applicazioni: 1- la variabilità genetica nelle scienze forensi le scienze forensi hanno la funzione...
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Applicazioni: 1- la variabilità Applicazioni: 1- la variabilità genetica nelle scienze forensigenetica nelle scienze forensi
Le scienze forensi hanno la funzione di aiutare i giudici e le giurie Le scienze forensi hanno la funzione di aiutare i giudici e le giurie nel prendere delle decisioni per risolvere questioni legali, siano nel prendere delle decisioni per risolvere questioni legali, siano esse legate a crimini o controversie civili.esse legate a crimini o controversie civili.
La genetica forense è una delle discipline delle scienze forensi. La genetica forense è una delle discipline delle scienze forensi. L’importanza della genetica nelle scienze forensi si è L’importanza della genetica nelle scienze forensi si è notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie alla evoluzione notevolmente accresciuta negli ultimi anni, grazie alla evoluzione dei marcatori genetici polimorfici e degli strumenti utilizzatidei marcatori genetici polimorfici e degli strumenti utilizzati
Variabilità genetica nelle scienze forensiVariabilità genetica nelle scienze forensi
A cosa serve?A cosa serve? Identificare individui che hanno commesso dei criminiIdentificare individui che hanno commesso dei crimini Predire la popolazione di origine di un DNA (es. Africano, Predire la popolazione di origine di un DNA (es. Africano,
Asiatico ecc.)Asiatico ecc.) Ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (es. colore Ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (es. colore
capelli)capelli) Identificare le vittime nei disastri di massa (disastri aerei, Identificare le vittime nei disastri di massa (disastri aerei,
genocidi, ecc.)genocidi, ecc.) Risolvere casi di paternità incertaRisolvere casi di paternità incerta Identificazione di drogheIdentificazione di droghe Identificazione di DNA appartenente a specie a rischio di Identificazione di DNA appartenente a specie a rischio di
estinzione in crimini legati al loro contrabbandoestinzione in crimini legati al loro contrabbando
Variabilità genetica nelle Variabilità genetica nelle scienze forensiscienze forensi
Il primo caso: il signor Colin PitchforkIl primo caso: il signor Colin Pitchfork
1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire 1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK)(UK)
1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona
Il Il modus operandimodus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo.medesimo.
1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, venne incriminato dei due 1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, venne incriminato dei due delitti, ma l’analisi del DNA mediante fingerprinting rivelò delitti, ma l’analisi del DNA mediante fingerprinting rivelò successivamente che egli era innocente.successivamente che egli era innocente.
Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting dei 5000 individui corrispondeva a quello dell’assassino.fingerprinting dei 5000 individui corrispondeva a quello dell’assassino.
1987: una persona del posto rivelò che un amico, un certo Colin Pitchford, 1987: una persona del posto rivelò che un amico, un certo Colin Pitchford, gli aveva chiesto di partecipare allo screening in sua vece in cambio di gli aveva chiesto di partecipare allo screening in sua vece in cambio di denaro.denaro.
Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.
Variabilità genetica nelle scienze forensiVariabilità genetica nelle scienze forensi
Il DNA fingerprintingIl DNA fingerprinting Introdotto da Alec Jeffreys nel Introdotto da Alec Jeffreys nel
19751975 Il DNA viene estratto, digerito Il DNA viene estratto, digerito
con enzimi di restrizione, con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su denaturato e trasferito su membrana (southern blotting). membrana (southern blotting). Quindi viene utilizzata una sonda Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus “core” minisatellite multi-locus “core” minisatellite marcata con radioattivo per marcata con radioattivo per l’ibridazione. l’ibridazione.
Il segnale radioattivo viene Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi Xuna lastra sensibile ai raggi X
Probabilità di match con sonda multilocus = 3 X 10-11
““Evoluzione” dei marcatori utilizzati nella genetica Evoluzione” dei marcatori utilizzati nella genetica forenseforense
1986. Il primo marcatore utilizzato per fini forensi è stato il DNA 1986. Il primo marcatore utilizzato per fini forensi è stato il DNA fingerprinting, basato su sonde multilocus per minisatelliti fingerprinting, basato su sonde multilocus per minisatelliti (Pitchfork)(Pitchfork)
Vengono introdotte le sonde per singoli loci minisatelliti (SLP), si ha Vengono introdotte le sonde per singoli loci minisatelliti (SLP), si ha il vantaggio di poter trattare da un punto di vista statistico i dati il vantaggio di poter trattare da un punto di vista statistico i dati (“probabilità di match”)(“probabilità di match”)
1988. Primo kit commerciale per l’individuazione di SNPs tramite 1988. Primo kit commerciale per l’individuazione di SNPs tramite PCR (sistema HLA), si ha il vantaggio di poter analizzare frammenti PCR (sistema HLA), si ha il vantaggio di poter analizzare frammenti degradati e/o in scarsa quantitàdegradati e/o in scarsa quantità
Primi anni ’90. Vengono utilizzati i microsatelliti: elevata Primi anni ’90. Vengono utilizzati i microsatelliti: elevata eterozigosità, PCR, vantaggi per la trattazione statistica.eterozigosità, PCR, vantaggi per la trattazione statistica.
1992. mtDNA: elevata variabilità di sequenza, tipizzazione possibile 1992. mtDNA: elevata variabilità di sequenza, tipizzazione possibile anche su quantità minime di DNAanche su quantità minime di DNA
1992. primo STR del cromosoma Y: campioni misti uomo/donna ecc.1992. primo STR del cromosoma Y: campioni misti uomo/donna ecc.
Marcatori autosomici, del mtDNA e del Marcatori autosomici, del mtDNA e del cromosoma Y: vantaggi e svantaggi nelle cromosoma Y: vantaggi e svantaggi nelle
scienze forensiscienze forensi
Generare un profilo Generare un profilo STRSTR
1. Estrarre e purificare il DNA1. Estrarre e purificare il DNA
Contenuto in DNA dei campioni biologici:Tipo di campione Quantità di DNASangue 30,000 ng/mLmacchia 1 cm2 200 ngmacchia 1 mm2 2 ng
Liquido seminale 250,000 ng/mLtampone vaginale postcoitale 0 - 3,000 ng
CapelliCapello strappatoCapello perso
1 - 750 ng/capello1 - 12 ng/capello
SalivaUrine
5,000 ng/mL1 - 20 ng/mL
Primers marcati con fluorocromi Primers marcati con fluorocromi differenti per differenti gruppi di STRsdifferenti per differenti gruppi di STRs
Amplificare tramite PCR più Amplificare tramite PCR più microsatelliti (multiplex) microsatelliti (multiplex) utilizzando primers utilizzando primers fiancheggianti fiancheggianti
Generare un profilo Generare un profilo STR:STR:2. PCR2. PCR
Generare un profilo STR:Generare un profilo STR:3. sequenziamento mediante 3. sequenziamento mediante elettroforesi capillare: ABI 310elettroforesi capillare: ABI 310
Prodotto PCR iniettato Prodotto PCR iniettato nella colonnanella colonna
Si applica corrente Si applica corrente elettricaelettrica
Il DNA viene separato in Il DNA viene separato in base alla sua lunghezza:base alla sua lunghezza:
Il DNA si muove vero il Il DNA si muove vero il polo positivopolo positivo
Il colore del prodotto Il colore del prodotto PCR viene registrato PCR viene registrato quando passa nel quando passa nel detectordetector
DetectorWindow
Generare un profilo STR:Generare un profilo STR:3. seq. mediante elettroforesi capillare: 3. seq. mediante elettroforesi capillare:
Generare un profilo STR:Generare un profilo STR:4. interpretazione dei dati del sequenziamento: dati grezzi4. interpretazione dei dati del sequenziamento: dati grezzi
D3 vWA FGA
D8 D21 D18
D5 D13 D7
Am
RAW DATARAW DATA
PROCESSED DATAPROCESSED DATA
•Il software GENESCAN divide I dati grezzi in un elettroferogramma separato per ciascun colore
•Blue•Green•Yellow•Red
•Il software GENOTYPER identifica i differenti loci e per ciascuno di essi riconosce gli alleli facendo riferimento ad uno standard di peso molecolare
La probabilità di match: “la regola del La probabilità di match: “la regola del prodotto”prodotto”
Il peso di una corrispondenza (match) tra un profilo di Il peso di una corrispondenza (match) tra un profilo di DNA ed un sospetto è quantificato tramite la DNA ed un sospetto è quantificato tramite la “probabilità di match”:“probabilità di match”:
Ovvero: qual’è la probabilità che un profilo come quello Ovvero: qual’è la probabilità che un profilo come quello creato a partire dal materiale biologico rinvenuto creato a partire dal materiale biologico rinvenuto corrisponda ad un individuo della popolazione?corrisponda ad un individuo della popolazione?
Si applica la regola statistica del prodotto per eventi Si applica la regola statistica del prodotto per eventi indipendentiindipendenti
La regola del prodottoLa regola del prodotto
0.222 x 0.222 x 2
= 0.1
Probabilità di match: la regola del Probabilità di match: la regola del prodottoprodotto
1 in 79,531,528,960,000,000
1 in 10 1 in 111 1 in 20
1 in 22,200
x x
1 in 100 1 in 14 1 in 81
1 in 113,400
x x
1 in 116 1 in 17 1 in 16
1 in 31,552
x x
Contenuto in DNA dei campioni biologici:
Tipo di campione Quantità di DNA
Sangue 30,000 ng/mLmacchia 1 cm2 200 ngmachia 1 mm2 2 ng
Liquido seminale 250,000 ng/mLtampone vaginale postcoitale 0 - 3,000 ng
CapelliCapello strappatoCapello perso
1 - 750 ng/capello1 - 12 ng/capello
Saliva
Urine5,000 ng/mL
1 - 20 ng/mL
Il massacro di Srebrenica Il massacro di Srebrenica
– Le forze serbe conquistano Le forze serbe conquistano SrebrenicaSrebrenica
– Vengono massacrati numerosi Vengono massacrati numerosi Bosniaci mussulmani Bosniaci mussulmani
– Si perdono le tracce di 30000 Si perdono le tracce di 30000 personepersone
Il massacro di Il massacro di SrebrenicaSrebrenica Viene raccolto il sangue dei parenti delle persone Viene raccolto il sangue dei parenti delle persone
scomparse scomparse Vengono sequenziati la regione di controllo del DNA Vengono sequenziati la regione di controllo del DNA
mitocondriale ed alcuni STR autosomicimitocondriale ed alcuni STR autosomici Viene estratto il DNA dai resti delle vittime non Viene estratto il DNA dai resti delle vittime non
identificateidentificate Viene analizzato il DNA nucleare per I resti meglio Viene analizzato il DNA nucleare per I resti meglio
conservati ed il mtDNA nei casi più degradaticonservati ed il mtDNA nei casi più degradati Il confronto dei profili del DNA dei parenti con quello Il confronto dei profili del DNA dei parenti con quello
delle vittime permette di riconoscere l’identita di delle vittime permette di riconoscere l’identita di numerose vittimenumerose vittime
Identificazione delle persone Identificazione delle persone disperse nel World trade center in disperse nel World trade center in seguito ad attacco terroristico del seguito ad attacco terroristico del 9/119/11 Il progetto ha Il progetto ha
generatogenerato– 52,000 profili STR 52,000 profili STR – 44,000 profili mtDNA 44,000 profili mtDNA – 17,000 profili SNPs17,000 profili SNPs
850 delle 1594 850 delle 1594 vittime identificate vittime identificate grazie all’analisi del grazie all’analisi del DNADNA
Il caso dell’albero testimoneIl caso dell’albero testimone
3 maggio 1992, Phoenix, AZ3 maggio 1992, Phoenix, AZ Una donna viene ritrovata morta per Una donna viene ritrovata morta per
strangolamento nelle vicinanze di alberi di strangolamento nelle vicinanze di alberi di Cercidium floridum.
Nel camion di un sospetto vengono rinvenuti dei frutti di Cercidium floridum.
La specie in questione presenta una notevole La specie in questione presenta una notevole variabilità di sequenzavariabilità di sequenza
L’analisi del DNA (mediante analisi RAPD-L’analisi del DNA (mediante analisi RAPD-random amplified polymorphic DNA) permette random amplified polymorphic DNA) permette di stabilire che i frutti appartengono ad uno di stabilire che i frutti appartengono ad uno degli alberi che si trovano sulla scena del delittodegli alberi che si trovano sulla scena del delitto
Il profilo RAPD non corrisponde a nessuno degli Il profilo RAPD non corrisponde a nessuno degli alberi della stessa specie analizzati per alberi della stessa specie analizzati per confrontoconfronto
Il sospetto viene incriminatoIl sospetto viene incriminato
La tecnica RAPD – Random Amplified Polymorphic DNA
Si utilizzano dei primers corti (10 basi) che hanno una elevata probabilità di appaiarsi a più regioni del genoma e quindi producono una serie di amplificati che possono poi essere analizzati mediante separazione su gel di agarosio.
Generalmente utilizzati quando non si ha a disposizione la sequenza del DNA di una certa specie, oppure non se ne conoscono siti variabili
Il gatto palla di neveIl gatto palla di neve
3 ottobre 1994, Prince Edward 3 ottobre 1994, Prince Edward Island, CanadaIsland, Canada
Scompare una donna di 32 Scompare una donna di 32 anni, successivamente anni, successivamente ritrovata morta.ritrovata morta.
Nella sua macchina Nella sua macchina abbandonata vengono abbandonata vengono ritrovate tracce del suo ritrovate tracce del suo sangue assieme ai peli di un sangue assieme ai peli di un gattogatto
L’ex marito della vittima, tra i L’ex marito della vittima, tra i sospettati, vive con un gatto sospettati, vive con un gatto di nome palla di nevedi nome palla di neve
Il DNA estratto dai peli di palla Il DNA estratto dai peli di palla di neve presenta un profilo di neve presenta un profilo DNA uguale a quello ottenuto DNA uguale a quello ottenuto dai peli ritrovati nella dai peli ritrovati nella macchina della vittima.macchina della vittima.
L’ex marito viene incriminatoL’ex marito viene incriminato
Problemi per l’utilizzazione dei Problemi per l’utilizzazione dei marcatori polimorfici in ambito marcatori polimorfici in ambito
forenseforense
DegradazioneDegradazione Drop out allelicoDrop out allelico Falsi picchiFalsi picchi Regola del prodotto non sempre Regola del prodotto non sempre
valida (parenti)valida (parenti)
Problemi: Dropout allelicoProblemi: Dropout allelico
1500
Campione da analizzareCampione da analizzare
Campione di riferimentoCampione di riferimento
150
?
Quando il DNA estratto è molto scarso o fortemente degradato si può verificare che uno solo dei due alleli ad un locus venga amplificato.Nella figura l’allele 14 al sito D13S317 non si è amplificato:Falso omozigote 8/8, in realtà eterozigote 8/14
Problemi: falsi picchiProblemi: falsi picchi
– Negli elettroferogrammi Negli elettroferogrammi possono presentarsi dei possono presentarsi dei falsi picchi dovuti a falsi picchi dovuti a problemi tecnici e/o problemi tecnici e/o biologici.biologici.
– Questi picchi possono Questi picchi possono essere interpretati essere interpretati erroneamente come erroneamente come allelialleli
Problemi: La regola del prodotto non considera la possibilità che il colpevole sia un parente del sospettato
Se il colpevole è un parente del sospettato, la regola del prodotto per calcolare la probabilità di match non è più valida, in quanto i due condivideranno diversi alleli uguali per discendenza.