avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da luffa operculata
TRANSCRIPT
RODOLFO ALEXANDER SCALIA
Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da Luffa operculata em
Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus
aureus
São Paulo
2014
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de
São Paulo, para obtenção do título de Doutor em
Pesquisa em Cirurgia.
RODOLFO ALEXANDER SCALIA
Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da Luffa operculata em
Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus
aureus
São Paulo
2014
(Corrigida)
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de
São Paulo para obtenção do título de Doutor em
Pesquisa em Cirurgia.
Área de concentração: Reparação Tecidual
Orientador: Prof. Dr. José Eduardo Lutaif Dolci
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Scalia, Rodolfo Alexander
Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da Luffa operculata
em Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae e
Staphyllococcus aureus./ Rodolfo Alexander Scalia. São Paulo, 2014.
Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Pesquisa em
Cirurgia.
Área de Concentração: Reparação Tecidual
Orientador: José Eduardo Lutaif Dolci
1. Luffa operculata 2. Sinusite 3. Produtos com ação
antimicrobiana 4. Medicamentos fitoterápicos
BC-FCMSCSP/37-14
À minha esposa Érica, pelo amor e apoio
incondicionais.
Aos meus pais e irmãos, pela dedicação e
incentivo à minha formação.
Aos meus avós, pela presença e cumplicidade.
Aos meus amigos, por compreenderem minha
ausência no período de realização deste
projeto.
“O que quer você faça em sua vida será
insignificante, mas é muito importante que
o faça, pois ninguém mais o fará!”
(Mahatma Gandhi)
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e à Irmandade da
Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, por permitir meu aprimoramento contínuo
na vida acadêmica;
Ao Prof. Dr. José Eduardo Lutaif Dolci, Professor Titular do Departamento de
Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo, pela orientação neste trabalho e em todos os momentos da minha vida
acadêmica, participativo não só como um mestre, mas como um pai, um amigo, um
mentor;
Ao Prof. Dr. Leonardo da Silva, Professor Assistente do Departamento de
Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo, por sua contribuição para a realização deste estudo;
À Prof. Dra. Suely Mitoi Ykko Ueda, Professora Assistente da Disciplina de
Microbiologia, do Departamento de Ciência Patológicas da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo, por participar intensamente de todas as
etapas de elaboração e execução deste trabalho;
À Prof. Dra. Lícia Mimica, Professora Adjunto do Departamento de Ciências
Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, por
permitir o uso do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo para a realização deste trabalho;
À Sra. Suzethe Matiko Sassagawa, biotécnica do Departamento de Ciências
Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, sem a
qual seria impossível a realização desta pesquisa;
A todos os funcionários do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo, pelo empenho na realização deste estudo;
A todos os funcionários, residentes e especializandos do Departamento de
Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo, pela contribuição na realização deste trabalho;
Ao Prof. Dr. Edson Ibrahim Mitre, Professor Assistente do Departamento de
Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo, pela leitura do manuscrito e pelas opiniões agregadas ao formato final da
tese;
Ao Prof. Dr. Alessandro Murano Ferré Fernandes, Professor Instrutor do
Departamento de Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo, pela leitura do manuscrito e pelas opiniões agregadas ao
formato final da tese;
Ao Prof. Dr. Paulo Roberto Lazarini, Professor Adjunto do Departamento de
Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo, pelo estímulo constante a minha formação acadêmica, pela leitura do
manuscrito e pelas opiniões agregadas ao formato final da tese;
A Prof. Dra. Eulalia Sakano, Professora Colaboradora da Faculdade de Ciências
Médicas e Médica Otorrinolaringologista contratada pelo Hospital de Clínicas da
Universidade Estadual de Campinas, pela leitura do manuscrito e pelas opiniões
agregadas ao formato final da tese;
À Prof. Dra. Mônica Aidar Menon Miyake, pela enorme contribuição, paciência e
entusiasmo para este estudo;
Ao Prof. Dra. Melissa Ferreira Vianna, amiga e parceira de tantos anos, pela leitura
do manuscrito e pelas opiniões agregadas ao formato final da tese;
Ao Prof. Dr. Eduardo Makoto Kosugi, Professor Assistente do Departamento de
Otorrinolaringologia da Universidade Federal de São Paulo, pela leitura do
manuscrito e pelas opiniões agregadas ao formato final da tese;
Ao Prof. Dr. Marco Antônio dos Anjos Corvo, Médico Instrutor do Departamento de
Otorrinolaringologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo, pela amizade incontestável, pela leitura do manuscrito e pelas opiniões
agregadas ao formato final da tese;
Ao Sr. Daniel Gomes, analista de secretaria do Curso de Pós-Graduação da
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, pelo prestativo auxílio
em todas as questões que envolveram o programa;
À Sra. Erika Tiemi Fukunaga, estatística instrutora da Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo, pela contribuição na análise estatística deste
estudo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela
contribuição à pesquisa, por meio de bolsa de estudos.
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC: American Type Culture Collection
cm: centímetro
CBM: concentração bactericida mínima
CIM: concentração inibitória mínima
DL50: dose letal para 50% dos animais testados
FCMSCSP: Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo
Fig.: Figura
°C: graus Celsius
ISCMSP: Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo
mL: mililitro
mm: milímetro
mg/L: miligrama por litro
mg/Kg: miligrama por quilograma
p: probabilidade
Quad.: Quadro
Tab.: Tabela
TSB: Trypic Soy Bean
UFC/mL: Unidades Formadoras de Colônia por mililitro
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................1
1.1. Revisão da literatura ................................................................................. 5
1.2. Luffa operculata ........................................................................................ 5
1.2.1. Considerações gerais ........................................................................... 5
1.2.2. Aplicações e formas de utilização ......................................................... 7
1.2.3. Considerações fitoquímicas, toxicológicas e farmacológicas ............... 9
1.2.4. Considerações sobre a atividade antimicrobiana da Luffa operculata 13
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 15
2.1. Objetivos gerais ..................................................................................... 15
2.2. Objetivos específicos ............................................................................. 15
3. MATERIAL E MÉTODO ...................................................................................... 16
3.1. Comitê de Ética ..................................................................................... 16
3.2. Obtenção do extrato .............................................................................. 16
3.3. Obtenção e escolha dos microorganismos ............................................ 17
3.4. Preparo dos inóculos bacterianos......................................................... 19
3.5. Obtenção das concentrações de Luffa operculata ................................ 20
3.6. Controles ............................................................................................... 22
3.7. Critérios de análise ................................................................................ 24
3.8. Análise estatística ................................................................................. 26
4. RESULTADOS .................................................................................................... 27
4.1. Controles ............................................................................................... 27
4.2. Microrganismos …………………………………………………………...... 27
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 31
5.1. Escolha do extrato ............................................................................... 31
5.2. Concentrações utilizadas .................................................................... 32
5.3. Agentes bacterianos ............................................................................. 33
5.4. Uso popular .......................................................................................... 35
5.5. Limitações do estudo ........................................................................... 36
5.6. Considerações para o futuro ................................................................ 38
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 40
7. REFERÊNCIAS .................................................................................................. 41
FONTES CONSULTADAS .................................................................................... 44
RESUMO ............................................................................................................... 45
ABSTRACT ............................................................................................................ 46
APÊNDICES .......................................................................................................... 47
1. INTRODUÇÃO
As rinossinusites caracterizam-se pela inflamação do revestimento mucoso da
cavidade nasal e dos seios paranasais. O termo rinossinusite tem sido utilizado em
substituição à sinusite, pois raramente acontece um processo inflamatório dos seios
paranasais, sem que exista, concomitantemente, um comprometimento da mucosa do
nariz(1).
As rinossinusites agudas podem surgir em consequência de quadros virais,
bacterianos ou fúngicos e estar associadas a quadros alérgicos, polipose
nasossinusal e disfunção vasomotora da mucosa(2). A prevalência das rinossinusites,
tanto na população adulta, quanto na pediátrica é elevada(2).
As rinossinusites virais são uma das causas mais comuns pelas quais
crianças e adultos buscam atendimento médico. Estima-se que a população adulta
apresente de dois a cinco episódios por ano, enquanto crianças na fase escolar
possam apresentar de sete a dez episódios no mesmo período(3,4). Acredita-se que
desses quadros virais, de 0,5% a 10% possam evoluir para quadros de rinossinusite
bacteriana(2).
A suspeita de uma superinfecção bacteriana deve ser considerada quando
sintomas virais como obstrução nasal, congestão facial, rinorréia, entre outros,
perdurarem por mais de dez dias ou quando houver a piora dos sintomas referidos,
após cinco dias do início do quadro(2,3).
Dados recentes denotam que a prevalência de rinossinusite crônica no
município de São Paulo seja de aproximadamente 5,51%, ou seja, com uma
população urbana de mais de 11 milhões de habitantes, mais de 500 mil indivíduos
são acometidos, ao ano, por rinossinusite nesta cidade(5).
2
Estima-se que, anualmente, as rinossinusites acometam um em cada sete
adultos nos Estados Unidos, resultando em cerca de 31 milhões de indivíduos
diagnosticados a cada ano(6).
O impacto dos quadros de rinossinusites na saúde pública pode ser aferido
pelo número de prescrições antibióticas realizadas para seu tratamento. Uma a cada
cinco prescrições de antibióticos para adultos nos Estados Unidos é destinada ao
tratamento de rinossinusites, o que as torna a quinta maior causa de prescrição de
antibióticos nesse país, gerando gasto anual de cerca de 5,8 bilhões de dólares(7,8).
A ampla utilização de antibióticos nos quadros de rinossinusite bacteriana,
além da erradicação do agente agressor, visa restabelecer a função normal da
mucosa nasal, assim como dos seios paranasais, abreviando a duração dos
sintomas e prevenindo complicações locais e intracranianas(7).
Os agentes etiológicos mais prevalentes das rinossinusites bacterianas são
o Streptococcus pneumoniae e o Haemophilus influenzae, responsáveis por cerca
de 70% das infecções. A Moraxella catarrhalis, o Staphylococcus aureus e o
Streptococcus beta hemolítico são menos frequentes(9,10).
Em uma revisão de artigos em que foram realizadas punção e aspiração de
seios maxilares de indivíduos adultos com rinossinusite, foram identificados nas
culturas: Streptococcus pneumoniae em 20 a 43% destas aspirações, Haemophilus
influenzae em 22 a 35% e Moraxella catarrhalis em 2 a 10%(11). Outras bactérias
encontradas foram Staphylococcus aureus e bactérias anaeróbias, mais comuns nos
quadros de rinossinusite crônica(12-14).
Apesar de amplamente utilizados, os antibióticos não são a única opção
terapêutica para as rinossinusites(2). Tratamentos adjuvantes devem ser utilizados,
de acordo com os sintomas, necessidades e limitações de cada paciente.
3
De forma geral, lavagens nasais com soluções salinas, corticosteroides
tópicos e sistêmicos, anti-histamínicos, descongestionantes nasais, mucolíticos,
dentre outros, também podem ser utilizados(2,3,7,15).
Uma das opções terapêuticas empregadas pela população, para o tratamento
das rinossinusites é a fitoterapia. Tradicionalmente utilizada pela população rural
carente, especialmente no Norte, Nordeste e Centro-Oeste do Brasil, a fitoterapia
vêm sendo cada vez mais utilizada nos centros urbanos de todo o país, por
pacientes dos mais variados níveis socioeconômicos e culturais(15).
Os fitomedicamentos são extratos padronizados, industrializados em
condições adequadas de higiene, com controle rigoroso de qualidade, produzidos a
partir de princípios ativos vegetais purificados e que possuem em sua composição
apenas matérias-primas vegetais(2). Medicamentos que incluam princípios ativos
isolados, mesmo que de origem vegetal, não são considerados fitoterápicos,
segundo a Resolução de Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (RDC N°14 de 2010)(16).
Um dos principais motivos pelos quais a população tem grande aceitação dos
medicamentos fitoterápicos é acreditar que, por serem extraídos de plantas naturais
não apresentam qualquer tipo de efeito colateral(17). Porém, o fato de muitos
produtos não terem origem conhecida, nem controles rigorosos de produção e
armazenamento, ou qualquer padronização de extrato ou dose, podem levar a
interações medicamentosas, além de riscos de intoxicação e morte(2,15,17,18).
Dentre os fitoterápicos utilizados informalmente para o tratamento das rinites
e rinossinusites, a Luffa operculata, conhecida como “cabacinha” ou “buchinha-do-
norte” é provavelmente a mais utilizada(18,19). Sua ocorrência se dá por extensos
territórios da América do Sul, especialmente no Brasil, onde é muito comum nos
4
estados do Amazonas, Ceará, Pernambuco, Bahia, Mato Grosso, Minas Gerais e
São Paulo(20). Apesar do seu emprego disseminado por grande parte da população
dos centros rurais e urbanos de nosso país para o tratamento de rinossinusites, o
uso da Luffa operculata não é recomendado pelas diretrizes Brasileiras, Americanas
ou Europeias de Rinossinusites(2-4,21,22).
Um estudo experimental, realizado para avaliar a ação da Luffa operculata
sobre a superfície da mucosa nasal de coelhos, mostrou alterações superficiais no
epitélio da mucosa nasal nas concentrações de 0,5% e 1% de extrato de Luffa
operculata, sem alterações ultra-estruturais do epitélio, o que sugere que este
poderia regenerar-se(23).
Em outro estudo experimental, que avaliou a ação da Luffa operculata sobre o
epitélio e a atividade mucociliar de palato de rã, observou-se efeitos mais deletérios
do epitélio, com alterações ultra-estruturais e ruptura das zônulas de adesão, o que
acarretou em anormalidades no transporte de fluidos e no transporte iônico. Nesse
estudo, as doses utilizadas foram de 60 mg/L, 600 mg/L e 1200 mg/L de Luffa
operculata, e as lesões encontradas foram dose-dependentes, ou seja, quanto maior
a concentração da infusão, maior seu efeito deletério da mucosa(15).
Em recente revisão sistemática sobre a eficácia da Luffa operculata no
tratamento clínico das rinossinusites, concluiu-se que faltam dados científicos sobre
o tema e que os dados disponíveis atualmente ainda são muito controversos(24).
Desta forma, tornam-se necessários novos estudos, criteriosos e confiáveis para que
a Luffa operculata possa ser utilizada com segurança e eficiência no tratamento das
doenças nasossinusais(24,25).
5
1.1 . Revisão da literatura
1.2. Luffa operculata
1.2.1. Considerações gerais
A Luffa operculata é uma planta angiosperma e dicotiledônea, encontrada em
grande parte do Brasil. Trepadeira pertencente à família das cucurbitáceas
(Cucurbitaceae), apresenta caule herbáceo e delgado podendo medir até dez metros
de comprimento. Sua forma é pentagonal e ramificada, com gavinhas compridas e
vilosas dispostas opostamente às folhas e ramos. Suas folhas são simples,
reticulinérveas e com pecíolo alongado. Apresentam-se dispostas alternadamente e
sua tonalidade é mais escura na face superior, quando comparada à inferior. Suas
flores são pequenas, amarelo-pálidas e compostas por cinco pétalas, unidas entre si
na extremidade proximal (Fig. 1). Seus frutos são ovoides, pedunculados e de
superfície rugosa. Apresentam de cinco a seis centímetros de comprimento, por três
a quatro centímetros de largura. Quando secos, apresentam coloração amarelo-
claro a castanho, percorridos externamente por estrias longitudinais (Fig. 2). Seu
interior apresenta mesocarpo fibroso, que se dispõe em um emaranhado frouxo,
contendo sementes achatadas de superfície levemente rugosa e coloração
castanho-escura(21,24-28).
A Luffa operculata pode ser encontrada por toda América Latina. Sua
ocorrência se dá em grande parte no Equador, Guatemala, Colômbia e Brasil. Em
nosso país, cresce em grandes extensões das regiões Norte e Nordeste, como nos
estados do Amazonas, Ceará, Pernambuco e Bahia, estendendo-se até os estados
do Mato Grosso, Minas Gerais e São Paulo(21,25,26,28).
6
Fonte: http://www.flickr.com/photos/stationalpinejosephfourier/7885155990/
FIGURA 1. Imagem mostrando caule, folhas, flores e frutos da Luffa operculata
Fonte: http://www.reocities.com/luizmeira/fito.htm
FIGURA 2. Imagem mostrando fruto seco da Luffa operculata
7
Nos países da América Latina, apresenta os mais variados nomes: Cabacito,
Esponjuelo, Estropajo, Moroquiliti, Tzenayotli, Esponjilla, entre outros. No Brasil,
dentre os sinônimos mais citados estão: “Abobrinha do Norte”, “Bucha dos
caçadores”, “Bucha dos Paulistas”, “Buchinha”, “Cabacinho”, “Purga de João Pais” e
“Purga dos Paulistas”. Estas últimas denominações, certamente são por sua ação
purgativa, uma das mais importantes aplicações terapêuticas da Luffa
operculata(21,25,26,28). Dentre as sinonímias botânicas mais utilizadas para Luffa
operculata, a Momordica bucha, Momordica operculata, Momordica purganas,
Cucumis sepium, Poppya operculata, Luffa quiquefida e Elaterum quinquefidum,
provavelmente, são as mais citadas(28).
1.2.2. Aplicações e formas de utilização
A Luffa operculata apresenta uma série de propriedades terapêuticas
difundidas pela população Brasileira. Na clínica médica, podem ser utilizadas no
tratamento de febre, doenças herpéticas, icterícia, sífilis, tínea, ascites, entre outras.
Na ginecologia, para o tratamento de amenorreias e como abortivo. Na oftalmologia,
para o tratamento de oftalmias crônicas e na otorrinolaringologia, para o tratamento
de rinites, sinusites, laringites e hidropsia(21,24,26,27).
De todas as utilizações da Luffa operculata, talvez o efeito purgativo e sua
ação mucolítica no tratamento das sinusites, sejam os efeitos mais difundidos e
utilizados pela população(15,21).
Estudos recentes encontraram atividade antitumoral da Luffa operculata frente
a neoplasias malignas em tumor de tecido conjuntivo, sugerindo maiores
investigações em outros processos tumorais(29).
8
O uso da Luffa operculata é extremamente tradicional na cultura popular
Brasileira. Consta que sua primeira citação tenha ocorrido em meio ao século
passado, no Guia Médico Brasileiro de 1841 (Chenoviz)(28). Em 1888, ocorreu a
primeira tentativa de registro de seu uso sob a forma farmacêutica de pílulas, em
composição com a resina de Jalapa do Brasil. Na década de 50, foi registrado no
extinto Serviço Nacional de Fiscalização de Medicina e Farmácia o “Oper-sinus”,
fitoterápico derivado de extrato aquoso de Luffa operculata, utilizado na forma de
gotas nasais para o tratamento de rinossinusites crônicas(21,28).
Desde 1986, a Divisão Nacional de Vigilância Sanitária, que posteriormente
se tornou a atual Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), incluiu a Luffa
operculata no catálogo Brasileiro de Produtos Farmacêuticos(21).
Atualmente, no Brasil, existe um medicamento alopático autorizado pela
ANVISA para o tratamento de rinossinusites chamado Sinustrat Adulto Tradicional®.
Fabricado pelo laboratório Avert®, apresenta em sua composição Luffa operculata a
1%, cloreto de sódio e conservantes. O Sinustrat Solução Nasal® e o Sinustrat
Vasoconstritor® também são produzidos pelo mesmo laboratório, porém não
possuem Luffa operculata em sua composição(24,25,28,30).
Existem muitas apresentações, formulações e preparações para a Luffa
operculata, variando de acordo com a indicação e o local do país onde é
comercializada. Esse conhecimento é transmitido de geração a geração, por meio
da comunicação verbal entre os ervateiros, especialmente na região Nordeste do
Brasil(28).
De forma geral, suas flores, folhas, sementes e frutos podem ser usados nas
preparações das infusões da Luffa operculata, porém, sem dúvida, a parte mais
utilizada nessas preparações é o fruto seco da planta. A maneira como a infusão é
9
realizada depende do emprego que se dará a ela. Para efeitos purgativos, pode-se
preparar uma infusão de 6 gramas de fruto em 500 mililitros (mL) de água fervente e
tomar uma colher, de hora em hora, até que se alcance o efeito desejado. Também
é relatado o uso desse fitoterápico sob a forma de clister(21). Para o tratamento da
sinusite, o fruto é cortado em quatro partes, e destas, um quarto do fruto é colocado
em 500 mL de agua fervente, até que a infusão fique morna. Essa infusão pode ser
administrada através de aspiração nasal (5 a 10 mL) ou sob a forma de instilação
nasal, que é menos efetiva(15,21,26,28). O efeito esperado é a rinorréia profusa, às
vezes sanguinolenta, o alívio da obstrução nasal e a expulsão de pólipos(21,28).
1.2.3. Considerações fitoquímicas, toxicológicas e farmacológicas
A cromatografia em camada fina constitui-se o método de screnning da Luffa
operculata. Por meio da dissolução em clorofórmio é possível extrair seu composto
lipossolúvel por hidrólise enzimática da tintura da planta, formando assim, quatro
faixas diferentes. Duas dessas faixas correspondem às cucurbitacinas B e D, o que
pode ser usado para a identificação de soluções dessa planta(21).
A análise fitoquímica da Luffa operculata apresenta outros componentes,
além das cucurbitacinas B e D, que são encontradas em sua resina. Glicosídeos,
saponina, esteróis livres, ácidos orgânicos e fenóis também podem ser isolados. Na
resina, além das cucurbitacinas já descritas, podem ser encontradas a elaterina A e
a isocucurbitacina B(21,25,28).
Inicialmente, testes toxicológicos realizados em camundongos estimaram uma
DL50, ou seja, dose letal para 50% dos camundongos testados, de 5 mg/Kg de
cucurbitacinas B. Extrapolando esses valores para o homem, a dose tóxica da Luffa
operculata seria de 75 mg/Kg, o que corresponderia a 5 gramas de fruto seco ou 50
10
mL de tintura a 10%(21). Mais recentemente, estudos relataram DL50 em torno de 170
mg/Kg. Desta forma, aproximadamente 10 g de extrato de Luffa operculata seriam
capazes de matar um adulto com cerca de 70 Kg(31).
Dentre as propriedades farmacológicas da Luffa operculata, devemos
salientar seu efeito laxante ou purgativo, decorrente da ação das cucurbitacinas e de
seus glicosídeos sobre a mucosa intestinal. A ação detergente das saponinas
contribui para essa ação cáustica sobre a mucosa intestinal, através da
emulsificação dos compostos lipossolúveis, o que acarreta em evacuações fluidas e
copiosas(21,25,28).
Algumas hipóteses foram levantadas sobre os mecanismos de ação da Luffa
operculata para o tratamento das rinossinusites. Estudos iniciais pensavam existir
uma ação descongestionante da Luffa operculata sobre a mucosa nasal, que foram
mais tarde refutados por outros autores, que não encontraram ação anti-histamínica,
vasoconstritora ou anti-inflamatória(32-34).
Posteriormente, um estudo experimental avaliou a atividade antiviral de um
fitoterápico utilizado para quadros inflamatórios nasais, contendo Luffa operculata,
Euphorbium resinífera e Pulsatilla pratensis. Apesar de clara atividade antiviral
apresentada pela medicação, a Luffa operculata não apresentou atividade antiviral in
vitro sobre o vírus sincicial respiratório, o rinovírus humano, o vírus influenzae ou o
vírus herpes simples, o que foi atribuído aos outros componentes da medicação(34).
Dois estudos subsequentes foram de extrema importância para esclarecer
alguns efeitos da Luffa operculata sobre o epitélio de animais(15,23). O primeiro,
publicado em 2001, realizou aplicação de Luffa operculata em concentrações de
0,5% e 1% na cavidade nasal de sete coelhos, por 14 dias consecutivos. Após esse
período, foram observadas apenas alterações estruturais superficiais no epitélio da
11
mucosa nasal, o que não se estendeu até a lâmina basal, sugerindo que o mesmo
poderia regenerar-se, mesmo em concentrações mais elevadas(23). O segundo,
realizado em 2004, avaliou o efeito da infusão de diferentes concentrações de
extrato aquoso de Luffa operculata (60 mg/L, 600 mg/L, 1200 mg/L) sobre um
modelo experimental isolado de palato de rã, cujo epitélio é muito semelhante ao
das vias aéreas superiores dos mamíferos. Neste estudo, ao contrário do anterior,
observou-se alterações estruturais na lâmina basal que se mostraram dose-
dependentes, ou seja, quanto maior a concentração da solução de Luffa operculata,
maior o comprometimento e destruição das zônulas de adesão (tight junctions),
como o aumento dos espaços intercelulares e anormalidades no transporte iônico e
de fluidos(15).
Outro estudo testou a eficácia da solução tópica nasal de Luffa operculata a
1% comparada ao soro fisiológico, no tratamento de modelo experimental em
coelhos, nos quais foram induzidas rinossinusites bacterianas. Parâmetros
hematológicos, histológicos e cultura de secreções sinusais não demonstraram
diferença estatística entre a Luffa operculata e o soro fisiológico(25).
Alguns estudos clínicos também foram realizados para avaliar a ação da Luffa
operculata nas afecções nasossinusais.
Em 1989 foi realizado um estudo duplo-cego controlado e randomizado em
152 pacientes com rinossinusite. Utilizando como critério de avaliação a melhora dos
sintomas clínicos, foram testados e comparados três medicamentos homeopáticos
tópicos, dos quais dois continham Luffa operculata, e um, placebo. Não foram
encontradas diferenças entre os medicamentos avaliados, ou entre eles e o placebo.
Os resultados encontrados em relação à rinossinusite aguda e à rinossinusite
12
crônica foram semelhantes aos apresentados na literatura para antibióticos tópicos e
descongestionantes tópicos nasais(35).
Outro trabalho avaliou a eficácia da instilação de extrato aquoso de Luffa
operculata a 1% para o tratamento de 33 pacientes com rinossinusite aguda ou
rinossinusite crônica agudizada por 15 dias. Critérios clínicos e radiológicos
sugeriram melhora dos quadros nasossinusais sem efeitos adversos significantes, o
que levou os autores à conclusão de que o medicamento seria útil no tratamento das
rinossinusites agudas(30).
Em 1999, outro autor utilizou medicação tópica contendo Luffa operculata
para tratar 119 pacientes com rinossinusite aguda, por duas semanas, não
observando efeitos colaterais, sendo necessária a antibioticoterapia complementar
em apenas um paciente(36).
Para o tratamento de rinite alérgica sazonal foi realizado um estudo duplo-
cego, controlado e randomizado com 146 pacientes. Os critérios utilizados foram a
melhora clínica dos pacientes e a aplicação de questionários de qualidade de vida.
Foram comparados o cromoglicato de sódio tópico e outro medicamento contendo
Luffa operculata em sua composição. Os autores concluíram que ambas as
medicações levaram à melhora da qualidade de vida e dos sintomas clínicos, o que
sugere que ambas as formas de tratamentos apresentaram eficiência e
tolerabilidade semelhantes(37).
Em revisão sistemática de artigos sobre a Luffa operculata, seu mecanismo
de ação e sua eficácia terapêutica, publicados na literatura de 1966 a 2006, foram
encontrados cinco trabalhos experimentais e cinco trabalhos clínicos sobre a Luffa
operculata. Nenhum dos trabalhos descritos apresentava relevância, pertinência ou
adequação em relação aos temas propostos. Desta forma, o autor concluiu que
13
ainda há escassez de trabalhos criteriosos e confiáveis para a utilização deste
medicamento para o tratamento de rinossinusites, com eficácia e segurança
comprovadas(24).
1.2.4. Considerações sobre a atividade antimicrobiana da Luffa operculata
A Luffa operculata apresenta uma série de propriedades terapêuticas
difundidas pela população Brasileira. Apesar de diversos estudos buscarem
encontrar os mecanismos pelos quais a Luffa operculata apresenta tais
propriedades, não foram encontradas evidências de atividades anti-histamínicas,
vasoconstritoras, anti-inflamatórias ou antivirais desse fitoterápico(31-34). Alterações
estruturais sobre a mucosa respiratória foram descritas por meio de trabalhos
experimentais, porém, sem estabelecer com segurança a concentração e o modo
pelo qual a Luffa operculata possa ser utilizada(15,23).
Apesar de não encontrarmos referências sobre a atividade antimicrobiana da
Luffa operculata na literatura, em 2008 foi realizado um estudo sobre a atividade
biológica da Luffa operculata, em que foi pesquisada sua ação antifúngica e
antimicrobiana sobre diversas cepas de bactérias e fungos. Foram preparados
extratos alcoólicos de Luffa operculata em diferentes concentrações (12,5 mg/mL, 25
mg/mL, 50 mg/mL e 100 mg/mL) e avaliada sua ação in vitro contra diferentes
agentes. O extrato mostrou-se ativo na concentração de 100 mg/mL para
Staphylococcus aureus e 50 mg/mL para Staphylococcus epidermidis. Não foi
encontrada atividade antimicrobiana nas diferentes concentrações para
Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli. Apesar de encontrar uma promissora
atividade antimicrobiana da Luffa operculata, a autora sugere que novos estudos
14
sejam realizados, na tentativa de elucidar de forma mais ampla sua atuação frente a
diversos agentes patógenos, assim como estabelecer seus mecanismos de ação(29).
15
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos gerais
Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro da Luffa operculata em
Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus aureus.
2.2. Objetivos específicos
Avaliar o perfil de susceptibilidade de bactérias causadoras de infecções de
vias aéreas superiores (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e
Streptococcus pyogenes) à Luffa operculata.
16
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1. Ética
O estudo foi realizado no Laboratório da Disciplina de Microbiologia do
Departamento de Ciências Patológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa
Casa de São Paulo (FCMSCSP) e no Departamento de Otorrinolaringologia da
Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (ISCMSP), no período entre
2011 e 2013, após a aprovação dos Comitês Científicos dos respectivos
departamentos (Apêndices 1 e 2).
O Comitê de Ética e Pesquisa da FCMSCSP dispensou a avaliação do projeto
por não se tratar de estudo com seres humanos ou com animais de experimentação
(Apêndice 3).
3.2. Obtenção do extrato
Foi utilizado um frasco de 125 mL de extrato alcoólico de Luffa operculata da
empresa farmacêutica Schraiber®, com teor alcoólico de 65% e concentração de
10%. Lote número 5343, fabricado em 06/10/2010, com validade até 06/10/2015
(Fig. 3).
17
FIGURA 3. Extrato alcoólico de Luffa operculata
3.3. Obtenção e escolha dos microrganismos
Para a realização do ensaio microbiológico foram selecionados espécimes de
origem clínica, armazenados na bacterioteca do Laboratório de Microbiologia da
FCMSCSP, assim como cepas de origem American Type Culture Collection (ATCC).
As cepas ATCC são cepas padrão com perfil e suscetibilidade conhecidos, ou
seja, apresentam um número de série, que possibilitam saber, independentemente
de onde sejam avaliadas, sua resposta frente a antibióticos previamente testados,
garantindo assim, a reprodutibilidade do estudo.
Apesar das cepas ATCC apresentarem perfil conhecido, não é possível
avaliar a atividade antimicrobiana de um novo medicamento sem a presença de
cepas de origem clínica, pois, as cepas ATCC não representam as bactérias que
acometem as doenças no dia a dia. Cepas de origem clínica são necessárias, pois
apresentam perfis diferentes de suscetibilidade, o que garante maior fidelidade da
avaliação da ação antimicrobiana aos agentes de interesse.
18
De forma geral, as cepas ATCC podem ser divididas em sensíveis e
resistentes. As sensíveis, utilizadas neste estudo, apresentam sensibilidade aos
antibióticos utilizados na prática clínica, enquanto as resistentes não. As cepas
ATCC, conceitualmente, quando apresentam resistência a duas ou mais classes de
antimicrobianos que seriam originalmente sensíveis, são classificadas em
multirresistentes. De acordo com a finalidade do estudo, ambas podem ser utilizadas
para controle de qualidade técnica e laboratorial.
Apesar dos agentes etiológicos mais prevalentes das rinossinusites
bacterianas serem o Streptococcus pneumoniae, o Haemophilus influenzae e a
Moraxella catarrhalis, existem muitos fatores envolvidos na obtenção, cultura e
manutenção de cada agente bacteriano, que influenciaram na escolha dos agentes
do nosso estudo.
O Haemophilus influenzae e a Moraxella catarrhalis são bactérias fastidiosas,
apresentam crescimento lento e necessitam de meios especiais de cultura e de
nutrientes para o seu desenvolvimento. Tal fato, associado à questão de que maioria
dos pacientes cujas culturas encaminhadas para o laboratório apresentaram
tratamento antimicrobiano prévio à coleta do material, fez com que, no período da
criação de nossa bacterioteca (26 meses), poucas cepas de Moraxella catarrhalis e
Haemophilus influenzae fossem isoladas. Mesmo após seu isolamento, por
dificuldade na preservação, nenhuma delas permaneceu viável, impossibilitando o
uso em nossa pesquisa.
Por serem agentes prevalentes nas infecções de vias aéreas superiores,
bactérias menos exigentes, e consequentemente, não necessitarem de meios de
cultura especiais para manutenção de sua viabilidade e crescimento, foram
19
selecionadas cepas de Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e
Streptococcus pyogenes para o presente estudo.
A seleção das cepas se deu da seguinte forma:
1) Staphylococcus aureus (25 cepas)
- 1 amostra ATCC-25923 – cepa padrão, com perfil de susceptibilidade sensível e
conhecido.
- 24 amostras de origem clínica com perfil de susceptibilidade variável.
2) Streptococcus pneumoniae (25 cepas)
- 1 amostra ATCC-49619 – cepa padrão, com perfil de susceptibilidade sensível e
conhecido.
- 24 amostras de origem clínica com perfil de susceptibilidade variável.
3) Streptococcus pyogenes (25 cepas)
- 1 amostra ATCC-19615 – cepa padrão, com perfil de susceptibilidade sensível e
conhecido.
- 24 amostras de origem clínica com perfil de susceptibilidade variável.
3.4. Preparo dos inóculos bacterianos
Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, as cepas de
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae e Streptococcus pyogenes
foram transferidas para tubos de ensaio com 10 mL de caldo peptona de caseína de
soja, Tryptic Soy Bean (TSB), meio que permite a manutenção da viabilidade das
bactérias. As suspensões dos microrganismos foram padronizadas comparando-as
a 0,5 na escala de Mc Farland, correspondendo a aproximadamente 1,5 x 108
UFC/mL (Unidades Formadoras de Colônia por mililitro).
20
A escala de Mc Farland (Quad. 1) é uma escala nefelométrica de 11 tubos,
numerada de 0,5 a 10, cujo padrão de turvação é o mais frequentemente utilizado
nos laboratórios de microbiologia do Brasil e dos Estados Unidos, para determinar a
intensidade de multiplicação bacteriana em meios de cultivo líquidos. A multiplicação
bacteriana se opõe à passagem da luz, o que provoca a turvação e a opacificação
do meio. Quanto maior o número de bactérias presentes na amostra, maior será o
grau de turvação do meio de cultura. Recomendada pela Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI) nos Estados Unidos, a escala nefelométrica de Mc
Farland foi adotada e também recomendada pela ANVISA no Brasil(38). Com essa
regulamentação, é possível estabelecer um padrão, que pode ser aferido em
qualquer local de país, tornando a leitura de seus resultados correspondentes.
QUADRO 1. Escala nefelométrica de MC Farland, com número de bactérias estimado em cada tubo
Tubo n° 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N° aprox. bactérias
(X108)
1,5 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
3.5. Obtenção das concentrações de Luffa operculata
Para a obtenção das diferentes concentrações do extrato alcoólico de Luffa
operculata foi utilizado como meio de cultura e diluente o TSB, mesmo meio utilizado
no preparo dos inóculos bacterianos.
Foram feitas várias diluições para avaliar a eficácia da Luffa operculata nas
concentrações de 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 1% e 2%, a partir da concentração inicial
do extrato alcoólico a 10% (Tab. 1).
21
Tabela 1. Cálculo das diluições a partir da concentração inicial do extrato alcoólico de Luffa
operculata a 10%
Concentrações de
Luffa operculata
(%)
Luffa operculata 10% (mL) TSB (mL) Luffa operculata + TSB
(mL)
0,2 0,2 9,8 10
0,3 0,3 9,7 10
0,4 0,4 9,6 10
0,5 0,5 9,5 10
1 1 9 10
2 2 8 10
Legenda: TSB = Tryptic Soy Bean
Para obter essas diluições foi utilizada uma pipeta milimetrada, que permitiu
coletas precisas do extrato alcoólico de Luffa operculata a 10%, com conteúdo
mínimo de 0,1 mL, e tubos de ensaio estéreis e secos, com capacidade para 10 mL
de solução. Foram preparados diversos tubos com 8 mL, nas diferentes
concentrações, que foram utilizados de acordo com a necessidade, sem que fosse
preciso mantê-los armazenados. Um novo tubo contendo Luffa operculata e TSB,
nas diferentes concentrações, foi preparado somente após o término do tubo
anterior, visando assim, evitar qualquer tipo de contaminação decorrente de seu
armazenamento.
Após essa diluição, foi colocado 1 mL do extrato alcoólico nas diferentes
concentrações, em diferentes tubos secos e estéreis de 10 cm X 1,5 cm. Nesses
tubos, foi acrescido 1 mL de caldo de bactérias à concentração de 0,5 Mc Farland,
correspondendo a aproximadamente 1,5 x 108 UFC/mL.
22
Todos os testes de turvação, semeaduras de 24 e 48 horas e controles foram
realizados em duplicata para todas as concentrações, para descartar qualquer tipo
de contaminação da amostra.
3.6. Controles
Para evitar viés na interpretação dos dados, foram realizados três controles
das amostras: controle negativo, controle positivo e controle alcoólico.
Para a realização do controle negativo, foi utilizado um tubo com 2 mL de
Luffa operculata e para o controle positivo, outro tubo com 2 mL de caldo de
bactérias. Esses tubos foram levados à estufa, onde foram incubados a
aproximadamente 35oC ± 2°C, por 24 horas. Após as 24 horas foi feita a leitura dos
tubos para verificar se houve ou não crescimento bacteriano, indicado pela turvação
do meio. Todos os tubos foram semeados, em placas de ágar-sangue de 90 mm,
para avaliar crescimento e viabilidade dos Streptococcus pneumoniae e
Streptococcus pyogenes, e em placas de 150 mm de ágar Muller-Hinton, para
avaliar crescimento e viabilidade dos Staphylococcus aureus. A leitura das placas foi
realizada pós 24 horas e 48 horas.
De acordo com a ANVISA, soluções alcoólicas entre 60% e 80% são as
mais efetivas para a erradicação de bactérias. Seu modo de ação predominante
consiste na desnaturação e na coagulação das proteínas, associado a outros
mecanismos, como a ruptura da integridade citoplasmática e a lise celular
bacteriana. Soluções alcoólicas com concentrações maiores que 80% não
apresentam a mesma capacidade bactericida e tornam-se menos potentes pelo fato
de as proteínas plasmáticas não se desnaturarem com facilidade sem a presença de
23
água. Soluções contendo álcool em concentrações menores de 60% não
apresentam a mesma eficiência em sua ação asséptica(39).
Para evitar que o veículo alcoólico do extrato de Luffa operculata interferisse
nos resultados do efeito antimicrobiano do nosso estudo, foi necessária a criação de
um controle alcoólico para as diferentes concentrações testadas.
Sendo assim, após a diluição do extrato de Luffa operculata a 10% e teor
alcoólico de 65% para extratos de Luffa operculata nas concentrações de 0,2%,
0,3%, 0,4%, 0,5%, 1% e 2%, foram calculados os teores alcoólicos das mesmas,
para a criação do controle (Tab. 2).
Tabela 2. Cálculo das diluições e teor alcoólico, a partir da concentração inicial do extrato alcoólico
de Luffa operculata a 10% e teor alcoólico de 65%
Concentrações de
Luffa operculata (%)
Luffa operculata
10% (mL)
TSB
(mL)
Luffa operculata
+ TSB (mL)
Teor alcoólico
(%)
0,2 0,2 9,8 10 1,30
0,3 0,3 9,7 10 1,95
0,4 0,4 9,6 10 2,60
0,5 0,5 9,5 10 3,25
1 1 9 10 6,50
2 2 8 10 13,00
Legenda: TSB = Tryptic Soy Bean
O maior teor alcoólico encontrado foi de 13%, na concentração de Luffa
operculata a 2%. Para confirmar a ausência de ação antimicrobiana do etanol
nessas diferentes concentrações, tubos com etanol nos diferentes teores alcoólicos
entre 1,35 e 13% e caldo de bactérias foram levados à estufa, onde foram incubados
a, aproximadamente, 37o C ± 2°C por 24 horas. Após 24 horas foi realizada a leitura
24
dos tubos para verificar se houve ou não crescimento bacteriano, indicado pela
turvação do meio; e semeadura de todos os tubos em placas de ágar-sangue de 90
mm, para avaliar crescimento e viabilidade dos Streptococcus pneumoniae e
Streptococcus pyogenes, e placas de 150 mm de ágar Muller-Hinton para os
Staphylococcus aureus. O mesmo procedimento foi realizado após 48 horas de
incubação.
3.7. Critérios de análise
Para os critérios de análise, foram considerados testes negativos aqueles em
que não houve a turvação do meio após a inoculação das bactérias, confirmados
pela ausência do crescimento das bactérias nas semeaduras de 24 horas e 48
horas. Foram considerados positivos os testes que apresentaram turvação do caldo
ou positividade nas semeaduras de 24 horas ou 48 horas (Fig. 4 e 5).
Figura 4. (A) Presença de turvação; (B) ausência de turvação
A B
25
Figura 5. Placas de Ágar Muller-Hinton: (A) sem crescimento bacteriano; (B) com crescimento
bacteriano. Placas de Ágar-sangue: (C) sem crescimento bacteriano; (D) com crescimento bacteriano
A ausência de turvação nos tubos de ensaio não possibilita, se considerada
isoladamente, afirmar se existe ou não a erradicação das bactérias no meio
contendo Luffa operculata e caldo de bactérias. Permite dizer, que houve uma
concentração inibitória mínima (CIM), ou seja, a mínima concentração na qual o
crescimento bacteriano foi inibido. Se houve crescimento bacteriano nas
semeaduras de 24 horas e 48 horas, é necessária maior concentração de Luffa
operculata para que ocorra a morte de todas as bactérias. Quando a ausência de
turvação na leitura dos tubos de ensaio é confirmada pela ausência de crescimento
bacteriano nas semeaduras de 24 horas e 48 horas, podemos estabelecer a
concentração bactericida mínima (CBM), ou seja, a mínima concentração necessária
para a morte de todas as bactérias.
A B
A
C D
26
3.8. Análise estatística
Para verificar a concordância entre os métodos de turvação e semeadura de
24 horas e 48 horas, foi utilizado o método Kapa, que visa, por medida de
associação, estabelecer concordância entre variáveis qualitativas. Seu valor pode
ser igual à zero, ou diferente de zero. Quando diferente de zero calcula-se o valor de
concordância. É considerada fraca concordância quando p<0,4, moderada
concordância quando 0,4<p<0,6, e forte concordância quando p>0,6. Todas as
amostras foram realizadas em duplicata. O programa utilizado para análise
estatística foi o SPSS 13.0 para Windows.
27
4. RESULTADOS
4.1. Controles
Nenhum dos tubos de controle negativo com Luffa operculata apresentou
turvação visível ou crescimento de qualquer linhagem de bactérias nas diferentes
concentrações.
Todos os controles positivos com caldo de bactérias e todos os controles
alcoólicos apresentaram turvação visível e crescimento bacteriano específico de
cada caldo, sem contaminação das amostras.
Todos os controles negativos, positivos e com álcool foram realizados em
duplicata para todas as amostras, e confirmaram seus resultados.
4.2. Microrganismos
Todos os tubos que continham Luffa operculata nas concentrações a 0,2% e
0,3% e caldo de bactérias com Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae
e Staphylococcus aureus apresentaram turvação após incubação de 24 horas. As
semeaduras de 24 horas e 48 horas confirmaram a presença de bactérias e
mostraram crescimento somente dos agentes testados, o que excluiu qualquer tipo
de contaminação das amostras.
Todos os tubos que continham Luffa operculata na concentração de 0,4% e
caldo de bactérias com Streptococcus pyogenes não apresentaram turvação após
incubação de 24 horas. Porém, dentre as 25 amostras de Streptococcus pyogenes
(ATCC-19615 e 24 amostras clínicas) testadas, uma amostra clínica (4%)
apresentou crescimento bacteriano nas semeaduras de 24 horas e de 48 horas
(Tab. 3).
28
Dentre os 25 tubos que continham Luffa operculata na concentração de 0,4%
e Streptococcus pneumoniae (ATCC-49619 e 24 amostras clínicas); a amostra
ATCC e duas amostras clínicas (12%), não apresentaram turvação após incubação
de 24 horas, nem crescimento bacteriano nas semeaduras de 24 horas e 48 horas.
Cinco outras amostras clínicas (20%) não apresentaram turvação após incubação de
24 horas, porém, apresentaram crescimento após semeaduras de 24 horas e 48
horas. Dezessete amostras clínicas (68%) apresentaram turvação após incubação
de 24 horas e crescimento bacteriano nas semeaduras, em 24 horas e 48 horas.
Essas 25 semeaduras apresentaram crescimento somente de Streptococcus
pneumoniae, o que excluiu qualquer tipo de contaminação das amostras. A análise
estatística mostrou Kapa ≠0 e p<0,449, indicando resultado moderadamente
sugestivo de resposta antimicrobiana (Tab. 3).
Todos os tubos que continham Luffa operculata nas concentrações a 0,4% e
0,5% e caldo de bactérias com Staphylococcus aureus apresentaram turvação após
incubação de 24 horas. As semeaduras de 24 horas e 48 horas confirmaram a
presença dessas bactérias.
Todos os tubos que continham Luffa operculata a 0,5%, 1% e 2% e caldo de
bactérias com Streptococcus pyogenes não apresentaram turvação após incubação
de 24 horas e não houve crescimento bacteriano nas semeaduras em 24 horas e 48
horas.
Dentre os 25 tubos que continham Luffa operculata na concentração de 0,5%
e Streptococcus pneumoniae (ATCC-49619 e 24 amostras clínicas), a amostra
ATCC e 11 amostras clínicas (48%) não apresentaram turvação após incubação de
24 horas ou crescimento bacteriano nas semeaduras de 24 horas e 48 horas. Seis
outras amostras clínicas (24%) não apresentaram turvação após incubação de 24
29
horas, porém, apresentaram crescimento após semeaduras de 24 horas e 48 horas.
Sete amostras clínicas (28%) apresentaram turvação após incubação de 24 horas e
crescimento bacteriano nas semeaduras em 24 horas e 48 horas. Essas 25
semeaduras mostraram crescimento somente de Streptococcus pneumoniae, o que
excluiu qualquer tipo de contaminação das amostras. A análise estatística mostrou
Kapa ≠0 e p<0,528, indicando resultado moderadamente sugestivo de resposta
antimicrobiana (Tab. 3).
Os tubos que continham Luffa operculata a 1% e 2% e caldo de bactérias com
Streptococcus pneumoniae, não apresentaram turvação após incubação de 24 horas
e não houve crescimento bacteriano nas semeaduras em 24 horas e 48 horas.
Dentre os 25 tubos que continham Luffa operculata na concentração de 1% e
Staphylococcus aureus (ATCC – 25923 e 24 amostras clínicas), a amostra ATCC e
três amostras clínicas (16%) não apresentaram turvação após incubação de 24
horas, porém, todas apresentaram crescimento após semeaduras de 24 horas e 48
horas (Tab. 3).
Os tubos que continham Luffa operculata a 2% e caldo de bactérias com
Staphylococcus aureus não apresentaram turvação após incubação de 24 horas e
não houve crescimento bacteriano nas semeaduras em 24 horas e 48 horas.
30
Tabela 3. Resultados de turvação e semeaduras da Luffa operculata nas diferentes concentrações,
nos agentes bacterianos
Agente Concentração Turvação (n=25) Semeaduras de 24 horas e 48 horas
(n=25)
Streptococcus pyogenes
Luffa operculata 0,4% Kapa = 0 (p não calculado)
Negativa 25 (100%) Positiva (0%)
Negativas 24 (96%) Positivas 1 (4%) Negativas (0%) Positivas (0%)
Streptococcus pneumoniae
Luffa operculata 0,4% (Kapa≠zero p<0,449) Luffa operculata 0,5% (Kapa≠zero p<0,528)
Negativa 8 (32%) Positiva 17 (68%) Negativa 18 (72%) Positiva 7 (28%)
Negativas 3 (12%) Positivas 5 (20%) Negativas (0%) Positivas 17 (68%) Negativas 12 (48%) Positivas 6 (24%) Negativas (0%) Positivas 7 (28%)
Staphylococcus aureus
Luffa operculata 1% (Kapa = 0 (p não calculado)
Negativa 4 (16%) Positiva 21 (84%)
Negativas (0%) Positivas 4 (16%) Negativas (0%) Positivas 21 (84%)
31
5. DISCUSSÃO
5.1. Escolha do extrato
Uma das grandes dificuldades para a utilização de plantas em estudos
controlados é a falta de padronização dos fitoterápicos. Nenhum dos trabalhos
experimentais publicados entre 2001 e 2010 apresentou a mesma forma de
obtenção do extrato de Luffa operculata(15,23-25).
Outra dificuldade para a utilização de plantas in natura, especialmente quando
se pretende avaliar a ação antimicrobiana de um fitoterápico, é garantir a
procedência desse material e a ausência de contaminação. Em artigo publicado em
2001, foi avaliada a qualidade dos frutos secos de Luffa operculata do Mercado
Municipal de São Luiz do Maranhão, e ficou comprovada a contaminação de todas
as amostras do fruto de Luffa operculata adquiridos nesse mercado; alguns por
fungos, outros por bactérias, o que os tornava impróprios para o uso(40).
Visando evitar a presença de frutos contaminados que pudessem interferir
nas amostras do nosso estudo, assim como garantir que o mesmo extrato fosse
utilizado em todo trabalho, optamos por utilizar um extrato alcoólico industrializado
da Luffa operculata, cujo acesso estivesse disponível para a replicação do estudo,
caso fosse necessário. A escolha do extrato da Schraiber® se deu pelo fato de ser
uma empresa consagrada na fabricação de fitomedicamentos e uma das maiores
distribuidoras desses produtos no Brasil.
É importante salientar que a reprodutibilidade da pesquisa fica restrita ao lote
especificamente utilizado neste estudo. Dependendo das condições do solo, da
incidência solar e do índice pluviométrico, não é possível garantir que outros lotes,
produzidos em outras estações do ano ou em outras plantações, apresentem o
32
mesmo resultado encontrado em nosso estudo. É necessário que outras pesquisas,
com diferentes extratos de Luffa operculata nas mesmas concentrações e com os
mesmos agentes bacterianos sejam realizados para garantir alguma comparação.
5.2. Concentrações utilizadas
Alguns artigos foram publicados desde a década de 60, na tentativa de avaliar
os mecanismos de ação pelo qual a Luffa operculata age sobre o epitélio respiratório
e comprovar sua eficácia terapêutica no tratamento clínico das rinossinusites(24). Os
autores não encontraram critérios confiáveis para a sua utilização com segurança(24).
O uso de forma inadequada, especialmente em altas concentrações de Luffa
operculata, pode levar, até mesmo, a uma piora dos quadros nasossinusais(15,17).
Mesmo assim, alguns trabalhos clínicos e experimentais citam as concentrações de
0,5% e 1% para o tratamento das rinossinusites(21,25,30).
Como encontramos somente um estudo sobre a atividade antimicrobiana da
Luffa operculata, relatando screnning com diversas bactérias e fungos(29), optamos
por iniciar a investigação com a concentração de 1%, a mesma presente no extrato
comercial liberado pela ANVISA e testada em grande parte dos trabalhos citados na
literatura(23,25,30). Testamos o dobro da concentração recomendada (2%),
estabelecendo assim um limite para esta atividade antimicrobiana, sem que se
aproximasse de sua DL50(21,31) ou levasse ao aumento de seus efeitos deletérios à
mucosa. Por fim, foram avaliadas outras concentrações entre 0,2%, 0,3%, 0,4% e
0,5%, na tentativa de se estabelecer uma concentração mínima em que a Luffa
operculata apresentasse efeito antimicrobiano, com o mínimo de efeitos colaterais.
33
5.3. Agentes bacterianos
Todos os tubos que continham Luffa operculata nas concentrações a 0,2% e
0,3% e caldo de bactérias com Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae
e Staphylococcus aureus apresentaram turvação após incubação de 24 horas,
denotando crescimento bacteriano nessas concentrações, e consequentemente,
ausência de ação antimicrobiana para qualquer um dos agentes.
Todos os tubos que continham Luffa operculata na concentração de 0,4% e
caldo de bactérias com Streptococcus pyogenes, não apresentaram turvação após
incubação de 24 horas, o que denotou ação antimicrobiana para esse agente, nessa
concentração. A ausência de turvação visual, isoladamente, nos fez inferir que em
torno da concentração de 0,4% foi possível encontrar a CIM para o Streptococcus
pyogenes.
Como a ausência de turvação visual, confirmada pela ausência de
crescimento nas semeaduras de 24 horas e 48 horas, ocorreu somente nos tubos
com Luffa operculata em concentrações superiores a 0,5%, inferimos que em torno
dessa concentração pode-se estabelecer a CBM para esses agentes.
Algumas amostras que continham Luffa operculata nas concentrações de
0,4%, 0,5% e caldo de bactérias com Streptococcus pneumoniae, não apresentaram
turvação do meio. Porém, o fato de algumas amostras apresentarem crescimento
bacteriano nas semeaduras confirmou que, assim como para o Streptococcus
pyogenes, em torno de 0,4% ou 0,5%, podemos estabelecer sua CIM para o
Streptococcus pneumonie.
Em concentrações de Luffa operculata superiores a 1%, não houve turvação
nos tubos contendo Streptococcus pneumoniae ou crescimento bacteriano nas
semeaduras de 24 horas e de 48 horas, porém, pelo fato de não terem sido testadas
34
concentrações intermediárias entre 0,5% e 1%, não podemos concluir que a CBM
para o Streptococcus pneumoniae seja a 1%. É possível que em alguma
concentração entre 0,5% e 1% ocorra a morte de todas as bactérias testadas, e para
isso, seriam necessários estudos clínicos com escalonamento maior de
concentrações de Luffa operculata para estabelecer sua CBM.
Alguns tubos contendo Luffa operculata a 1% e caldo de bactérias com
Staphylococcus aureus não apresentaram turvação visual após a leitura de 24
horas, o que sugere que nessa concentração a Luffa operculata apresentou
atividade antimicrobiana para esse agente, estabelecendo, assim, sua CIM.
Somente na concentração de 2% houve ausência de turvação e ausência de
crescimento bacteriano nas semeaduras de 24 horas e de 48 horas, porém, assim
como ocorreu com os Streptococcus pneumoniae, não é possível garantir que essa
concentração seja sua CBM. A falta de concentrações intermediárias entre 1% e 2%
não garante que um valor maior do que 1% e menor que 2% também seja capaz de
erradicar todos os Staphylococcus aureus (Quad. 2).
Quadro 2. Presença ou ausência de crescimento bacteriano nas diferentes concentrações do extrato
de Luffa operculata
Bactérias Concentrações de Luffa operculata
0,2% 0,3% 0,4% 0,5% 1% 2%
Streptococcus pyogenes + + + - - -
Streptococcus pneumoniae + + + + - -
Staphylococcus aureus + + + + + -
(+) Presença de bactérias (turvação ou semeaduras positivas)
(-) Ausência de bactérias (turvação e semeaduras negativas)
Apesar de se tratar de Cocos Gram positivos, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus aureus apresentaram perfis de
35
susceptibilidade diferentes à Luffa operculata. Concentrações menores, em torno de
0,5%, foram capazes de erradicar todos os Streptococcus pyogenes, enquanto
somente a 1% erradicaram os Streptococcus pneumoniae e, a 2%, os
Staphylococcus aureus. Essa resposta à Luffa operculata se deu da mesma forma
que esses agentes respondem aos antibióticos convencionais. Muitos são os
mecanismos pelos quais essas bactérias desenvolvem resistência ao uso de
antimicrobianos. O Streptococcus pneumoniae, por exemplo, apresenta-se
capsulado, o que dificulta a ação dos antimicrobianos em sua parede celular.
Normalmente, apresenta maior resistência aos antibióticos que o Streptococcus
pyogenes. Já o Staphylococcus aureus, apresenta, dentre outros motivos, maior
capacidade de criar resistência bacteriana que os agentes anteriores, pelo fato de
ser um alto indutor de betalactamase.
5.4. Uso popular
Uma das formas mais difundidas para a preparação da infusão de Luffa
operculata pela população, especialmente no Nordeste do Brasil, é a colocação de
1/4 do fruto seco da planta, em 500 mL de água quente. Após a imersão do fruto em
agua quente, é necessário esperar que a água fique morna, para que possa ser
aspirada ou instilada pelo nariz, até que ocorra a saída de uma rinorréia profusa, e
por vezes, serosanguinolenta(15,21,26,28).
Em 2004, foi realizado trabalho experimental com 46 palatos de rã, divididos
em cinco grupos distintos. O Grupo 1 (controle) com 10 palatos imersos em solução
isotônica de Ringer rã, o Grupo 2 (infusão diluída – 60 mg/L) com 10 palatos imersos
em solução com 1/4 do fruto seco em 5 litros de Ringer rã, o Grupo 3 (infusão base
– 600 mg/L) com 10 palatos imersos em solução com 1/4 de fruto seco em 500 mL
36
de Ringer rã, o Grupo 4 (solução concentrada – 1200 mg/L) com 10 palatos imersos
em solução com 1/4 de fruto seco em 250 mL de Ringer rã e o Grupo 5 (infusão em
água – 600 mg/L) com 6 palatos imersos em solução com 1/4 de fruto seco em 500
mL de água mineral, semelhante ao uso popular(15). Foram encontradas
anormalidades no epitélio que se acentuaram de forma gradual, a partir do Grupo 2
até o Grupo 5. O Grupo 5, com palatos de rã imersos na infusão com água,
apresentou resultados muito semelhantes aos do Grupo 4, onde a concentração de
Luffa operculata foi extremamente elevada(15).
Isso mostra que, a maneira como a população realiza a infusão de Luffa
operculata (1/4 de fruto em 500 mL de água) é extremamente lesiva à mucosa,
destruindo grande quantidade das tight junctions, e causando lesões irreversíveis na
camada basal. A concentração dessas infusões de uso popular pode ser comparada
à do Grupo 4 (infusão concentrada – 1200 mg/L)(15), o que resultaria em uma
concentração aproximada de 12%, ou seja, 12 vezes maior do que a medicação
liberada pela ANVISA e comercializada no país(15,30). Assim sendo, consideramos
contra indicada a realização dessas infusões.
5.5. Limitações do estudo
A escassez de trabalhos sobre a atividade antimicrobiana da Luffa operculata
gerou grande dificuldade em encontrar referências para a discussão do nosso
estudo. O único trabalho que realizou um screnning sobre a atividade antimicrobiana
de algumas cepas ATCC de diferentes bactérias, também encontrou CIM para
Staphylococcus aureus de 100 mg/mL(29). Em nossa pesquisa, assim como no
estudo anterior, avaliamos a cepa ATCC-25923, que apresentou CIM na
concentração de 1% junto com outras três amostras clínicas. As outras 21 amostras
37
clínicas testadas apresentaram turvação visual após cultura de 24 horas e
crescimento bacteriano após semeaduras de 24 horas e 48 horas, o que não repetiu
os resultados da amostra ATCC. A falta de estudos com extratos em concentrações
intermediárias entre 0,5% e 1% não nos permite afirmar que sua CIM é de 1%, mas
nos permite inferir que pode estar entre 0,5% e 1%. Da mesma forma, a CBM para
Staphylococcus aureus também não pode ser estabelecida, mas podemos afirmar
que para essas amostras utilizadas em nosso estudo, se encontra entre
concentrações de 1% e 2% de Luffa operculata.
Nenhum estudo anterior avaliou a atividade antimicrobiana da Luffa
operculata em relação à Streptococcus pyogenes ou Streptococcus pneumoniae.
Claramente, em nosso estudo, os Streptococcus pyogenes se mostraram mais
susceptíveis à ação antimicrobiana da Luffa operculata, do que os Streptococcus
pneumoniae, e estes, por sua vez, em relação aos Staphylococcus aureus.
É importante salientar, que uma série de substâncias como as cucurbitacinas
B e D, glicosídeos, saponina, esteróis livres, ácidos orgânicos e fenóis, foram
isolados na análise fitoquímica da Luffa operculata(21,25,28). Apesar de uma série de
substâncias apresentarem efeito terapêutico, outras podem apresentar efeito tóxico
e, inclusive, levar a uma piora dos quadros de infecções de vias aéreas
superiores(15).
Assim sendo, mesmo com o efeito antimicrobiano promissor desse
fitoterápico(29), novos estudos devem ser realizados, visando estabelecer quais
desses componentes apresentam efeito terapêutico e quais são as concentrações
mais adequadas para que seu uso não cause mais prejuízos do que benefícios.
Esses estudos devem buscar reconhecer e separar os componentes tóxicos e
terapêuticos da Luffa operculata, para que se possa embasar ou rejeitar seu uso no
38
tratamento dos quadros inflamatórios e infecciosos das vias aéreas
superiores(15,24,25,33).
5.6. Considerações para o futuro
Muitos estudos têm sido realizados na tentativa de elucidar as propriedades
terapêuticas da Luffa operculata. Estabelecer a tênue relação de toxicidade e
tratabilidade é o desafio a ser alcançado.
Encontrar ação antimicrobiana neste fitoterápico pode ser de grande valia no
arsenal de tratamento de doenças das vias aéreas superiores, visto que a cada dia,
mecanismos de resistência bacteriana dificultam o tratamento dessas afecções.
O fato dos fitoterápicos apresentarem variações em suas características e
em seus componentes, com alterações dos componentes do solo, índices
pluviométricos e sazonalidade de sua coleta, fazem com que sua composição seja
sempre diferente, com características únicas, o que dificulta a indução de resistência
bacteriana.
A partir do momento que se estabeleça uma dose segura para o uso na
cavidade oral, seu efeito antimicrobiano frente ao Streptococcus pyogenes poderia
ser de grande importância na criação de um spray oral para profilaxia de febre
reumática. Pacientes com teste rápido positivo e sem sinais e sintomas muito
intensos poderiam fazer uso desse spray para erradicar o agente, sem o uso de
antibióticos de forma sistêmica.
O mesmo pode ser dito para o tratamento de doenças nasossinusais, em
que fica comprovada a presença de biofilme. Seu efeito cáustico e detergente, por
meio das cucurbitacinas e saponinas, se controlados os efeitos colaterais, pode, em
baixas doses, ser útil na destruição da estrutura de polissacarídeos e,
39
consequentemente, facilitar a ação de algum antibiótico associado na cura dessas
doenças.
É importante continuar buscando esclarecimentos sobre esse e outros
fitoterápicos, na tentativa de solucionar problemas que surgem a cada dia, e que,
por muitas vezes, não obtemos sucesso com os recursos que disponibilizamos no
momento.
40
6. CONCLUSÃO
O extrato de Luffa operculata apresentou atividade antimicrobiana in vitro
contra os agentes bacterianos causadores de infecções de vias aéreas superiores
testados nesse trabalho, tanto naqueles agentes com perfil e suscetibilidade
conhecidos (ATCC), como os de origem clínica.
41
7. REFERÊNCIAS
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45
Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana da Luffa operculata em
Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus
aureus
Rodolfo Alexander Scalia
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas
da Santa Casa de São Paulo, para obtenção do título de Doutor em Pesquisa em
Cirurgia, 2014
RESUMO
Objetivo: Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro da Luffa operculata em agentes
causadores de infecções de vias aéreas superiores: Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae e Streptococcus pyogenes. Métodos: Foram utilizadas
diferentes concentrações de extrato alcoólico de Luffa operculata em caldo de
bactérias dos agentes avaliados. Após incubação de 24 horas foi realizada a leitura
de turvação do meio, e posteriormente, semeadura em placas de ágar-sangue e
ágar Muller-Hinton, após 24 horas e 48 horas de incubação. Foram considerados
testes negativos aqueles em que não houve a turvação do meio, confirmados pela
ausência do crescimento das bactérias nas semeaduras. Foram considerados
positivos os testes que apresentaram turvação do caldo ou positividade nas
semeaduras de 24 horas ou 48 horas. Os resultados foram submetidos à análise
estatística pertinente. Resultados: Os extratos de Luffa operculata apresentaram
atividade antimicrobiana, especialmente para Streptococcus pyogenes, seguido dos
Streptococcus pneumoniae e Staphylococcus aureus. Conclusão: O extrato de
Luffa operculata apresentou atividade antimicrobiana in vitro contra os agentes
estudados.
46
Antimicrobial activity of Luffa operculata in vitro in Streptococcus pyogenes,
Streptococcus pneumonia and Staphylococcus aureus
Rodolfo Alexander Scalia
Thesis presented to the School of Medical Sciences of Santa Casa de São Paulo, to
obtain the title of Doctor of Research in Surgery, 2014
ABSTRACT
Aim: To evaluate in vitro antibacterial activity of Luffa operculata against three
ordinary agents of upper respiratory tract infection: Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes. Methods: Different
concentrations of Luffa operculata alcoholic extract were applied to bacterial broth
containing reference and comunity strains of the three described agents. After a 24-
hour incubation period, the bacterial culture turbidity was measured. Samples were
then inoculated onto Mueller-Hinton and human blood agar plates. Bacterial growth
was analized after 24 hours and 48 hours incubation period. The test was considered
negative if no turbidity changes were observed on the culture medium, and confirmed
by the absence of bacterial growth into the inoculated plates. Tests were considered
positive both when turbidity changes were observed on the bacterial broth or when
bacterial growth were detected on inoculated plates. Appropriate data statistical
analysis was performed. Results: Luffa operculata extracts showed antibacterial
activity mainly to Streptococcus pyogenes followed by Streptococcus pneumoniae
and Staphylococcus aureus. Conclusion: Luffa operculata extract showed in vitro
antibacterial activity against the studied agents.
47
APÊNDICES
Apêndice 1. Aprovação do Comitê Científico do Departamento de Ciências
Patológicas
48
Apêndice 2. Aprovação do Comitê Científico do Departamento de
Otorrinolaringologia
49
Apêndice 3. Dispensa do Comitê de Ética e Pesquisa da FCMSCSP