REPBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELAMINISTERIO PARA EL PODER POPULAR DE EDUCACIN UNIVERSITARIA INSTITUTO UNIVERSITARIO POLITCNICO SANTIAGO MARIOINGENIERA AGRONMICA

Laboratorio de Fitopatologa Salida Practica INIA Mrida (INFORME DE SALIDA PRCTICA)

Autor: Argenis ZambranoAsignatura: FitopatologaProfesor: Ing. Agro. Luis Ral Ramrez

Mrida, Junio de 2015INTRODUCCINLos laboratorios a nivel Fito-sanitario estn facultados para la identificacin y el registro de las enfermedades que perjudican a las plantas en un lugar determinado, adems de dar diagnsticos y posibles enmiendas, para prevenir mayores daos dentro de las reas del cultivo, Las Buenas Prcticas de Laboratorio (BPL) representan un sistema de calidad relativo a los procesos organizativos y condiciones, bajo los cuales se han de planificar, realizar, controlar, registrar, archivar e informar PROGRAMA DE CUMPLIMIENTO DE LAS BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO Rev. 3 (2/2/2004). Dentro del laboratorio se deben optimizar los trabajos bajo parmetros establecidos que permitan realizar y registrar perfectamente los resultados que dan las muestras en el laboratorio.En el Laboratorio de Fitopatologa del INIA Mrida, se ejecutan actividades tanto de investigacin como de descripcin de las enfermedades de las plantas, conjuntamente se trabaja en las siguientes reas: a) Patologa de semillas.b) Estudios de las enfermedades fngicas en plantas. c) Estudios de bacterias de suelos y de plantas.d) Estudios y presencia de nematodos en los suelos.

OBJETIVOSGeneral Ampliar conocimientos en el rea de la asignatura de Fitopatologa por medio de visitas guiadas al INIA (instituto de investigaciones Agropecuarias) Mrida que influyan en formacin de los estudiantes de pregrado en la especialidad de Ingeniera Agronmica.Especifico Familiarizarse con el funcionamiento de los laboratorios de investigacin de fitopatologa ubicado en el INIA Mrida. Examinar el protocolo para la recepcin y anlisis de muestras que son analizadas en el laboratorio de Fitopatologa del INIA Mrida. Reconocer el funcionamiento de los equipos y materiales usados para el diagnstico de las enfermedades en plantas y suelo a travs anlisis Fitopatolgicos.

PARTE TERICA El INIA Mrida se encuentra conformada por profesionales especialistas de gran experiencia en enfermedades de las plantas as como aquellas enfermedades causadas por factores medioambientales. Los trabajos de investigacin y proyeccin que realizan abarcan diversos cultivos. INIA-MERIDA cuenta con modernos laboratorios de fitopatologa, entomologa, suelos, pastos y forrajes y en 2006 el de biologa molecular, a su vez junto al laboratorio de cultivo de tejidos vegetales de Mucuches y el de qumica y calidad del cacao en San Juan de Lagunillas, constituyen una formidable herramienta tecnolgica de apoyo para el desarrollo agrcola del estado Mrida y de los estados vecinos, dicha institucin deja de ser un espacio para la formacin de investigadores y se convierte en actor fundamental para el desarrollo de las condiciones de vida de los ciudadanos y las generaciones futuras.LA INSTITUCINEn el INIA se trabaja para dar impulso la agricultura como una contribucin a la instauracin de la prosperidad del pas, reconociendo su importancia fundamental como medio de vida de miles de familias rurales en Venezuela. Esta tarea, en la prctica se centra en la bsqueda de una mejora sustantiva de la eficiencia y la eficacia operacional, tanto en el logro de los productos, como en la calidad de los servicios prestados por nuestra institucin.MISINSe impulsa la innovacin tecnolgica agroalimentaria para optimizar la funcin produccin en el sistema agroalimentario nacional, bajo la estructura social comunal, en el marco del modelo agrario socialista.VISINEs una institucin componente del sistema agrario nacional, dedicado a la innovacin agroalimentaria, que permite fortalecer los valores ticos socialistas del modelo agrario vigente, como instrumento para la nueva sociedad; que reconoce y promueve la cultura ancestral, tradicional, formal e informal en la consolidacin del socialismo revolucionario, cientfico y bolivariano.

Los Laboratorios de Fitopatologa realizan anlisis fitopatolgicos. Se realizan estudios tanto a suelos como a plantas. Cuenta con capacidad tcnica para determinar especies de hongos, bacterias y nematodos. Si se envan muestras al laboratorio de fitopatologa, los resultados indicarn el estado sanitario del suelo y, en caso de ser necesario, se recomendarn las prcticas y tecnologas a aplicar para sanear o controlar los patgenos presentes.El Laboratorio de Fitopatologa INIA MERIDA, es un espacio donde se llevan a cabo distintas actividades como trabajos de investigacin, se les brinda apoyo a investigadores, se atiende a otras instituciones educativas sobre el funcionamiento del mismo, sealando que su actividad principal es atender las necesidades de enseanza y puedan realizar experimentos prcticos necesarios para comprobar los conocimientos tericos que se les imparte en el aula y proporcionarles las herramientas para realizar aplicaciones reales de los conocimientos adquiridos.En el Laboratorio de Fitopatologa se imparten prcticas relacionadas con la observacin e identificacin de microorganismos patgenos como: hongos, bacterias, nematodos. Tambin se observan e identifican microorganismos no patgenos de cultivos que forman parte de la microflora del suelo. Para muchas personas la produccin agrcola es su nica fuente de sustento y si sta falla o no es lo suficientemente rentable, la familia del productor se ver afectada, as como el suministro de productos agrcolas al resto de la comunidad o regin

PARTE EXPERIMENTAL DE CAMPO El laboratorio de fitopatologa cuenta con la infraestructura necesaria y el equipamiento suficiente para la observacin e identificacin de hongos, bacterias y nematodos fitopatgenos, y para cubrir las necesidades del mismo. Las clulas y los tejidos para llevar a cabo sus funciones normales no puede verse afectada por ningn patgeno, si est se encuentra afectada, disminuye o se anula por completo su capacidad productora; como resultado, la planta muere o merma su crecimiento. La identificacin de la especie que causa sntomas en una planta, deben clasificarse, este paso es necesario para lograr la identificacin y el control de cualquier enfermedad de las plantas. TCNICAS DE TINCIN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAO Y AGRUPACIN CELULAR.Como las clulas bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de colorantes para hacerlas ms ntidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear tcnicas de coloracin simples o diferenciales. Tincin simple. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos ms valiosos que se tienen para la tincin de bacterias. Es excelente para las bacterias del gnero Curtobacterium donde puede demostrar el perlado y los grnulos. En los bacilos esporulados (Bacillus), teidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos no teidos dentro de clulas azules. Tincin diferencial. Una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas es la Tincin de Gram., porque no solo permite determinar la forma y agrupacin de las bacterias, sino tambin es de considerable valor en la identificacin y clasificacin, al separar a las bacterias en gram negativas y gram positivas.

IDENTIFICACIN DE GNEROS DE NEMTODOS FITOPARSITOS. Los nemtodos Fitoparsitos abarcan un gran nmero de gneros y especies de gran importancia agrcola. El conocimiento de la sintomatologa, morfologa, biologa y control es de inters fundamental para el parasitlogo. El control de los nemtodos fitoparsitos, se basa en una identificacin correcta del nematodo en cuestin, de ah que sea importante conocer las caractersticas morfolgicas ms importantes de los principales gneros de estos patgenos.MTODO DE EXTRACCIN DEL EMBUDO DE BAERMANNA continuacin se describe la tcnica del embudo de Baermann, pues no requiere ningn equipamiento especfico y puede ser empleada fcilmente sin la necesidad de conocimientos tcnicos en el manejo de aparatos de laboratorio.Material necesario 10 g de suelo o 25 g de material vegetal Embudo de vidrio de 10 cm. de dimetro Soporte de madera o metal para los embudos Filtro de tela, algodn o celulosa sobre un tamiz que ejerza de soporte del suelo o material vegetal Manguerita de goma o silicona de 10 a 15 cm. de largo Pinzas o clips para cerrar las mangueritas Recipiente para recoger la suspensin de nematodos tras la migracin Placa de recuento y microscopio o Lupa binocular

Procedimiento1. Se colocan los embudos sobre los soportes de madera o metal, las mangueritas en la parte final de los embudos y se cierran con pinzas o clips.2. La muestra de suelo se tamiza a travs de una malla de 0,5-1 cm., se mezcla cuidadosamente y se toman unos 100 g para ser colocados sobre el filtro de tela, algodn o celulosa, sostenido por un tamiz o malla de unos 2 mm de apertura. El material vegetal se macera o trocea finamente y se toman entre 5 y 25 g que se colocan sobre el filtro.3. Se coloca el tamiz con la muestra sobre el embudo y se llena ste de agua hasta que cubra ligeramente el suelo o material vegetal.4. Se permite la migracin de los nematodos del suelo al agua durante 48 horas como mnimo, aunque en algunos casos puede durar hasta 7-14 das. Es preciso revisar el nivel de agua peridicamente a fin de evitar la desecacin de la muestra.5. Abrimos el clip y recolectamos los nematodos en un recipiente.6. Pasamos una alcuota de la suspensin a una placa de recuento y contamos en el microscopio.MTODO DE EXTRACCIN DE NEMATODOS QUSTICOSLos quistes de Globodera y Heterodera se extraen mediante la tcnica del embudo de Fenwick, la cual se basa en la propiedad de los quistes de flotar en agua, ayudados por una burbuja de aire que se forma en su interior. Para que est tcnica sea eficaz es necesario que el suelo que contiene los quistes haya sido desecado previamente. Los quistes se recogen en un tamiz de unas 150 m de apertura de malla y luego sobre un papel de filtro del que se pescan y cuentan. Para obtener el humero de huevos viables es necesario abrirlos individualmente o triturarlos y contar el nmero de juveniles vivos.AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMASEl aislamiento consiste en el proceso de separacin de microorganismos a partir de su sustrato natural (plantas) para hacerlas crecer en un medio de cultivo artificial. El aislamiento y cultivo persigue diversos fines, el ms comn en un laboratorio de fitopatologa es para diagnosticar la causa de una enfermedad desconocida, sin embargo, puede tener objetivos didcticos o de investigacin sobre taxonoma, fisiologa y gentica microbiana. Es comn tambin cuando se quiere tener cepas puras en la evaluacin de productos qumicos in Vitro. El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de la biologa de estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo: a) pueden ocurrir mutacionesb) se puede perder parcial o totalmente su patogenicidadc) los hongos pueden o no formar cuerpos fructferos en medios artificiales; estos cuerpos pueden presentar variacin, d) existen hongos que no se pueden cultivar (parsitos obligados) y otros que requieren medios complejos para su desarrollo. Las tcnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar y de la propia experiencia del investigadoLas enfermedades de las plantas son importantes para el hombre debido a que perjudican sus productos. Dentro de las enfermedades presentes que actualmente se analizan en el laboratorio de fitopatologa de INIA del estado Mrida se pueden enumerar las siguientes:1. Enfermedades ocasionadas por hongos.2.Enfermedades ocasionadas por bacterias.3. Enfermedades ocasionadas por nematodos.Cuando ingresa una muestra al laboratorio, se recoge una informacin detallada del lugar, da y persona que tomo dicha muestra adems de otros datos que permitan al momento de obtener un resultado, dar las recomendaciones pertinentes al caso con la finalidad de no alterar el equilibrio ecolgico. En el recorrido se observaron, tanto los equipos los materiales y parte del protocolo (anteriormente mencionado) y procedimiento para el anlisis de las muestras Fitopatgenas vase la imagen 1 donde se observa una cmara de flujo laminar en la cual se trabaja se realiza la siembra de microorganismos protegidos del medio exterior para evitar las contaminaciones.

Imagen 1.- Cmara de flujo laminar Por otro lado se lograron observar muestras de bacterias de hongos y nematodos que fueron y que estaban siendo analizados por el personal del laboratorio, que muy amablemente nos permitieron compartir parte de sus experiencias y de algunas de las investigaciones que en dicho laboratorio se realizan.Las siguientes imgenes representan parte del material observado en la lupa estereoscpica y a simple vista en las instalaciones, en las imgenes se observa las colonias de las bacterias (imagen 3 inferior), y la forma en la cual son sembradas las bacterias en los medios de cultivo (imagen 2 Superior).

Imagen 2.- forma de siembra de bacterias en medios de cultivo.

Imagen 3.-Colonias de bacterias observadas en la lupa.

Imagen 4.-Siembra de Bacterias en medios de cultivo

Imagen 5.-Papa conservada con sintomatologas de Ralstonia

Imagen 6.-Forma de determinar si una planta presenta bacterias en los tejidos vasculares

Imagen 7.-Observacin de quistes de nematodos en la lupa estereoscpica

CONCLUSIN La importancia de las prcticas se fundamenta en la vinculacin teora-prctica, que es una necesidad ineludible en el proceso de enseanza- aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biolgicas, y de la Ingeniera Agronmica, esta premisa se debe reproducir en el caso particular en todas las asignaturas que se imparten en el Instituto Universitario Politcnico Santiago Mario. Estas iniciativas permiten que los estudiantes tengan las herramientas bsicas para trabajar en el manejo de microorganismos, manejo de equipo y otros materiales en el laboratorio de fitopatologa. De tal manera que se incluyen los procedimientos para el anlisis de muestras de vegetales en la identificacin y/o deteccin de agentes fitopatgenos, La participacin en estas actividades de formacin adems de la identificacin de los microorganismos que causan las sintomatologas es de suma importancia para la formacin acadmica y por sobre todo para resolver la problemtica que ha existido en el campo, las tcnicas de laboratorio aplicadas por esta institucin (INIA). Debido a esto podemos indicar este tipo de actividades contribuye de manera eficiente en la investigacin y en la formacin de futuros profesionales capacitados en la determinacin de enfermedades en cultivares.