Aula de enzimologia

Tema Cinética enzimática

Prof. Adriane M. F. MilagresDepartamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena

Universidade de São Paulo – USPadriane@debiq.eel.usp.br

Cinética das reações catalisadas por enzimas

1. Efeito da concentração de substrato

Conteúdo:

• Cinética de uma reação simples

• Determinando Vmax e Km

• Significado de Km

• Cinética do tipo cooperativo

A atividade de uma enzima e a concentração do substrato não são, em geral, proporcionais

Qual a porcentagem dos sítios ativos estão ocupados?

Por que estudar a cinética enzimática?

• Determinar as constantes cinéticas do S e dos inibidores

• Ajudar a elucidar os mecanismos de reação

• Determinar a função de uma enzima em uma rota metabólica

• Conhecer as condições ótimas de catálise

A velocidade da reação é proporcional a S

O modelo de Michaelis-Menten é útil para explicar a cinética das reações catalisadas por enzimas.

O modelo de Michaelis-Menten considera que uma reação enzimática ocorre em dois passos:

Hipótese de equilíbrio rápido e estado estacionário

V = k3 [ES] K1 [E] [S] = K2 [ES] K2 = [E] [S]K1 [ES]

2) [Et] = [E] + [ES] 1) V = k3 [ES]

V = k3 [ES][Et] [E] + [ES]

V = K3

K2 = Ks = [E] [S] K1 [ES]

[ES] = [E] [S] ks

[E] [S] ks

Et E + [E] [S] ks

V= Vm [S] ks + [S]

ETAPA 2.Formação do produto (P) a partir do complexo ES, com recuperação da forma livre da enzima (E)

ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma enzima (E), formando um complexo intermediário (ES)

Hipótese de Briggs - Haldane

A reação do anterior está representada no equilíbrio:

onde k1, k2, k3e k4 são as constantes de velocidade de cada etapa.

Nesse caso, a da reação(V), ou seja, a velocidade de formação do produto será:

Porém, no estado inicial, podemos simplificar a reação:

A velocidade inicial de reação neste caso é dada por:

Na análise cinética da reação catalisada por uma enzima, consideramos apenas o ESTADO ESTACIONÁRIO, que é aquele em que, apesar de estarem mudando as concentrações de S (diminuindo) e de P (aumentando), não há variação da concentração dos intermediários da reação.

Velocidade de formação de ES =Velocidade de decomposição de ES

ou...k1[E].[S] = (k2+ k3)[ES] (eq. 3)

A equação 3 pode ser re-arranjada em:

Para simplificar a equação 4, foi definida uma constante, Km, conhecida como Constante de Michaelis:

No numerador, temos duas constantes de velocidade de reações de DECOMPOSIÇÃO de ES e no denominador, a constante de velocidade da FORMAÇÃO de ES.

Dessa forma, Km é uma medida da AFINIDADE da enzima pelo substrato.

Km ALTO = Baixa afinidade eKm BAIXO = Alta afinidade

Como toda a enzima que estiver na solução de reação (ETOTAL) corresponde à soma das espécies E (enzimas livres) e ES (enzimas no complexo com substrato),

Podemos substituir esta equação na da velocidade inicial da reação é Vo = k3.[ES]:

Quando todas as enzimas estão na forma de complexo ES, atingimos a velocidade máxima de reação, ou seja, se [E]TOTAL= [ES], então a equação 10, pode ser representada por:

•Se [S]<<<Km, então: Vo = Vmax [S] Vo = K[S] Km

•E se [S] >>>> Km, Vo = Vmax V0= k3[E]TOTAL

•Se V0=Vmáx/2, temos: Km = [S].

Ou seja, Km corresponde à concentração de S necessária para se atingir a metade da velocidade máxima!

Significado de Km

• Importante parâmetro da reação enzimática e da função biológica

• Fornece uma medida da [S] para que ocorra uma catálise significativa

• Km esta relacionado as constantes de velocidade de cada etapa da reacão

Significado do kcat/KM: A Eficiência Catalitica

• É uma medida de eficiência da Enzima• Permite comparar a preferência de uma Enzima para diferentes Substratos

Significado do kcat/KM: A perfeição cinética

Diagrama Lineweaver-Burk(Duplo-Recíproco)

Determinação experimental dos parâmetros cinéticos

As concentrações de substrato escolhidas devem ser proximas do Km

Críticas ao gráfico L.B.

1) Aumentos iguais de S que fornecem pontos igualmente espaçados no grafico V x S não fornecem pontos igualmente espaçados no L.B.

2) Valores tendem a se agrupar próximo ao eixo 1/v e aparecem poucos pontos mais altos da escala e são os que devem pesar no traçado da reta

3) Pequenos erros na determinação de V se tornam maiores quando se calcula o seu recíproco.

Gráfico de Eadie-HofsteeNão envolve o recíproco de V e podem tornar mais precisos

[S]v

mKmaxVv

VmaxKm

v -KmInclinação =

v[S]

Vmax

Gráfico de Hanes-WoolfMais indicado para dados obtidos com aumentos iguais de S

[S]

[S] v

-Km

KKmm

VVmaxmax

1Vmax

Inclinação =

[S]maxV1

maxVmK

v[S]

Exercício:1) Os seguintes dados foram obtidos para uma enzima que catalisa a

reação S-P. As concentrações de substrato abrangem uma faixa bastante ampla para nos permitir utilizar qualquer um dos gráficos lineares. Trace os gráficos e determine Km e Vmax.

[S] (M) V (nmoles/L/min)

8,33 10-6 13,8

1 10-5 16

1,25 10-5 19

1,67 10-5 23,6

2 10-5 26,7

2,5 10-5 30,8

3,33 10-5 36,3

4 10-5 40

5 10-5 44,4

6 10-5 48

8 10-5 53,4

1 10-4 57,1

2 10-4 66,7

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATOEste gráfico mostra como varia a velocidade inicial de uma reação com o aumento da concentração de substrato:

Ou seja,Vmáx e Km podem ser calculados quando V0 é medida em função de várias concentrações de substrato.

1) Quando [S] é muito grande – V = Vmax P = Vmax . t

Ordem da reação2) Quando S é muito pequeno

Vo = Vmax [S] Vo = K[S] Km

K é uma constante de primeira ordem (min -1)

0

0log3,2 ttkSS

dtSSdk 1

-dS = kS dt

Exercício:

1) Uma enzima teve sua atividade determinada a uma concentração inicial de [S] de 2 x 10-5 M. Em 6 min, metade do substrato foi utilizado. O Km para o substrato é de 5 x 10 -3 M . Calcule a) k, b) Vmax, c) concentração de produto formado em 15 min.

Enzimas Alostéricas

• Não obedecem a Cinética de Michaelis-Menten• Quanto maior a [S] maior será a atividade da E até esta alcançar o Vmax• A curva da V versus [S] e sigmóide • Segue modelo da curva de saturação da Hemoglobina com O2• Sistema cooperativo

Ativador alostérico Inibidor alostérico

Enzimas alostéricas

possuem uma região diferente do sítio ativo e se liga um efetor ou modulador alostérico. A mudança conformacional decorrente da ligação do efetor alostérico se propaga pela molécula e afeta o sítio ativo, ativando-o ou inibindo-o.

Gráfico V x S é uma curva sigmóide

Enzimas tipo V: efetores alostéricos alteram a Vmax - hiperbólica Enzimas tipo K: efetores alostéricos alteram o Km - Cinética sigmoidal(indica cooperatividade)

Enzimas com sítios múltiplos

1) Sitios independentes (hiperbólica)2) Sítios interdependentes (Sigmoidal)

k’ k3E + hS ------ ESh ------- ESh-1 + P

V = k3 [ESh] (1)Et = [E] + [ESh] [ESh] = [E] [S]h / k’

V = k3 [ESh] Et [E] + [ESh]

V = k3 [E] [S]h / k’Et [E] + [E] [S]h / k’

V = k3 [S]h

[Et] k’ + [S]h V = Vm [S]h

K’ + [S]h

Equações de V x [S]

[S] é a concentração de substrato

S50 é a concentração de substrato para a qual a enzima está hemisaturada e em que a velocidade é metade de Vmax.

h é o coeficiente de Hill e é uma medida do grau de cooperatividade (ou sigmoidicidade): quando h=1 a equação acima simplifica e é igual à equação de Michaelis-Menten (ausência de cooperatividade).

V = Vm [S]h K’ + [S]hRearranjando:

vK’ + v[S]h = Vm [S]h

Vk’ = Vm[S]h –v[S]h

Vk’ = (Vm – v) [S]h

V = [S]h

Vm – V k’

Log ( V ) = h log [S] - log k’ (Equação de Hill) ( Vm – V )

A equação de Hill também é linearizável:

Exercício:

Determine se a enzima obedece uma cinetica hiperbólica ou sigmoidal e calcule ou estime as constantes cinética apropriadas (Km, Vmax ou K’ [S]0,5 , nap e Vmax)

[S] (M x 104) V (micromoles/L/min) 6,5 1,5412,5 5,88 25 20 50 50100 80200 94,12400 98,46800 99,61

1) O estudo cinético de uma enzima nos informa sobre o modo como a atividade da enzima se modifica quando se alteram as condições do meio em que esta é ensaiada.

2) O estudo cinético de uma enzima é importante para caracterizar essa enzima, desta maneira distinguindo-a funcionalmente das demais enzimas inclusive das que podem catalisar a mesma reação.

3) O desenho de condições de ensaio adequadas à dosagem de uma enzima numa preparação biológica complexa é feita com base em estudos de cinética.

Considerações finais: