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Etablierung eines zellulären in vitro Assays zur Bestimmung der

Angiotensin II Aktivität basierend auf der Expression von Luziferase

durch die Aktivierung von NF-κB

2. Bachelorarbeit

Bachelorstudiengang Molekulare Biotechnologie

Fachhochschule Campus Wien

Vorgelegt von:

Rebecca Petri

Personenkennzeichen: 0710543035

Betreuer:

Dr. Günther Staffler

Abgabetermin: 04.06.2010

Kurzfassung

Etablierung eines zellulären in vitro Assays zur Bestimmung der Angiotensin II

Aktivität basierend auf der Expression von Luziferase durch die Aktivierung von

NF-κB

Arterielle Hypertonie, allgemein bekannt als Bluthochdruck, erhöht das Risiko für

kardiovaskuläre Krankheiten drastisch und stellt daher in der heutigen Gesellschaft ein

zunehmendes Problem dar.

Im Körper spielt das Renin-Angiotensin System (RAS) eine entscheidende Rolle in der

Regulierung des Blutdruckes. Die physiologisch aktivste Komponente dieses Systems ist

das Peptid-Hormon Angiotensin II (AngII). AngII bindet an den Angiotensin II Typ 1

Rezeptor (AT1R) und bewirkt dadurch die Verengung von Arteriolen, die Freisetzung von

Aldosteron und die renale Aufnahme von Natrium, alles Faktoren, die zu einer

Blutdrucksteigerung führen. Unter pathophysiologischen Bedingungen ist AngII

maßgeblich an der Entwicklung eines chronisch erhöhten Blutdruckes beteiligt. Somit

stellt das Renin-Angiotensin System ein sehr gutes Angriffsziel für Therapien gegen

arterielle Hypertonie dar.

Die vorliegende Bachelorarbeit ist Teil eines Projektes von AFFiRiS AG, dessen Ziel es

ist, einen Peptidimpfstoff zu entwickeln, welcher Angiotensin II (AngII) neutralisiert und da

durch für die Behandlung von Bluthochdruck eingesetzt werden kann. Im Zuge dieser

Bachelorarbeit soll ein zellulärer in vitro Assay entwickelt werden, mit dem die Messung

der AngII Aktivität möglich ist. Dieser zelluläre Assay basiert auf der transienten

Kotransfektion eines Angiotensin II Typ 1 Rezeptor-„Enhanced Green Fluorescent

Protein“ (AT1R-EGFP) Expressionsvektors und eines Nukleärer Faktor-κB Luziferase

Reporter Gen System (NF-κB-luc) Expressionsvektors in menschliche Nierenzellen

(HEK293). Die Zellen werden nach der Transfektion mit unterschiedlichen AngII

Konzentrationen stimuliert. Durch die Bindung von AngII an den AT1 Rezeptor wird NF-κB

freigesetzt. Dieser bindet an das Luziferase Response Element und löst so die Produktion

von Luziferase aus. Es konnte gezeigt werden, dass AngII zu einer erhöhten

Luziferaseproduktion führt und diese durch monoklonale Antikörper gehemmt werden

kann.

2

Abstract

Establishment of a cellular in vitro assay for the evaluation of angiotensinII activity

based on the expression of luciferase triggered by the activation of NF-κB

High blood pressure increases the risk of cardiovascular diseases dramatically and

therefore represents a severe problem in today´s society. The renin-angiotensin system

(RAS) plays a major role in the control of blood pressure. The physiologically most active

component of this system is the peptide hormone angiotensin II (AngII). Its binding to the

angiotensin II type 1 receptor (AT1R) promotes vascular resistance, the release of

aldosteron and the renal reabsorption of sodium. Under pathological conditions all those

functions lead to a chronically elevated blood pressure. Due to its function and due to the

fact that different drugs exist that interfere with the RAS, this system represents a well

characterized and validated target for the treatment of hypertension.

The present bachelor thesis is part of a project of AFFiRiS AG. AFFiRiS AG aims at

developing a vaccine that neutralizes AngII and thus lowers blood pressure in

hypertensive patients. In the present bachelor thesis a cellular assay is developed which

allows the measurement of AngII activity. The cellular assay is based on the co

transfection of an angiotensin II type 1 receptor-Enhanced Green Fluorescent Protein

(AT1R- EGFP) vector and a nuclear factor-κB luciferase reporter gene system (NF-κB-luc)

vector into Human Embryonic Kidney (HEK293) cells. Upon transfection HEK293 cells are

stimulated by different concentrations of AngII. The binding of AngII to the AT1 receptor

triggers the release of NF-κB. Subsequently NF-κB binds to the luciferase response

element and leads to the expression of luciferase. In the present work we were able to

show that AngII leads to an increased luciferase production which can be inhibited by an

AngII-specific monoclonal antibody.

3

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung....................................................................................................................5

2. Ergebnisse .................................................................................................................9

2.1 Transfektion von HEK293 Zellen mit einem EGFP-N1 Vektor ..................................9

2.2 Testung unterschiedlicher Transfektionsmethoden ................................................11

2.3 Überprüfung der Plasmid DNA mittels Restriktionsfragmentanalyse ......................12

2.4 Transfektionen unterschiedlicher DNA-Konstrukte .................................................13

2.5 Bestimmung der Kinetik der transienten Transfektion.............................................14

2.6 Lokalisierung des AT1 Rezeptors mittels Fluoreszenzmikroskopie .........................15

2.7 Stimulation der HEK293 Zellen und Messung der Luziferaseproduktion ................16

2.8 Testung monoklonaler Antikörper...........................................................................18

3. Diskussion ................................................................................................................19

4. Literaturverzeichnis ..................................................................................................22

5. Eigenständigkeitserklärung.......................................................................................23

6. Anhang.....................................................................................................................24

6.1 Materialien und Methoden......................................................................................24

6.2 Abkürzungsverzeichnis ..........................................................................................29

6.3 Abbildungsverzeichnis............................................................................................30

6.4 Protokolle ...............................................................................................................31

4

1. Einleitung

Arterielle Hypertonie, allgemein bekannt als Bluthochdruck, stellt in der heutigen

Gesellschaft ein schwerwiegendes Problem dar, da sie das Risiko für Herz-

Kreislauferkrankungen und deren Begleiterscheinungen, wie Schlaganfälle, Nieren

fehlfunktionen und Herzrhythmusstörungen drastisch erhöht.1 Die Entstehung von

Bluthochdruck kann von vielen Faktoren beeinflusst und ausgelöst werden. Ernährung,

Fettleibigkeit, Bewegungsmangel und genetische Veranlagung stellen potentielle

Risikofaktoren für die Entstehung arterieller Hypertonie dar.2

Im Körper spielt das Renin-Angiotensin System (RAS) eine bedeutende Rolle in der

Kontrolle des Blutdruckes. Renin ist eine Peptidase, die vorwiegend in den

juxtaglomerulären Zellen der Niere produziert wird. Sie spaltet das in der Leber produ

zierte Protein Angiotensinogen, wodurch das Dekapeptid Angiotensin I (AngI) entsteht.

Durch die Abspaltung zweier Aminosäuren von AngI durch das Angiotensin Converting

Enzyme (ACE) wird das Peptid-Hormon Angiotensin II (AngII) gebildet. Angiotensin II ist

acht Aminosäuren lang und ist die physiologisch aktivste Komponente des RA-Systems.

Es wird kurz nach seiner Produktion von Angiotensinasen weiter zu Angiotensin III

(AngIII) und Angiotensin IV (AngIV) abgebaut.1

AngII kann an die spezifischen Zelloberflächen-Rezeptoren, den Angiotensin II Typ 1

(AT1) Rezeptor und den Angiotensin II Typ 2 (AT2) Rezeptor binden und so

unterschiedliche biologische Funktionen erfüllen (vgl. Abb. 1). Beide Rezeptoren gehören

der Klasse der „G-Protein Coupled Receptors“ (GPCR) an und besitzen eine Sieben

Transmembran-Domäne.3

Der AT1 Rezeptor ist auf zahlreichen Geweben im Körper lokalisiert. Neben der glatten

Gefäßmuskulatur wird der AT1 Rezeptor auch in der Niere, in der Nebenniere, im Gehirn,

und im Herzen exprimiert.3 Die Bindung von AngII an den AT1 Rezeptor induziert unter

anderem die Verengung von Arteriolen, die verstärkte Freisetzung von Aldosteron und die

Aufnahme von Natrium in die Niere.1 All diese Faktoren führen zu einer Erhöhung des

Blutdruckes. Unter pathophysiologischen Bedingungen steht die Bindung von AngII an

den AT1R in direkter Verbindung mit der Entstehung von chronischer, arterieller

Hypertonie. Bei der Bindung von Ang II an den AT1 Rezeptor wird das daran gekoppelte

G-Protein aktiviert. Dieses aktiviert wiederum unter anderem die Phospholipase C (PLC),

welche Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PIP2) in Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und

Diacylglycerol (DAG) spaltet. IP3 löst die Freisetzung von Calcium aus dem

5

Endoplasmatischen Retikulum aus. Dieser Calciumeinstrom führt zusammen mit DAG zur

Aktivierung verschiedener Enzyme, die Einfluss auf die Zellfunktion nehmen.4 Über diesen

Signalweg wird auch die Iκ-Kinase β aktiviert. Sie phosphoryliert I-κB, einen Inhibitor von

NF-κB, und löst so die Freisetzung des Transkriptionsfaktors aus.

Im Gegensatz zu der Funktion des AT1 Rezeptors ist jene des AT2 Rezeptors noch relativ

unbekannt. Es wird jedoch vermutet, dass er vielen Funktionen des AT1 Rezeptors

entgegensteuert. Im Fetus wird der AT2 Rezeptor in allen Geweben exprimiert. Nach der

Geburt erfolgt die Expression des Rezeptors in einigen Geweben nur noch in sehr gerin

gen Mengen oder wird gänzlich gestoppt.3 Experimente zeigen, dass die Bindung von

AngII an den AT2 Rezeptor zur Gefäßerweiterung und zur Freisetzung von

Stickstoffmonoxid führt. Außerdem werden Apoptose und Zelldifferenzierung gefördert

und Zellwachstum gehemmt. Es wird angenommen, dass die Signalweiterleitung des AT2

Rezeptors G-Protein abhängig und unabhängig über die Aktivierung von Serin/Threonin

und Tyrosin Phosphatasen geschieht.5

Abb. 1: Renin-Angiotensin Hormonkaskade. Renin spaltet Angiotensinogen in Angiotensin I. Dieses wird vom

Angiotensin Converting Enzyme (ACE) in Angiotensin II gespaltet, welches acht Aminosäuren lang ist. AngII kann

an den AT1 Rezeptor und AT2 Rezeptor binden und so unterschiedliche Funktionen induzieren.1

Da arterielle Hypertonie zu schwerwiegenden Folgen führen kann, wurden bereits

zahlreiche Medikamente und Therapien entwickelt, die diesen entgegensteuern. Da das

Renin-Angiotensin System ein attraktives Angriffsziel für Therapien darstellt, wurden be

reits ACE Inhibitoren, AT1R Blocker und Renin Inhibitoren gegen Bluthochdruck

entwickelt.4

AFFiRiS AG hat das Ziel, einen Impfstoff auf Peptidbasis zu entwickeln, der die

blutdruckerhöhende Wirkung von AngII verhindert. Hierzu verwendet AFFiRiS AG

6

VARIOTOPE®. VARIOTOPE® sind Peptide, die sich in ihrer Aminosäuresequenz von

AngII unterscheiden, jedoch trotzdem eine humorale Immunantwort gegen dieses Hormon

auslösen können. Die vorliegende Bachelorarbeit wurde im Rahmen dieses Projektes

verfasst. Das Ziel dieser Arbeit war einen zellulären Assay zu entwickeln, mit dem es

möglich ist, die inhibierende Wirkung der VARIOTOP®-induzierten Antikörper auf

Angiotensin II zu testen.

Abb. 2: Prinzip des zellulären Assays. Kommt es zu einer Bindung von AngII an den AT1 Rezeptor, wird in den

HEK293 Zellen NF-κB freigesetzt. Der Transkriptionsfaktor bindet an das „Response Element“ auf dem Vektor und

es k ommt zur Produktion von Luziferase. Dieses Signal kann gemessen werden.

Das Prinzip dieses Assays ist in Abbildung 2 dargestellt. Es basiert auf der Kotransfektion

eines NF-κB Luziferase Reporter Gen System (NF-κB-luc) Expressionsvektors und eines

AT1R-EGFP Expressionsvektors (vgl. Abb. 3) in menschliche Nierenzellen (HEK293).

Nach der Expression des AT1 Rezeptors an der Zelloberfläche, kann AngII an den AT1

Rezeptor binden. Durch diese Bindung wird I-κB, ein Inhibitor von NF-κB, durch die Iκ

Kinaseβ phosphoryliert. I-κB wird anschließend ubiquitinyliert und durch das Proteasom

abgebaut.6 NF-κB wird nun freigesetzt und löst durch die Bindung an das eingebrachte

Luziferase Response Element die Produktion von Luziferase aus. In der Gegenwart von

VARIOTOP®-induzierten Antikörpern, die freies AngII neutralisieren, sollte die

Freisetzung von NF-κB nicht erfolgen und daher kein Luziferasesignal messbar sein.

An Hand der unterschiedlichen Lumineszenzsignale sollte daher die inhibierende Wirkung

der VARIOTOP®-induzierten Antiköper auf AngII bewertet werden.

7

Abb. 3: AT1R-EGFP Expressionsvektor. Der Vektor trägt an seinem C-Terminus ein EGFP-Gen. Die AT1R cDNA

wurde in die „Multiple Cloning Site“ (MCS) am N-Terminus des EGFP Gens kloniert. Dies erlaubte die Expression

eines EGFP-AT1R Fusionsproteins.

Im Zuge dieser Bachelorarbeit sollten die Expressionsvektoren AT1R-EGFP und NF-κB

luc transient in HEK293 Zellen kotransfektiert werden und die Transfektionseffizienz durch

„Fluoresence Activated Cell Sorting“ (FACS) Analysen bestimmt werden. Um die

Funktionalität des Assays zu überprüfen sollten HEK293 Zellen nach der Kotransfektion

mit unterschiedlichen AngII Konzentrationen stimuliert und die Luziferaseproduktion

gemessen werden. In weiterer Folge sollte mit monoklonalen Antikörpern getestet

werden, ob die Aktivität von AngII inhibiert werden kann. Ziel dieser Bachelorarbeit war,

die Basis für zukünftige Versuche zu schaffen, in denen, mit Hilfe des Luziferase Assays,

die inhibierende Wirkung von VARIOTOP®-induzierten Antiköpern aus Seren getestet

werden kann.

8

2. Ergebnisse

2.1 Transfektion von HEK293 Zellen mit einem EGFP-N1 Vektor

Im Zuge der vorliegenden Bachelorarbeit sollte ein zellulärer Assay mit menschlichen

Nierenzellen (HEK293) etabliert werden, mit dem es möglich ist die inhibierende Wirkung

von VARIOTOP®-induzierten Antikörpern auf AngII zu messen.

Im ersten Schritt wurden HEK293 Zellen mit einem EGFP-N1 Vektor transfektiert, um zu

ermitteln, wie effizient diese Zellen transfektiert werden können. Die Zellen wurden in den

Dichten 0,25x106 Zellen/ml, 0,5x106 Zellen/ml und 1x106 Zellen/ml ausgesät. Die

Transfektion wurde mit Calcium Phosphat durchgeführt und 24 Stunden nach der

Transfektion die Transfektionseffizienz durch eine FACS Analyse bestimmt.

Abbildung 4 zeigt Dot Plots der untransfektierten (vgl. Abb. 4A) und der transfektierten

(vgl. Abb. 4B) HEK293 Zellen. Jeder Punkt auf diesen Plots steht für ein Ereignis, das

detektiert wurde. Bei gemessenen Ereignissen kann es sich unter anderem um einzelne

Zellen, Zellcluster oder auch Zellfragmente handeln. Auf den in Abbildung 4 dargestellten

Dot Plots wurde der Foward Scatter (FSC) gegen die Fluoreszenz von EGFP (FL1)

aufgetragen. In Abbildung 4B kann gesehen werden, dass viele HEK293 Zellen eine

starke Fluoreszenz 1 (grüne Fluoreszenz) aufwiesen. Dies zeigte, dass die Zellen

erfolgreich transfektiert werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass jene

Zellen, die trotz der Behandlung mit Calcium Phosphat nicht erfolgreich transfektiert

werden konnten, eine allgemeine Verstärkung der Fluoreszenzintensität aufweisen. Diese

Verstärkung wurde vermutlich durch eine erhöhte Eigenfluoreszenz der Zellen

hervorgerufen.

Abb. 4: FACS Analyse der HEK293 Zellen. Es wurden Dot Plots erstellt und der Foward Scatter gegen die EGFP

Fluoreszenz aufgetragen. A: Dot Plot der untransfektierten HEK293 Zellen. Es wurden keine positiv transfektierten

Zellen gemessen. B: Dot Plot der transfektierten Zellen. Es konnten viele positiv transfektierte Zellen detektiert

werden.

Des Weiteren wurden die transfektierten Zellen auf einem Density Plot dargestellt, auf

dem der FSC gegen den Side Scatter (SSC) aufgetragen wurde. Abbildung 5 zeigt jene

Zellen, die in einer Dichte von 0,5x106 Zellen/ml ausgesät wurden. Es konnten zwei

Populationen unterschieden werden, die durch helle Flächen am Density Plot erkennbar

waren. Die erste Population wies eine geringe Größe und Granularität auf. Dies waren

9

Hinweise darauf, dass es sich bei dieser Population um Zellfragmente und tote Zellen

handelte. Die Größe und Granularität der zweiten Population zeigte, dass sie vermutlich

von lebenden Zellen gebildet wurde. Deshalb wurde sie durch das Gate R1 eingegrenzt

(vgl. Abb. 5).

Abb. 5: Density Plot von transfektierten HEK293 Zellen. Helle Stellen zeigen Zellanhäufungen an. Es können

demnach zwei Populationen erkannt werden. Die vermutlich lebenden Zellen wurden mit dem Gate R1 eingegrenzt.

Um die Transfektionseffizienz zu ermitteln wurde ein Histogramm erstellt (vgl. Abb. 6A),

das die Fluoreszenz von EGFP (FL1) bezogen auf die Zellanzahl darstellte. Dabei wurde

die Fluoreszenzintensität der lebenden, untransfektierten Zellen (grün) mit jener, der

lebenden, transfektierten Zellen (violett) überlagert. In Abb. 6 ist ersichtlich, dass die

transfektierten Zellen im Gegensatz zu den untransfektierten Zellen eine starke

Verschiebung der FL1 aufweisen. Durch das Gate M1 wurden die positiv transfektierten

Zellen von den negativ transfektierten Zellen abgegrenzt. In diesem Versuch wurde das

Gate in Bezug auf den Dot Plot (vgl. Abb. 4B) der transfektierten Zellen gesetzt, da die

Veränderung der Eigenfluoreszenz mit einbezogen werden musste. Daher wurden jene

Zellen als positiv transfektiert betrachtet, welche eine Fluoreszenz über 102 aufwiesen

(vgl. Abb. 6).

Abb. 6: FACS Analyse untransfektierter und transfektierter Zellen. A: Das Histogramm der transfektierten Zellen

(violett) wurde mit dem Histogramm der untransfektierten Zellen (grün) überlagert. Das Gate M1 grenzt die positiv

transfektierten Zellen ein. B: Die Statistik zeigt, dass 60,82% der lebenden Zellen positiv transfektiert werden

konnten.

60,82% jener HEK293 Zellen, die in einer Dichte von 0,5x106 Zellen/ml ausgesät wurden,

wiesen eine grüne Fluoreszenz auf. Die Transfektionseffizienzen, die mit den Zelldichten

1x106 Zellen/ml und 0,25x106 Zellen/ml erzielt werden konnten, betrugen 50,97% und

48,08%.

Auf Grund dieses Versuchs konnte gezeigt werden, dass die Transfektion des EGFP-N1

Vektors in HEK293 Zellen sehr gut funktionierte und mit der Zelldichte 0,5x106 Zellen/ml

10

die höchste Transfektionseffizienz erreicht werden kann. Aus diesem Grund wurde diese

Zelldichte für weitere Versuche beibehalten.

2.2 Testung unterschiedlicher Transfektionsmethoden

Es gibt eine große Auswahl an unterschiedlichen Transfektionsreagenzien. Um jenes

Reagenz zu bestimmen, mit dem die höchste Transfektionseffizienz bei HEK293 Zellen

erreicht werden kann, wurden neben Calcium Phosphat, das FuGENE®6 Transfektions

reagenz von Roche, sowie das Lipofectamine™ Reagenz von Invitrogen getestet.

HEK293 Zellen wurden mit dem EGFP-N1 Vektor transfektiert und die jeweiligen

Transfektionseffizienzen durch FACS Analysen bestimmt.

Wie in Abbildung 7 ersichtlich, führten alle getesteten Transfektionsmethoden zu positiv

transfektierten Zellen (vgl. Abb. 7 A1, B1, C1). Die lebenden Zellen wurden in Density

Plots durch das Gate R1 eingegrenzt. Die Histogramme der transfektierten Zellen (violett)

wurden mit den Histogrammen der untransfektierten Zellen (grün) überlagert (vgl. Abb. 7

A2, B2, C2). Die positiv transfektierten Zellen wurden mit dem Gate M1 eingegrenzt (vgl.

Abb. 7 A2, B2, C2). Auch hier musste die allgemeine Veränderung der Eigenfluoreszenz

mit einbezogen werden, die vor allem bei den Transfektionen mit dem Lipofectamine™

Reagenz und Calcium Phosphat zu beobachten war. Es wurde ermittelt, dass mit

Lipofectamine™ die höchste Transfektionseffizienz erzielt werden konnte (~62%).

Allerdings wurde bei dieser Transfektion auch die höchste Zahl an toten Zellen gemessen.

Die Transfektion mit Calcium Phosphat war mit einer Transfektionseffizienz von 46,88%

ebenfalls sehr erfolgreich. Mit dem FuGENE®6 Transfektionsreagenz konnte allerdings

nur eine Transfektionseffizienz von 19,92% erzielt werden. Diese Methode schien daher

für die Transfektion und für HEK293 Zellen nicht optimal geeignet zu sein.

Auf Grund der hohen Transfektionseffizienz, der geringeren Rate an toten Zellen und

nicht zuletzt auf Grund der einfachen Handhabung wurde die Calcium Phosphat

Transfektionsmethode auch für alle weiteren Transfektionen angewandt.

11

Abb. 7: FACS Analyse von HEK293 Zellen, die durch unterschiedliche Transfektionsmethoden transfektiert wurden.

Es wurden Dot Plots erstellt, bei denen der FSC gegen die EGFP Fluoreszenz aufgetragen wurde. Die Histogramme

der lebenden, transfektierten HEK293 Zellen (violett) wurden mit den Histogrammen der lebenden,

untransfektierten HEK293 Zellen (grün) überlagert. Positiv transfektierte Zellen wurden auf den Histogrammen mit

dem Gate M1 eingegrenzt und die Transfektionseffizienzen ermittelt. A: Dot Plot und Histogramm der Zellen, die mit

Calcium Phosphat transfektiert wurden. Es wurde eine Transfektionseffizienz von 46,88% erreicht. B: Dot Plot und

Histogramm jener Zellen, die mit dem Lipofectamine™ Reagent transfektiert wurden. Die Transfektionseffizienz

betrug 62,07%. C: Dot Plot und Histogramm jener HEK293 Zellen, die mit dem FuGENE®6 Reagenz transfektiert

wurden. Die Transfektionseffizienz betrug 19,92%.

2.3 Überprüfung der Plasmid DNA mittels Restriktionsfragmentanalyse

Da die Transfektion der HEK293 Zellen mit dem EGFP-N1 Vektor erfolgreich war und

sowohl die geeignete Zelldichte als auch die Transfektionsmethode für den zellulären

Assay gewählt wurden, sollten HEK293 Zellen im nächsten Schritt mit dem AT1R-EGFP

Vektor transfektiert werden. Im Zuge früherer Versuche von AFFiRiS AG wurde AT1R

cDNA bereits in einen EGFP-N1 Vektor kloniert. Durch das Einfügen der DNA an den N-

Terminus von EGFP, wurde die Expression eines C-terminalen Fusionsproteins

gewährleistet. Vor der Transfektion des AT1R-EGFP Vektors sollte nun die DNA mittels

Restriktionsfragmentanalyse überprüft werden.

Der EGFP-N1 Vektor und der AT1R-EGFP Vektor wurden mit den Restriktionsenzymen

BamHI und EcoRI einfach und doppelt verdaut. Die verdauten und unverdauten Vektoren

wurden auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen (vgl. Abb. 8). Die Proben der Restriktion

des EGFP-N1 Vektors wurden in die Taschen 1-4 und die Proben der Restriktion des

AT1R-EGFP Vektors in die Taschen 5-9 geladen. In die erste Tasche wurde der DNA

Marker geladen. Auf den Lanes 1-3 können in Abbildung 8 DNA Banden in einer Höhe

von ~5000kb gesehen werden. Da der EGFP-N1 Vektor eine Größe von 4.7kb aufweist,

deutete dies auf eine erfolgreiche Linearisierung des Vektors durch die

Restriktionsenzyme hin. Auf den Lanes 5 und 6 befinden sich DNA Banden des AT1R

12

Vektors in einer Höhe von ~6000kb. Da die AT1R cDNA eine Größe von 1077bp7 und der

EGFP-N1 Vektor eine Größe von 4.7kb aufweisen, ist die Größe dieser DNA Banden ein

Hinweis darauf, dass der AT1R-EGFP Vektor die AT1R cDNA enthält und der Vektor

durch die Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI erfolgreich linearisiert wurde. Auf Lane 7

kann in Abbildung 8 der Doppelverdau des AT1R-EGFP Vektors gesehen werden Es

befinden sich, wie erwartet, zwei Banden auf dieser Lane: eine DNA Bande mit einer

Größe von ~4500kb und eine weitere DNA Bande mit einer Größe von ~1000kb. Dies ist

ein weiterer Hinweis darauf, dass der AT1R-EGFP Vektor die cDNA des Rezeptors enthält

und sie durch die Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI erfolgreich herausgeschnitten

werden konnte.

Abb. 8: 1%iges Agarosegel zur Überprüfung der Plasmid DNA. Die Lanes 1-4 zeigen die DNA Banden des EGFP-N1

Vektors und die Lanes 5-8 jene des AT1R-EGFP Plasmids. Die Plasmide wurden mit dem Enzym BamHI (Lanes

1+5), mit dem Enzym EcoRI (Lanes 2+4) und mit beiden Enzymen (Lanes 3+7) verdaut. Lane 4 und Lane 8 zeigen

die Banden der unverdauten Vektoren. Auf Lane 0 wurde der DNA Marker aufgetragen.

2.4 Transfektionen unterschiedlicher DNA-Konstrukte

Für den zellulären Assay mussten HEK293 Zellen mit dem AT1R-EGFP Vektor und dem

NF-κB-luc Vektor kotransfektiert werden. Daher sollte in diesem Versuch die Effizienz

dieser Kotransfektion ermittelt werden. Da in vorhergegangenen Versuchen die

Transfektion des EGFP-N1 Vektors erfolgreich war und die Transfektionseffizienz bekannt

war, wurde diese Transfektion als Positivkontrolle durchgeführt. Als Negativkontrolle

diente die Transfektion des NF-κB-luc Konstrukts, da diese Transfektion zu keiner grünen

Fluoreszenz führen sollte. Außerdem wurden HEK293 Zellen mit den Vektoren NF-κB-luc

und EGFP-N1 kotransfektiert.

Jene Zellen, die mit dem NF-κB-luc Vektor transfektiert wurden, zeigten bei der FACS

Analyse erwartungsgemäß keine grüne Fluoreszenz, da dieser Vektor kein EGFP enthält

(vgl. Abb. 9A). Die Transfektion des EGFP-N1 Vektors ergab erneut mit 66,98% eine sehr

13

hohe Transfektionseffizienz. Von jenen Zellen, welche mit dem EGFP-N1 Vektor und dem

NF-κB-luc Vektor kotransfektiert wurden, konnten 31,15% positiv transfektiert werden. Bei

der Kotransfektion des AT1R-EGFP Vektors und des NF-κB-luc Vektors wiesen 32,03%

der lebenden HEK293 Zellen eine grüne Fluoreszenz auf.

Durch diesen Versuch konnte gezeigt werden, dass jene Zellen, die mit dem AT1R-EGFP

Vektor transfektiert worden waren, EGFP, und daher vermutlich auch den AT1 Rezeptor

exprimieren.

Abb. 9: FACS Analyse der HEK293 Zellen. A: Dot Plot jener HEK293 Zellen, die mit dem NF-κB-luc

Expressionsvektor transfektiert wurden. Es wurden keine positiv transfektierten Zellen gemessen. B: Dot Plot der

Transfektion des EGFP-N1 Vektors. Es konnte eine Transfektionseffizienz von 66,98% gemessen werden. C: Dot

Plot jener Zellen, die mit den Expressionsvektoren NF-κB-luc und EGFP-N1 kotransfektiert wurden. Die

Transfektionseffizienz betrug 31,15%. D: Dot Plot jener HEK293 Zellen, die mit den Expressionsvektoren NF-κB-luc

und AT1R-EGFP kotransfektiert wurden. Es wurden 32,08% der Zellen positiv transfektiert.

2.5 Bestimmung der Kinetik der transienten Transfektion

Für die Stimulation der HEK293 Zellen mit AngII ist es notwendig, dass das AT1R-EGFP

Fusionsprotein in vielen HEK293 Zellen exprimiert wird. Daher sollte die Kinetik der

Expression des Fusionsproteins nach der Transfektion untersucht werden und ein

geeigneter Zeitpunkt für die Stimulation bestimmt werden. HEK293 Zellen wurden mit den

Expressionsvektoren AT1R-EGFP und NF-κB-luc kotransfektiert, sowohl nach 24 Stunden

als auch nach 48 Stunden wurde eine FACS-Analyse durchgeführt. Um tote Zellen von

lebenden Zellen unterscheiden zu können, wurde eine Färbung mit 7-Aminoactinomycin D

(7-AAD) durchgeführt. 7-AAD ist eine fluoreszierende Chemikalie, die in die DNA toter

Zellen interkaliert und daher durch FACS Analysen detektiert werden kann. Abbildung 10

zeigt HEK293 Zellen 24 Stunden nach der Transfektion. Es wurde ein Density Plot erstellt

und der FSC gegen die 7-AAD Fluoreszenz aufgetragen. Es können auf diesem Plot drei

Populationen unterschieden werden. Bei jener Population, die eine hohe 7-AAD

Fluoreszenz aufwies, handelte es sich um tote Zellen. Lebende Zellen wurden mit dem

Gate R1 eingegrenzt. Die dritte Population, welche eine geringe Größe und eine

schwache 7-AAD Fluoreszenz aufwies, wurde von Zellfragmenten gebildet. Die

Fluoreszenz der lebenden Zellen wurde in einem Histogramm dargestellt und die positiv

transfektierten Zellen mit dem Gate M1 abgegrenzt. Nach 24h konnte in diesem Versuch

14

eine Transfektionseffizienz von 17,37% gemessen werden. Die Anzahl der toten Zellen

belief sich auf ~20% (vgl. Abb. 10C).

Abb. 10: Kinetikstudie der AT1R-EGFP Expression durch eine FACS Analyse nach 24h. A: Es wurde eine 7-AAD

Färbung durchgeführt und ein Density Plot erstellt. Das Gate R1 schließt die lebenden Zellen ein. B: Das

Histogramm beinhaltet ausschließlich die Zellen des Gates R1. Durch das Gate M1 wurden die positiv

transfektierten Zellen eingegrenzt. C: Die Statistik des Histogramms zeigt, dass die Transfektionseffizienz 17,37%

betrug.

Nach 48h wurden die FACS Analyse und die 7-AAD Färbung wiederholt. Es konnte

bereits eine Abnahme der Transfektionseffizienz und eine Zunahme der Anzahl der toten

Zellen gemessen werden. Die Transfektionseffizienz betrug 14,77% und die Anzahl der

toten Zellen stieg von ~20% auf ~40% (vgl. Abb. 11 C).

Abb. 11: Kinetikstudie der AT1R-EGFP Expression durch eine FACS Analyse nach 48h. A: Es wurde eine 7-AAD

Färbung durchgeführt und ein Density Plot erstellt. Auf diesen Density Plot wurde ein Gate R1 gesetzt, das die

lebenden Zellen einschließt. B: Das Histogramm zeigt nur jene Zellen, die durch das Gate R1 eingeschlossen

wurden. Ein weiteres Gate M1 wurde gesetzt, das die positiv transfektierten Zellen eingrenzt. C: Die Statistik zeigt,

dass di e Transfektionseffizienz 14,77% betrug.

Diese Daten zeigten, dass nach 48 Stunden die Expression des AT1R-EGFP

Fusionsproteins bereits abnimmt und eine Vielzahl von HEK293 Zellen bereits tot ist.

Daher wurde beschlossen die Stimulation für den zellulären Assay nach 24 Stunden

durchzuführen.

2.6 Lokalisierung des AT1 Rezeptors mittels Fluoreszenzmikroskopie

In diesem Versuch sollte mit einem Fluoreszenzmikroskop überprüft werden, ob der AT1

Rezeptor nach der Transfektion des AT1R-EGFP Expressionsvektors an der Oberfläche

von HEK293 Zellen exprimiert wird.

Es wurden zunächst die untransfektierten HEK293 Zellen mikroskopiert. Dabei konnte

gesehen werden, dass auch diese HEK293 Zellen eine schwache Eigenfluoreszenz

aufweisen. Diese konnte hauptsächlich intrazellulär in granulären Strukturen erkannt

werden (vgl. Abb. 12).

15

Abb. 12: Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie untransfektierter HEK293 Zellen. Die Eigenfluoreszenz der

HEK293 Ze llen war intrazellulär in granulären Strukturen lokalisiert.

Im Gegensatz dazu konnte bei positiv transfektierten Zellen deutlich gesehen werden,

dass die Expression von EGFP an der Zelloberfläche lokalisiert war. Dies war ein Hinweis

darauf, dass der AT1 Rezeptor erfolgreich in die HEK293 Zellen transfektiert werden

konnte und an der Zelloberfläche der HEK293 exprimiert wird (vgl. Abb.13).

Abb. 13: Fluoreszenzmikroskopie einer positiv transfektierten HEK293 Zelle. Die EGFP-Fluoreszenz ist an der

Zelloberfläche lokalisiert.

2.7 Stimulation der HEK293 Zellen und Messung der Luziferaseproduktion

In den vorhergegangen Versuchen der vorliegenden Bachelorarbeit konnte erfolgreich

gezeigt werden, dass der AT1R-EGFP Vektor die AT1R cDNA enthält, die Kotransfektion

mit dem AT1R-EGFP Expressionsvektor und dem NF-κB-luc Expressionsvektor

funktionierte und der Rezeptor nach der Transfektion an der Zelloberfläche der HEK293

Zellen exprimiert wird. Weiters wurden die geeignete Zelldichte und die beste

Transfektionsmethode für die Kotransfektion ermittelt und der Zeitpunkt für die Stimulation

festgelegt. Daher sollte im nächsten Schritt gezeigt werden, dass die gewünschte

Freisetzung von NF-κB durch die Bindung von AngII an den AT1 Rezeptors möglich ist.

Bei einer erfolgreichen Freisetzung bindet NF-κB an das Luziferase Response Element

des NF-κB-luc Expressionsvektors und löst so ein Luziferasesignal aus.

Im folgenden Versuch wurden HEK293 Zellen nach der Transfektion mit den

Expressionsvektoren AT1R-EGFP und NF-κB-luc mit 10-6M und 10-9M AngII stimuliert.

Als Positivkontrolle wurden die Zellen mit 5ng/ml TNFα stimuliert. TNFα stimuliert die

Freisetzung von NF-κB und sollte daher bei einer erfolgreichen Transfektion des NF-κB

Konstrukts zu einem erhöhten Luziferasesignal führen. Zusätzlich zu TNFα und AngII

wurden die Zellen mit 10-7M Losartan inkubiert. Losartan ist ein AT1R Inhibitor und wird

gegen Bluthochdruck eingesetzt, da er die Bindung von AngII an seinen Rezeptor

16

verhindert.4 Losartan sollte demnach das durch AngII ausgelöste Luziferase Signal

hemmen, jedoch keinen Einfluss auf das durch TNFα ausgelöste Signal haben.

In diesem Versuch führte die Stimulation der HEK293 Zellen mit TNFα zu einem sehr

starken Anstieg der Lumineszenz. Allerdings wurde das Signal durch die Zugabe von

10-7M Losartan geschwächt (vgl. Abb. 14).

Abb. 14: Ergebnisse des Luziferase Assays. Die durchgeführten Stimulationen wurden auf der x-Achse und die

Lumineszenz auf der y-Achse aufgetragen. Das durch TNFα ausgelöste Signal erreichte den maximalen Messwert,

wurde jedoch durch Losartan geschwächt. AngII konnte hingegen nur ein schwaches Signal auslösen, welches

jedoch durch Losartan stark he rabgesetzt werden konnte.

Die Stimulationen mit 10-9M und 10-6M AngII führte im Vergleich zu TNFα nur zu einem

geringen Anstieg der Lumineszenz, deshalb wurden in Abbildung 15 die Ergebnisse der

Stimulationen mit AngII getrennt dargestellt. Es konnte mit 10-9M AngII ein höheres Signal

induziert werden als mit 10-6M AngII. Durch die Zugabe von Losartan konnte das durch

10-6M AngII-induzierte Signal um den Faktor fünf geschwächt werden.

Abb. 15: Ergebnisse der Stimulation von HEK293 Zellen mit AngII und Losartan. Das Signal von 10-9M AngII ist

deutlich höher als jenes von 10-6M AngII. Durch die Zugabe von 10-7M Losartan konnte das AngII Signal um den

Faktor fünf geschwächt werden.

In einem weiteren Versuch wurden nach der Kotransfektion mit den Expressionsvektoren

AT1R-EGFP und NF-κB-luc, 10-6M AngII, TNFα und Losartan zu den HEK293 Zellen

hinzugegeben. Dieser Luziferase Assay zeigte allgemein sehr hohe Lumineszenzsignale,

was durch ein starkes Hintergrundsignal erklärbar ist. Trotzdem konnte sowohl bei der

Stimulation mit TNFα als auch bei der Stimulation mit 10-6M AngII eine deutliche Zunahme

der Luziferaseproduktion gemessen werden. Das durch 10-6M AngII-induzierte Signal

konnte auch bei diesem Versuch mit 10-7M Losartan stark herabgesetzt werden. Es

17

konnte in mehreren Assays beobachtet werden, dass Zellen, die mit Losartan und AngII

stimuliert wurden, sogar ein schwächeres Lumineszenzsignal aufwiesen als unstimulierte

Zellen.

Abb. 16: Lumineszenzsignale unstimulierter und stimulierter HEK293 Zellen. Die Zellen wurden mit 10-6M AngII,

TNF , 10-7α M Losartan stimuliert. Das S ignal der AngII Stimuation wurde durch Losartan stark g eschwächt.

2.8 Testung monoklonaler Antikörper

Da die Stimulation mit AngII ein deutliches Luziferase Signal induzierte und das Signal

durch Losartan gehemmt werden konnte, sollte nun die inhibitorische Fähigkeit von

monoklonalen Antikörpern getestet werden. Es wurden HEK293 wie schon in den

Versuchen zuvor, mit den Vektoren AT1R-EGFP und NF-κB-luc kotransfektiert und mit

10-6M AngII stimuliert. Durch die Zugabe eines AngII spezifischen monoklonalen

Antikörpers (mAb 32-4-4) sollte gezeigt werden, dass das AngII-induzierte Signal durch

den Antikörper geblockt werden kann. Als Isotyp Kontrolle wurde ein irrelevanter,

monoklonaler Antiköper verwendet (mAb 151). Es konnte gemessen werden, dass das

AngII-induzierte Signal durch den Kontrollantikörper nicht beeinträchtigt wurde, es

hingegen durch den AngII spezifischen Antikörper erfolgreich herabgesetzt werden

konnte. Dies zeigte, dass der monoklonale Antikörper 32-4-4 das AngII-induzierte Signal

spezifisch inhibieren konnte.

Abb. 17: Überprüfung der inhibitorischen Fähigkeit v on monoklonalen Antikörpern. Die S timulation mit AngII führte

zu einer signifikanten Steigung des Lumineszenzsignals. Der monoklonale Kontrollantiköper hatte keinen Einfluss

auf di eses Signal. Der AngII spezifische monoklonale Antiköper hingegen konnte d ieses Signal herabsetzen.

18

3. Diskussion

Im Zuge der vorliegenden Bachelorarbeit sollte ein zellulärer in vitro Assay in HEK293

Zellen etabliert werden, mit dem es möglich ist die Aktivität von AngII durch die

Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB zu messen.

Da HEK293 Zellen den AT1 Rezeptor nicht endogen exprimieren, wurden sie mit einem

AT1R-EGFP Expressionsvektor transient transfektiert. EGFP ist ein fluoreszierendes

Protein, das nach seiner Aktivierung eine grüne Fluoreszenz aufweist, und daher leicht

detektiert werden kann. Diese Eigenschaft ermöglicht zum einen die Bestimmung der

Transfektionseffizienz durch FACS Analysen und zum anderen die Lokalisation des AT1

Rezeptors nach seiner Expression in der Zelle mittels Fluoreszenzmikroskopie. Die

Funktionalität eines AT1R-EGFP Fusionsproteins in HEK293 Zellen wurde bereits 2002

durch Versuche von Hunyady bestätigt.8

Um zu überprüfen, ob der AT1R-EGFP Expressionsvektor die cDNA des Rezeptors

tatsächlich enthält, wurde eine Restriktionsfragmentanalyse durchgeführt. Diese zeigte,

dass der AT1R-EGFP Expressionsvektor sowohl mit dem Restriktionsenzym BamHI als

auch mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert werden konnte. Der Doppelverdau des

Vektors führte erwartungsgemäß zu zwei DNA Banden. Allerdings wiesen diese DNA

Banden Größen von ~4500bp und ~900-1000bp, anstatt 4700bp und 1077bp auf. Eine

Erklärung für diese Abweichungen könnte sein, dass das Gel ungleichmäßig lief und

daher die DNA Fragmente unterschiedlich schnell aufgetrennt wurden. In Anbetracht

dessen kann auf Grund der Ergebnisse angenommen werden, dass der AT1R-EGFP

Expressionsvektor die AT1R cDNA enthält und daher sowohl EGFP als auch der Rezeptor

in den Zellen exprimiert werden können.

Die Ergebnisse dieser Restriktionsfragmentanalyse konnten in dieser Arbeit durch FACS

Analysen bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass HEK293 Zellen, die mit den

Expressionsvektoren AT1R-EGFP und NF-κB-luc transient kotransfektiert wurden, eine

grüne Fluoreszenz aufwiesen. Dies zeigte, dass die Zellen erfolgreich mit dem AT1R

EGFP Vektor transfektiert werden konnten und EGFP exprimierten. Da die AT1R-cDNA an

den N-Terminus des EGFP-Gens angefügt wurde, kann angenommen werden, dass auch

der Rezeptor erfolgreich exprimiert werden konnte.

Allerdings wiesen Zellen, die mit dem AT1R-EGFP Konstrukt transfektiert worden waren,

eine geringere Fluoreszenzintensität auf als jene Zellen, die mit dem EGFP-N1 Vektor

alleine transfektiert wurden. Die Tatsache, dass anstatt EGFP nun das gesamte

Fusionsprotein exprimiert werden musste, könnte diese Intensitätsabnahme erklären.

Eine weitere Bestätigung für die erfolgreiche Expression des Rezeptors erbrachte die

Fluoreszenzmikroskopie. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von EGFP in

19

positiv transfektierten Zellen an der Zelloberfläche lokalisiert war, wo auch die Expression

des Rezeptors erwartet wurde.

Um zu überprüfen, ob der Rezeptor auch funktionell aktiv ist, wurden kotransfektierte

HEK293 Zellen mit unterschiedlichen AngII Konzentrationen stimuliert. Durch diese

Stimulation konnte in einigen Assays eine signifikante Erhöhung der Luziferaseproduktion

erzielt werden. Um die Spezifität dieser Signalerhöhung zu überprüfen wurden die Zellen

zusätzlich zu AngII mit Losartan inkubiert. Losartan ist ein AT1R Inhibitor, der die Bindung

von AngII an seinen Rezeptor verhindert.4 Das AngII-induzierte Signal konnte durch

Losartan gänzlich unterdrückt werden. Diese Tatsache zeigte, dass das Signal spezifisch

durch AngII ausgelöst wurde und der AT1 Rezeptor daher funktionell aktiv sein musste.

Eine weitere Bestätigung für die Funktionalität des Assays und die Spezifität des AngII

Signales erbrachte die Testung von monoklonalen Antikörpern. Es konnte gezeigt

werden, dass ein AngII spezifischer monoklonaler Antikörper das AngII-induzierte

Luziferasesignal schwächen konnte, während ein AngII unspezifischer Kontrollantikörper

diesen Effekt nicht auslöste.

Es konnte also gezeigt werden, dass HEK293 Zellen, die mit dem AT1R-EGFP

Expressionsvektor transfektiert wurden, sowohl EGFP als auch den AT1 Rezeptor

exprimierten und der Rezeptor in den Zellen funktionell aktiv war. Weiters konnte die

Funktionalität des Assays durch die erfolgreiche Inhibierung des AngII-induzierten Signals

mit einem AngII spezifischen, monoklonalen Antikörper, bestätigt werden.

Allerdings konnten auch einige unsichere Faktoren im Assay ausgemacht werden. Es

wurde im Zuge von Versuchen festgestellt, dass zwischen unterschiedlichen Wells große

Schwankungen in den Transfektionseffizienzen auftraten. Da in den ersten Versuchen

jeweils ein Well pro Stimulus verwendet wurde, konnten die Ergebnisse auf Grund

unterschiedlicher Transfektionseffizienzen oftmals nicht verglichen werden. Daher

müssen in der vorliegenden Bachelorabeit die Ergebnisse des ersten Luziferase Assays

mit Vorsicht betrachtet werden. In weiteren Versuchen wurden, um diesem Problem

entgegenzuwirken, mehrere Wells pro Stimulus verwendet und der Mittelwert für die

Auswertungen berechnet. Um für die Stimulation gleichwertige Bedingungen zu schaffen,

wurde nach einer Methode gesucht, mit der es möglich ist, gleiche Transfektions

effizienzen in unterschiedlichen Wells zu erreichen. Hierfür wurden Zellen für die

Transfektion gepoolt und anschließend auf Wellplatten aufgeteilt. Durch FACS Analysen

konnte gemessen werden, dass mit dieser Methode gleiche Transfektionseffizienzen von

Well zu Well geschaffen werden konnten.

Doch auch die Stimulation mit AngII per se stellt in diesem Assay einen unsicheren Faktor

dar. Während TNFα beständig zu sehr hohen Signalanstiegen führte, führte die

Stimulation mit AngII oft nur zu einer schwachen Steigerung der Lumineszenzsignale. Es

20

wurde zunächst vermutet, dass das NF-κB-luc Konstrukt nicht erfolgreich transfektiert

werden konnte, da TNFα jedoch durchwegs zu starken Luziferasesignalen führte, konnte

dies ausgeschlossen werden. Dies könnte also bedeuten, dass die Aktivierung von NF-κB

durch AngII allgemein nicht gut funktionierte und der Transkriptionsfaktor daher kein

optimales Kontrollelement in diesem Assay darstellt.

Ruiz-Ortega et al. bestimmten den Effekt von AngII auf die Aktivität von NF-κB in glatten

Gefäßmuskelzellen (VSMC) von Ratten. Sie transfektierten die Zellen transient mit einem

NF-kB-luc Konstrukt und stimulierten sie mit AngII. Nach der Stimulation maßen sie, wie

auch in der vorliegenden Arbeit, die Luziferaseproduktion. Sie konnten zeigen, dass die

Stimulation der Zellen mit 10-7M AngII zu einer 6-fachen Steigerung der

Luziferaseproduktion führte.9 In der vorliegenden Bachelorarbeit konnte hingegen meist

nur eine 2-fache Steigerung der Luziferase Aktivität erzielt werden. Ein Grund für diese

Ergebnisse könnte die Tatsache sein, dass glatte Gefäßmuskelzellen, im Gegensatz zu

HEK293 Zellen, den AT1 Rezeptor endogen exprimieren und daher auch mit AngII

erfolgreicher stimuliert werden können.

In einigen Assays führte die Zugabe von Losartan zu einer Schwächung des TNFα

induzierten Luziferasesignals. Da Losartan in den ersten Versuchen vier Stunden vor den

restlichen Stimuli zu den Zellen hinzugefügt wurde, wurde vermutet, dass Losartan durch

diese Präinkubation toxisch auf die Zellen wirkte und dadurch das Signal von TNFα

herabgesetzt wurde. Dies würde jedoch bedeuten, dass auch die Blockade des AngII

induzierten Signals durch die toxische Wirkung und nicht auf Grund einer spezifischen

Inhibierung herabgesetzt wurde. Da jedoch das Signal von TNFα durch Losartan nur

geschwächt und das Signal von AngII beinahe gänzlich blockiert wurde, wurde auch in

diesen Versuchen die Blockade des AngII-induzierten Signals durch Losartan als

spezifisch angesehen.

Zusammenfassend konnte in dieser Bachelorarbeit gezeigt werden, dass durch den

zellulären Assay spezifische AngII Signale gemessen und durch monoklonale Antikörper

geschwächt werden können. Da dieser Assay in diesem Stadium jedoch noch sehr

instabil ist, kann er für die Testung VARIOTOP®-induzierter Antikörper nicht

herangezogen werden. Eine Möglichkeit diesen Assay stabiler zu gestalten, wäre die

Verwendung einer stabil transfektierten Zelllinie. In zukünftigen Versuchen muss

außerdem entschieden werden, ob die Aktivierung von NF-κB durch AngII tatsächlich ein

geeignetes Kontrollelement darstellt.

21

4. Literaturverzeichnis

1 Pandey R. et al. (2009): Vaccine for hypertension: Modulating the rennin-angiotensin

system. Journal of Cardiology 134,160-168

2 Maurer P. et al. (2009): Immunization against angiotensins for the treatment of

hypertension. Clinical Immunology 134, 89-95

3 de Gasparo M. et al. (2000): International Union of Pharmacology. XXIII. The

Angiotensin II Receptors: Pharmacological Reviews 52, 415-472

4 Zaman M. A. et al. (2002): Drugs targeting the renin-angiotensin-aldosterone system.

Nature Reviews Drug discovery 1, 621-636

5 Wenzel U. O. et al. (2009): The angiotensin II type 2 receptor in renal disease. Journal of

the Renin-Angiotensin-Aldosterone System 11, 37-41

6 Guo R. et al. (2006): Angiotensin II induces NF-kB activation in HUVEC via the

p38MAPK pathway. PEPTIDES 27, 3269-3275

7 Schussek S. (2009): Evaluation of candidate peptides for the immunisation against

Angiotensin II. Diplomarbeit, Universität Wien.

8 Hunyady L. et al. (2002): Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of

recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. Journal of Cell Biology 157, 1211

1222

9 Ruiz-Ortega M. et al. (2000): Angiotensin II Activates Nuclear Transcription Factor κB

Through AT1 and AT2 in Vascular Smooth Muscle Cells. Circulation Research 86, 1266

1272

22

5. Eigenständigkeitserklärung

23

6. Anhang

6.1 Materialien und Methoden

Zellkultur

HEK293 Zellen werden in Dulbecco`s modified Eagles medium (DMEM) + GlutaMAX™

mit 10% fetalem Kälberserum (FCS) und Penicillin/Streptomycin (P/S) kultiviert. Die Zellen

werden zweimal in der Woche 1:20 gesplittet.

Für die Zellzählung werden 10µl Zellsuspension mit 140µl 1xPBS und 50µl 0.4%

Trypanblau (GIBCO) versetzt. Mit Hilfe einer Neubauer Zählkammer werden die Zellen

unter einem Lichtmikroskop gezählt.

Die Zellanzahl pro Milliliter wird durch folgende Rechnung berechnet:

Gezählte Zellen x Verdünnungsfaktor x 104

Anzahl der Quadrate in Zählkammer

Transfektion der HEK293 Zellen

Calcium Phosphat Transfektion

0,25-1x106 Zellen/ml werden einen Tag vor der Transfektion in DMEM mit 10% FCS und

P/S in einer Petrischale (16ml), oder in einer 6-Well Platte (2ml/Well) ausgesät. Am

folgenden Tag wird das Medium entfernt und FCS freies DMEM mit P/S hinzugefügt. Für

die Transfektion wird zunächst die Plasmid DNA in der entsprechenden Menge H2O und

CaCl2 verdünnt. Zuletzt wird der HeBS- Puffer tropfenweise und unter leichtem Schütteln

hinzugefügt.

Mengenangaben für ein Well einer 6-well Platte (zu je 2ml)

2µg AT1R-EGFP Plasmid DNA

2µg NF-κB-luc Plasmid DNA

9µl 2M CaCl2

71µl HeBS Puffer

61µl H2O

Der Ansatz wird tropfenweise zu den Zellen pipettiert. Nach 4 bis 5 Stunden wird die

Transfektionslösung entfernt und frisches Medium (DMEM mit 10% FCS und P/S)

hinzugefügt.

24

Transfektion mit FuGENE®6 Transfection Reagent (Roche)

Es werden drei Ansätze mit drei unterschiedlichen FuGENE®6 Reagenz Konzentrationen

durchgeführt, sodass das Verhältnis zwischen Plasmid DNA und Reagenz 1:6,1:3 und 2:3

beträgt. Zunächst wird FCS und P/S freies DMEM in der entsprechenden Menge in

Eppendorf Tubes vorgelegt und das FuGENE®6 Reagenz hinzupipettiert. Der Ansatz wird

kurz gevortext und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Zuletzt wird die Plasmid

DNA in dem entsprechenden Verhältnis hinzugefügt. Der gesamte Ansatz wird gevortext

und für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird der Ansatz

tropfenweise zu den Zellen hinzugefügt. Nach 4 bis 5 Stunden wird das Medium

abgenommen und DMEM mit 10%FCS und P/S hinzugefügt.

(Siehe Protokoll „FuGENE®6 Transfection Reagent“ von Roche)

Transfektion mit Lipofectamine™ Reagent und PLUS® Reagent (Invitrogen)

1µg EGFP-N1 Plasmid DNA wird in 100µl FCS freiem DMEM mit P/S verdünnt. Das Plus®

Reagenz wird gevortext und 10µl zu der verdünnten DNA hinzugefügt. Der Ansatz wird für

15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

10µl Lipofectamine™ Reagenz werden ebenfalls in 100µl FCS freiem DMEM mit P/S

verdünnt und nach der Inkubationszeit zu dem restlichen Ansatz hinzugefügt und erneut

für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wird der Ansatz tropfenweise zu den Zellen hinzugefügt. Nach 4 bis 5

Stunden wird das Medium abgenommen und DMEM mit 10%FCS und P/S hinzugefügt.

(siehe Protokoll „Lipofectamine™ Reagent“ von Invitrogen)

Stimulation der transfektierten HEK293 Zellen

Stimulation mit AngII, TNFα und Inhibierung mit Losartan

Die Stimulation der HEK293 Zellen wird 24h Stunden nach der Transfektion in einer 6

Well Platte oder einer 24-Well Platte durchgeführt. Vor Zugabe der Stimuli wird das

Medium entfernt und FCS freies DMEM hinzugefügt. Die Zellen werden mit 10-7M

Losartan (Sigma-Aldrich), 10-6M und 10-9M Angiotensin II und 5ng/ml TNFα (R&D

Systems) stimuliert. Losartan wird 2 bis 4 Stunden vor der Stimulation mit AngII und TNFα

zu den Zellen hinzugefügt. Nach der Inkubationszeit werden die restlichen Stimuli

hinzugefügt und die Mediumsschale vorsichtig geschwenkt um die Stimuli zu verteilen.

Stimulation mit AngII und Testung monoklonaler Antikörpern

10-6M AngII und 0,6x10-6M AngII-spezifischer Antikörper (mAb 32-4-4) bzw. 0,4x10-6M

Kontrollantikörper (mAb 151) werden für 30 Minuten in 2ml FCS freiem DMEM in

25

Eppendorf Tubes präinkubiert. Anschließend wird das Medium von den Hek293 Zellen

abgenommen und der AngII-Antikörper-Mix zu den Zellen hinzugefügt.

Luziferase Assay

24 Stunden nach der Stimulation werden die Zellen mit 300µl des Lysis Buffers (Super

Light Luciferase Reporter Gene Assay Kit, BioAssay Systems; Gentaur) abgelöst. 200µl

der abgelösten Zellen werden entnommen und auf zwei Wells einer 96-Well Platte (black

VIEW plate PerkinElmar) zu je 100µl aufgeteilt. Anschließend wird das Luziferase Signal

mit dem TECAN GENios Reader (Luminometer) und dem Programm luminescence.mth

gemessen. Der Emissionsfilter und der Anregungsfilter werden hierfür zuvor entfernt.

(Integrationszeit: 500msec)

FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) Analyse

Die FACS Analyse ermöglicht die Zählung von Zellen und die Messung ihrer Größe, ihrer

Granularität und ihrer Fluoreszenz. Die Zellen werden einzeln angeordnet und von einem

Laser bestrahlt. Trifft ein Laserstrahl auf eine Zelle, wird dieser, abhängig von der Größe

und der Oberflächenbeschaffenheit jener Zelle, unterschiedlich stark gestreut. Durch

diese Streuung können Größe und Granularität bestimmt werden. Dabei misst der Foward

Scatter die Größe der Zellen, während der Side Scatter die Granularität der Zellen angibt.

Außerdem können Fluoreszenzen detektiert werden und so Zellen selektiert werden. Die

FACS Analysen werden mit dem FACScan Flow Cytometer 65 von Becton Dickinson

GmbH und dem Programm CellQuest Pro durchgeführt. Für die Messung werden 2x105

4x105 Zellen entnommen, für 3 bis 4 Minuten bei 1000rpm abzentrifugiert und der

Überstand abgenommen. Das Pellet wird anschließend in 400µl eiskaltem FACS Puffer

resuspendiert.

7-AAD Färbung

Kurz vor der FACS-Analyse wird 7-AAD (Stocklösung 1mg/ml) in einem Verhältnis von

1:1000 zu den Messproben hinzugefügt und kurz gevortext. Bei 7-AAD handelt es sich um

7-Aminoactinomycin D. Diese fluoreszierende Chemikalie kann in die DNA von toten

Zellen interkalieren, da deren Zellmamembran löchrig und dadurch durchlässig werden.

Restriktionsfragmentanalyse

1µg DNA wird mit 1µg Enzym (BamHI, EcoRI von Fermentas), 16µl ddH2O und 2µl

Reaktionspuffer (1x BamHI Buffer von Fermentas) für 3 bis 5 Stunden bei 37°C inkubiert.

Anschließend werden die Verdaue auf ein 1%iges Agarosegel geladen (~45 Minuten,

100V).

26

Agarosegelelektrophorese

Es wird 1%iges Agarosegel in 1xTAE in der Mikrowelle erhitzt und 10µl (1:10000) Sybr

Safe DNA Stain (Invitrogen) hinzugefügt. Als DNA Marker wird der GeneRuler™ 1kB DNA

Ladder (Fermentas) verwendet. Das Gel wird in 1xTAE für ungefähr 45 Minuten bei 100V

laufen gelassen und die Banden anschließend unter UV Licht im Transluminator M-26 (bio

Doc-It System) angesehen. Als Ladepuffer wurde ein Puffer aus Xylencyanol und Orange

Green (Sigma) verwendet.

Durchlicht- und Fluoreszenzmikroskopie

HEK293 Zellen werden mit 1xPBS von der Zellkulturschale abgelöst und 600µl in ein

Eppendorf Tube überführt. Die Zellen werden bei 1000rpm für 4 Minuten abzentrifugiert.

Der Überstand wird verworfen und das Pellet in eiskaltem 1xPBS resuspendiert. Die

Zellen werden tropfenweise auf einen Objektträger überführt und für 2 bis 3 Minuten

inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mikroskopiert.

Allgemeine Puffer

1xPBS

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

4,3 mM Na2HPO4

1,47 mM KH2PO4

pH 7,4-7,6

Ladungs Puffer für DNA Gel

10 mM Tris-HCl (pH 7,6)

0,15% Orange Green (Sigma O3756)

0,03% Xylencyanol FF (Sigma X4126)

60% Glycerol (Roth 7530.1)

60 mM EDTA pH 8,0

27

HeBS Puffer

280mM NaCl

1,5mM Na2HPO4

50mM Hepes (Sigma H-7006)

FACS Puffer

1xPBS

1%BSA

0,1%NaN3

28

6.2 Abkürzungsverzeichnis

7-AAD 7-Aminoactinomycin D

ACE Angiotensin Converting Enzyme

AngI Angiotensin I

AngII Angiotensin II

AngIII Angiotensin III

AngIV Angiotensin IV

As Aminosäure

AT1R Angiotensin Typ 1 Rezeptor

AT2R Angiotensin Typ 2 Rezeptor

DAG Diacylglycerol

DMEM Dulbecco`s modified Eagles medium

DNA Desoxyribonukleinsäure

EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FCS Fetales Kälber Serum

FL1 Fluoreszenz 1

FSC Forward Scatter

HEK293 Zellen Human Embryonic Kidney cells

Hepes 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)

ethansulfonsäure

I-κB Inhibitor von κB

IP3 Inositol-1,4,5-triphosphat

MCS Multiple Cloning Site

NF-κB Nukleärer Faktor κB

NF-κB-luc NF-κB Response-Element Luziferase

Reporter Gen Expressionsvektor

NO Stickstoffmonoxid

PBS Phosphate Buffer Saline

PLC Phospholipase C

P/S Penicillin/Streptomycin

RAS Renin-Angiotensin System

SSC Side Scatter

TAE Tris Acetat

Ethylendiamintetraessigsäure

TNFα Tumornekrosefaktor α

VSMC glatte Gefäßmuskelzellen

29

6.3 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Eigene Graphik


Abbildung 3: Schussek, S (2009): Evaluation of candidate peptides for the immunisation

against angiotensin II. Diplomarbeit, Universität Wien. S. 45


Abbildung 5: siehe oben













30

6.4 Protokolle

Online unter: http://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1815091a.pdf

(01.06.2010)

31

Online unter: http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/lipofectamine_man.pdf

(01.06.2010)

37

bachelorstudiengang molekulare biotechnologie … · in the present bachelor thesis a cellular...

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