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Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática: Inibição enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP [email protected]

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Page 1: Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática: Inibição enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de

Aula de enzimologia

Tema Cinética enzimática: Inibição

enzimática

Prof. Adriane M. F. MilagresDepartamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena

Universidade de São Paulo – [email protected]

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Cinética enzimática

Sumário:

• Inibição reversívelModelos de inibição

• Modificação química

• Inibição irreversível

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INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.

INIBIDORES

REVERSÍVEIS IRREVERSÍVEIS

Competitivos Não Competitivos Incompetitivos

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INIBIÇÃO COMPETITIVA:

substrato e inibidor competem para o mesmo sítioKm kcat

K4[E] [I] = K5[EI

[K5] = [E] [I][K4] [EI]

1) V = K3 [ES]2) [ET] = [E] +[ES] +[EI]

V = K3 [ES][ET] [E] +[ES] +[EI]

[E][S]V = Vmax Km [E] + [E][S] + [E][I] Km Ki

V = Vmax [S]______ Km (1 +[I]) + [S] Ki

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INIBIÇÃO COMPETITIVA

1- sem inibidor

2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

Km (1 +[I]) + [S]1= _____Ki_______V Vmax [S]

V = Vmax [S]______ Km (1 +[I]) + [S] Ki

Km (1 +[I]) 1 = _____Ki__ 1 + 1V Vmax [S] Vm

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INIBIÇÃO INCOMPETITIVA:

substrato e inibidor ligam-se em sítios diferentes

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INIBIÇÃO INCOMPETITIVA:

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1- sem inibidor

2- com inibidor na concentração [I1] 3- com inibidor na concentração [I2] > [I1]

INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA

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INIBIÇÃO MISTA

α

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Diagrama Lineweaver-Burk para inibição mista

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EQUAÇÃO GERAL DE INIBIÇÃO

α

Km

αKm

K3

βK3

α = ∞ e β = 0 - Inibição competitiva pura

1 < α <∞ e β = 1 - Inibição competitiva parcial

α = 1 e β = 0 - Inibição não competitiva pura

α = 1 e 0< β <1 - Inibição não competitiva parcial

1 < α <∞ e β = 0 - Inibição tipo misto

1 < α <∞ e 0< β <1 – Inibição do tipo misto com β# 0

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1__ [i]

1_____inclin.

1_____inclin.

1_____interc.

1_____interc.

βVmKs(α- β)

βVm1-β

-βαKi

Para inibições com diagnóstico hiperbólico

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INIBIÇÃO PELO PRODUTO

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INIBIÇÃO PELO SUBSTRATO

Se K4 = 0

Se 0 < K4 < K2

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Exemplo 2:Fosfofrutoquinase

Frutose 6P Frutose 1,6 BiP

ATP ADP

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MODIFICAÇÃO QUÍMICA

Moléculas específicas podem interagir com a enzima inibindo-a

Inibidores irreversíveis

E + M F em que:

E – enzimaM – modificadorF – enzima modificada inativaK2 - constante de segunda ordem

K2

V = K2 [M][E]

V = KOBS [E]

KOBS = K2 [M]

K2 = KOBS

M

Log EnzimaRemanescente (%)

t

Kobs

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nLog Kobs

Log M

E + nM F e [M] >>> [E]k2

Kobs = k2 Mn

Log Kobs = log K2 + nlog M

Segundo caso: n é o numero de moléculas para inativar a enzima

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Inibidores irreversíveis:

Compostos orgânicos clorados ou fosforados reagem com o resíduo S1 de serino-enzimas, formando um complexo irreversível.

Uma das enzimas altamente sensível a esses compostos é a acetilcolinesterase, responsável pela metabolização do neurotransmissor acetilcolina em neurônios centrais e periféricos.

Este é o mecanismos de ação dos inseticidas organofosforados, como o malathion e o parathion.

dose letal: 3-13 mg/Kg, oral

Inseticidasorganofosforados

meia vida – 23 anos

“gás dos nervos” (dose letal 0,01 mg/kg, oral),

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PMSF phenylmethane

sulphonyl fluoride

H3C SO2F

No laboratório, serino-enzimas podem ser identificadas por serem eficientemente inibidas por compostos organofosforados menos tóxicos como o diisopropilfluorofosfato (DFP) ou o fluoreto de fenilmetilenosulfonila (PMSF).

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A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas

vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade de S e da própria E ?

Agora vamos falar de:

1. Inibidores:• irreversíveis: não protéicos e protéicos• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo

2. Alosteria:• ativadores e inibidores• cooperatividade

3. Modulação covalente• Fosforilação e defosforilação • Ativação de zimogênios

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inativa ativa

Fosforilação - Defosforilação

quinase

fosfatase

enzima

fosfato

substrato

Ao contrário da alosteria, em que os efetores ligam-se à enzima apenas por ligações fracas, na modulação covalente a enzima é modificada covalentemente por duas outras enzimas: uma quinase fosforila a enzima às custas de ATP, e uma fosfatase remove o grupo fosfato da enzima fosforilada. A modulação covalente é energéticamente cara, pois necessita duas outras proteínas e ATP para regular a atividade de uma enzima. Ao contrário, na alosteria a enzima é controlada pelas concentrações relativas de seus efetores e a afinidade da enzima por estes.

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A atividade enzimática pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas

vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:

Como são controladas as enzimas in vivo, além de alterações na disponibilidade de S e da própria E ?

Agora vamos falar de:

1. Inibidores:• irreversíveis: não protéicos e protéicos• reversíveis: competitivo, não competitivo ou misto, incompetitivo

2. Alosteria:• ativadores e inibidores• cooperatividade

3. Modulação covalente• Fosforilação e defosforilação • Ativação de zimogênios

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• zimogênios: as proteases são sintetizadas numa forma inativa por estar em uma conformação desfavorável, com bloqueio ou desalinhamento dos resíduos do sítio catalítico.

• conformação desfavorável resulta de porções adicionais da cadeia poli-peptídica, que devem ser retirados para que a proteína assuma a forma ativa.

• podem acontecer duas situações, combinadas ou não: - zimogênio tem uma extensão N-terminal (pro-segmento) que precisa ser retirada. Pro-segmentos podem ter de 2 a 150 resíduos a.a. - zimogênio tem cadeia polipeptídica única, que precisa ser clivada (proteólise limitada) para formar duas ou mais subunidades.

• conversão do zimogênio à protease ativa pode resultar da ação proteolítica de outra protease, ou de alteração do pH ou temperatura do meio, ou ainda, da adsorção do zimogênio à uma superfície negativa. Esses eventos determinam mudança conformacional e/ou auto-hidrólise pela própria protease.

• ativação é irreversível, e porisso, energeticamente cara para o organismo.

Ativação de zimogênios é um caso específico de modulação covalente exclusivo de alguns tipos de enzimas proteolíticas.