiascomo Fusobacterium spp. El diagnóstico ha derealizarse siempre mediante los hallazgos clínicos yuna tinción de Gram de las úlceras bucales tomadasen torunda en la que se observaran espiroquetas,bacilos fusiformes y leucocitos polimorfonucleares. Elcultivo no es útil para el diagnóstico de estaenfermedad.

11.5 ACTINOMICOSISLa actinomicosis es una enfermedad granulomatosacrónica caracterizada por la presencia de lesionessupurativas que pueden evolucionar a abscesos yfístulas. En ocasiones, se produce una supuraciónpurulenta con gránulos macroscópicos de azufre decolor blanquecino, amarillento o marrón. Su principalagente etiológico es Actinomyces israelii aunqueotras especies como A. naeslundii A. meyeri, A.odontolyticus, A. gerencseriae o A. viscosus tambiénpueden estar implicados. Esta infección suele serpolimicrobiana y los microorganismos másfrecuentemente encontrados junto al géneroActinomyces son Propionibacterium propionicum,Fusobacterium spp., Eikenella corrodens,Capnocytophaga spp., Actinobacillusactinomycetemcomitans, Prevotella spp.,Porphyromonas spp. y algunos estreptococos. Eldiagnóstico se basa en primer lugar, y cuando esténpresentes, en la observación microscópica de losgránulos de azufre (0, 1-5 mm) obtenidos demuestras como tejidos, lavados bronquiales, líquidoscorporales, dispositivos intrauterinos o exudadospurulentos. Estos gránulos tienen un borde irregulardebido a la acumulación de bacterias bacilarespertenecientes al género Actinomyces. Con unatinción de Gram se observan bacilos grampositivosen forma de garrote, normalmente ramificados y quese deben diferenciar de otros microorganismosmorfológicamente similares como Nocardia spp. oStreptomyces spp. La petición de un cultivo paraActinomyces spp. a partir de los gránulos de azufreo, en su ausencia, de las muestras sospechosasdebe especificarse en el volante de solicitud ya querequiere un pretratamiento especial y una incubaciónprolongada. Se utilizan los medios de cultivo sólidosy líquidos habituales para el cultivo demicroorganismos anaerobios pero deben ser lo másfrescos posible. Los gránulos de azufre y lasmuestras sólidas se trituran en un medio deenriquecimiento líquido y el triturado se siembra enuna placa de agar sangre para anaerobios, en unaplaca de agar con alcohol fenil-etílico y sangre, y enun caldo de enriquecimiento. Estos medios de cultivose incuban en ambiente anaerobio a 35-37ºCdurante un mínimo de 7 días, tiempo que puedeextenderse hasta las 2-4 semanas. Cuando se tratede muestras ricas en microbiota, como genitales odispositivos intrauterinos, es recomendable diluirlasde 1:10 a 1:10.000 y sembrar las diluciones en agarsangre Columbia con y sin metronidazol a unaconcentración de 2,5 µg/ml. Todas las especies deActinomyces son anaerobias facultativas conexcepción de A. meyeri que es anaerobia estricta. Lamorfología de las colonias de Actinomyces spp. varíade un aspecto liso a una apariencia molardependiendo de ciertos factores como el tipo demedio y condiciones de cultivo y la edad de lascolonias. El aspecto de las bacterias con la tinción deGram también puede ser variable observándosedesde bacilos grampositivos ramificados a formascocoides. La diferenciación de las especies deActinomyces es difícil aún utilizando los sistemas deidentificación comerciales.

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11.6 INFECCIONES ENDOMETRIALESSon infecciones generalmente polimicrobianas conpredominio de flora anaerobia. La muestra ideal paracultivo es tejido endometrial obtenido mediante unacánula de aspiración en condiciones de anaerobiosisy evitando la contaminación con la microbiotavaginal. No deben utilizarse hisopos, pues a losinconvenientes del uso de las torundas se une el quelos agentes causales de la infección suelenencontrarse incluídos en el tejido. La muestra,transportada adecuadamente, se procesa lo másrápidamente posible triturándose en un caldo decultivo. La mezcla resultante se siembra en losmedios habituales para el cultivo de anaerobios,sólidos y líquidos, aerobios y facultativos, específicosde bacterias aerobias productoras de infeccionesendometriales como agar Thayer-Martin o Martin-Lewis, agar Shepard Al y para micobacterias. Elproceso ulterior coincide con el general previamentedescrito.

11.7 ENTEROCOLITIS DEL PACIENTE CONNEUTROPENIALa enterocolitis del paciente con neutropenia es unainfección necrótica del ciego y otras zonas delintestino producida generalmente por C septicum y,en menor medida, por otros clostridios como C.tertium, C. perfringens, C. sporogenes y C. sordelli.Se manifiesta por fiebre, dolor abdominal queaumenta cuando se palpa el cuadrante inferiorderecho del abdomen, y diarrea acuosaocasionalmente sanguinolenta. Los tejidos afectadosestán edematosos, hemorrágicos, necróticos ycontienen numerosos clostridios. Esta infecciónafecta a pacientes neutropénicos o con procesosoncológicos gastrointestinales. El diagnósticomicrobiológico se realiza a partir de las siguientesmuestras: sangre (3 series de hemocultivos tomadosde diferentes zonas de venopunción), heces (unmínimo de 25 gramos o mililitros), contenido dellumen y/o de tejido del área ileocecal afectada, estasdos últimas recogidas durante la intervenciónquirúrgica o la autopsia. Cuando se sospeche unamionecrosis u otra forma de infección progresivatambién debe tomarse una biopsia o aspirado delmúsculo afectado. Tanto C. septicum como el restode los clostridios implicados crecen muy bien yrápidamente en los medios de cultivo habituales paraanaerobios, donde a las 48 horas de incubaciónproducen colonias grandes e irregulares. Lascolonias de C. septicum son muy características yaque crecen en velo por toda la superficie del mediode cultivo (del mismo modo que los microorganismosdel género Proteus en agar sangre) y no crecen enagar con alcohol feniletílico.

11.8 TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICOTécnicas rápidas de detección de Clostridiumdifficile toxigénico

A pesar de la alta sensibilidad y especificidad deluso combinado del cultivo toxigénico y del ensayo decitotoxicidad, su realización puede llevar de 1 a 4días. Además, existen muchos laboratorios demicrobiología que carecen de la infraestructura

necesaria para la realización de cultivos celulares.Estos inconvenientes han dado lugar a la apariciónde sistemas comerciales de detección de C. difficiletoxigénico en heces que son muy sencillas derealizar y que han reducido considerablemente eltiempo de diagnóstico. Las principales técnicascomerciales disponibles en la actualidad son:1) Técnicas que detectan glutamato deshidrogenasa:este enzima es un antígeno bastante específico deC. difficile pero tiene el inconveniente de que estápresente tanto en las cepas toxigénicas como notoxigénicas, por ello las técnicas basadas en sudetección no las discriminan y tienen valores deespecificidad discretos. Los sistemas basados enaglutinación de partículas de látex (CDT®, BectonDickinson; Meritec C. difficile®, Meridian Diagnostics)dan los resultados en pocos minutos y los queutilizan técnicas de enzimoinmunoensayo(lmmunoCard C. difficile®. Meridian Diagnostics;Triage C. difficile panel®, Biosite Diagnostics) en 15-20 minutos. Los valores de sensibilidad yespecificidad son del 84-92% y 96-100%,respectivamente.2) Técnicas que detectan toxina A: existennumerosos sistemas comerciales que detectan laenterotoxina de C. difficile mediante técnicas deenzimoinmunoensayo. El tiempo necesario para laobtención de resultados varía de unos pocos minutosa varias horas. Los valores de sensibilidad yespecificidad son muy diversos dependiendo delsistema comercial que se utilice, aunque sonsuperiores a los obtenidos por las técnicas basadasen la detección de glutamato deshidrogenasa. Suprincipal problema estriba en que no detectan cepastoxigénicas que no producen toxina A, que se estimasuponen el 10% del total de cepas toxigénicasproductoras de enfermedad.3) Técnicas que detectan toxina A y B: son mássensibles que las anteriores ya que son capaces dedetectar cepas que no producen toxina A y si B. Losprincipales sistemas disponibles son C. difficile Tox-A/B Tets® (TechLab), Cd Toxin A+B® (RohmPharma) y Premier Cytoclone® (MendianDiagnostics).

12. BIBLIOGRAFÍA1. Allen SD, Emery CL, Lyerly DM. Clostridium. En: MurrayPR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RHeditores. Manual of Clinical Microbiology, Eighth Edition.American Society for Microbiology, Washington, D.C.;2003. p. 835-855.2. Dowell VR Jr. Botulism and tetanus: selectedepidemiologic and microbiologic aspects. Rev Infect Dis1984;6:S202-S207.3. García-Rodríguez JA, Cantón R, García Sánchez JE,Gómez-Lus ML, Martínez Martínez L, Rodríguez-Avial C,Vila J. Procedimientos en Microbiología Clínica 11.Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a losantimicrobianos. SEIMC.4. Guerrero Gómez C, Sánchez Carrillo C. Procedimientosen Microbiología Clínica 1a. Recogida, transporte yprocedimiento general de las muestras en el laboratorio demicrobiología. SEIMC.5. Isenberg HD: Clinical Microbiology ProceduresHandbook. American Society for Microbiology, Washington,D.C.; 1992, 1997.

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6. Jousimies-Somer HR, Summanen P, Citron DM, BaronEJ, Wexler HM, Finegold SM. Wadsworth �KTL AnaerobicBacteriology Manual. Star Publishing Company. Belmont,C.A. 2002.7. Jousimies-Somer HR, Summanen PH, Wexler H,Finegold SM, Gharbia SE, Shah HN. Bacteroides,Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, and otheranaerobic gram-negative bacteria. En: Murray PR, BaronEJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH editores. Manualof Clinical Microbiology, Eighth Edition. American Societyfor Microbiology, Washington, D.C.; 2003. p. 880-901.8. Loza Fernández de Bobadilla E, Planes Reig A,Rodríguez Creixems M. Procedimientos en MicrobiologíaClínica 1a. Hemocultivos. SEIMC.9. Lyerly DM, Krivan HC, Wilkins TD. Clostridium difficile:its disease and toxins. Clin Microbiol Rev 1988;1:1-18.10. Moncla BJ, Hillier SL. Peptostreptococcus,Propionibacterium, Lactobacillus, Actinomyces, and othernon-spore-forming anaerobic gram-positive bacteria. En:Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, YolkenRH editores. Manual of Clinical Microbiology, EighthEdition. American Society for Microbiology, Washington,D.C.; 2003. p. 857-879.11. NCCLS. Methods for Antimicrobial SusceptibilityTesting of Anaerobic Bacteria. Approved Standard. FifthEdition. M11-A5, 2001.12. NCCLS. Methods for Antimicrobial SusceptibilityTesting of Anaerobic Bacteria. Approved Standard. SixthEdition. M11-A6, 2004.13. Rood JI, McClane BA, Songer JG et al. The Clostridia:Molecular Biology and Pathogenesis. San Diego:Academic; 1997.14. Shandera WX, Tacket CO, Blake PA. Food poisoningdue to Clostridium perfringens in the United States. J InfetDis 1983;147:167-170.

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Figura 1.- Esquema del procesamiento inicial de la muestra

Muestra

Exámen directo Medio líquidoTioglicolato

MicroscópicoTinción de Gram

Placas

Incubación en anaerobiosisAgar brucellaSNVBBEPEAAYE*

Incubación al 10% CO2Agar sangreAgar chocolate

* Cuando se sospecha la presencia de clostridios

Macroscópico

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Anexo 1.- Análisis de los productos finales del metabolismo mediante cromatografía gas-líquido

1º - Incubar, hasta obtener un buen crecimiento, un cultivo en medio líquido de la bacteria a estudiar

2º - Añadir dos gotas de H2SO4 al 50% a 5 ml del cultivo (acidificar a un pH aproximadamente de 2), centrifugar, yrecoger el sobrenadante para analizar aquí los productos metabólicos acumulados. Los productos acumulados que interesan para la identificación bacteriana son fundamentalmente:

a) - Ácidos grasos volátiles: fórmico, acético, propiónico, isobutírico, butírico, isovalérico, valérico, isocaproico ycaproico.

b) - Ácidos grasos no volátiles: láctico y succínico

3º - a) Extraer directamente los ácidos volátiles con éter b) Metilar los ácidos no volátiles y extraer los metilderivados con cloroformo4º - Inyectar 1 µl del extracto correspondiente en la columna del cromatógrafopara separar e identificar los productos extraídos

A.- Extracción con éter de los ácidos volátiles acumulados en el medio de cultivo1. Separar 1 ml del sobrenadante (en tubo de cristal)2. Añadir 0.2 ml de H2SO4 al 50% y 0,4 g de NaCl3. Añadir 1ml de éter (tapar y mezclar bien invirtiendo el tubo 20 veces)4. Centrifugar brevemente para separar la capa de éter5. Inyectar 1 µl de éter en la columna

Si el cromatógrafo utilizado esta equipado con un detector de ionización de llama (FID) y una columna SP-1220,se puede prescindir de esta extracción e inyectar directamente el sobrenadante del cultivo

B.- Preparar metil derivados (de los ácidos pirúvico, láctico y succínico) y proceder a su extracción con cloroformo1. Separar 1 ml del sobrenadante (en tubo de cristal)2. Añadir 0.2 ml de H2SO4 al 50% + 1 ml de metanol. Tapar y mezclar bien3. Colocar a baño o bloque de calor a 60ºC 30 minutos4. Dejar enfriar5. Añadir 0.5 ml de cloroformo ( tapar y mezclar bien invirtiendo el tubo 20 veces )6. Centrifugar brevemente para separar la emulsión7. Eliminar con una pipeta parte de la capa acuosa8. Usando la jeringa de inyección aspirar directamente el cloroformo que se encuentra en el fondo del tubo.9. Inyectar 1 µl de cloroformo en la columna

PNT-AN-01PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIONES POR ANAEROBIOS

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1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl objetivo de este documento es normalizar elprocesamiento de muestras para el diagnósticomicrobiológico de las infecciones producidas pormicroorganismos anaerobios. Su aplicación seextiende desde la extracción de las muestras, hastala identificación definitiva de los aislados anaerobios.En este documento quedan excluidas ladescripciones correspondientes a los hemocultivosde microorganismos anaerobios (ver PNT-HC-01) yal diagnóstico de Clostridium difficile toxigénico (verPNT-AN-02). Este procedimiento es aplicable a todoslos laboratorios de hospitales, centros de salud ocualquier laboratorio que realice determinaciones demicrobiología clínica.

2. FUNDAMENTOLas bacterias anaerobias producen un amplioabanico de infecciones en el hombre, desde cuadrosocasionados por toxinas producidas por diferentesespecies del género Clostridium (botulismo, tétanos,gangrena gaseosa, diarrea asociada al uso deantibióticos, etc) hasta infecciones endógenas noexotóxicas que pueden afectar a casi cualquier partedel organismo. Los requisitos especiales decrecimiento de las bacterias anaerobias condicionanun procesamiento particular de las muestras y suscultivos que va a ser detallado a continuación.

3. DOCUMENTACIÓN DE CONSULTASeguridad en el laboratorio de microbiología clínica(Procedimiento 10). Procedimientos en microbiologíaclínica. SEIMC, 2000.Recogida, transporte y procesamiento general de lasmuestras en el laboratorio de Microbiología (PNT-RTP-01). SEIMC, 2003.Hemocultivos (PNT-HC-01). SEIMC, 2003.Procedimientos específicos para cada tipo detécnica.

4. RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LASMUESTRAS

4.1. SELECCIÓN DE LA MUESTRAPara que los estudios microbiológicos tengan valores necesario tomar las muestras de forma que laflora normal no las contamine. Las muestras deelección para cada tipo de infección se muestran enla siguiente tabla1.

4.2. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA- Muestras obtenidas mediante aspiración conjeringa. Una vez obtenida la muestra, expulsar el gasdel interior de la jeringa tapando la aguja con unagasa estéril impregnada en alcohol para eliminar elriesgo de aerosoles. A continuación, cambiar la agujapor otra estéril e inocular, previa desinfección deltapón de goma, el contenido de la jeringa en lasuperficie del agar de un vial de transporte paraanaerobios.

- Muestras de tejidos y biopsias quirúrgicas.

Pueden remitirse en un frasco estéril siempre ycuando el procesamiento sea rápido. En casocontrario, el frasco puede introducirse en una bolsade anaerobiosis. Otra opción, es introducir lasmuestras a unos 5 mm de la base de agar de unosfrascos especiales que contienen un indicador deanaerobiosis.

- Muestras recogidas en torunda. Aunque no serecomienda la utilización de torundas, en ciertasocasiones no es posible utilizar otro método. En talescasos usar unos tubos con medio para anaerobios eintroducir las torundas a 5 mm del fondo del tubocerrándolo inmediatamente.

4.3. ENVÍO DE LAS MUESTRAS AL LABORATORIORellenar un volante para cada muestra. Es necesarioindicar en los volantes el nombre del paciente, elservicio donde se encuentra ingresado, el número decama y el número de teléfono del control deenfermería. Facultativo que solicito el análisis. Datosdel centro de salud si es una petición de lacomunidad. Sería deseable añadir en los volantesotra información que ayudara a la valoración delcultivo en el laboratorio como el tratamientoantibiótico previo a la toma de muestras, laenfermedad de base del paciente, el síndrome clínicoque padece en el momento actual y si la infección esde adquisición nosocomial o comunitaria.Introducir la muestra con su respectivo volante enuna bolsa de plástico y enviarla inmediatamente alServicio de Microbiología, donde se mantendrá atemperatura ambiente (las temperaturas deincubación pueden ocasionar sobrecrecimientobacteriano o pérdida de cepas mientras que lastemperaturas bajas pueden permitir un aumento enla difusión de oxígeno) con la excepción de las orinassuprapúbicas (2-8ºC) y los hemocultivos (35-37ºC).El tiempo óptimo desde la toma de la muestra hastael procesamiento es de 2-3 horas con la excepciónde las muestras transportadas en frascos estérilesque deben procesarse idealmente en menos de 30minutos. Para una descripción más detallada deltransporte y conservación de las muestras incluidoslos volúmenes mínimos aceptables de cada tipo demuestra ver el PNT-RTP-01.

4.4. RECEPCIÓN Y REGISTRO DE LASMUESTRAS

Una vez ha llegado la muestra al laboratorioanotar la fecha y hora de recepción, asignar a lamuestra un número del registro general dellaboratorio de Microbiología y comprobar que cumplelos requisitos para su aceptación. Los volantespasarán a Secretaria para su registro en el sistemade gestión del laboratorio.

4.5. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO DELAS MUESTRAS. ACCIONES A TOMAR

El laboratorio de microbiología debe determinar,una vez recibida la muestra en el laboratorio, si esta

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cumple con los requisitos para ser procesada. Estosrequisitos incluyen entre otros, una correctaidentificación, tipo de muestra adecuada para la

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Tabla 1. Muestras de elección para cada tipo de infecciónInfecciones Muestras

SNC (abscesos y empiemas) AspiraciónBiopsias

Cabeza y cuello AspiradosBiopsias

Oculares - Endoftalmitis Aspiración intraocularORL

- Sinusitis

- Otitis media crónica

Aspiración percutanea o por rinoscopia y materialquirúrgico de los senosTorunda

Tracto respiratorio inferior- Neumonías

- Empiema pleural

Catéter telescopado protegidoLavado broncoalveolarPunción pulmonar percutáneaToracocentesis

Aparato circulatorio- Bacteriemia- Endocarditis- Pericarditis

HemocultivoVálvula, verrugaLíquido pericárdico

Intraabdominales- Peritonitis y abscesos- Colecistitis- Heridas laparotómicas

Aspiración y cirugíaBilis tomada quirúrgicamenteTomas en profundidad

Tubo digestivo- Diarrea asociada aantimicrobianos- Intoxicación por C. perfringens

HecesHeces para toxina y recuento

Genitales femeninas CirugíaCuldocentesisAspiración (absceso Bartholino)Aspiración endometrial protegidaDIUs (actinomicosis)

Urinarias Punción suprapúbicaOsteoarticulares

- Artritis- Osteomielitis

AspiraciónAspiración, cirugía, biopsia

Tejidos blandos Aspiración percutáneaCirugíaTomas en profundidad

Relacionadas con alimentos- Intoxicación por C. perfringens- Botulismo

Alimento sospechoso (recuento)Alimento sospechoso (toxina, bacteria)

Botulismo Alimento sospechoso (toxinas, cultivo)Suero (detección de las toxinas, no suele ser positivaen el lactante)Contenido gástrico y vómitos (toxinas)Heces (toxinas y cultivo)Material de heridas (cultivo)Muestras ambientales (bioterrorismo)Torundas nasales (bioterrorismo)

Tétanos Material de la presunta puerta de entrada

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petición, y condiciones adecuadas de transporte yconservación. Es necesario que cada laboratorioestablezca y difunda a los servicios peticionarios suspropios requisitos de la aceptación de una muestrapara estudio microbiológico.

El laboratorio de microbiología debe disponertambién de un sistema de registro de estasincidencias en el que figure la muestra implicada, lapersona que la recibe, el tipo de incidencia, lapersona de contacto del servicio solicitante y laresolución de la incidencia (si la muestra no seprocesa, si finalmente se decide su procesamiento yen qué condiciones, etc.).Las incidencias más frecuentes en la llegada de unamuestra al laboratorio de microbiología y lasacciones a realizar (toma de decisiones) ante cadacaso son las siguientes:

- Muestra deficientemente identificada: no seaceptará una muestra sin identificar, mal identificadao en la que no coincidan la identificación del volantede petición con la de la muestra. En cualquier casose contactará con el servicio peticionario haciéndoleconocer la necesidad de que procedan a la correctaidentificación de la muestra. Si se puede recoger otramuestra, se solicitará nuevamente. Dependiendo dela importancia de la muestra, se puede optar a suprocesamiento antes de la correcta identificación conel objeto de que no se deteriore la misma.

- Muestras derramadas: no se aceptaránmuestras claramente derramadas y se solicitará unanueva muestra. En el caso de no ser posible larecogida de una nueva muestra, desinfectarexternamente el envase o trasvasar la muestra a uncontenedor estéril. En este caso, se indicará en elinforme que la muestra estaba derramada y que losresultados deben ser interpretados con la debidaprecaución.

- Transporte/conservación inadecuados: unade las causas más frecuentes es la existencia deviales de anaerobiosis que han sido abiertos por loque el oxígeno ha entrado en contacto con lamuestra y ha virado el indicador resazurina a colorvioleta. En el caso de muestras que no se puedanvolver a recoger (por ejemplo: muestras quirúrgicas)se puede optar por procesarlas informando porescrito al servicio solicitante de la incidencia en larecogida/transporte de la muestra y alertando de quelos resultados obtenidos deben ser interpretados conla precaución correspondiente. En el caso de que eltransporte deficiente invalide totalmente el estudiomicrobiológico (por ejemplo, muestras en formol), nose aceptarán estas muestras y se informará alservicio solicitante de la inadecuación de la muestra.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS5.1. MEDIOS DE CULTIVO:

Agar sangre (Nevera a 4ºC)Agar chocolate (Nevera a 4ºC)Agar MacConkey (Nevera a 4ºC)Agar Brucella o agar Schaedler con 5% de

sangre de carnero con vitamina K1 (1µg/ml) yhemina (5µg/ml) (Nevera a 4ºC)Agar Bacteroides bilis esculina con amicacina(BBE) (Nevera a 4ºC)Agar con alcohol fenil-etílico (PEA) (Nevera a4ºC)Agar Schaedler con neomicina (75µg/ml) yvancomicina (7,5µg/ml) (SNV) o con kanamicina(75 µg/ml) y vancomicina (7,5µg/ml) (SKV)(Nevera a 4ºC)Agar sangre con 2,5 µg/ml de metronidazol(Nevera a 4ºC)Agar con yema de huevo (AYE) (Nevera a 4ºC)Agar TSI (Nevera a 4ºC)Agar Thayer-Martin o Martin-Lewis (Nevera a4ºC)Agar Shepard AI (Nevera a 4ºC)Medios de cultivo específicos para micobacterias(Nevera a 4ºC)Caldo de tioglicolato sin indicador suplementadocon vitamina K1 (200 µl) y hemina (20 µl).(Nevera a 4ºC)Caldo PRAS PYG (Nevera a 4ºC)

5.2. SOLUCIONES Y REACTIVOS:Tubos de agua destilada estéril (Temperaturaambiente)Tubos con solución estéril de Ringer lactato (Neveraa 4ºC)Sistemas de identificación:

- Discos de bilis (Nevera a 4ºC)- Oxgall (Nevera a 4ºC)- Desoxicolato sódico (Nevera a 4ºC)- Discos de 5µg de vancomicina (Nevera a 4ºC)- Discos de 1.000 µg de kanamicina (Nevera a

4ºC)- Discos de 10µg de colistina (Nevera a 4ºC)- Galerías de identificación de anaerobios (Nevera

a 4ºC) - Otros reactivos necesarios para la realización de las pruebas de identificación final

Reactivos para tinciones (Temperatura ambiente)Reactivos necesarios para las técnicas de detecciónde la enterotoxina de Clostridium perfringensLas condiciones de almacenamiento (temperatura,humedad, etc.) de los reactivos y medios de cultivoutilizados deben ser establecidas, controladas yrevisadas.Se debe realizar, con periodicidad (semanal,mensual, trimestral, etc.) establecida por el propiolaboratorio, una revisión de los materialesalmacenados (cantidad, caducidades, estadogeneral) con el fin de comprobar el estado de losmismos, verificando su correcta ubicación en losespacios identificados y definidos para ellos en elalmacén y su aptitud para el uso (ver como ejemplode formato el del Anexo 2, Revisión de almacén,PNT-RTP-01).

6. APARATOS Y MATERIAL

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Neveras (control diario de temperatura).Cámaras, jarras o bolsas de anaerobiosis (controlesde anaerobiosis).Estufa de cultivo a 35ºC (control diario detemperatura).Cabina de seguridad biológica (limpieza diariadespués de su utilización).Microscopio óptico (limpieza después de suutilización).Centrífuga.Congeladores de -20º C y – 80º C.Cromatógrafo gas-liquido

Otro material necesario:Asas desechablesPortasCubresTubos pequeños estérilesGuantesPapel de filtroClorogel y lejíaPapel de manosOtros

Al finalizar cada jornada de trabajo, revisar y reponerlos productos y el material necesario para el trabajodel día siguiente. Semanalmente, por escrito, solicitaral supervisor el material fungible que precise serrepuesto.De manera periódica (preferiblemente a diario) debecontrolarse la temperatura (y humedad/presión deCO2 si fuera necesario) de cadaestufa/nevera/congelador al inicio de la jornada detrabajo con un termómetro situado permanentementeen el centro de cada equipo. El termómetro debepermitir la medida de la temperatura máxima ymínima alcanzadas. Se anotará en la hoja de registrode temperatura de cada aparato (como ejemplo sepropone la del Anexo 3, Registro de temperatura,PNT-RTP-01) y en el caso de temperaturas mínima omáxima fuera del rango de aceptación, anotar laincidencia y realizar las acciones frente a esavariación. Estas acciones, por un lado, debenasegurar los resultados derivados de los cultivos ypor otro corregir esa desviación.Se sugieren los siguientes intervalos de aceptación:

- estufas de 35-37°C se acepta una mínimasuperior o igual a 34° C y máxima inferior o igual a37,5°C·

- para las neveras el intervalo de tolerancia quese acepta es generalmente de 2º - 8° C, aunquepuede variar en función de los reactivos quecontengan.Todos los termómetros utilizados en la medida detemperaturas de los aparatos se han de verificarmediante un termómetro de referencia calibrado. Seintroducirá el termómetro utilizado para la mediciónde la temperatura y el termómetro calibrado en elequipo correspondiente (nevera, congelador oestufa) durante un mínimo de 15 minutos. Seaceptarán aquellos termómetros cuyas desviaciones

no sobrepasen los límites establecidos para cadauso concreto. La periodicidad de la verificación de lostermómetros con el termómetro calibrado debe serestablecida por el propio laboratorio.Existen sistemas automáticos para el control de latemperatura, humedad, presión de CO2, etc., quecontrolan de una manera permanente (en intervalosde 15-20 minutos) los anteriores parámetros congran fiabilidad y que utilizan sondas de referenciaverificadas por organismos certificados. Estossistemas alertan de las desviaciones que seproducen de una manera más rápida que el controlmanual, controlan todos los equipos del laboratorio ygeneran los informes de estos parámetros.

7. PROCESAMIENTO7.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Procesar la muestra atendiendo a las normas delProcedimiento de Seguridad en el laboratorio deMicrobiología Clínica (documento 10, SEIMC). Esaconsejable procesar la muestra durante losprimeros 15 minutos tras su recepción. Idealmente,utilizar una cámara de anaerobios para elprocesamiento de la muestra. Previamente al cultivo,homogeneizar las muestras tanto líquidas opurulentas (vórtex) como sólidas (troceando elmaterial con ayuda de un bisturí o triturándolo en 1ml de caldo mediante un mortero). Cuando lamuestra se ha recogido en torunda, exprimir ésta enun pequeño volumen de caldo mediante movimientosrotatorios sobre las paredes del tubo.

7.2. INOCULACIÓN DE LA MUESTRAUna vez homogeneizada la muestra depositar

una gota del material purulento, o bien, 2-3 gotas sino es purulento, en cada uno de los medios decultivo, una gota en un portaobjetos para la tinción deGram y el resto en el medio de enriquecimiento.

7.3. EXAMEN DIRECTO7.3.1. Examen macroscópico. Consiste en observarciertas características como presencia de mal olor(productos metabólicos), fluorescencia roja con luzultravioleta (protoporfirina de especies pigmentadasde Prevotella o Porphyromonas), presencia desangre, color negruzco (anaerobios pigmentados),necrosis, gas, gránulos de azufre (Actinomyces spp.y Propionibacterium propionicum), pus, etc.7.3.2. Examen microscópico. Mediante la tinción deGram.

7.4. CULTIVO DE LA MUESTRALa mayoría de las bacterias anaerobias requieren

para su crecimiento vitamina K1 y hemina. Esaconsejable utilizar una combinación de mediosenriquecidos no selectivos, selectivos y diferenciales,entre los que se incluyen:

- Agar Brucella o agar Schaedler con sangre decordero, vitamina K1 y hemina: son mediosenriquecidos no selectivos.

- Agar Bacteroides bilis esculina con amikacina

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(BBE): es un medio selectivo y diferencial quepermite el crecimiento y diferenciación deBacteroides del grupo fragilis que produce coloniasque viran el medio a un color negruzco. Tambiénpueden crecer otras especies aunque se distinguende los anteriores por producir colonias máspequeñas con un diametro inferior a 1 mm.

- Agar con alcohol fenil-etílico (PEA): es un medioselectivo que inhibe el crecimiento de los bacilosgramnegativos facultativos y el crecimiento en formade velo de algunos clostridios.

- Agar Schaedler con neomicina o kanamicina yvancomicina: es un medios selectivo paraBacteroides grupo fragilis y algunas especies dePrevotella.

- Agar con yema de huevo (AYE): medio selectivoy diferencial para especies del género Clostridium.

- Caldo de tioglicolato sin indicador suplementadocon vitamina K1 y hemina: utilizado como medio deenriquecimiento o de mantenimiento.

- Medios para aerobios y facultativos.Cada laboratorio debe realizar una vigilancia de lacalidad de los medios de cultivo que utiliza, tanto delos preparados en el propio laboratorio (apariencia,crecimiento/inhibición, esterilidad) como de los quese adquieran comercialmente.El laboratorio debe solicitar al proveedor de mediosde cultivo los certificados de los controles de calidaddonde deben estar incluidas las característicasfísicas y químicas que definen al medio de cultivo.Esos certificados deben conservarse en ellaboratorio. Asimismo, se deberán realizar controlesde calidad a los medios adquiridos comercialmente.El propio laboratorio debe elegir tanto la periodicidadcomo la selección de los medios a los que realizar elcontrol de calidad en función del tipo de medios queutilice, la variedad y los datos históricos de laconformidad de los controles realizados por ellaboratorio con las características que el proveedorfacilite: un medio estable y que no haya ocasionadoproblemas de crecimiento según registros previos sedebe controlar menos que uno que sea menosestable y haya ocasionado problemas en su uso. Ellaboratorio debe generar registros de este control demedios adquiridos de proveedores y conservar estosregistros para poder evaluar los medios yreconsiderar permanentemente el control de calidadde los mismos. Como ejemplo de formato para elregistro de control de medios adquiridoscomercialmente se propone el formato del Anexo 4(Control de medios preparados, PNT-RTP-01). Coneste control no sólo se evalúa la conformidad dellaboratorio con los medios que adquiere yapreparados sino que también se evalúan lascondiciones de procesamiento, estufas y atmósferasutilizadas.

Para el control de los medios se debenutilizar preferentemente cepas de colección (ATCC,CECT u otras colecciones) pero en el caso de notener acceso a estas cepas se podrán utilizar cepasaisladas en el propio laboratorio con características

perfectamente definidas.

7.5. INCUBACIÓN DE LA MUESTRAInmediatamente después de realizar la siembra enlas placas incubarlas en atmósfera anaerobia(cámaras, jarras o bolsas de anaerobios) a 35-37º C.Las placas incubadas en cámara de anaerobios sepueden examinar a las 24 horas de incubaciónmientras que las placas incubadas en jarras o bolsasdeben mantenerse 48 horas antes de examinarlas.Medios selectivos como el de BBE para Bacteroidesgrupo fragilis o el de AYE para clostridios se puedenexaminar a las 24 horas, ya que ambosmicroorganismos crecen rápidamente. Se aconsejamantener las placas no selectivas, incluidas aquellascon crecimiento de colonias, un mínimo de 7 díaspara facilitar la recuperación de los crecedores lentos(Actinomyces, Porphyromonas, Propionibacterium,Bilophila, etc). Se recomienda reincubar aquelloscaldos de enriquecimiento que no muestren turbidezun total de 10 días. En el diagnóstico de laactinomicosis el tiempo de incubación debe sermayor, generalmente entre las 2 y las 4 semanas.Incubar en CO2 y ambiente las placas para aerobiosy facultativos.

7.6. PROCESAMIENTOS ESPECIALES7.6.1. Líquidos orgánicos. Inocularlos en frascos dehemocultivos aerobios y anaerobios reservando unpequeño volumen para la tinción de Gram. Adiferencia de otros líquidos, los líquidos amnióticos yfluidos obtenidos por culdocentesis no necesitancentrifugarse antes de la tinción de Gram. El periodode incubación varía de 5 a 7 días dependiendo delsistema de cultivo utilizado. Subcultivar los frascosen los que se detecta crecimiento de manera idénticaa los hemocultivos. En general, el cultivo anaerobiodel líquido cefalorraquídeo no es útil aunque sí lopueden ser los abscesos cerebrales, los empiemassubdurales y los abscesos epidurales.7.6.2. Catéter telescopado. Cortar el cepillo ycolocarlo en un tubo que contenga 1 ml. de soluciónestéril de Ringer lactato. Agitar en el vórtex durante30 segundos y preparar dos diluciones seriadas al1/100 en Ringer lactato. Sembrar 0,1 ml de cada unade las dos diluciones en agar sangre, agarMacConkey, agar chocolate, y en medios selectivosy no selectivos para anaerobios.7.6.3. Lavado broncoalveolar. Agitar en el vórtexdurante 30 segundos y preparar dos dilucionesseriadas al 1/100 a partir de la inicial en Ringerlactato. Procesar de manera idéntica a como seprocesa el catéter telescopado. 7.6.4. Heces para el diagnóstico de toxiinfecciónde Clostridium perfringens. Realizar la detecciónde la enterotoxina en heces a través de técnicas deaglutinación pasiva reversa mediante látex (Oxoid) oenzimoinmunoensayo (TechLab), o bien, medianteensayos específicos de citotoxicidad en cultivoscelulares de células Vero de acuerdo a lasinstrucciones del sistema utilizado.

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7.6.5. Diagnóstico de botulismo. El diagnósticodebe realizarse mediante la confirmación de lasneurotoxinas y/o el cultivo del agente etiológico demuestras del paciente. Para el diagnóstico de laintoxicación alimentaria, deben obtenerse 15-20 mlde suero, 25-50 gramos de heces y la comidasospechosa de contener el agente infeccioso. En elbotulismo de las heridas se recomienda obtenersuero, heces y material tisular o exudativo de laherida infectada. Cuando se sospeche botulismo dellactante y botulismo por colonización intestinal serecomienda obtener suero, heces y contenidogástrico del paciente. En el botulismo inhalatorio seha de obtener suero, contenido gástrico, heces,torundas nasales del individuo y el materialsospechoso de contener las esporas del agenteetiológico. Debido a la gran toxicidad de lasneurotoxinas, todas las muestras sospechosasdeben enviarse al laboratorio de referencia delInstituto de Salud Carlos III para su posteriorprocesamiento.7.6.6. Diagnóstico de angina de Vincent. El cultivono es útil para el diagnóstico de esta enfermedad. Eldiagnóstico siempre ha de realizarse mediante loshallazgos clínicos y una tinción de Gram de lasúlceras bucales tomadas en torunda en la queaparezcan espiroquetas, bacilos fusiformes yleucocitos polimorfonucleares.7.6.7. Diagnóstico de actinomicosis. El diagnósticode la actinomicosis debe basarse, en primer lugar ycuando estén presentes, en la observaciónmicroscópica de los gránulos de azufre (0, 1-5 mm)obtenidos de muestras afectadas como tejidos,lavados bronquiales, líquidos corporales, dispositivosintrauterinos o exudados purulentos. Estos gránulostienen un borde irregular debido a la acumulación debacterias bacilares perteneciente al géneroActinomyces. Con una tinción de Gram se observanbacilos grampositivos en forma de garrotenormalmente ramificados y que deben serdiferenciados de otros microorganismos comoNocardia spp. o Streptomyces spp. El cultivo paraActinomyces spp. de los gránulos de azufre o, antesu ausencia, de las muestras sospechosas debeespecificarse en el volante de la muestra ya querequiere un pretratamiento especial y una incubaciónprolongada. Deben utilizarse los medios de cultivosólidos y líquidos habituales para el cultivo demicroorganismos anaerobios aunque éstos debenser lo más frescos posible. Cuando se trate degránulos de azufre o de muestras sólidas éstasdeben triturarse en medio de enriquecimiento líquidoy el triturado debe sembrarse en una placa de agarsangre para anaerobios, en una placa de agar PEA yen un caldo de enriquecimiento. Los medios decultivo deben incubarse en ambiente anaerobio a 35-37º C durante un periodo mínimo de 7 días quepuede ser extendido hasta las 2-4 semanas. Cuandose trate de muestras ricas en microflora como lasmuestras genitales o los dispositivos intrauterinos esrecomendable hacer diluciones de 1:10 a 1:10.000

de la muestra y sembrar las diluciones en agarsangre Columbia con y sin metronidazol a unaconcentración de 2,5 µg/ml. Todas las especies deActinomyces con excepción del anaerobio estricto A.meyeri son anaerobios facultativos. La morfología delas colonias de Actinomyces spp. varía de unaaspecto liso a una apariencia molar dependiendo deciertos factores como el tipo de medio de cultivo, lascondiciones de cultivo y la edad de las colonias. Elaspecto de las bacterias con la tinción de Gramtambién puede ser variable observándose desdebacilos grampositivos ramificados a formas cocoides.La diferenciación de las especies de Actinomyces esdifícil aún utilizando los sistemas de identificacióncomerciales.7.6.8. Diagnóstico de las infeccionesendometriales. Obtener muestra de tejidoendometrial mediante una cánula de aspiración encondiciones de anaerobiosis y evitando lacontaminación con la flora vaginal. La obtención deuna muestra con un hisopo no es recomendable yaque los agentes causales de la infección suelenencontrarse dentro del tejido. Una vez obtenida lamuestra, ésta debe introducirse en un medio detransporte anaeróbio y procesarse lo másrápidamente posible. La muestra de endometrio debetriturarse en caldo de cultivo y la mezcla resultantedebe sembrarse en medio habituales para el cultivode microorganismos aerobios y anaerobios, y enmedios específicos de bacterias aerobiasproductoras de infecciones endometriales como agarThayer-Martin o Martin-Lewis, agar Shepard Al omedios específicos para micobacterias. Los cultivospara anaerobios deben incubarse un mínimo de 7días antes de descartarlos como estériles.7.6.9. Diagnóstico de la enterocolitis delneutropénico. Extraer 3 tandas de hemocultivostomadas de diferentes zonas de venopunción, unmínimo de 25 gramos o mililitros heces y muestrasde lumen o de tejido del área ileocecal afectadarecogidos durante la intervención quirúrgica o laautopsia y transportados en medios para anaerobios.Cuando se sospeche de mionecrosis u otra forma deinfección progresiva debe también tomarse unabiopsia o aspirado del músculo afectado. Sembrar enmedios habituales de microorganismos anaerobios eidentificar los aislados según los procedimientoshabituales para microorganismos anaerobios.

7.7. EXAMEN DE LOS CULTIVOS Y AISLAMIENTOExaminar los cultivos, seleccionar todas las coloniasmorfológicamente distintas y realizar, a partir de cadacolonia distinta, un subcultivo en un medio paraanaerobios no selectivo (atmósfera anaerobia) y enun medio de agar chocolate (atmósfera aerobiaenriquecida con CO2), e incubar durante 48 horas a35ºC. Cuando se trate de cultivos de catéterestelescopados o de lavados broncoalveolares,seleccionar sólo las colonias con recuentossignificativos (103 ó 104 UFC/ml, respectivamente).

Seleccionar los subcultivos que crezcan sólo

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en el medio anaerobio (anaerobios estrictos) yaquellos subcultivos que también crezcan en medioaerobio débilmente y con característicasmorfológicas sugestivas de anaerobiosaerotolerantes (Actinomyces, Propionibacterium,Bifidobacterium, algunos clostridios).En el caso de que en los cultivos primarios no seaislen microorganismos anaerobios y el caldo deenriquecimiento aparezca turbio, realizar unsubcultivo de éste tanto en medios aerobios como enmedios anaerobios no selectivos. Si, por el contrario,el caldo no está turbio, realizar un pase ciego a los10 días de incubación.

7.8. IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLADOSANAEROBIOS7.8.1. Identificación preliminar. Realizar una tinciónde Gram de cada uno de los aislados anaerobios. Yaque algunas especies de anaerobios retienen elcolorante con mucha variabilidad, el resultado de latinción de Gram puede ser dudoso. En estos casos, ycuando las características coloniales no ayuden aresolver esta duda, es recomendable realizar unsubcultivo en un medio no selectivo con un disco de5µg de vancomicina para diferenciar losgrampositivos (sensibles) de los gramnegativos

(resistentes). Cuando se trate de bacilosgramnegativos, realizar la prueba de la resistencia ala bilis (ver apartado 10), y otro subcultivo en unmedio no selectivo al que se se colocarán 3 discosde antibióticos que contengan, respectivamente, 5µgde vancomicina, 1.000 µg de kanamicina y 10µg decolistina. Con los resultados de la identificaciónpreliminar anterior, informar al clínico siguiendo lasiguiente clasificación:

- Cocos grampositivos anaerobios.- Bacilos grampositivos anaerobios. Entre éstos

se puede discriminar entre Clostridium spp., cuandose observen esporas o una morfología típica de C.perfringens, o Propionibacterium spp., cuando seobserve la morfología característica y una catalasapositiva.

- Cocos gramnegativos anaerobios. Pueden serinformados también como Veillonella spp. ya queeste es el género más frecuentemente encontrado enclínica.

- Bacilos gramnegativos. Es recomendableclasificarlos en 5 subgrupos atendiendo a laspruebas de la resistencia a la bilis y de la sensibilidada los discos de antibióticos de acuerdo al siguienteesquema:

SensibilidadSubgrupo Bilis-resistencia Va Ka CoBacteroides grupo fragilis Sí R R RBGNA grupo Prevotella/Porphyromonas No V1 R VFusobacterium spp.2 No R S SBGNA grupo Bacteroides ureolyticus/Campylobacter2 No R S SBGNA grupo Bilophila/Sutterella Sí R S S

1 Aunque la sensibilidad a la vancomicina puede diferenciar ambos géneros (Prevotella spp.: vancomicina R,;Porphyromonas spp.: vancomicina S), se recomienda informar preliminarmente de una forma agrupadaatendiendo a la pigmentación de las colonias ya que el lento crecimiento de estos microorganismos puede retrasarvarios días la información.

2 La diferenciación presuntiva de ambos grupos ha de basarse en características morfológicas de la cepa.Abreviaturas: BGNA, bacilo gramnegativo anaerobio; Va, vancomicina; Ka, kanamicina; Co, colistina; S,

sensible; V, con sensibilidad variable; R, resistente.

7.8.2. Identificación final. El grado de exactitud enla identificación de los aislados anaerobios dependeen buena medida de los recursos de cadalaboratorio. Idealmente, se deberían realizar lassiguientes pruebas: estudio de la capacidad deproducir indol, capacidad de descomponer el H2O2,otras pruebas específicas de cada uno de los grupostal y como se detallarán en la descripción de éstos,estudio de la capacidad sacarolítica y/o proteolítica(pruebas manuales o

sistemas comerciales, como el API20A,

bioMerieux), o bien, estudio de la dotaciónenzimática (pruebas manuales o sistemascomerciales, como el API ZIM o el ATB32A,bioMerieux) y, por último, la detección de losproductos finales del metabolismo bacterianomediante cromatografía gas-líquida (ver apartado10). Atendiendo a estas pruebas, el esquema declasificación de cada uno de los 5 grupos debacterias anaerobias será el siguiente:

7.8.2.1. Cocos grampositivos anaerobiosProducto metabolismo Prueba del indol Especies1

Ácido acético Finegoldia magnaMicromonas micros

Ácido butírico Negativa Anaerococcus (Peptostreptococcus) prevotiiAnaerococcus (Peptostreptococcus) tetradiusAnaerococcus (Peptostreptococcus) lactolyticusAnaerococcus (Peptostreptococcus) vaginalisPeptoniphilus (Peptostreptococcus) lacrimalis2

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Peptoniphilus (Peptostreptococcus) ivoriiÁcido butírico Positiva Peptoniphilus (Peptostreptococcus) indolicus2

Peptoniphilus (Peptostreptococcus) asaccharolyticus2

Peptoniphilus (Peptostreptococcus) harei2Anaerococcus (Peptostreptococcus) vaginalisAnaerococcus (Peptostreptococcus) hydrogenalis

Ácido isocaproico y otrosácidos orgánicos

Peptostreptococcus anaerobius

Ácido caproico y otros ácidosorgánicos

Anaerococcus (Peptostreptococcus) octavius

1 En general, la diferenciación entre especies dentro de cada grupo metabólico puede dilucidarse mediante la realización de pruebas bioquímicas manuales o mediante sistemas de identificación2 O Schleiferella

7.8.2.2. Bacilos grampositivos anaerobios:- Clostridium spp.:Lecitinasa Lipasa Indol Ureasa Productos metabolismo EspeciesPositiva Positiva Negativo C. novyi APositiva Negativa Negativo C. perfringensPositiva Positivo Negativa C. bifermentansPositiva Positivo Positiva C. sordelliiNegativa Positiva C. botulinum

C. sporogenesNegativa Negativa Ácido acético C. ramosum

C. clostridioformeNegativa Negativa Ácido butírico C. tetani

C. septicumC. butyricum

Negativa Negativa Ácido isocaproico C. difficile

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- Propionibacterium spp.: confirmaciónmediante la detección de ácido propiónicocomo producto final del metabolismo. P. acnes:catalasa (+), indol (+) y nitratos (+)- Eggerthella lenta (Eubacterium lentum):nitratos (+), estimulación del crecimiento conarginina y producción de SH2 en TSI

7.8.2.3. Cocos gramnegativos anaerobios:- Veillonella spp.: nitratos (+)- Acidaminococcus spp.: nitratos (-) yproducción de ácido butírico- Megasphaera spp.: nitratos (-) y producciónde ácido caproico

7.8.2.4. Bacilos gramnegativos anaerobios:- Bacteroides grupo fragilis: diferenciaciónentre especies mediante pruebas bioquímicasmanuales o mediante sistemas comerciales- BGNA grupo Prevotella/Porphyromonas:diferenciación entre géneros por la sensibilidada la vancomicina (Prevotella spp.: resistente;Porphyromonas spp.: sensible) y entreespecies mediante pruebas bioquímicasmanuales o mediante sistemas comerciales- Fusobacterium spp.: producción de ácidobutírico como producto final del metabolismo- BGNA grupo Bacteroidesureolyticus/Campylobacter: nitratos (+)- B. ureolyticus: ureasa (+)- Campylobacter (Bacteroides) gracilis: ureasa(-), inmóvil- Campylobacter (Wolinella) rectus: ureasa (-),móvil- BGNA grupo Bilophila/Sutterella:- Bilophila wadsworthia: catalasa (+)- Sutterella wadsworthensis: catalasa (-)

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOSUna vez realizada la identificación preliminar de losaislados anaerobios y, en su caso, la identificacióndefinitiva de los aislados aerobios, registrar losresultados en el programa de gestión del laboratorioe imprimir el informe definitivo. Una vez impresostodos los informes positivos, el facultativoresponsable debe revisarlos y firmarlos. Repetir elproceso cuando se obtengan las identificacionesfinales de los microorganismos anaerobios. Cuandose obtengan resultados cuyo conocimiento precozpor parte del clínico sea importante en el manejo delpaciente, informar telefónicamente el resultadoanotando en un registro la persona que recibe lainformación.Después de enviar la información hacia las áreas dehospitalización o centros de salud correspondientes,anotar todos los resultados en el Libro de Registrodel laboratorio y en la hoja diaria. Guardar ordenadosen archivadores todos los protocolos de trabajosignificativos.Se recomienda archivar, al menos, las cepas de losmicroorganismos anaerobios más significativos,especialmente las especies de Bacteroides grupofragilis para la realización periódica de pruebas de

sensibilidad a antimicrobianos.9. RESPONSABILIDADESLos técnicos de laboratorio serán los responsablesde la realización de los procedimientos, de realizar,cuando sea necesario, el informe preliminar verbalde los resultados y de emitir el informe escrito tantopreliminar como definitivo.El facultativo tendrá bajo su responsabilidad lainterpretación de los resultados y la validación detodos los informes emitidos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOPrueba de la resistencia a la bilis. Se puede realizarsiguiendo uno de los siguientes procedimientos:

- Prueba en disco. Realizar un subcultivo delmicroorganismo en un medio sólido enriquecido noselectivo y colocar un disco de bilis sobre la primeradescarga. Incubar anaeróbicamente durante 24-48horas. El microorganismo será resistente a la biliscuando no exista halo de inhibición.

- Prueba en agar BBE. Realizar un subcultivo enagar BBE. Incubar anaeróbicamente durante 24-72horas. El microorganismo será resistente a la bilis enel caso de que sea capaz de crecer en el mediosiempre y cuando no produzca colonias mucho máspequeñas que las producidas en un medio noselectivo. Este test sólo está recomendado cuandose sospeche de especies de Bacteroides grupofragilis o Bilophila spp. ya que este medio tieneciertas sustancias que pueden inhibir el crecimientode otras especies.

- Prueba en caldo. Inocular 2 tubos de mediolíquido (caldo tioglicolato o caldo PRAS PYG), unosuplementado con Oxgall al 2% y desoxicolatosódico al 0,1% y otro sin suplementar, con 2 gotas deun cultivo líquido del microorganismo en crecimientoexponencial. Incubar ambos tubos hasta que el tubosin suplementar muestre turbidez. Se consideraráresistente a la bilis cuando el tubo con suplementadocon Oxgall muestre una turbidez al menos similarque la del tubo control.

Análisis de los productos finales del metabolismomediante cromatografía gas-líquida:

- Inocular varias colonias del microorganismo aestudiar en un medio líquido e incubar hasta que seobtenga abundante crecimiento

- Añadir dos gotas de H2SO4 al 50% a 5 ml. delcultivo (pH ≅ 2), centrifugar, y recoger elsobrenadante.

- Extracción de los ácidos grasos volátiles:- Separar 1ml. del sobrenadante (en tubo de

cristal)- Añadir 0.2ml. de H2SO4 al 50% y 0,4 g de

NaCl- Añadir 1ml. de éter (tapar y mezclar bien

invirtiendo el tubo 20 veces)- Centrifugar brevemente para separar la capa

de éterSi el cromatógrafo utilizado esta equipado con undetector de ionización de llama (FID) y una columna

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SP-1220, se puede prescindir de esta extracción eutilizar directamente el sobrenadante del cultivo

- Extracción de los ácidos grasos no volátiles:- Separar 1 ml. del sobrenadante (en tubo

de cristal)- Añadir 0.2 ml. de H2SO4 al 50% y 1 ml. de

metanol. Tapar y mezclar bien- Colocar a baño o bloque de calor a 60ºC

durante 30 minutos- Dejar enfriar- Añadir 0.5ml. de cloroformo (tapar y

mezclar bien invirtiendo el tubo 20 veces )- Centrifugar brevemente para separar la

emulsión- Eliminar con una pipeta parte de la capa

acuosa- Usando la jeringa de inyección aspirar

directamente el cloroformo que se encuentra enel fondo del tubo.

Inyectar 1 µl del extracto correspondiente en lacolumna del cromatógrafo para separar e identificarlos productos extraídos.

11. LIMITACIONESPor razones de extensión de este procedimiento, nose describen las técnicas utilizadas para laidentificación definitiva de los microorganismosanaerobios. Esta descripción se encontrará en labibliografía citada a continuación.

12. BIBLIOGRAFÍA1- Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, YolkenRH. Manual of Clinical Microbiology, Eighth Edition.American Society for Microbiology, Washington, D.C.;2003.2- Isenberg HD. Clinical Microbiology ProceduresHandbook. American Society for Microbiology, Washington,D.C.; 1992, 1997.3-Jousimies-Somer HR, Summanen P, Citron DM, BaronEJ, Wexler HM, Finegold SM. Wadsworth –KTL AnaerobicBacteriology Manual. Star Publishing Company. Belmont,C.A.; 2002.4-Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica(Procedimiento 10). Procedimientos en microbiologíaclínica. SEIMC, 2000. En: http: //www.seimc.org/.5-Recogida, transporte y procesamiento general de lasmuestras en el laboratorio de Microbiología (PNT-RTP-01).SEIMC, 2003. En: http : //www.seimc.org/.Hemocultivos (PNT-HC-01). SEIMC, 2003. En: http://www.seimc.org/.

PNT-AN-02PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE DIARREA O COLITIS ASOCIADA A

Clostridium difficile

ELABORADO REVISADO Y APROBADOJefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº. ...........ASIGNADA A.................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología del Hospital .......................... La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

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1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl objetivo de este documento es normalizar elprocesamiento de muestras para el diagnósticomicrobiológico de la diarrea o colitis asociada al usode antibióticos producida por Clostridium difficiletoxigénico. Su aplicación se extiende desde laextracción de las muestras, hasta la detección de lastoxinas de C. difficile. Este procedimiento esaplicable a todos los laboratorios de hospitales,centros de salud o cualquier laboratorio que realicedeterminaciones de microbiología clínica.

2. FUNDAMENTOClostridium difficile es la causa más frecuente dediarrea y colitis asociada al uso previo de antibióticosen el ambiente hospitalario. Su incidencia estáalrededor de los 10 casos por 1.000 admisiones. Lastoxinas implicadas son la toxina A o enterotoxina y latoxina B o citotoxina. El diagnóstico se basa en ladetección de las toxinas a partir de heces, lumen obiopsias del intestino grueso. No se recomienda elanálisis sobre heces sólidas ya que la sensibilidadqueda disminuida y por la existencia de portadoressanos de C. difficile toxigénico. El procedimientodiagnóstico más sensible es el denominado cultivotoxigénico, es decir, el ensayo de citotoxicidad de latoxina B en líneas celulares de los aislados de C.difficile recuperados del cultivo. Sin embargo, esrecomendable realizar a la vez un ensayo decitotoxicidad directa sobre las heces ya que aumentala sensibilidad de la técnica en un 5% y reduce eltiempo medio necesario para el diagnóstico de laenfermedad. Para aquellos laboratorios quecarezcan de las infraestructuras necesarias para larealización del ensayo de citotoxicidad, o bien, encasos en los que sea urgente el diagnóstico, haydisponibles sistemas comerciales para la detecciónrápida de toxina A ó A+B.

3. DOCUMENTACIÓN DE CONSULTASeguridad en el laboratorio de microbiología clínica(Procedimiento 10). Procedimientos en microbiologíaclínica. SEIMC, 2000.Recogida, transporte y procesamiento general de lasmuestras en el laboratorio de Microbiología (PNT-RTP-01). SEIMC, 2003.Procedimientos específicos para cada tipo detécnica.

4. RECOGIDA Y TRANSPORTE DE LASMUESTRAS4.1. SELECCIÓN Y OBTENCIÓN DE LA MUESTRAEl tipo de muestra necesario para el diagnóstico dediarrea o colitis asociada a C. difficile son heceslíquidas o no formadas, contenido de lumen obiopsias del intestino grueso de pacientes consíntomas de la enfermedad. El volumen de muestrade heces debe ser de 5-20 ml.

4.2. TRANSPORTE DE LA MUESTRAUna vez obtenida la muestra, debe transportarse en

un recipiente estéril sin ningún medio conconservante. Las torundas rectales no estánrecomendadas salvo para estudios epidemiológicos.Rellenar un volante para cada muestra. Es necesarioindicar en los volantes el nombre del paciente, elservicio donde se encuentra ingresado, el número decama y el número de teléfono del control deenfermería. Sería deseable añadir en los volantesotra información que ayudara a la valoración delcultivo en el laboratorio como el tratamientoantibiótico previo a la toma de muestras, laenfermedad de base del paciente, el síndrome clínicoque padece en el momento actual y si la infección esde adquisición nosocomial o comunitaria.Introducir la muestra con su respectivo volante enuna bolsa de plástico y enviarla al laboratorio deMicrobiología. El tiempo máximo recomendado parael transporte de la muestra dependerá de latemperatura de ésta durante el envío desde el lugarde la extracción hasta el laboratorio de Microbiología:

• Temperatura ambiente: 1 hora.• Refrigerada a 2-8º C: 24 horas.• Congelada a –20º C: más de 24 horas.

4.3. RECEPCIÓN Y REGISTRO DE LASMUESTRASUna vez haya llegado la muestra al laboratorio anotarla fecha y hora de recepción, asignar a la muestra unnúmero del registro general del laboratorio deMicrobiología y comprobar que cumple los requisitospara su aceptación. Los volantes pasarán aSecretaria para su registro en el sistema de gestióndel laboratorio.

4.4. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO DELAS MUESTRAS. ACCIONES A REALIZAREl laboratorio de microbiología debe determinar, unavez recibida la muestra en el laboratorio, si estacumple con los requisitos para ser procesada. Estosrequisitos incluyen entre otros, una correctaidentificación, una correcta consistencia diarreica dela muestra y condiciones adecuadas de transporte yconservación. Es necesario que cada laboratorioestablezca y difunda a los servicios peticionarios suspropios requisitos de la aceptación de una muestrapara estudio microbiológico.El laboratorio de Microbiología debe disponertambién de un sistema de registro de estasincidencias en el que figure la muestra implicada, lapersona que la recepciona, el tipo de incidencia, lapersona con la que se contacta del serviciosolicitante y la resolución de la incidencia (si lamuestra no se procesa, si finalmente se decide suprocesamiento y en qué condiciones, etc.).Las incidencias más frecuentes en la llegada de unamuestra al laboratorio de microbiología y lasacciones a realizar (toma de decisiones) ante cadacaso son las siguientes:

- Heces sólidas: la muestra seráautomáticamente rechazada y se solicitará otrainmediatamente.

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- Muestra deficientemente identificada: no seaceptará una muestra sin identificar, mal identificadao en la que no coincidan la identificación del volantede petición con la de la muestra. En cualquier casose contactará con el servicio peticionario haciéndoleconocer la necesidad de que procedan a la correctaidentificación de la muestra. Si se puede recoger otramuestra, se solicitará nuevamente.

- Muestras derramadas: no se aceptaránmuestras claramente derramadas y se solicitará unanueva muestra. Se procederá como en los casosanteriores solicitando una nueva muestra. En el casode no ser posible la recogida de una nueva muestra,desinfectar externamente el envase o trasvasar lamuestra a un contenedor estéril. En este caso, seindicará en el informe que la muestra estabaderramada y que los resultados deben serinterpretados con la debida precaución.

- Transporte/conservación inadecuados: En elcaso de muestras que no se puedan volver a recogerse puede optar por procesarlas informando porescrito al servicio solicitante de la incidencia en larecogida/transporte de la muestra y alertando de quelos resultados obtenidos deben ser interpretados conla precaución correspondiente.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS5.1. MEDIOS DE CULTIVO

Agar Brucella o agar Schaedler con 5% de sangrede carnero con vitamina K1 (1 µg/ml) y hemina (5µg/ml) (Nevera a 4ºC)

Agar fructosa-cicloserina-cefoxitina (CCFA) oagar yema de huevo-cicloserina-cefoxitina (CCEY)

Caldo de tioglicolato sin indicador suplementadocon vitamina K1 (200 µl) y hemina (20 µl) (Nevera a4ºC)

Monocapa de célular de mamíferos susceptiblesal efecto citopático de la toxina B (fibroblastoshumanos, células MRC-5, células K-1 de ovario dehamster chino, etc.)

Medio de mantenimiento celular (EMEM, etc.)

5.2. REACTIVOSPBS estéril (Nevera a 4ºC)Etanol (Temperatura ambiente)Sistemas de identificación:

- Discos de prolina (Nevera a 4ºC)- p-dimetilaminocinnamaldehido (Nevera a 4ºC)

- Reactivos necesarios para la realización dela cromatografía gas-líquido

Reactivos para tinciones (Temperatura ambiente)Reactivos necesarios para las técnicas de detecciónde la toxina A y/o B de C. difficile

Las condiciones de almacenamiento (temperatura,humedad, etc.) de los reactivos y medios de cultivoutilizados deben ser establecidas, controladas yrevisadas.Se deben realizar, con periodicidad (semanal,mensual, trimestral, etc.) establecida por el propio

laboratorio, una revisión de los materialesalmacenados (cantidad, caducidades, estadogeneral) con el fin de comprobar el estado de losmismos, verificando su correcta ubicación en losespacios identificados y definidos para ellos en elalmacén y su aptitud para el uso (ver como ejemplode formato el del Anexo 2, Revisión de almacén,PNT-RTP-01).

6. APARATOS Y MATERIALNeveras (control diario de temperatura).Cámaras, jarras o bolsas de anaerobiosis (controlesde anaerobiosis).Estufa de cultivo a 35ºC (control diario detemperatura).Cabina de seguridad biológica (limpieza diariadespués de su utilización).Microscopio óptico (limpieza después de suutilización).Microscopio de inversión (limpieza después de suutilización).Congelador.Cromatógrafo gas-líquido.

Otro material necesarioFiltros Millipore de 0,22 µmShell-vialTubos de 3 ml estérilesAsas desechablesPortasCubresGuantesPapel de filtroClorogel y lejíaPapel de manosOtros

Al finalizar cada jornada de trabajo, revisar y reponerlos productos y el material necesario para el trabajodel día siguiente. Semanalmente, por escrito, solicitaral supervisor el material fungible que precise serrepuesto.De manera periódica (preferiblemente a diario) debecontrolarse la temperatura de cadaestufa/nevera/congelador al inicio de la jornada detrabajo con un termómetro situado permanentementeen el centro de cada equipo. El termómetro debepermitir la medida de la temperatura máxima ymínima alcanzadas. Se anotará en la hoja de registrode temperatura de cada aparato (como ejemplo sepropone la del Anexo 3, Registro de temperatura,PNT-RTP-01) y en el caso de temperaturas mínima omáxima fuera del rango de aceptación, anotar laincidencia y realizar las acciones frente a esavariación. Estas acciones, por un lado, debenasegurar los resultados derivados de los cultivos ypor otro corregir esa desviación.Se sugieren los siguientes intervalos de aceptación:

- estufas de 35-37°C se acepta una mínimasuperior o igual a 34°C y máxima inferior o igual a37,5°C·

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- para las neveras el intervalo de tolerancia quese acepta es generalmente de 2º - 8°C, aunquepuede variar en función de los reactivos quecontengan.Todos los termómetros utilizados en la medida detemperaturas de los aparatos se han de verificarmediante un termómetro de referencia calibrado. Seintroducirá el termómetro utilizado para la mediciónde la temperatura y el termómetro calibrado en elequipo correspondiente (nevera, congelador oestufa) durante un mínimo de 15 minutos. Seaceptarán aquellos termómetros cuyas desviacionesno sobrepasen los límites establecidos para cadauso concreto. La periodicidad de la verificación de lostermómetros con el termómetro calibrado debe serestablecida por el propio laboratorio.Existen sistemas automáticos para el control de latemperatura, humedad, presión de CO2, etc., quecontrolan de una manera permanente (en intervalosde 15-20 minutos) los anteriores parámetros congran fiabilidad y que utilizan sondas de referenciaverificadas por organismos certificados. Estossistemas alertan de los desvíos que se producen deuna manera más rápida que el control manual,controlan todos los equipos del laboratorio y generanlos informes de estos parámetros.

7. PROCESAMIENTO7.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Procesar la muestra atendiendo a las normas delProcedimiento de Seguridad en el laboratorio deMicrobiología Clínica (documento 10, SEIMC). Esaconsejable procesar la muestra durante losprimeros 15 minutos tras su recepción. Cuando nosea posible, procesar para cultivo en un máximo de48 horas siempre que se conserve refrigerado a 2-8º,y procesar para ensayo de citotoxicidad en unmáximo de 72 horas cuando se conserve refrigerado(para periodos mayores hay que congelar lasmuestras a temperaturas entre –60 y -80ºC).Homogeneizar las muestras líquidas y semilíquidascon ayuda de un vórtex. Si se trata de biopsias,triturarlas en un medio líquido. Cuando la muestra seha recogido en torunda, exprimir ésta en un pequeñovolumen de caldo mediante movimientos rotatoriossobre las paredes del tubo. Actualmente, serecomienda realizar el denominado cultivotoxigénico, es decir, el ensayo de citotoxicidad de latoxina B en líneas celulares de los aislados de C.difficile recuperados del cultivo. Sin embargo, puedeser recomendable realizar a la vez un ensayo decitotoxicidad directa sobre las heces ya que aumentala sensibilidad de la técnica en un 5% y reduce eltiempo medio necesario para el diagnóstico de laenfermedad

7.2. CULTIVO TOXIGÉNICO7.2.1. Pretratamiento de las muestras. Enocasiones, las muestras necesitan un tratamientoprevio al cultivo según la selectividad del medio decultivo utilizado:

- No necesario pretratamiento: medios de cultivoselectivos como el agar CCFA (de elección) o elagar CCEY.- Necesario pretratamiento: cuando se utilicenmedios no selectivos como el agar Brucella o elagar Schaedler con 5% de sangre de carnerocon vitamina K1 y hemina. La finalidad delpretratamiento es compensar la inexistencia deantibióticos selectivos en el medio de cultivomediante la selección de esporas de C. difficile yla eliminación de los microorganismosacompañantes. Este pretratamiento consiste enañadir volúmenes iguales de muestrahomogeneizada y alcohol absoluto en un tubo,mezclar bien y dejar actuar al alcohol durante unperiodo de 30-60 minutos. Otra posibilidad esrealizar un choque térmico a 80ºC de lasmuestras homogeneizadas durante un periodode 10 minutos aunque este procedimiento esmenos efectivo. También es posible utilizar unmedio de cultivo ligeramente selectivo como elmedio CCEY que contiene una menorconcentración de antibióticos que el agar CCFA.

7.2.2. Siembra de las muestras. La siembra de lasmuestras puede realizarse de alguna de lassiguientes maneras:

- siembra cuantitativa: diluir 1 ml dehomogeneizado (o de mezcla de homogeneizadocon alcohol absoluto) con 9 ml de caldo detioglicolato u otro caldo de enriquecimiento en tubosque contengan perlas de cristal, mezclar en vórtexdurante unos 60 segundos hasta que la suspensiónsea homogénea, realizar diluciones seriadas al 1:10y sembrar 0,1 ml de las diluciones 10-1, 10-3 y 10-5 enplacas de agar. Tras 24-48 horas de incubación enambiente anaeróbico a 37ºC contar el número decolonias de C. difficile sólo en aquellas placas en lasque el recuento esté entre 30 y 300 unidadesformadoras de colonias (UFC). Realizar la inspecciónde las placas a las 24 horas de incubación sólocuando éstas se incuben en cámaras deanaerobiosis, para los demás casos incubar lasplacas 48 horas. Calcular el número de UFC por mlmultiplicando las UFC de cada una de las placaselegidas para el recuento por el factor de dilución ypor 10 (por ejemplo, si hay 30 UFC en la placasembrada con 0,1 ml de dilución 10-3, el número deUFC por ml será de 30x103x10= 3x105 UFC/ml).Cuando se parta de la mezcla de heces y alcoholmultiplicar por dos el valor obtenido. En el caso deque haya varias placas elegidas para el recuentorealizar una media aritmética de los valores deUFC/ml obtenidos para cada una de ellas.

- siembra semicuantitativa: inocular 0,1 gramos o2-3 gotas de muestra homogeneizada (o de mezclade homogeneizado con alcohol) en el primercuadrante del medio de cultivo y realizar un total de 4estrías en cada uno de los 4 cuadrantes de la placa.Incubar la placa al igual que en la siembracuantitativa y cuantificar el resultado como 1+(crecimiento sólo en el primer cuadrante), 2+ (primer

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y segundo cuadrante), 3+ (primer, segundo y tercercuadrante) o 4+ (todos los cuadrantes). El grado decuantificación de +4 suele corresponderse con unrecuento real de 105 UFC/ml.

- siembra cualitativa: sembrar 0,1 gramos o 2-3gotas de muestra homogeneizada (o de mezcla dehomogeneizado con alcohol) en el medio de cultivo eincubar la placa de igual manera que en los casosanteriores. Informar el cultivo como crecimiento oausencia de crecimiento de C. difficile.7.2.3. Aislamiento e identificación. Las coloniasde C. difficile en agar CCFA tienen unos 4 mm dediámetro y son amarillas, con aspecto de vidrioesmerilado, circulares, con un perfil en forma debotón o lisas y que viran el color rosa-anaranjado delmedio a un color amarillo. Además, las coloniasproducen p-cresol que recuerda al olor de lascuadras. Las colonias en agar CCEY son grises enun primer momento y con el centro blanquecinocuando se reincuban tiempos más prolongados, sonfluorescentes con un color verde-amarillento brillanteal ser expuestas a luz UV de longitud de onda larga ytambién tienen el característico olor a p-cresol. En latinción de Gram se observan bacilos grampositivosrectos que contienen, especialmente en los mediosno selectivos, esporas ovales subterminales en suinterior. La confirmación de las colonias sospechosaspuede realizarse de alguna de las siguientesmaneras:

- prueba de la L-prolina aminopeptidasa:extender con la ayuda de un asa una colonia enun disco humedecido de PRO-KIT (Remel),esperar 2 minutos y añadir una gota de p-dimetilaminocinnamaldehido dejando actuar 1minuto. Las cepas de C. difficile producen unareacción positiva caracterizada por el desarrollode una coloración rosa intensa o roja.Alternativamente, puede realizarse unasuspensión de la colonia en 2-3 ml de agua osuero salino, añadir un disco de prolina (Rosco,WEE-TABS), incubar 2-4 horas, añadir una gotade p-dimetilaminocinnamaldehido e interpretarigual que en el caso anterior. Existen otrosclostridios que también producen esta reaccióncomo C. sordellii, C. bifermentans, C.clostridioforme, C. sporogenes y C. glycolicum,especialmente, cuando crecen en medios noselectivos. La diferenciación ha de basarse en lamorfología de las colonias, la actividad lecitinasa(C. sordellii y C. bifermentans la hidrolizan, adiferencia de C. difficile) y lipasa (C. sporogenesla hidroliza, a diferencia de C. difficile).- detección de glutamato deshidrogenasa:mediante aglutinación por látex (Becton-Dickinson) o por enzimoinmunoensayo. Lascepas de C. difficile producen esta enzimaaunque otras especies, como las mencionadasarriba también pueden producir resultadospositivos.- cromatografía de gas-líquido: la presencia deácido isocaproico es característica de C. difficile

(ver PNT-AN-01).7.2.4. Ensayo de citotoxicidad. Consiste en ladetección de la toxina B o citotoxina en ciertas líneascelulares de mamíferos (fibroblastos humanos,células MRC-5, células K-1 de ovario de hamsterchino, etc.) mediante la observación de un típicoefecto citopático producido por la toxina que esneutralizado por la antitoxina específica. Aunqueexisten diversos sistemas comerciales para ladetección de la toxina B (Advanced ClinicalDiagnostics, Bartels Inc., Biowhittaker Inc., TechLabInc.) el procesamiento general es de la siguientemanera. Suspender varias colonias de C. difficile enun caldo de enriquecimiento como caldo tioglicolato,incubar el caldo en anaerobiosis durante 24 horas a37ºC, filtrar la suspensión y añadir 1 ml de filtrado y 1ml de medio de mantenimiento (como, por ejemplo,medio EMEM) en cada uno de dos shell-vial quecontengan la monocapa de células humanas, añadirla antitoxina B en uno de los shell-vial e incubardurante 24 horas en un ambiente anaerobio a 35-7ºC. Observar la monocapa mediante microscopio deinversión. Si se observa el efecto citopático en el vialsin antitoxina y no existe tal efecto en el vial conantitoxina se tratará de una cepa toxigénica de C.difficile. Si, en cambio, el efecto citopático también seproduce en el vial con antitoxina se tratará de unatoxicidad inespecífica por lo que habrá que diluir elfiltrado y repetir el procedimiento para intentareliminar esta toxicidad inespecífica (cuando se partede colonias puras de C. difficile es muy raro que seproduzca una toxicidad inespecífica). Si no seproduce efecto citopático en ningún vial, reincubar 24horas más e interpretar de la misma forma. Sitranscurridas 48 horas no existe efecto citopático setratará de una cepa no toxigénica de C. difficile.

7.3. CITOTOXICIDAD DIRECTADiluir 0,5 ml de muestra homogeneizada en 1 ml dePBS, centrifugar la mezcla a 3.500g durante 15minutos y filtrar el sobrenadante. Procesar el filtradotal como se describe en el apartado 7.2.4. Ya que setrata de un filtrado de la muestra y no de un cultivopuro, es más frecuente que se produzcan toxicidadesinespecíficas.

7.4. MÉTODOS DE DETECCIÓN RÁPIDA DE C.DIFFICILE TOXIGÉNICO

A pesar de la alta sensibilidad y especificidaddel uso combinado del cultivo toxigénico y delensayo de citotoxicidad, su realización puede llevarde 1 a 4 días. Además, existen muchos laboratoriosde Microbiología que carecen de la infraestructuranecesaria para la realización de cultivos celulares.Estos inconvenientes han dado lugar a la apariciónde técnicas comerciales de detección de C. difficiletoxigénico directamente de la muestra que son muysencillas de realizar y que han reducido el tiempo dediagnóstico considerablemente. Las principalestécnicas comerciales disponibles en la actualidadson:

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7.4.1. Técnicas que detectan glutamatodeshidrogenasa. Ésta enzima es un antígenobastante específico de C. difficile aunque tiene elinconveniente de que no discrimina entre las cepastoxigénicas y no toxigénicas por lo que las técnicasbasadas en su detección suelen tener valores deespecificidad discretos. Existen ciertos sistemascomerciales basados en aglutinación mediante látex(CDT, Becton Dickinson; Meritec C. difficile, MeridianDiagnostics) capaces de obtener resultados enpocos minutos. Otros sistemas, basados en técnicasde enzimoinmunoensayo (lmmunoCard C. difficile.Meridian Diagnostics; Triage C. difficile panel, BiositeDiagnostics), pueden dar resultados en tan solo 15-20 minutos, con valores de sensibilidad yespecificidad del 84-92% y 96-100%,respectivamente.7.4.2. Técnicas que detectan toxina A. Existennumerosos sistemas comerciales que detectan latoxina A o enterotoxina de C. difficile mediantetécnicas de enzimoinmunoensayo. El tiemponecesario para la obtención de resultados varia deunos pocos minutos a varias horas. Los valores desensibilidad y especificidad son muy variadosdependiendo del sistema comercial que se utilice,aunque son superiores a los obtenidos por lastécnicas basadas en la detección de glutamatodeshidrogenasa. Su principal problema estriba enque no detectan cepas toxigénicas que carecen detoxina A (se estima que suponen el 10% del total decepas toxigénicas productoras de enfermedad).7.4.3. Técnicas que detectan toxina A y Son mássensibles que las anteriores ya que son capaces dedetectar cepas Tox A- y ToxB+. Los principalessistemas comerciales son C. difficile Tox-A/B Test(TechLab), Cd Toxin A+B (Rohm Pharma) y PremierCytoclone (Mendian Diagnostics).Seguir las instrucciones del fabricante para larealización de cada una de las pruebas rápidasdescritas anteriormente.El laboratorio debe solicitar al proveedor de mediosde cultivo los certificados de los controles de calidad,donde estarán incluidas las características físicas yquímicas que los definen y que deberá conservar.Asimismo realizara sus propios controles de calidadde los medios adquiridos comercialmente. El propiolaboratorio debe elegir tanto la periodicidad como laselección de los medios a los que realiza el controlde calidad en función del tipo, variedad y de losdatos históricos de la conformidad de los controlesrealizados por el laboratorio con las característicasque el proveedor facilite: un medio estable y que nohaya ocasionado problemas de crecimiento segúnregistros previos se debe controlar menos que unoque sea menos estable y haya ocasionadoproblemas en su uso. El laboratorio debe generarregistros de este control de medios adquiridos deproveedores y conservar estos registros para poderevaluar los medios y reconsiderar permanentementeel control de calidad de los mismos. Como ejemplode formato para el registro de control de medios

adquiridos comercialmente se propone el formulariodel Anexo 4 (Control de medios preparados, PNT-RTP-01). Con este control no sólo se evalúa laconformidad del laboratorio con los medios queadquiere ya preparados sino que también se evalúanlas condiciones de procesamiento, estufas yatmósferas utilizadas.Para el control de los medios se deben utilizarpreferentemente cepas de colección (ATCC, CECT uotras colecciones) pero en el caso de no teneracceso a estas cepas se podrán utilizar cepasaisladas en el propio laboratorio con característicasperfectamente definidas.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOSSi se realiza como única técnica la detección rápidade la toxina A o las toxinas A+B y el resultado esnegativo informar como “Detección rápida de toxinaA (ó A y B) negativa”. Si el resultado es dudosoinformar como “Detección rápida de toxina A (ó A yB) dudosa. Rogamos envíen nueva muestra”. Si elresultado es positivo informar como “Detecciónrápida de toxina A (ó A y B) positiva”.Si se realiza la detección rápida de la toxina A o lastoxinas A+B como una técnica urgente previa alcultivo toxigénico o a la citotoxicidad directa y elresultado es negativo informar preliminarmente como“Detección rápida de toxina A (ó A y B) negativa.Resultado pendiente de confirmación mediantecultivo toxigénico (o citotoxicidad directa)”. Si elresultado es dudoso informar como “Detecciónrápida de toxina A (ó A y B) dudosa. Resultadopendiente de confirmación mediante cultivotoxigénico (o citotoxicidad directa)”. Si el resultado espositivo informar como “Detección rápida de toxina A(ó A y B) positiva. Resultado pendiente deconfirmación mediante cultivo toxigénico (ocitotoxicidad directa)”. Una vez obtenidos losresultados del cultivo toxigénico o de la citotoxicidaddirecta y si el resultado es positivo añadir al resultadode la detección rápida, en el caso de que se hayahecho, “Cultivo toxigénico (o citotoxicidad directa) deClostridium difficile positivo”. Si el resultado esnegativo añadir al resultado de la detección rápida,en el caso de que se haya hecho, “Cultivo toxigénico(o citotoxicidad directa) de Clostridium difficilenegativo”. Si se produce una toxicidad inespecífica apesar de la realización de diluciones seriadas añadiral resultado de la detección rápida, en el caso de quese haya hecho, “Muestra tóxica. Rogamos envíennueva muestra”. Cuando la siembra de los cultivossea cuantitativa o semicuantitativa, expresar losresultados positivos de una manera cuantitativa.La forma de expresar cada uno de los posiblesresultados descritos anteriormente son orientativos.Cada laboratorio debe establecer los suyos propios.Registrar los resultados en el programa de gestióndel laboratorio e imprimir el informe definitivo. Unavez impresos todos los informes, el facultativoresponsable debe revisarlos y firmarlos. Cuando seobtengan resultados cuyo conocimiento precoz por

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parte del clínico sea importante en el manejo delpaciente, informar telefónicamente el resultadoanotando en un registro la persona que recibe lainformación.Después de enviar la información hacia las áreas dehospitalización correspondientes, anotar todos losresultados en el Libro de Registro del laboratorio y enla hoja diaria. Guardar ordenados en archivadorestodos los protocolos de trabajo significativos.9. RESPONSABILIDADES

Los técnicos de laboratorio serán losresponsables de la realización de los procedimientos,de realizar, cuando sea necesario, el informepreliminar verbal de los resultados y de emitir elinforme escrito tanto preliminar como definitivo.El facultativo tendrá bajo su responsabilidad lainterpretación de los resultados y la validación detodos los informes emitidos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTONo existe una procedimiento internacionalmente

aceptado para el procesamiento de las muestraspara el diagnóstico de la diarrea y/o colitis por C.difficile. Por este motivo, el procedimiento aquídesarrollado es únicamente orientativo.

11. LIMITACIONESNo aplicable.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA,

Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology, EighthEdition. American Society for Microbiology,Washington, D.C.; 2003.

2. Isenberg HD. Clinical Microbiology ProceduresHandbook. American Society for Microbiology,Washington, D.C.; 1997.

3. Jousimies-Somer HR, Summanen P, Citron DM,Baron EJ, Wexler HM, Finegold SM. Wadsworth –KTL Anaerobic Bacteriology Manual. StarPublishing Company. Belmont, C.A.; 2002.

4. Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica(Procedimiento 10). Procedimientos enmicrobiología clínica. SEIMC, 2000. En: http://www.seimc.org/.

5. Recogida, transporte y procesamiento general delas muestras en el laboratorio de Microbiología(PNT-RTP-01). SEIMC, 2003. En: http://www.seimc.org/.

6. Lyerly DM, Krivan HC, Wilkins TD. Clostridiumdifficile: its disease and toxins. Clin Microbiol Rev1988; 1:1-18.