ASAM NUKLEATDNA dan RNAPolimer/PolinukleotidaMonomer : nukleotidaKomponen : gula, fosfat, basa

www.esb.utexas.edu/ mabrybio211/chapter05/ch5.htm

Tulang punggung :Fosfat-gulaBasa dalam untaiAntiparalel

Polaritas : 53 vs 35

Komplemen :Pasangan basa(C=O dan N-H basaantar polinukleotida)

Ikatan fosfodiester(antar nukleotida)

DNA

KROMOSOM VS PLASMID

SEL

DNA : menyimpan dan mentransmisi informasi

genetik

RNA : berperan dalam ekspresi informasi genetik

Protein : hasil dari ekspresi informasi genetik

memiliki fungsi tertentu

DNA vs RNA

Gula: deoksiribosaBasa: AGCTUntai ganda Prokariot: sitoplasma

Eukariot: inti

Penyimpaninformasi

Gula: ribosa

Basa: AGCU

Untai tunggal

Prokariot: sitoplasma

Eukariot: inti dansitoplasma

Hasil transkripsi

PROTEIN

Polimer

Monomer : asamamino (20 aa)

Polaritas :Ujung N - Ujung C

Ikatan peptida

RNA > Protein20 amino acids occur in nature64 different combinations of 4 nucleotides

GUUGUCGUAGUG

UAAUAGCUUCUCCUACUG

GCUGCCGCAGCG

RNA codons

Amino Acid

ASAM AMINO

FUNGSI PROTEIN

Protein struktural kolagen, keratin

Protein fungsional

motilitas : flagelin

Enzim : piruvat kinase

Kontraksi : aktin

Transport : hemoglobin

Hormon : insulin

Reseptor : asetilkolin

Imunoglobulin : antibodi

dll

Asam nukleat vs protein

Nukleotida

Polaritas 5 3

Ikatanfosfodiester

Penyimpaninformasi

Asam amino

Polaritas N C

Ikatan peptida

Hasil ekspresi DNA

SENYAWA TERAPEUTIK

PROTEIN: INSULIN, INTERFERON, STREPTOKINASE, ERITROPOEITIN, ANTIBODI MONOKLONAL, HBsAg

DNA: TERAPI GEN, DNA ANTISENS, OLIGONUKLEOTIDA, VAKSIN DNA

GENOM KROMOSOM - GEN

FENOTIP VS GENOTIP

KROMOSOM DAN DNA

GEN DAN EKSPRESI GEN ..

MENGAPA INFORMASI TENTANG TRANSKRIPSI PENTING?

PROTEIN INGIN DIPEROLEH DALAM JUMLAH BESAR

SALAH SATU STRATEGI ADALAH MENINGKATKAN EFISIENSI TRANSKRIPSI

TRANSKRIPSI

SINTESIS RNA (mRNA, rRNA, tRNA)

RNA POLIMERASE

SITOPLASMA (PROKARIOT)

PROMOTOR (KUAT vs LEMAH)

TERMINATOR (KUAT vs LEMAH)

OPERATOR (REGULASI)

SITUS AKTIVATOR (REGULASI)

mRNA

TRANSKRIPSI

TRANSKRISPI DAN BIOTEKNOLOGI

PROMOTOR DAN TERMINATOR KUAT

PROMOTOR DAN TERMINATOR DIKENALI OLEH RNA POLIMERASE INANG

TRANSKRIPSI BALIK

KEBALIKAN TRANSKRIPSI

RNA DNA (cDNA)

REVERSE TRANSKRIPTASE

VIRUS (RETROVIRUS)

TRANSLASI

SINTESIS POLIPEPTIDA CETAKAN mRNA (tRNA dan rRNATIDAK DITRANSLASI TETAPI BERFUNGSI LANGSUNG)

RIBOSOM RIBOSOM BINDING SITE (RBS) AUG (KODON START) UAA, UGA, UAG (KODON STOP)

INISIASI TRANSLASI PADA PROKARIOT

Ribosome-binding site = (RBS)

A = situs tRNA aminoasil; P = situs tRNA peptidil

Kodon stop Kodon start

TERMINASI TRANSLASI

ORGANISASI GEN PROKARIOT

Promotor

Komponen transkripsi: promotor, terminator, situs inisiasitranskripsiKomponen translasi: RBS, kodon start, kodon stop

Inisiasitranskripsi

Coding sequence

terminator

5

3

3

5

RBS

Kodon start

Kodon stop

TRANSKRIPSI (EUKARIOT)

HASIL TRANSKRIPSI: RNA PRIMER (INTRON DAN EKSON)

PENAMBAHAN CAP DAN EKOR POLI A

PENGHILANGAN INTRON (SPLICING)

RNA MATANG DIKIRIM KELUAR INTI SIAP DITRANSLASI

TRANSKRIPSI (EUKARIOT)

HASIL TRANSKRIPSI: RNA PRIMER (INTRON DAN EKSON)

PENAMBAHAN CAP DAN EKOR POLI A

PENGHILANGAN INTRON (SPLICING)

RNA MATANG DIKIRIM KELUAR INTI SIAP DITRANSLASI

MENGAPA INFO MENGENAI TRANSKRIPSI PADA EUKARIOT PENTING?

PROTEIN DARI EUKARIOT BANYAK DIGUNAKAN SEBAGAI PROTEIN TERAPEUTIK

INFORMASI PADA PROTEIN TERLETAK PADA mRNA MATANG TANPA INTRON

MULAI BEKERJA DARI mRNA MATANG DNA

Transkripsi balik

Masalah pada eukariot adalah genmengandung intron dan ekson

Sintesis DNA menggunakan mRNA sebagai cetakan

DNA hasil sintesis disebut cDNA(tidak mengandung intron)

Katalisis oleh reverse transkriptase

REPLIKASI DAN

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Central Dogma of Molecular Biology

Replikasi

Replikasi adalah penggandaan DNA

Sintesis 2 molekul DNA dari 1 molekul DNA

Konsep pasangan basa

Arah 5 ke 3 pada untai yang disintesis

Dikatalisis oleh DNA polimerase

Mulai pada origin of replication (ori) Protein DnaA mengenali pertama kali Protein pengikat DNA untai tunggal Helikase (pembuka untai) Girase (merelakskan super kumparan) Primase (RNA polimerase) DNA polimerase DNA ligase (menyambungkan fragmen

Okazaki)

Komponen komponen Replikasi DNA

REPLIKASI DNA

Gap filling & DNA repairPol-Replikasi pada mitokondriaPol-Replikasi leading strandPol-Gap filling & DNA repairPol-Replikasi lagging strandPol-

EukariotReplikasiPol IIIGap filling & DNA repairPol IIGap filling & DNA repairPol I

FungsiProkariot

DNA POLIMERASE

PCR :

Polymerase Chain Reaction

(Karry Mulis, 1985)

Perbanyakan DNA in vitro, hanya ditabung reaksi, tidak di dalam sel

Dasar : Struktur DNA

* Ikatan kovalen antara satu nucleosida dan yang lain

*Ikatan hidrogen antara kedua buah strand

PCR

Perbanyakan karena adanya pembentukancopy DNA

Komponen yang diperlukan:

* template DNA

* oligonukleotida pendek (primer)

* DNA polymerase & buffer

* dNTP

PCR Step 1 Thermal Denaturation

PCR Step 2 Annealing of Primer to DNA

DNA

Primer

PCR Step 3 DNA PolymerizationPrimer Extension

DNA

PrimerDNA Polymerase

End of 1st PCR Cycle Double-Stranded DNA Copy (Amplicon)

of the Target Sequence

DNA

Amplicon

PCR End of Second Cycle

cDNA

Amplicon

Biotin

Biotin

Typical PCR cycles

94 oC

55 oC

72 oC

Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3

T

Time (seconds)

Perbanyakan DNA:

eksponensial

2

4

8

16

220

KEISTIMEWAAN PCR?

* DNA Polymerase :

enzim termostabil :Taq Polymerase

* Tidak perlu penambahan enzym di setiapsiklusnya

* Enzym tetap bekerja setelah proses denaturasi

(94oC)Dalam 1 mesin saja

Tahap PCR

* siapkan PCR di dalam tabungreaksi: template DNA, primers, TaqDNA polymerase, dNTP

* reaksi PCR dalam mesin

* perancangan primer

0.5 kb

deteksi

Kontrol PCR

Kontrol positif: DNA templat; harus +

Kontrol negatif: tanpa DNA templat

Kontrol internal: DNA yang ada dalamreaksi

PCR product

PCR KUALITATIF

1400 pbs

500 pbs

PCR KUANTITATIFlisis

PCR

denaturasi

hibridisasisubstrat

deteksi kolorimetri molekul target sinyal

Deteksi kolorimetri

Produk PCRBiotin

Avidin

Horse radish peroxidase

H2O2

TMB

Pelacak

PCR konvensional vsPCR real-time

PCR konvensional: amplifikasidilanjutkan dengan deteksi(konsekutif)

Real-time PCR: amplifikasi langsungdeteksi (simultan)