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Inn. Vet. Med. • N.o 33 • Settembre 2016 1

N.o 33 • Settembre 2016

Atti Enteric Winter Tour (EWT)Ottobre 2016 – Febbraio 2017

•Editoriale ................................................................................. 2•Microbiomaintestinale:conoscerloerispettarlo

(Tommaso Furlanello) - Introduzione .............................................................................. 3 - Formazione del microbiota intestinale ........................................ 4 - Distribuzione dei batteri, dal cavo orale alle feci ........................ 4 - Variazioni del microbiota intestinale ........................................... 5 - Funzioni del microbiota intestinale ............................................. 5 - Disbiosi: uno squilibrio microbico associato ad una patologia ..... 6 - Glossario essenziale ................................................................... 7 - Riferimenti ................................................................................ 7

•PEA-m:unavia“secondoNatura”perlaprotezioneentericadelcaneedelgatto

(Maria Federica della Valle, Alda Miolo, Cristina Medori) - PEA: un endocannabinoide a meccanismo ALIA ........................ 8 - PEA nel distretto gastrointestinale .............................................. 9 - Evidenze pre-cliniche ................................................................. 9 - Evidenze cliniche in gastroenterologia veterinaria .................... 10 - Conclusioni ............................................................................. 11 - Riferimenti ............................................................................... 11

Approccioalla diarreadel cane

Atti Enteric Winter Tour (EWT)Approccio alla diarrea del cane

INNOVATION IN VETERINARY MEDICINE

Semestrale di Scienze Veterinarieregistrato presso il Tribunale di Milanoil 18/2/2000 al n° 128

Proprietario: Innovet Italia srl, Milano

Direzione ed Edizione: Centro di Documentazione e Informazione Scientifica (Ce.D.I.S.) InnovetVia Einaudi, 13 35030 SaccolongoTel. (+39) 049.80.15.583 Fax (+39) 049.80.15.737E-mail: cedis@innovet.it Web: www.innovet.it

Direttore Responsabile: M. Federica della Valle

Tipografia: Nuova Jolly di Bastianello IvanoViale dell’Industria, 28 35030 Rubano

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Invio articoli citatiGli articoli citati nelle sezioni “Riferimenti” sono disponibili presso il CeDIS (Centro di Documentazione e Informazione Scientifica). Per richiedere l’invio gratuito di una copia (al solo scopo di studio personale) inviare una mail a cedis@innovet.it, indicando il codice riportato tra parentesi alla fine del riferimento bibliografico specifico. Per accedere a BiblioVet, il servizio di documentazione on line disponibile alla sezione CeDIS, è sufficiente registrarsi sul sito www.innovet.it

Tutte le malattie hanno origine nell’intestino(Ippocrate, V secolo a.C.)

EditorialeInnovation in Veterinary Medicine dedica questo numero agli atti dell’Enteric Winter Tour (EWT), una tournée di incontri scientifici in giro per l’Italia, organizzata da ottobre 2016 a febbraio 2017. Lo scopo è di fornire al veterinario di base consigli pratici e soluzioni innovative per gestire nella maniera più corretta ed efficace la diarrea del cane. Il mio ringraziamento speciale va a Tommaso Furlanello, autorevole internista veterinario (nonché diplomato patologo clinico), per aver dato la piena disponibilità a condurre in prima persona l’EWT, spiegando, tappa dopo tappa, “cosa fare”, ma soprattutto “cosa non fare” nella gestione degli squilibri intestinali del cane.Tema principale dell’EWT – e quindi di questo numero della nostra rivista - è l’ecosistema incredibilmente complesso di comunità microbiche e relativa massa genetica (tecnicamente noto come “microbioma”) che, se rispettato nella sua equilibrata composizione, è cruciale per la tutela della salute intestinale e del benessere immunitario del cane e del gatto. Così come, quando questo equilibrio viene perso (si parla allora di “disbiosi”), il microbioma alterato diventa il diretto responsabile di tanti invalidanti disturbi intestinali del piccolo animale, dalla diarrea acuta e cronica all’IBD, oltre che di condizioni più generalizzate come obesità, diabete e, perfino, asma e atopia. Dall’EWT emerge dunque una visione critica aggiornatissima della distribuzione e delle funzioni del microbioma intestinale, ma anche delle disbiosi e delle tante cause che la determinano (es. uso poco ragionato degli antimicrobici).A chiusura di questo numero di InnVetMed, un breve articolo a cura del nostro CeDIS fornisce una visione chiara e sintetica del potenziale di utilizzo della PEA-m (Palmitoiletanolamide micronizzata) come via “secondo Natura” per la protezione enterica del cane e del gatto. A cominciare dalla descrizione della PEA come bioregolatore endogeno multitasking dell’intero ambiente enterico (barriera intestinale compresa). Per proseguire e concludere con le evidenze pre-cliniche e ciniche ottenute con l’utilizzo di questa straordinaria sostanza fisiologica in diversi modelli e quadri clinici di infiammazione enterica e ipermotilità funzionale.

Buona lettura!

Renato della ValleAmministratore Unico Innovet

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IntroduzioneUna vera rivoluzione tecnologica ha radicalmente e irreversibilmente modificato la nostra conoscenza relativamente al ruolo dei microorganismi nelle condizioni di omeostasi e di malattia. Per decenni abbiamo descritto i batteri, presenti nell’ambiente o sopra e dentro i nostri corpi, limitati dalle modestissime informazioni che potevamo ottenere dagli esami colturali, che permettono di far crescere non più del 3% dei batteri (box 1). Il 97% quindi ci era inaccessibile.1

Negli ultimi anni, grazie alle nuove tecnologie (tabella 1) 2 è stato possibile scoprire l’incredibile biodiversità del microbioma, ovvero la massa genetica corrispondente a batteri, virus e funghi che sono ospitati nel nostro organismo e in quello dei nostri animali. Ci riferiamo ad immense varietà e quantità di materiale genetico e di cellule: il 90% delle cellule presenti in un essere umano sono di origine batterica e dispongono di 9 milioni di geni, contro i 20.500 geni appartenenti al genoma umano.3 Limitandosi al microbiota intestinale, ci riferiamo a 500-1000 specie batteriche che assommano a 1014 batteri,4 a determinare un peso totale di 1-2 kg.5

La presenza di un normale e vitale microbioma è fondamentale per mantenere l’integrità dell’ospite.

Microbioma è la massa genetica della comunità microbica (microbiota) che popola l’intestino.

Microbioma intestinale: conoscerlo e rispettarloTommaso FurlanelloMed Vet, Ph.D, Diplomato ECVCP (European College of Veterinary Clinical Pathology)Clinica Veterinaria San Marco, Padovatf@sanmarcovet.it

Box 1

• Mancanza di informazioni relativamente ai fabbisogni di crescita.• Predominanza di anaerobi, difficili da far crescere e mantenere vitali.• Impossibilità di ricreare in vitro l’ecosistema originario, che deriva

anche da interazioni tra differenti batteri e altri microorganismi, quali Archaea, virus e funghi.

Perché è difficile ottenere una coltura dalla gran parte dei batteri (in particolare nel tratto gastroenterico)?

Metodica Descrizione Pro Contro

Ibridazione fluorescente in situ (FISH, Fluorescence in situ hybridization)

Oligonucleotidi (sonde) marcati con coloranti fluorescenti vengono ibridati con sequenze di RNA ribosomiale nelle cellule batteriche

Identificazione, quantificazione e visualizzazione delle cellule batteriche presenti nei tessuti (luminali versus aderenti alle cellule versus mucoso-invasive)

Laboriosità, necessità di sviluppare le sonde fluorescenti per l’ibridazione in situ (FISH) per ogni gruppo batterico di interesse

PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)

Gli organismi bersaglio vengono evidenziati in tempo reale (real-time) con l’utilizzo di primer (filamenti di innesco) e/o sonde marcate con coloranti fluorescenti

Sensibilità (rilievo e relativa quantificazione dei gruppi batterici in un campione); velocità (poche ore); convenienza economica

Necessità di sviluppare i saggi per ogni gruppo batterico di interesse

Sequenziamento di nuova generazione (es. 454-pyrosequencing, Illumina)

I batteri presenti in un campione sono amplificati con l’uso di primer universali; i frammenti PCR di DNA (ampliconi) vengono poi sequenziati tramite un sistema di sequenziamento ad alta resa

Teoricamente, identificazione di tutti i batteri presenti in un campione; indagine semi-quantitativa; indica le variazioni relative dei gruppi batterici all’interno della comunità microbica

Richiede conoscenze avanzate di bioinformatica; cicli lunghi; probabilità di segnali falsi positivi dai reagenti

Metagenomica (sequenziamento mediante tecnica shotgun di DNA genomico)

Il DNA genomico viene frammentato e successivamente sequenziato a random (senza amplificazione PCR) su sequenziatore ad alta resa

Fornisce non solo l’identificazione dei batteri, ma anche dei geni funzionali presenti nel campione

Molto costoso, richiede conoscenze avanzate di bioinformatica

Tabella 1Metodichecomunementeutilizzateperlacaratterizzazionedelmicrobiotaintestinale (da: Suchodolski JS, 2016) 2

Rimanendo in ambito intestinale, il microbiota difende da patogeni residenti e non residenti, partecipa allo sviluppo e al mantenimento del normale epitelio intestinale e realizza alcune azioni metaboliche che non possono essere portate a termine da esseri umani e carnivori domestici.6 Il campo in cui si sta maggiormente concentrando la ricerca è inoltre legato alle interazioni con il sistema immunitario locale e sistemico,7 che verranno successivamente e sommariamente descritte più avanti nel testo.

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Æ AsmaÆ AllergiaÆ Sovrappeso ed obesitàÆ Malattia infiammatoria intestinale (IBD)

Tabella 2Possibiliconseguenzediterapieantimicrobicheinetàpediatrica 10,11

Box 2

Gli“altri”microbiomiIl testo di questo articolo si è focalizzato sul microbioma intestinale. Va considerato però che che ogni singolo distretto corporeo, essere vivente o oggetto inanimato dispone di un proprio microbioma, solitamente persistente nel tempo e in grado di influenzare e modulare le caratteristiche dell’ospite. Di seguito verranno riportati alcuni esempi.

1. Pierazan F, Olivry T, Paps JS et al. The skin microbiome in allergen-induced canine atopic dermatitis, Vet Dermatol. 2016 Aug 3. doi: 10.1111/vde.12366 [Cod. 21359]

2. Ericsson AC, Personett AR, Grobman ME et al. Composition and predicted metabolic capacity of upper and lower airway microbiota of healthy dogs in relation to the fecal microbiota. PLoS One. 2016;11(5):e0154646 [Cod. 21360]

3. Thomas-White K, Brady M, Wolfe AJ et al. The Bladder Is Not Sterile: History and Current Discoveries on the Urinary Microbiome, Curr Bladder Dysfunct Rep. 2016; 11:18–24 [Cod. 21361]

4. Narasimhan S, Fikrig E. Tick microbiome: the force within. Trends Parasitol. 2015;31(7):315-23 [Cod. 21362]

5. Dhami NK, Reddy R, Mukherjee A. Application of calcifying bacteria for remediation of stones and cultural heritages, Front Microbiol. 2014; 5:304 [Cod. 21363]

Cute1 La cute è un ecosistema complesso, colonizzato da una ampissi-ma varietà di microorganismi, che comprendono batteri, funghi e virus. L’integrità della cute dipende dal loro equilibrio. Ad esempio, la presenza di una disbiosi, con riduzione della biodiversità, può indurre reazioni aller-giche nei cani atopici. Ciò indica, almeno per quanto riguarda l’atopia del cane, che la disbiosi precede lo sviluppo delle lesioni cutanee e non è una semplice conseguenza della progressione del danno tissutale.

Vie respiratorie2 Equivocando i risultati degli esami colturali, in passa-to si era erroneamente ritenuto che le basse vie respiratorie fossero sterili. In realtà, esiste un ricco microbiota, formato da batteri che non crescono nei normali terreni. Esistono anche differenti microbioti per ogni distretto respiratorio, a partire dal naso per arrivare agli alveoli polmonari. Alcuni batteri, costantemente individuati con i test di biologia molecolare, sono da considerarsi tra i patogeni (es. Pseudomonas spp. o Acinetobacter spp). In analogia con quanto accade in ambito gastroenterico con Clostridium difficile, si ritiene che la loro patogenicità si possa amplificare in presenza di una disbiosi locale, legata in particolare all’utilizzo di antibiotici. Anche in corso di malattie polmonari, sia infettive, che allergiche e degenerative, si osserva disbiosi. La ricerca è estremamente attiva nel capire se le alterazioni del microbioma sono cause e/o conseguenze di tali patologie, in modo tale da poter sfruttare dal punto di vista sia diagnostico che terapeutico le popolazioni batteriche presenti in salute o in malattia.

Vie urinarie/vescica3 In condizioni di normalità, le urine raccolte per cistocentesi non sono sterili, essendo presente un variegato micro-bioma, con abbondante presenza di Lactobacillus e Gardnerella. Con le metodiche molecolari si possono anche isolare Enterobacteriaceae, quali Escherichia, Klebsiella e Proteus. Una crescita è possibile solo modificando radicalmente le tecniche colturali e adattandole alle esigenze dei batteri che si stanno via via individuando con le tecniche molecolari. Il microbiota presenta un pattern differente nei pazienti umani affetti da incontinenza e ciò rappresenta un altro campo di indagine in rapida espansione, in particolare considerando le potenziali possibilità terapeutiche offerte dai probiotici. Inoltre è di grande interesse la moderna teoria secondo cui le infezioni da catetere sono causate dal danno anatomico a carico delle vie urinarie, a sua volta in grado di facilitare la crescita di batteri residenti piuttosto che importati dall’ambiente con la procedura di cateterismo.

Zecche4 Oltre alla presenza dei noti patogeni, nelle zecche è presente un microbioma molto ricco e differenziato a seconda delle strutture anato-miche (ghiandole salivari, intestino, organi riproduttivi, etc.). Si osservano batteri sia aerobi che anaerobi, con predominanza di gram-negativi. Il microbioma influenza il grado di patogenicità e la capacità di trasmissione dei patogeni.

Monumenti storici5 Utilizzando il marmo antico come esempio, si deve considerare che il suo deterioramento è causato principalmente da fenomeni biotici, tra cui l’effetto del microbioma residente, con presenza, tra gli altri, di batteri in grado di produrre un biofilm, che a sua volta è un microbioma distinto. La modulazione dei batteri presenti rappresenta l’obiettivo di una nuova disciplina chiamata microbial geotechnology, che si prefigge di proteggere i monumenti dalla degrazione indotta da microbiomi non idonei.

Formazione del microbiota intestinaleSono disponibili scarse informazioni relative alla colonizzazione batterica dei cuccioli di cane e di gatto, ma ragionevolmente ci si può riferire a quanto descritto nella specie umana e in animali da esperimento. I neonati nascono in una condizione di presunta sterilità, anche se si deve considerare che esiste un microbiota placentale che probabilmente causa una prima colonizzazione del feto già nella vita intrauterina.8 La maggior parte dei batteri che vanno a localizzarsi nel neonato provengono dal canale del parto (se naturale) o da altre fonti. L’iniziale popolazione batterica intestinale comprende prevalentemente aerobi, ma nelle settimane che seguono prevarranno gli anaerobi. Anche gli altri microbiomi, ad esempio cutaneo e respiratorio (box 2), evolvono in modo simile.9 Un corretto sviluppo del microbiota intestinale è indispensabile per una contemporanea maturazione del sistema immunitario. Si può facilmente comprendere quindi come forti variazioni della flora microbica, come comunemente avviene in corso di terapie antibiotiche, si possono accompagnare in età pediatrica a rilevanti ed irrimediabili complicazioni che accompagneranno il soggetto a vita (tabella 2).10,11

Distribuzione dei batteri, dal cavo orale alle feciCome accennato in precedenza, il numero complessivo di batteri presente nel tratto gastroenterico è elevatissimo e riferibile a 100 milioni di milioni di batteri.12 La quantità di batteri varia dal cavo orale (1012), con minori quantità nello stomaco (103-104), per aumentare poi progressivamente nel grosso intestino, arrivando a 1011 batteri per grammo di contenuto intestinale.13 Procedendo in senso aborale, oltre alla numerosità aumenta anche la biodiversità, con predominanza nel piccolo intestino di aerobi ed anaerobi facoltativi, mentre nel grosso intestino prevalgono gli anaerobi.2

I principali phyla batterici, sia nel cane che nel gatto, sono rappresentati da Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria e Fusobacteria, costituendo circa il 99% di tutto il microbiota (Figura 1).2,14 Per altri ricercatori nel gatto si possono osservare anche quote importanti di Actinobacteria,15 che sono anche ben rappresentati nel microbioma intestinale umano.7 Per quanto riguarda le classi, Clostridia è la predominante, con più del 65% delle sequenze che descrive gruppi quali Clostridium clusters XIVa e XI e Ruminococcus.16

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Variazioni del microbiota intestinaleSi deve considerare che il microbiota, anche in condizioni di normalità, è fortemente influenzato dalle condizioni ambientali, dall’alimentazione, dall’età (ad esempio nel gatto anziano e nell’uomo diminuiscono i Faecalium bacterium fecali),15 dalla razza e da altre caratteristiche individuali.16 È interessante notare però che, in assenza di disbiosi, le attività metaboliche/funzionali, anche in presenza di differenze importanti a livello di genere batterico o addirittura di phylum, tendono a essere mantenute anche tra specie differenti.10

Figura1. Distribuzione dei principali phyla battericinei diversi tratti gastro-intestinali del cane.14

Funzioni del microbiota intestinaleIn linea generale, il microbiota intestinale esercita numerose ed insostituibili funzioni: di natura metabolica (tabella 3), di supporto all’integrità della mucosa intestinale, di controllo nei confronti di batteri patogeni e di educazione e modulazione del sistema immunitario (tabella 4). Tali attività sono sintetizzate in numerosi lavori di review, che sottolineano il ruolo e le implicazioni fisiopatologiche del microbiota intestinale.4,7,10,16

Di estremo interesse è la produzione di acidi grassi a catena corta (Short Chain Fatty Acids, SCFA), che sono il frutto dell’attività metabolica di numerosi batteri, tra i quali nel cane si possono citare Faecalibacterium prausnitzii, Eubacterium rectale, Eubacterium hallii e Ruminococcus bromii.16 I principali SCFA sono l’acido acetico, l’acido propionico e l’acido butirrico. A tali SCFA competono attività indispensabili quali: l’assorbimento di minerali ed elettroliti; lo stimolo alla circolazione mucosale e al metabolismo, proliferazione e differenziazione cellulare; lo stimolo al rilascio di muco; e l’azione preventiva sulle coliti, oltre che antineoplastica sui tumori intestinali. Le loro azioni si realizzano anche a livello sistemico, rappresentando una fonte energetica, regolando la pressione sistemica ed esercitando importanti interazioni con l’immunità. In particolare, gli SCFA sono in grado di regolare l’attività dei linfociti Treg e modulare la funzione dei linfociti Th2. Anche clinicamente si possono osservare gli effetti immunomodulanti degli SCFA. Ad esempio, l’incremento di fibra nella dieta, con conseguente aumentata produzione di propionato, riduce la gravità dell’asma.17,18 Gli SCFA possono essere misurati con grande accuratezza nelle feci, permettendo di valutare l’integrità del microbiota e fornendo dei dati oggettivi per valutare l’efficacia di manipolazioni dietetiche o di prebiotici e probiotici (Figura 2).Infine, non deve essere tralasciato l’effetto protettivo di commensali e simbionti nei confronti di batteri patogeni (patobionti), capaci come sono di inibirne la crescita per sottrazione delle risorse metaboliche (es. glucidiche), impedirne l’aderenza alla superficie dell’epitelio intestinale grazie alla stimolazione della produzione di muco e di peptidi antimicrobici, e regolarne la virulenza tramite meccanismi non ancora ben definiti.19 Un altro meccanismo protettivo molto importante per contrastare le infezioni da Clostridium difficile è dato dalla deconiugazione degli acidi biliari primari compiuta da alcuni batteri, tra i quali Clostridium scindens. Gli acidi biliari secondari, frutto di questa deconiugazione, esercitano infatti una rilevante azione inibente sulla crescita delle forme vegetative di C. difficile (tabella 4).20

Tabella 3

Æ Digestione di polisaccaridi complessi e produzione di acidi grassi a catena corta (SCFA, Short Chain Fatty Acids)

Æ Sintesi endogena di vitamine ed aminoacidiÆ Metabolismo degli acidi biliariÆ Metabolismo lipidicoÆ Degradazione degli ossalati dietetici

Attivitàmetabolichecontrollatedalmicrobiotaintestinale

Tabella 4

Æ Facilita la maturazione del sistema immunitario intestinale

Æ Modula in senso anti-infiammatorio i linfociti Treg, i recettori Tool-like e i recettori NOD2

Æ Favorisce la produzione di acidi biliari secondari e indolo, con azione antibatterica

Interazionidelmicrobiotaintestinaleconl’immunitàlocaleesistemica

Figura2. Quantità fecali di acidi grassi a catena corta (SCFA) in cani e gatti sani [Laboratorio di Analisi Veterinarie San Marco, Padova, 2016]

H3C O-

O

Acetato

Cane: 0,02 - 0,95Gatto: 0,04 - 0,89

H3CO-

O

Cane: 0,03 - 0,54Gatto: 0,1 - 0,86

PropionatoH3C O-

O

Cane: 0,02 - 2,12Gatto: 0,02 - 0,61

Butirrato

SCFA e formula stechiometrica

Quantità misurabili nelle feci in condizioni di normalità (mmol/gr di feci)Metodica: gascromatografia abbinata alla spettrometria di massa (GC-MS)

Firmicutes

Proteobacteria

Bacteroidetes

Spirochaetes

Fusobacteria

Actinobacteria

Duodeno

Digiuno

Colon/Feci

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(B)

(A)

Treg

CD

Tn

ML

Th17

Th1

LB

Iga

(C)

MΦ

MC

V

N

Ambiente(es. stress, allergeni)

Tossine(es. alimentari)

Malattie sistemiche(es. diabete, obesità)

Genetica

Farmaci(es. antibiotici) Disbiosi

Infezioni

Disbiosi: uno squilibrio microbico associato ad una patologiaL’intestino ospita centinaia di differenti specie batteriche, alcune delle quali protettive ed altre potenzialmente patogene. In condizioni normali si realizza una interazione tra l’ospite e il microbiota, che coinvolge anche altri microrganismi quali Archaea, virus e funghi, finalizzata al mantenimento della salute intestinale e alla limitazione della presenza e crescita di possibili patogeni. Quando si verificano delle alterazioni in questo equilibrio per variazioni della flora, della sua composizione funzionale e attività metabolica, o della sua distribuzione locale, si parla di una condizione di disbiosi. Esistono 3 meccanismi di disbiosi: 1) la perdita di microorganismi benefici: 2) l’eccessiva crescita di microorganismi potenzialmente patogeni; e 3) la perdita della diversità microbica.21 Grazie alle moderne techniche di biologia molecolare, sono stati individuati pattern di disbiosi in un elevato numero di stati patologici, alcuni dei quali apparentemente non direttamente collegati al tratto gastroenterico (es. diabete mellito). Rimane da stabilire, caso per caso, se le anomalie del microbiota siano la causa della patologia descritta, o piuttosto la loro conseguenza.22 L’accumularsi di innumerevoli ricerche su uomo e roditori e, in parte, anche sui carnivori domestici, sta indirizzando verso un ruolo sempre più importante delle disbiosi, non tanto come semplice effetto secondario di altre patologie, quanto piuttosto come evento patogenetico fondamentale, anche in grado di modificare la risposta immunitaria, sia innata che acquisita, dell’ospite (Figura 3). In questo senso, l’obesità rappresenta un esempio di estremo interesse. Infatti, nei pazienti umani obesi il microbioma differisce

Æ Diminuzione della biodiversità battericaÆ Riduzione di batteri produttori di SCFA (es. Fusobacteria) Æ Aumentata presenza di Enterobacteriaceae sulla superficie mucosale

Tabella 5AlcunemanifestazionididisbiosiosservateincorsodiIBD2, 24

in maniera significativa da quello degli individui sani, presentando una minore quota di Bacteroidetes, maggiori quantità di Firmicutes e una minore biodiversità. Tale squilibrio incrementa la capacità di assorbire nutrienti dalla dieta, con feci che presentano un minor contenuto energetico. Si modifica anche l’utilizzo e lo stoccaggio dei nutrienti. Il ruolo della disbiosi nell’obesità viene altresì ben dimostrato dal trapianto di feci da roditori obesi a roditori normali. La colonizzazione dell’intestino con il microbiota anomalo determina, nell’arco di alcune settimane, la trasformazione del ricevente, con l’instaurarsi della condizione di obesità.23

Nel cane, è dimostrata una disbiosi: (a) in presenza di enteropatie croniche, IBD compresa (tabella 5); e (b) in caso di diarrea acuta, sia da stress, che infettiva o secondaria ad alimentazione inappropriata. Inoltre, tutte le alterazioni della motilità intestinale modificano la flora microbica. È stata descritta una disbiosi anche in caso di insufficienza pancreatica esocrina.12

In medicina umana, per motivare la diffusione nel mondo occidentale delle disbiosi e, di conseguenza, di alcune condizioni associate, quali la già citata obesità, il diabete mellito, l’IBD, l’asma e altre, sono state considerate due teorie, che, a nostro parere, possono essere prese in considerazione anche per i piccoli animali. Ci si riferisce in particolare alla teoriadell’igiene, tale per cui la mancata esposizione ad un’adeguata flora microbica

Figura3

Disbiosiesistemaimmunitario:principaliinterazioni.

La disbiosi è scatenata da molteplici fattori: genetici, ambientali, infettivi, iatrogeni e sistemici. La disbiosi danneggia direttamente l’integrità e la permeabilità della barriera epiteliale (A) e induce pesanti alterazioni a carico della risposta immunitaria enterica, sia innata che acquisita (B). In particolare, specifici componenti/tossine dei patobionti (batteri patogeni) stimolano la secrezione di citochine pro-infiammatorie e pro-ossidanti sia dai macrofagi (MΦ) che dalle cellule dendritiche della lamina propria (CD). Ciò induce lo sviluppo e l’attivazione di specifiche sottopopolazioni di linfociti implicate nell’infiammazione intestinale (Th1 e Th17), da una parte, e l’inibizione di altri subset linfocitari a significato regolatorio e immunodifensivo (Treg), dall’altra (B). In aggiunta, tale disequilibrio si ripercuote anche sui linfociti B (LB) e sulla produzione di IgA a significato protettivo. Infine, i mastociti residenti (MC) vengono direttamente attivati dai componenti microbici specifici, e rilasciano per degranulazione incontrollata e massiva (C) mediatori implicati nella risposta infiammatoria vasale (V), nell’iperafflusso di cellule infiammatorie (neutrofili, N) e nella stimolazione della muscolatura liscia gastrointestinale (ML) e delle locali terminazioni nervose (Tn).

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Glossario essenzialeMicrobioma: massa genetica dei microrganismi, ovvero il loro genoma. Comprende il batterioma, il viroma e il micobioma.14

Microbiotaomicroflora: comunità batteriche presenti su mucose o altri distretti corporei.14

Disbiosi: alterazione della composizione e/o ricchezza del microbiota intestinale.2

Metagenomica: analisi diretta del genoma presente in un campione. Metagenoma: materiale genetico aggregato, solitamente composto da DNA, proveniente da un ambiente polimicrobico.3

ambientale in età pediatrica non consente i necessari processi di interazione tra sistema immunitario e batteri, conditio sine qua non per lo sviluppo di un microbioma equilibrato. La seconda è la teoriadellanutrizione, che prende in considerazione la moderna dieta occidentale, povera di fibre, ma ricca di zuccheri raffinati e “ultra processed food”. Tale alimentazione non è adatta ad un microbioma efficiente e bilanciato. E i ben noti benefici della dieta mediterranea, in ultima analisi, sono principalmente dovuti ad adeguate produzioni di SCFA ad azione cardioprotettiva e antinfiammatoria.22

L’ultimo paragrafo di questo testo deve necessariamente essere dedicato al più importante meccanismo di disbiosi, ovvero l’utilizzodiantimicrobici. Tale classe di farmaci, spesso utilizzata in ambito gastroenterico in costante assenza di evidenze relative al ruolo eziologico di batteri patogeni, determina sempre variazioni importanti del microbioma, che possono poi mantenersi anche molto a lungo. Anche antibiotici (metronidazolo e tilosina), ritenuti idonei per la terapia della poco definita “diarrea responsiva agli antibiotici”, portano a variazioni molto importanti

e potenzialmente sfavorevoli del microbiota, a dispetto di una remissione sintomatologica e di una possibile robusta azione regolatrice su una probabile disbiosi. Ad esempio, il metronidazolo causa una diminuzione della diversità batterica ed un aumento delle Enterobacteriaceae.25 Anche la tilosina modifica in modo rilevante il microbiota, generando, come possibile effetto benefico, un conseguente aumento di Enterococcus.26 Osservando tale fenomeno, appare ragionevole proporre percorsi meno aggressivi e distruttivi per modulare la flora microbica, ad esempio utilizzando probiotici a base di Enterococcus faecium.

10. Becattini S, Taur Y, Pamer EG. Antibiotic-induced changes in the intestinal microbiota and disease. Trends Mol Med. 2016; 22(6):458-78 [Cod. 21344]

11. Tamburini S, Shen N, Wu HC et al. The microbiome in early life: implications for health outcomes. Nat Med. 2016;22(7):713-22 [Cod. 21345]

12. Suchodolski JS, Whittemore JC. The Role of Probiotics in the Management of Intestinal Dysbiosis. Clinician’s Brief, July 2016, pp.1-4. In: http://www.cliniciansbrief.com/article/role-probiotics-management-intestinal-dysbiosis [Cod. 21346]

13. Beloshapka AN, Forster GM, Holscher HD et al. Fecal microbial communities of overweight and obese client-owned dogs fed cooked bean powders as assessed by 454-pyrosequencing. J Vet Sci Technol 2016; 7:5 [Cod. 21347]

14. Schmitz S, Suchodolski JS. Understanding the canine intestinal microbiota and its modification by pro-, pre- and synbiotics – what is the evidence? Veterinary Medicine and Science 2016; 2 (2): 71–94 [Cod. 21348]

15. Bell ET, Suchodolski JS, Isaiah A et al. Faecal microbiota of cats with insulin-treated diabetes mellitus. PLoS One 2014; 9(10):e108729 [Cod. 21349]

16. Blake AB, Suchodolski JS. Importance of gut microbiota for the health and disease of dogs and cats. Animal Frontiers 2016; 6(3): 37-42 [Cod. 21350]

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Laureato a Bologna con una tesi sulla Peritonite Infet-tiva Felina nel 1990, ha frequentato l’Università della Georgia (USA) ed altri centri veterinari nordamericani.Da oltre vent’anni ha condiviso le sue esperienze nell’attività clinica quotidiana e i risultati degli studi scientifici a cui ha partecipato con i medici veterinari italiani, partecipando come relatore a numerosissimi incontri presso Gruppi di Studio, Società Scientifiche, Corsi SCIVAC, incontri regionali e meeting organizza-ti da Ordini Provinciali e altre organizzazioni. È autore o coautore di un gran numero di articoli scientifici pubblicati in riviste nazionali e internazionali.Dal 2005 è diplomato all’European College of Veteri-nary Clinical Pathology (ECVCP), confermato nel 2015

e nel 2011 è Dottore di Ricerca presso la Facoltà di Medicina Veterinaria di Padova, dove per molti anni è stato presente come Professore a Contratto.I suoi interessi sono rivolti alla medicina di laborato-rio e alle sue applicazioni pratiche, allo studio delle malattie infettive trasmesse da vettori e da sempre si è dedicato anche alla farmacologia clinica, come testimoniato dal suo ruolo come autore del Prontuario Veterinario SCIVAC. È socio fondatore della Società Italiana di Medicina Felina. Svolge l’attività libero-professionale presso la Clinica Veterinaria Privata San Marco di Padova, occupandosi esclusivamente di medicina interna ed è direttore clinico del Laboratorio d’Analisi Veterinarie San Marco, a Padova.

TommasoFurlanello(DVM, Ph.D, Dipl. ECVCP)

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PEA-m*: una via “secondo Natura” per la protezione enterica del cane e del gattoMaria Federica della Valle, Alda Miolo, Cristina Medori CeDIS Innovet (Centro di Documentazione e Informazione Scientifica)

PEA: un endocannabinoide a meccanismo ALIA Nell’ultimo decennio, la ricerca farmacologica nel settore dell’infiammazione e del dolore gastroenterico si è particolarmente concentrata sulle potenzialità applicative di bioregolatori endogeni, appartenenti alla famiglia delle N-acil-etanolammine (NAE). Si tratta di sostanze lipidiche sintetizzate localmente dai tessuti in risposta a danni di varia natura (cosiddetta produzione “on demand”), e dotate di attività fisiologiche di protezione e recupero dell’equilibrio omeostatico.1,2 Per questo, sono anche dette “autacoidi” (dal greco “autos” sé stesso e “akos”, rimedio). Alla famiglia delle NAE appartengono alcuni endocannabinoidi, come l’anandamide, e composti simil-endocannabinoidi, come la palmitoiletanolamide o PEA, capaci di esercitare effetti antinfiammatori ed antalgici, agendo direttamente o indirettamente sui recettori per i cannabinoidi (CB1 e CB2), espressi anche dal sistema gastrointestinale.2-5

La capacità della PEA di contrastare localmente situazioni di danno con modalità autacoide è storicamente nota come effetto ALIA (Autacoid Local Injury Antagonism)6,7 e si manifesta prevalentemente attraverso il controllo della reattività dei mastociti, particolari cellule immuno-infiammatorie normalmente localizzate nelle mucose gastroenteriche. La regolazione di queste cellule si traduce nel minor rilascio di mediatori8 direttamente coinvolti nelle risposte infiammatorie e nocicettive, oltre che nella regolazione della stessa permeabilità intestinale.9 In realtà, PEA è in grado di agire su un ventaglio di target, ri-bilanciando diverse vie dell’infiammazione e del dolore attraverso quello che oggi viene riconosciuto come un vero e proprio “pleiotropismo d’azione”.7,10

Ad esempio, PEA agisce da agonista di diversi sistemi recettoriali, sia nucleari (PPAR-a) che di membrana (recettori CB, GPR e TRPV1), coinvolti nei pathways infiammatori e nocicettivi, anche a livello intestinale.11 Inoltre, potenzia e prolunga le attività di altri endocannabinoidi ad azione antinfiammatoria (es. 2-AG, 2-arachidonoil-glicerolo)12 secondo un effetto detto “entourage” o di contorno.7,13 Infine, si comporta da gate-keeper (guardiano) della barriera intestinale,14 con ovvie ripercussioni sull’intero ambiente enterico, microbiota compreso.3 Il background di ricerca sopra descritto ha avuto importanti ripercussioni applicative. Oggi la PEA è al centro di un approccio terapeutico di “biofarmacologia a modulazione ALIA”, che sfrutta cioè la sua somministrazione con l’obiettivo strategico di ridare ai tessuti periferici e centrali quel surplus di bioregolatore lipidico necessario ad esercitare effetti antinfiammatori ed antalgici “secondo Natura”.6,7,15,16 I benefici della somministrazione orale di PEA - specie in formulazioni micronizzate (PEA-m) più biodisponibili, dunque più attive, rispetto alla PEA “pura” -17 sono oggi comprovate da una notevole mole di evidenze, pre-cliniche e cliniche, in numerosi settori specialistici della medicina sia umana che veterinaria.6,7,18 Il gastroenterico si è rivelato uno dei settori più promettenti, tanto che di recente la ricerca d’eccellenza ha definito “affascinante” (apPEAling) il potenziale terapeutico dell’aliamide nel controllo dell’infiammazione intestinale (colite).19

* PEA-m = Palmitoiletanolamide micronizzata

Inn. Vet. Med. • N.o 33 • Settembre 20168

PEA nel distretto gastrointestinaleLa PEA è dotata di caratteristiche essenziali che ne sanciscono l’importante ruolo di protezione e riequilibrio biologico:• Fisiologicapresenza nei tessuti enterici finora

analizzati,20-26 cane compreso.27

• Produzione“on demand” in risposta a danni di varia natura, tale per cui i livelli endogeni di PEA vanno incontro a significative modifiche in risposta a diverse condizioni intestinali infiammatorie, sia pre-cliniche che cliniche.7,21,28,29 In particolare, la riduzione dei livelli endogeni di PEA è correlata sia all’infiammazione e all’aumentato transito intestinale,21, 24 sia al dolore addominale.30 Nella mucosa duodenale di cane affetto da diarrea da IBD, i livelli di PEA aumentano invece di circa 5 volte rispetto alla mucosa sana (Figura 1).27 Si tratta di una produzione “al bisogno” rilevata anche in altre specie in corso di colite,22,23 e interpretata come meccanismo protettivo, attivato per limitare lo stato infiammatorio in atto.21,22,31

• Effettidiriequilibriodell’iper-reattivitàintestinale. Somministrata per via orale, la PEA si è rivelata in grado di controllare la flogosi intestinale e i sintomi correlati (es. disturbi di transito), come discusso più in dettaglio nei paragrafi successivi.

Figura1 - Livelli endogeni di PEA nel duodeno di cane sano e affetto da diarrea da IBD.

Evidenze pre-cliniche Gli effetti antinfiammatori ed enteroprotettivi della somministrazione di PEA sono stati testati in diversi modelli di infiammazione intestinale e ipermotilità funzionale associata. • PEAnormalizzailtransitointestinale, con un

significativo effetto anti-diarroico dose-dipendente (a partire dai 10 mg/kg).21,28

• PEAriduceilgradodiinfiammazioneintestinale.29,32,33 In particolare, il trattamento con PEA:1) down-regola l’espressione tissutale e i livelli

circolanti di marker ed enzimi pro-infiammatori (es. IL-1, TNF-a, NOS, COX2); 32,33

2) riduce l’espressione di molecole di adesione e di fattori di trascrizione della flogosi (es. NF-kb);33

3) diminuisce il grado di infiltrazione locale di cellule infiammatorie (neutrofili, macrofagi); 29,32,33

4) riduce il grado di infiltrazione e attivazione dei mastociti ileali;33

5) inibisce l’angiogenesi associata all’infiammazione colitica.34

• PEAripristinalamicroemacro-anatomiadelcolon, con recupero della corretta lunghezza e morfologia di anse e villi intestinali 29,32 (Figura 2), riduzione dei danni da apoptosi a carico degli enterociti (con conseguente ripristino della loro funzionalità di barriera), e rigenerazione della mucosa intestinale.29,33

• PEAmigliorailpunteggioclinico (DAI – Disease Activity Index) elasopravvivenza, con aumento del peso degli animali trattati, miglioramento della consistenza delle feci, riduzione del sanguinamento rettale e prevenzione della splenomegalia.29,32,33

Figura2- In un modello animale di infiammazione intestinale (A), la somministrazione di PEA (10 mg/kg) riduce il danno istologico e strutturale del colon infiammato (B) (da: Di Paola et al, 2012).33

A - Non trattato B - Trattato

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

PE

A n

el d

uo

den

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g)

Cane con diarreaCane sano

Foto

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)

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Evidenze cliniche in gastroenterologia veterinariaIn gastroenterologia veterinaria, il trattamento con PEA in forma micronizzata (PEA-m) ha già dato promettenti risultati sia nel cane 35,36 che nel gatto.37

Nelcane, la somministrazione orale di PEA-m (10 mg/kg/sid/30gg) migliora sensibilmente l’indice CIBDAI (Canine IBD Activity Index) in corso di diarrea cronica refrattaria alle terapie tradizionali e ascrivibile a diagnosi di IBD (Inflammatory Bowel Disease) da moderata a grave (Figura 3 A).35 Già dopo 5 giorni, la PEA-m si dimostra capace di migliorare/normalizzare parametri come il livello di attività generale, la presenza di vomito, la perdita di peso e di appetito, la frequenza delle evacuazioni e la consistenza delle feci. Dopo 30 giorni di trattamento, in tutti i casi trattati si registra una regressione dell’indice CIBDAI a valori (da 0 a 1) corrispondenti ad un punteggio di “malattia clinicamente irrilevante”.35

Uno studio osservazionale multicentrico ha altresì rilevato che la somministrazione orale di PEA-m (10 mg/kg/sid/30gg) a 33 cani affetti da diarrea acuta di varia eziologia migliora significativamente il Fecal Scoring System, un punteggio morfologico

visivo da 1 a 7 di forma e consistenza delle feci.36 L’andamento di tale punteggio mostra una crescente riduzione a partire dal secondo giorno di trattamento, fino a raggiungere un - 65% a fine studio, quando il valore medio del punteggio è 2, corrispondente cioè alle condizioni di morfologia e consistenza fecale di un cane sano (Figura 3 B). Circa un quarto dei cani (22%) raggiunge tale valore dopo 48 ore, e oltre la metà (58%) dopo una sola settimana di trattamento. A fine studio, la quasi totalità dei soggetti osservati (97%) rientra nel range di normale morfologia fecale, tipico dei cani non affetti da problemi di transito intestinale.36 Nelgatto, buoni risultati si sono ottenuti con la somministrazione orale di PEA-m (25 mg/kg/die/30gg) in 9 soggetti affetti da varie forme di IBD non responsiva alle tradizionali terapie dietetiche e farmacologiche.37 Già dopo 5 giorni di trattamento, il 44% dei gatti migliora sia per consistenza delle feci (Figura 4 A) che per frequenza delle evacuazioni (Figura 4 B). Dopo 30 giorni di trattamento con PEA-m, la consistenza delle feci migliora nel 56% dei casi, e la frequenza delle evacuazioni si normalizza nella quasi totalità dei gatti (89%).37

(A) (B)

(A) (B)

0

1

2

3

4

5

6

7

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9

Giorno 30Giorno 0 Giorno 5

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Punteggio ideale

1

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Normale

Quasinormale

Alterata

Moltoalterata

Giorno 0

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1 voltaal giorno

2 volteal giorno

3 volteal giorno

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Giorno 30

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Figura3 - Effetti della somministrazione orale di PEA-m nel cane con diarrea cronica ed acuta,misurati rispettivamente utilizzando l’indice CIBDAI (A) ed il Fecal Scoring System (B).

Figura4 - Effetti della somministrazione orale di PEA-m sulla consistenza delle feci (A)e la frequenza delle evacuazioni (B) in gatti con diarrea cronica da IBD.

Inn. Vet. Med. • N.o 33 • Settembre 201610

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ConclusioniNello specifico settore gastroenterologico, l’attuale mole di evidenze pre-cliniche, unitamente ai risultati clinici positivi ottenuti nel cane e nel gatto, sostengono gli effetti “disease-modifying” della PEA, capace cioè di contrastare l’iper-reattività neuroinfiammatoria tipica di molte enteropatie e gli associati disturbi di transito (diarrea), mimando i naturali meccanismi di protezione e difesa dai danni enterici (azione “secondo Natura”).7,29 Per questo, la PEA, specie in forma micronizzata (PEA-m), rappresenta un’importante novità terapeutica in gastroenterologia veterinaria, dove può:• determinare un rapido miglioramento della

sintomatologia in corso di diarrea, sia acuta che

cronica.35-37 Ciò può rappresentare un valido aiuto nella gestione dell’accelerato transito intestinale del cane e del gatto, con ripercussioni benefiche immediate sul benessere e la qualità di vita dei pazienti e del loro nucleo familiare;

• contribuire al controllo dell’infiammazione intestinale cronica, stante l’effetto ALIA della PEA su un meccanismo – la degranulazione mastocitaria – intorno al quale ruota l’intricato network cellulare e molecolare che presiede all’omeostasi intestinale e che risulta profondamente perturbato in condizioni patologiche molto comuni sia del cane che del gatto (es. IBD, Inflammatory Bowel Disease).9,38,39

Inn. Vet. Med. • N.o 33 • Settembre 2016 11

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Normalia® riduce i disturbi dell’assorbimento intestinale che causano diarrea e dolore.

www.innovet.it

normalia®

Innovet sostiene FSA (Fondazione Salute Animale)per la difesa del benessere animale.

Alimento dietetico complementare.

Per cani e gatti con disturbi dell’assorbimento intestinale.

Normalia® contiene PEA-m*, un biomodulatore endogeno prodotto localmente “on demand” allo scopo di proteggere i tessuti. Nel duodeno di cane, il suo contenuto aumenta di 5 volte in corso di alterazioni intestinali. Assieme all’Enterococcus faecium e ad uno specifico complesso elettrolitico, PEA-m* è in grado di normalizzare l’equilibrio intestinale, potenziando i meccanismi fisiologici di difesa. Normalia® non è un farmaco, ma un alimento dietetico capace di risolvere questo fastidioso problema in modo rapido, sicuro e naturale.

*PEA-m® = Palmitoiletanolamide micronizzata

nuova formula

Veterinary Innovation

pubb_normalia.pdf 1 13/09/2016 10:11:14

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