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HCG ELISA

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AVANCEPublicación de contenido científico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario

HCG ELISAPara la determinación de Gonadotrofina CoriónicaHumana en orina, plasma o suero.Método ELISA visual.

GT Lab lleva desde hace varios años produciendo un kit para la detec-ción de gonadotrofina coriónica humana (hCG) basado en un enzimo inmuno ensayo (ELISA) directo.Desde su lanzamiento, el kit tuvo un rápido éxito por su excelente performance.No obstante, GT Lab está permanentemente revisando sus productos según su política de mejora permanente. En el caso de la tecnología ELISA, mucho ha evolucionado en lo referente a la preparación de los componentes de los reactivos que se emplean.Así, podemos señalar el fuerte desarrollo producido en la fabricación de materiales plásticos empleados en la preparación de la fase sólida (microcubetas), lográndose procesos productivos que hacen que los anticuerpos empleados en la sensibilización de las mismas queden adheridos con mucha más fuerza, lo que redunda en mejoras en la sensibilidad y estabilidad de los reactivos.Igualmente, se ha avanzado mucho en los métodos de purificación de proteínas, lo que ha redundado en anticuerpos y conjugados mucho más puros, en mejoras en la especificidad y, nuevamente, en su esta-bilidad.Igualmente, debemos señalar mejoras productivas en la preparación misma de los reactivos componentes del kit en cuanto a la obtención de insumos de mayor pureza y una evolución lógica de la tecnología de producción.Así se obtienen importantes resultados en la producción de reactivos; robustos, de alta calidad de resultados; y con una excelente constan-cia de lote a lote.

N° 8 Octubre 2012

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HCG ELISA

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INTRODUCCIÓNGonadotropina Coriónica Humana (hCG)

La hCG es una hormona glicoproteica producida en el emba-

razo, fabricada por el embrión en desarrollo poco después de

la concepción y más tarde por el sincitiotrofoblasto (parte de

la placenta). Su función es evitar la desintegración del cuerpo

lúteo del ovario y, por ende, mantener la producción de pro-

gesterona que es fundamental para el embarazo en los seres

humanos. (1,2,3)

La hCG puede tener funciones adicionales; por ejemplo, se

cree que afecta a la tolerancia inmunológica del embarazo.

Las pruebas de embarazo más precoces se basan en la detec-

ción de hCG. (1,2,3)

Debido a que la hCG es producida también por algunos tipos

de tumores, es un importante marcador tumoral, pero no se

sabe si esta producción es una causa o un efecto de la tumo-

rigénesis. (4,5).

Al igual que otras gonadotropinas, la hCG se puede extraer

de la orina de mujeres embarazadas, que es la fuente más

usual y abundante, o por recombinación genética. (6)

Estructura de la hCG

La hCG es una glicoproteína compuesta de 244 aminoáci-

dos, con un peso molecular de 36,7 kDa. Sus dimensiones

totales son de 75×35×30 angstroms (7,5×3,5×3 nanómetros).

(1,2,3). La Figura 1 ofrece una visión esquematizada de su

estructura.

Es heterodimérica, con una subunidad β (beta) que es espe-

cífica de la hCG, y con una subunidad α (alfa) idéntica a la de

la hormona luteinizante (LH), la hormona folículo-estimulante

(FSH), y la hormona estimulante del tiroides (TSH). La subuni-

dad α (alfa) tiene 92 aminoácidos de largo y unas dimensiones

de 60×25×15 angstroms (6×2,5×1,5 nm).

La subunidad β de la hCG contiene 145 aminoácidos y unas

dimensiones de 6,5×2,5×2 nm, codificados mediante seis ge-

nes muy homólogos que están dispuestos en tándem y en

pares invertidos en el cromosoma 19q 13.3 - CGB (1, 2, 3, 5

, 7, 8).

Las dos subunidades crean un pequeño núcleo hidrófobo ro-

deado por una gran superficie con una proporción área volu-

men 2,8 veces mayor que la de una esfera. La gran mayoría

de los aminoácidos exteriores son hidrófilos.

Funciones de la hCG

La hCG interactúa con el receptor LHCG y promueve el man-

tenimiento del cuerpo lúteo durante el comienzo del embara-

zo, haciendo que éste secrete la hormona progesterona. La

progesterona enriquece el útero con un grueso revestimiento

de vasos sanguíneos y capilares, de manera que pueda soste-

ner el crecimiento del feto. Debido a su alta carga negativa, la

hCG puede repeler las células inmunitarias de la madre, pro-

tegiendo al feto durante el primer trimestre. También se ha

formulado la hipótesis de que la hCG placentaria puede ser

un vínculo para el desarrollo de la inmunotolerancia maternal.

Por ejemplo, las células endometriales tratadas con hCG indu-

cen un aumento en la apoptosis de las células T. Estos resulta-

dos sugieren que la hCG puede ser un enlace en el desarrollo

de la tolerancia inmunológica peritrofoblástica, puediendo

facilitar la invasión del trofoblasto, un proceso que acelera el

desarrollo fetal en el endometrio. También se ha sugerido que

los niveles de hCG están vinculados con la gravedad de los

mareos matinales en mujeres embarazadas. (3)

Debido a su similitud con la hormona luteinizante (LH), la

hCG también puede usarse clínicamente para inducir la ovu-

lación en los ovarios, así como la producción de testosterona

en los testículos. (7,8)

La hCG también juega un papel en la diferenciación y prolife-

ración celular, y puede activar la apoptosis. (3)

Pruebas de Gonadotropina Coriónica Humana

Los niveles de hCG pueden medirse en la sangre o la orina. (9)

Con mayor frecuencia, se hace como una prueba de embara-

zo, destinada a indicar la presencia o ausencia de un embrión

implantado. También pueden hacerse pruebas de hCG para

el diagnóstico o seguimiento de células germinales y tumores

trofoblásticos.

La mayor parte de las pruebas emplean un anticuerpo mono-

clonal (MAb) específico de la subunidad β de la hCG (βhCG).

Este procedimiento se emplea para asegurar que las pruebas

no dan falsos positivos por interferencia de la LH y la FSH en

la determinación. Tanto la LH como la FSH están siempre pre-

sentes en diferentes niveles, mientras que la presencia de hCG

casi siempre indica el embarazo. (9)

Prueba en orina

La prueba de orina puede ser un inmunoanálisis de distinto

fundamento (aglutinación de látex, ELISA, cromatográfico,

etc.). Los umbrales de detección van de 20 a 100 mUI/ml (mili

unidades internacionales por mililitro), dependiendo del reac-

tivo y el método empleado.

La realización del test sobre la primera orina matinal cobra

mayor importancia cuanto más temprano es el embarazo a

detectar, ya que dicha micción es más concentrada. Cuando la

orina es más diluida, con gravedad específica inferior a 1.015,

la concentración de hCG puede resultar fisiológicamente baja

quedar por debajo de la sensibilidad del método, dando even-

tuales falsos negativos.

Prueba de suero

La prueba en suero o plasma es típicamente un inmunoa-

nálisis quimioluminiscente, ELISA o fluorimétrico, que puede

detectar niveles de βhCG tan bajos como 5 mUI/ml y permite

la cuantificación de la concentración de βhCG.

La determinación cuantitativa de βhCG es útil en el segui-

miento de células germinales y tumores trofoblásticos, el se-

guimiento después del aborto involuntario, y el diagnóstico y

seguimiento después de tratar un embarazo ectópico. La au-

sencia de un feto visible en la vagina por ultrasonido después

de que la βhCG haya alcanzado niveles de 1500 UI/ml es muy

indicativo de un embarazo ectópico.

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Una enfermedad trofoblástica gestacional, como las molas

hidatidiformes (“embarazo molar”), o el coriocarcinoma, pue-

den producir altos niveles de βhCG (debido a la presencia de

sincitioltrofoblastos, parte de las vellosidades que componen

la placenta), a pesar de la ausencia de un embrión.

Los altos niveles de hCG también son un componente del

triple test, una prueba de detección para determinadas anor-

malidades cromosómicas fetales y defectos de nacimiento.

En todos estos casos, un ensayo cualitativo por un método

sensible y confiable como el ELISA, permite tener un dato

preliminar, a menudo suficiente para el diagnóstico, antes de

recurrir a métodos más costosos como la cuantificación.

Concentraciones usuales de hCGLa Tabla I indica los niveles de hCG típicamente encontrados

en suero para una población normal. Cada mujer puede te-

ner valores que escapen de estos rangos. La Tabla I indica los

niveles de hCG típicamente encontrados en suero para una

población normal. Cada mujer puede tener valores que esca-

pen de estos rangos.

Aplicaciones de la determinación de hCGEn general excede la necesidad de determinar su presencia

en relación al embarazo.

Efectivamente, existen varias situaciones vinculadas a dife-

rentes patologías y tratamientos donde la determinación de

hCG adquiere importancia.

- como marcador tumoral

La subunidad β de la gonadotropina coriónica humana tam-

bién es secretada por algunos tipos de cáncer como el corio-

carcinoma, los tumores de células germinales, la formación de

mola hidatidiforme, el teratoma con elementos de coriocarci-

noma (es raro), y los islotes de células tumorales. Por esta ra-

zón, un resultado positivo en hombres puede ser una prueba

de cáncer. El rango normal para los hombres es de 0-5 UI/ml,

aunque no debería sospecharse que hay cáncer si el nivel es

menor de 30 UI/ml. (4,5)

- en tratamientos de fertilidad

La hCG se utiliza ampliamente como medicación parenteral

en tratamientos de fertilidad en lugar de la hormona luteini-

zante. En presencia de uno o más folículos ováricos maduros,

la ovulación puede ser activada mediante la administración de

hCG. Como la ovulación ocurrirá unas 36-48 horas después

de la inyección de hCG, se pueden programar procedimientos

para tomar ventaja de esta secuencia temporal. Por lo tanto,

las pacientes que siguen una fertilización in vitro, en general,

reciben hCG para desencadenar la ovulación, pero tienen sus

óvulos recuperados en unas 36 horas después de la inyección

(unas pocas horas antes de lo que los óvulos serían liberados

normalmente en el ovario). (7,8)

La administración de hCG también se utiliza, en determina-

das circunstancias, para aumentar la producción de proges-

terona. (10)

En el varón, las inyecciones de hCG se utilizan para estimular

las células de Leydig que sintetizan la testosterona. La testos-

terona intratesticular es necesaria para la espermatogénesis

en las células de Sertoli. Los usos típicos de la hCG en los

hombres son el hipogonadismo y los tratamientos de fertili-

dad. (11,12)

Durante los primeros meses de embarazo, la transmisión del

VIH-1 de la mujer al feto es extremadamente rara. Se ha su-

gerido que esto se debe a la alta concentración de hCG, y

que la subunidad beta de esta proteína es activa contra el

VIH-1. (13)

- para la pérdida de peso

Un uso polémico de la hCG es como complemento de una

dieta ultra-baja en calorías desarrollada por el endocrinólogo

británico ATW Simeons (14). Esta técnica permitiría perder

grasa con una dieta muy baja en calorías sin perder tejido

muscular, combatiendo así la obesidad. Sin embargo, el uso

de la hCG para perder peso se considera ineficiente e insegu-

ro por la comunidad científica. (15,16,17)

- en combinación con esteroides anabolizantes

En el mundo de las drogas que aumentan el rendimiento de-

portivo, la hCG se utiliza cada vez más en combinación con

varios ciclos de esteroides anabólizantes androgénicos (EAA).

En los hombres, la hCG imita a la hormona luteinizante y

ayuda a restaurar y mantener la producción de testosterona

en los testículos. Debido a esto, la hCG se utiliza comúnmente

durante y después de los ciclos de esteroides para mantener y

restaurar el tamaño testicular, así como la producción de tes-

tosterona endógena. Sin embargo, si la hCG se utiliza durante

demasiado tiempo y en una dosis demasiado alta (con el con-

siguiente aumento de la testosterona natural), eventualmente

inhibirá su propia producción a través de retroalimentación

negativa sobre el hipotálamo y la hipófisis. (18)

Principio del ensayo

Se trata de un ensayo ELISA que emplea anticuerpos mo-

noclonales y policlonales específicos para subunidad βhCG,

permitiendo una determinación específica, rápida y sensible.

La hCG eventualmente presente en la muestra es capturada

por anticuerpos policlonales adsorbidos en la superficie inter-

na de los pocillos de una micro policubeta. Estas moléculas

de hCG así retenidas, reaccionan simultáneamente con un

anticuerpo monoclonal anti-beta hCG conjugado con peroxi-

dada, reteniendo así una actividad enzimática proporcional a

la cantidad de hormona presente.

Tras lavar el exceso de muestra y conjugado, se podrá revelar

la activad de peroxidasa retenida en el pocillo mediante la

acción de la tetrametilbenzidina. La aparición de un color ce-

leste a azul será indicador de una reacción positiva.

Composición de los Reactivos Provistos

Los reactivos son provistos listos para usar.

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Pocillos sensibilizados: 48 pocillos separables individual-

mente con anticuerpo policlonal anti-hCG adsorbidos en su

superficie.

Enzima-Conjugado: un frasco gotero con 2.5 ml de anti-

cuerpo monoclonal anti-βhCG conjugado con peroxidasa. El

reactivo posee un colorante rosado en su composición para

facilitar la visualización de su agregado en cada pocillo.

Reactivo A: un frasco gotero conteniendo 4 ml de solución

de peróxido de hidrógeno.

Reactivo B: un frasco gotero conteniendo 4 ml de solución

de tetrametilbenzidina en buffer fosfatos-citrato 50 mmol/l,

pH = 5.0

Control Negativo: un frasco gotero conteniendo 1 ml de

una solución proteica de, aproximadamente, 25 mUI/ml hCG

Control Positivo: un frasco gotero conteniendo 1 ml de una

solución proteica de reaccón negativa para hCG

Solución lavadora: 2 frascos goteros conteniendo, cada uno,

60 ml de solución salina tamponada a pH = 7.4

Accesorios:

Un soporte para los pocillos.

Conservación y estabilidad Conserve los reactivos refrigerados (2-8ºC) sin congelar. La

estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la

caja.

Precauciones y advertencias sobre su usoLos reactivos son para uso IN VITRO exclusivamente.

Mantenga los Pocillos Sensibilizados protegidos de la hume-

dad. No exponga los reactivos a la luz directa. No introduzca

pipetas o tips en los reactivos.

Debe tenerse especial cuidado en no intercambiar las tapas

de los frascos, que están identificadas con un código de color.

La caja y los envases contenidos en este producto no deben

ser reusados, debiendo descartarse como residuos peligrosos

una vez empleados, de acuerdo a la legislación vigente. El

personal que manipula los mismos debe ser debidamente ca-

pacitado para su manejo y descarte por la institución o labo-

ratorio que lo emplea.

REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOSNo son requeridos.

REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOSSuero, plasma u orina

Suero/plasma:

Obtenga de la manera usual, libre de hemólisis. En caso de

usar plasma, recoja con EDTA o heparina como anticoagu-

lante.

Separe el paquete globular por centrifugación dentro de los

30 minutos de obtenida la muestra.

Orina:

Es conveniente emplear la primera orina de la mañana, la

que al ser más concentrada provee mayor sensibilidad a la

determinación. Recoja en recipiente limpio, seco y sin conser-

vadores. La muestra a analizar debe ser límpida; centrifugue

antes de ensayar si fuera necesario.

Condiciones de conservación de las muestras.

Las muestras deben ser preferentemente frescas.

Suero/Plasma: 24 horas en refrigerador (2-8ºC) o 30 días con-

gelada (-20ºC).

Orina: 48 horas en refrigerador (2-8ºC).

Sustancias interferentes

Hemólisis y bilirrubinemia moderadas, no interfieren. La he-

moglobina, glucosa, acetaminofeno, ácido acetilsalicílico, áci-

do ascórbico, atropina, cafeína, ácido gentísico y otras drogas

en elevadas concentraciones pueden provocar falsos positivos

o falsos negativos, por lo que siempre es importante conocer

si el paciente está recibiendo alguna medicación. Nunca se

debe dejar de tomar un medicamento sin hablar primero con

el médico.

Manipulación y descarte

Las muestras de pacientes deben manipularse considerándo-

las potencialmente infecciosas, al igual que el material descar-

table y los utilizados en el ensayo, que hayan estado en con-

tacto con las mismas, incluido el papel absorbente. El descarte

debe hacerse de acuerdo a las buenas prácticas de laboratorio

y a las regulaciones locales.

Un procedimiento sugerido para descartarlos es el autoclava-

do a 121ºC durante una hora y el tratamiento de los líquidos

residuales con hipoclorito de sodio durante una hora a una

concentración final del 5%.

ENSAYO: Antes de proceder a la ejecución del ensayo, tanto los reacti-

vos como las muestras deben ser llevados a una temperatura

ambiente no inferior a los 20ºC. Homogeneice antes de usar.

Procedimiento de análisis:

Coloque en el soporte la cantidad de pocillos necesarios para

los Controles y las muestras a ensayar.

Pocillos sensibilizados 1 2 3

Control Negativo 1 gota ----- ----

Control Positivo ---- 1 gota ----

Muestra ---- ---- 1 gota

Enzima-Conjugado 1 gota 1 gota 1 gota

Mezcle por movimientos laterales del pocillo.

Incube a temperatura ambiente NO INFERIOR a 20ºC

Elimine el contenido de los pocillos por inversión y sacudiendo enérgicamente para favorecer el vaciado. Lave 5 veces con la Solución Lavadora provista. Escurra el contenido remanente en los pocillos sobre papel absorbente.

Reactivo A 1 gota 1 gota 1 gota

Reactivo B 1 gota 1 gota 1 gota

Mezcle por movimientos laterales del pocillo. Mantenga a temperatura ambiente NO INFERIOR a 20ºC.

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(*) Para evitar contaminaciones cruzadas entre pocillos, es

conveniente colocarlos separados entre sí en el soporte. El

agregado de la Solución Lavadora debe hacerse gota a gota

SIN QUE REBALSE su contenido para evitar contaminación

cruzada.

Para lograr un total escurrimiento del líquido de lavado, gol-

pee varias veces el pocillo invertido sobre el papel absorbente.

TIEMPOS DE LECTURA DE RESULTADOSCompare el color desarrollado por las muestras con los de los

Controles entre los 2 y los 5 minutos después del agregado

del Reactivo B.

INTERPRETACION DE RESULTADOS

CONTROL DE CALIDADSe recomienda procesar juntamente con las muestras a ensa-

yar, muestras positivas y negativas conocidas para controlar el

desempeño del ensayo.

Cada Laboratorio debe diseñar su propio sistema de Control

de Calidad Interno y establecer las medidas correctivas si se

superan los límites de tolerancia aceptables.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMENTOPara concentraciones elevadas de hCG, la intensidad del co-

lor desarrollado no es directamente proporcional a la concen-

tración hormonal.

NOTA

Si tras lo 5 minutos de incubación se desarrollara un tenue

color celeste, cuya intensidad fuera menor a la del Control

Positivo, esto podría deberse a:

- Lavado defectuoso.

- Baja concentración de hCG en la muestra

- Presencia de sustancias interferentes

Se sugiere repetir el ensayo y, si el resultado se repite habien-

do presunción de embarazo, repita la determinación sobre

una nueva muestra obtenida tras 72 horas.

PRESENTACIONCódigo 380048: 48 determinaciones

EVALUACION DE DESEMPEÑO

a- Comparación con otros métodos:

En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones

de muestras contra métodos

comerciales aprobados por ANMAT y tomados como referen-

cia: un método colorimétrico importado de igual fundamento

técnico y un método instrumental por ión selectivo. Los resul-

tados se muestran seguidamente y en los Graficos 1 y 2.

GT Elisa (1) Aglutinación Directa (2) Teórico (quimioluminiscencia)

NegNegNegNegNegNegNegNegNeg

±+

++++++++

++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

NegNegNegNegNegNegNegNegNegNegNegNeg

±++

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++

Neg (<5)Neg (<5)Neg (<5)Neg (<5)Neg (<5)Neg (<5)Neg (<5)Neg (<5)

152550125250300500

10001500200040008500

170001700001.7x1063.4x106

(1) Las cruces indican intensidad del color desarrollado, con-

siderando el máximo como ++++.

(2) Las cruces indican intensidad de aglutinación observada,

considerando el máximo como ++++.

b- Sensibilidad:

La sensibilidad es de aproximadamente 25 mUI/ml.

c- Especificidad:

No se han observa do reacciones cruzadas con otras hormo-

nas, tales como FSH, TSH y

d- Reproducibilidad:

Tratándose de una determinación visual cualitativa, la repro-

ducibilidad solamente puede evaluarse por comparación de

observaciones efectuadas por un mismo operario y entre dis-

tintos operarios. No se observaron diferencias de criterio en

ninguno de ambos casos, tanto al observar resultados dentro

de una misma corrida como entre diferentes corridas.

SUSTANCIAS DE REFERENCIAEn la calibración del método se ha empleado el 2do Estándar

Internacional IRP WHO 75/537

Figura 1

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HCG ELISA

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Tabla I

Casos Concentración hCG

Mujeres no embarazadas

Mujeres embarazadas (después último período menstrual)

3 semanas4 semanas5 semanas6 semanas

7-8 semanas9-12 semanas

13-16 semanas17-24 semanas25-40 semanas

Mujeres postmenopáusicas

<5.0 mUI/ml

5-50 mUI/ml5-426 mUI/ml18-7340 mIU/ml1080- 56500 mUI/ml7650-229000 mIU/ml25700-288000 mUI/ml13300-254000 mUI/ml4060-165400 mUI/ml3640-117000 mUI/ml

<9.5 mUI/ml

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