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1988, 54(6):1595.Appl. Environ. Microbiol.

S C Edberg, M J Allen and D B Smithmultiple tube fermentation method.

drinking water: comparison with the standardtotal coliforms and Escherichia coli frommethod for the simultaneous enumeration ofNational field evaluation of a defined substrate

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A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y . J u n e 1 9 8 8 , p . 1 5 9 5 - 1 6 0 10 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 8 / 0 6 1 5 9 5 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C 1 9 8 8 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

N a t i o n a l F i e l d E v a l u a t i o n o f a D e f i n e d S u b s t r a t e Method f o r t h eS i m u l t a n e o u s E n u m e r a t i o n o f T o t a l C o l i f o r m s a n d E s c h e r i c h i a c o l if r o m D r i n k i n g W a t e r : C o m p a r i s o n w i t h t h e S t a n d a r d M u l t i p l eTube F e r m e n t a t i o n Method

STEPHEN C . EDBERG,1* MARTIN J . ALLEN,2 DARRELL B . SMITH,3 ANDTHE NATIONAL COLLABORATIVE STUDYtD e p a t r t n e t i t of L a b o r a t o r y M e d i c i n e , Y a l e U n i v ' e r s i t v S c h o o l o J f M e d i c i n e , P . 0. Bo x 3 3 3 3 , 3 3 3 Cedar S t r e e t , N e w t , H a v e n .C o n n e c t i c u t 0 6 5 1 0 1 ; A m i e r i canW a t e r W o r - k s A s s o c i a t i o n Research F o u n l d a t i o n i , D e n v e r , Colorado 8 0 2 3 5 2 ; a ( 1 i dS o i t l i C e n t r a l C o n n e ( c t i c u i t R e g i o n b a l W a t e r A u t h o r i t y , N e w 1 Haven, C o n n e c t i c u t 0 6 5 / 1 3

R e c e i v e d 2 1 J a n u a r y 1 9 8 8 / A c c e p t e d 1 8 March 1 9 8 8A d e f i n e d s u b s t r a t e method was d e v e l o p e d t o s i m u l t a n e o u s l y enumerate t o t a l c o l i f o r m s an d E s c h e r i c h i a c o l if r o m d r i n k i n g w a t e r s w i t h o u t t h e n e e d f o r c o n f i r m a t o r y or c o m p l e t e d t e s t s . I t i s a new method based ont e c h n o l o g y t h a t u s es a h y d r o l y z a b l e s u b s t r a t e as a s p e c i f i c i n d i c a t o r - n u t r i e n t f o r t h e t a r g e t m i c r o b e s . Noe q u i p m e n t o t h e r t h a n a 3 5 C i n c u b a t o r a n d l o n g - w av e l e n g t h ( 3 6 6 - n m ) l i g h t i s n e c e s sa ry. To p e r f o r m t h e t e s t ,

on e o n l y h a s t o a d d water t o t h e powdered i n g r e d i e n t s i n a t u b e or f l a s k . I f t o t a l c o l i f o r m s are present i n t h ew a t e r s a m p l e , t h e s o l u t i o n w i l l c h a n g e f r o m i t s normal c o l o r l e s s s t a t e ( n o t a r g e t m i c r o b e s p r e s e n t ) t o y e l l o w .T h e s p e c i f i c p r e s e n c e o f E . c o l i w i l l c a u s e t h e same t u b e t o f l u o r e s c e u n d e r a l o n g w a v e ( 3 6 6 - n m ) UV l a m p . Thet e s t , c a l l e d A u t o a n a l y s i s C o l i l e r t ( A C ) , was compared w i t h S t a n d a r d M e t h o d s f o r t h e E x a m i n a t i o n o f Water andW a s t e w a t e r 1 0 - t u b e m ul t ip l e t u b e f e r m e n t a t i o n (MTF) i n a n a t i o n a l e v a l u a t i o n . F i v e u t i l i t i e s , r e p r e s e n t i n g s i xU . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y r e g io n s, p ar t i ci p at e d . A l l water s a m p l e s came from d i s t r i b u t i o ns y s t e m s . S p l i t s a m p l e s f r o m a w i d e v a r i e t y o f water s o u r c e s were a n a l y z e d f o r t h e MPN-versus-MPNc o m p a r i s o n . A t o t a l o f 1 , 0 8 6 t u b e s were p o s i t i v e b y MTF, a n d 1 , 2 7 9 were p o s i t i v e b y AC. There was nos t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e b e t w e e n MTF and AC . S p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n s f r o m p o s i t i v e t u b e s c o n f i r m e d t h e s e n s i t i v i t yo f t he AC. A n a t i o n a l e v a l u a t i o n o f t h e AC t e s t s h o w e d t h a t i t : ( i ) was as s e n s i t i v e as S t a n d a r d M e t h o d s MTF,( i i ) s p e c i f i c a l l y e n u m e r a t e d 1 t o t a l c o l i f o r m p e r 1 0 0 m l , i n a maximum o f 2 4 h , ( i i i ) s i m u l t a n e o u s l y e n u m e r a t e d1 E . c o l i p er 1 0 0 m l i n t h e same a n a l y s i s , ( i v ) was n o t s u b j e c t t o f a l s e - p o s i t i v e or f a l s e - n e g a t i v e r e s u l t s b yh e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a , ( v ) d i d n o t r e q u i r e c o n f i r m a t o r y t e s t s , ( v i ) grew i n j u r e d c o l i f o r m s , ( v i i ) was easy t oi n o c u l a t e , a n d ( v i i i ) was very easy t o i n t e r p r e t .

T h e r e are tw o s t a n d a r d m e t h o d s f o r t h e enumeration o ft o t a l c o l i f o r m s f r o m d r i n k i n g w a t e r . The m u l t i p l e t u b e f e r -mentation (MTF) t e c h n i q u e p r o v i d e s a m o s t - p r o b a b l e -number (MPN) a n a l y s i s a f t e r g r o w t h o f t o t a l c o l i f o r m s i nl i q u i d medium. The membrane f i l t e r (MF) t e c h n i q u e enumer-a t e s t o t a l c o l i f o r m s on t h e s u r f a c e o f agar b y p r o v i d i n g aCFU/100 m l count ( 1 ) . B o t h m e t h o d s require c o n f i r m e d a n dc o m p l e t e d t e s t s a f t e r t h e i n i t i a l o b s e r v a t i o n o f a p o s i t i v epri mary medium. A c o m p l e t e a n a l y s i s c an require an a d d i -t i o n a l 2 4 t o 7 2 h f o r a f i n a l r e s u l t . I n n e i t h e r method i s ani s o l a t e i d e n t i f i e d t o s p e c i e s or are an y members o f t h e f e c a lc o l i f o r m group d i f f e r e n t i a t e d f r o m t h e t o t a l c o l i f o r m group( 9 , 1 0 , 1 4 - 1 6 , 2 1 ) . B o t h t h e MTF a n d MF t e c h n i q u e s h a v eb e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d a n d are a p p r o v e d f o r r e g u l a t o r ym o n i t o r i n g p u r p o s e s ( 3 , 1 0 , 1 1 , 1 5 , 1 8 , 1 9 , 2 1 , 2 3 ) .D u r i n g a b i o f i l m t o t a l c o l i f o r m r e g r o w t h p r o b l e m i n t h e

8 C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t I n v e s t i g a t o r s i n t h e N a t i o n a l C o l l a b o r a t i v e S t u d y i n c l u d e t h ef o l l o w i n g : Mark L e C h e v a l l i e r , American Water Works S e r v i c eCompany, B e l l e v i l l e , I L 6 2 2 2 0 ; Nancy K r i z and Deborah C a l l a n ,Y a l e U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e . New H a v e n , CT 0 6 5 1 0 ; R o g e rWard a n d Dawn C a l v e r t , C a l i f o r n i a - A m e r i c a n Water Company.M o n t e r e y , CA 9 3 9 4 0 : Wayne J a c k s o n and M i c h e l l e U r y c . C o b bC o u n t y M a r i e t t a W a t e r . A c k w o r t h , GA 3 0 1 0 1 ; C a r o l Storms andJ u d y L o r i n e r , Mon m ou th C o n s o l i d a t e d Water C o m p a n y . T i n t o nF a l l s , NJ 0 7 7 2 4 : a n d Thomas Trok a n d M i c h a e l B u r n s . West-PennW a t e r C o m p a n y . P i t t s b u r g h . PA 1 5 2 2 6 .

d i s t r i b u t i o n system i n New H a v e n , C o n n e c t i c u t ( 8 ) , s e v e r a li n h e r e n t p r o p e r t i e s o f t h e MF a n d MTF t e c h n i q u e s l i m i t e dt h e a b i l i t y o f p u b l i c h e a l t h o f f i c i a l s t o make d e c i s i o n s r e g a r d -i n g t h e h e al t h r i s k . Most r e s t r i c t i n g were t h e t i m e r e q u i r e d t oo b t a i n a d e f i n i t i v e h e a l t h - b a s e d an s w e r, t h e i n a b i l i t y t od i f f e r e n t i a t e f e c a l f r o m t o t a l c o l i f o r m s w i t h o u t e i t h e r t h ep e r f o r m a n c e o f t e s t s s p e c i f i c a l l y f o r f e c a l c o l i f o r m or i d e n -t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a , a n d t h e s u b j e c t i v e n a t u r e o f i n t e r p r e -t a t i o n o f t h e a n a l y t i c a l m e t h o d s . I n res pon se t o t h e s e l i m i -t a t i o n s , a new t e c h n i q u e was d e v e l o p e d , b a s e d o nt e c h n o l o g y o r i g i n a l l y d e s i g n e d t o i d e n t i f y m i c r o b e s b y t h ea n a l y s i s o f t h e i r c o n s t i t u t i v e e nzy me s. T h i s method u s e s ah y d r o l y z a b l e s u b s t r a t e as a d e f i n e d s u b s t r a t e f o r o n l y t h et a r g e t m i c r o b e ( s ) one w i s h e s t o enumerate ( S . C . E d b e r g andM. K . E d b e r g , Y a l e J . B i o l . M e d . , i n p r e s s ) . The t e c h n o l o g yi s d e s i g n a t e d a u t o a n a l y s i s , b e c a u s e a c o l o r c h a n g e i s p r o -d u c e d b y t h e t a r g e t m i c r o b e ( s ) , w i t h no need f o r c o n f i r m a -t o r y t e s t s or t e c h n o l o g i s t l a b o r . To p e r f o r m t h e t e s t , on en e e d o n l y a d d water t o t h e p o w d e r e d formula i n a t u b e orf l a s k a n d i n c u b a t e . No e q u i p m e n t o t h e r t h a n an i n c u b a t o ra n d 366-nm l a m p i s necessary. S p e c i f i c c o l o r c h a n g e s denotet h e p r e s e n c e o f t h e t a r g e t m i c r o b e ( s ) . O n l y t h e t a r g e t m i-c r o b e s , t o t a l c o l i f o r m s ( y e l l o w ) and E s c h e r i c h i a c o l i ( f l u o -r e s c e n c e ) , p r o d u c e c o l o r c h a n g e s d u r i n g t h e t e s t p e r i o d .

I n a p p l y i n g t h e a u t o a n a l y s i s t e c h n o l o g y t o m i c r o b i a l watera n a l y s i s , we h o p e d t o a c h i e v e t h e f o l l o w i n g g o a l s : ( i ) t os p e c i f i c a l l y enumerate 1 t o t a l c o l i f o r m per 100 m l i n a1 5 9 5

V o l . 5 4 . N o . 6

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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

TABLE 1 . C h a r a c t e r i s t i c s o f p a r t i c i p a t i n g w a t e r u t i l i t i e sG e o g r a p h i c a l a r e a W a t e r s o u r c e T y p e o f P o p u l a t i o nu t i l i t y s e r v e d

C a l i f o r n i a , New M e x i c o , A r i z o n a W e l l , g r o u n d , s u r f a c e P r i v a t e > 2 5 0 , 0 0 0S o u t h w e s t e r n P e n n s y l v a n i a S u r f a c e , r i v e r P r i v a t e > 5 3 0 , 0 0 0C o n n e c t i c u t W e l l , g r o u n d , s u r f a c e , m i x e d M u n i c i p a l 4 0 0 , 0 0 0N o r t h e r n New J e r s e y W e l l , g r o u n d , s u r f a c e , r i v e r P r i v a t e 2 5 0 , 0 0 0N o r t h e r n G e o r g i a S u r f a c e M u n i c i p a l 2 5 0 , 0 0 0maximum o f 2 4 h , ( i i ) t o s i m u l t a n e o u s l y , s p e c i f i c a l l y e n u -m e r a t e 1 E . c o l i p er 1 0 0 m l i n t h e s a m e t e s t , ( i i i ) t o n o t b ea f f e c t e d b y h e t e r o t r o p h i c p l a t e c o u n t ( H P C ) o r g a n i s m sf o u n d i n d r i n k i n g w a t e r , ( i v ) t o n o t r e q u i r e c o n f i r m a t o r yt e s t s , ( v ) t o g r o w i n j u r e d c o l i f o r m s , ( v i ) t o b e e a s y t oi n o c u l a t e , a n d ( v i i ) t o b e v e r y e as y t o i n t e r p r e t .T h e a u t o a n a l y s i s m e t h o d was c o m p a r e d i n a n a t i o n a le v a l u a t i o n w i t h t h e 1 0 - t u b e MTF t e s t d e s c r i b e d i n S t a n d a r dM e t h o d s f o r t h e E x a m i n a t i o n o f W a t e r a n d W a s t e w a t e r ( 1 ) .T h e p r o t o c o l e x p l i c i t l y f o l l o w e d w a s t h a t o f t h e U . S . E n v i -r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y ( E . P . A . ) E n v i r o n m e n t a l Mon-i t o r i n g S u p p o r t L ab o r a t o r y f o r c e r t i f i c a t i o n o f a n a l t e r n a t i v em e t h o d ( 6 ) . C o l l a b o r a t i v e w a t e r u t i l i t i e s w e r e c h o s e n t or e f l e c t a l l s o u r c e s o f d r i n k i n g w a t e r a n d t o r e p r e s e n t av a r i e t y o f g e o g r a p h i c a l l o c a t i o n s , t r e a t m e n t t e c h n i q u e s , a n dw a t e r q u a l i t y c o n d i t i o n s .

MATERIALS AND M E T H O D SP a r t i c i p a n t s a n d s a m p l e s . F i v e u t i l i t i e s , r e p r e s e n t i n g s i xU . S . E . P . A . r e g i o n s , p a r t i c i p a t e d i n t h e n a t i o n a l e v a l u a t i o n( T a b l e 1 ) . T h e u t i l i t i e s r a n g e d f r o m t h o s e s e r v i n g a s i n g l eg e o g r a p h i c a l a r e a t o t h o s e s e r v i n g l a r g e n u m b e r s o f s m a l lc o m m u n i t y w a t e r s y s t e ms o v e r t h r e e s t a t e s . W a t e r s o u r c e si n c l u d e d d e e p a n d s h a l l o w w e l l s , s p r i n g s , r i v e r s , a n d s u r f a c er e s e r v o i r s . A l l w a t e r s am p l e s w e r e o b t a i n e d f r o m d i s t r i b u -t i o n s y s t e m s b y t h e p a r t i c i p a t i n g u t i l i t i e s ; h o w e v e r , a n e f f o r tw a s made t o o b t a i n w a t e r f r o m l o c a t i o n s m o s t l i k e l y t o y i e l dp o s i t i v e s am p l e s, s u c h a s d e a d e n d s , s t o r a g e r e s e r v o i r s , a n d

k n o w n p r o b l e m s i t e s . I n a c c o r d a n c e w i t h U . S . E . P . A .E n v i r o n m e n t a l M o n i t o r i n g S u p p or t L ab o r at o r y g u i d e l i n e s ,s i t e s w e r e p e r m i t t e d t o m i x s m a l l a m o u n t s o f t r e a t m e n te f f l u e n t o r r a w w a t e r w i t h a l a r g e v o l u m e o f d i s t r i b u t i o nw a t e r t o a c h i e v e p o s i t i v e s a m p l e s w i t h n a t u r a l m i c r o b i a lp o p u l a t i o n s ( 6 ) . S a m p l e s w e r e a l s o c o l l e c t e d d u r in g p e ri o d so f f l u s h i n g . T h e s e w a t e r s a m p l e s w e r e n o t n e c e s s a r i l y t h o s eu s e d f o r r o u t i n e m o n i t o r i n g f o r r e g u l a t o r y p u r p o s e s . S ec -t i o n s o f t w o o f t h e u t i l i t i e s h a d b e e n e x p e r i e n c i n g t o t a lc o l i f o r m r e g r o w t h p r o b l e m s .W a t e r s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d , t r a n s p o r t e d , a n d s t o r e d i ns t r i c t a c c o r d a n c e w i t h t h e g u i d e l i n e s d e s c r i b e d b y S t a n d a r dM e t h o d s a n d t h e U . S . E . P . A . ( 6 , 1 3 ) . E i t h e r s t e r i l e p o l y -m e t h y l p e n t e n e o r g l a s s f l a s k s c o n t a i n i n g s o d i u m t h i o s u l f a t ew e r e u s e d t o c o l l e c t t h e s a m p l e s .AC t e s t . T h e d e f i n e d s u b s t r a t e m e t h o d , c a l l e d A u t o -a n a l y s i s C o l i l e r t ( A C ) , w a s p r e p a r e d f o r u s a s 1 0 -t u b e MPNt e s t s ( A c c e s s M e d i ca l S y s t e ms , B r an f o r d , C o nn .) . T h e p o w -d e r f o r m u l a c o n t a i n e d , p e r l i t e r , t h e f o l l o w i n g : ( N H 2 ) 4 S O 4 , 5g ; M n ( S O 4 ) 2 , 0 . 5 , u g ; Z n S O 4 , 0 . 5 , u g ; M g S O 4 , 1 0 0 m g ; N a C l ,1 0 g ; C a C l 2 , 5 0 m g ; K H 2 P O 4 , 9 0 0 m g ; N a 2 H P O 4 , 6 . 2 g ;N a 2 S O 3 , 4 0 m g ; a m p h o t e r i c i n B , 1 m g ; o r t h o - n i t r o p h e n y l - p -D - g a l a c t o p y r a n o s i d e ( O N P G ) , 5 0 0 m g ; 4 - m e t h y l u m b e l l i f e r y l -P 3 - D - g l u c u r o n i d e (MUG), 7 5 m g ; a n d S o l a n i u m , 5 0 m g .S o l a n i u m i s a p l a n t e x t r a c t m i x t u r e t h a t a c t s a s a n e m u l s i f i e r .A l l i n g r e d i e n t s w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o .( S t . L o u i s , M o. ), w it h t h e e x c e p t i o n o f S o l a n i u m ( A c c e s s

M e d i c a l S y s t e m s ) . E a c h t e s t t u b e ( 1 3 b y 1 0 0 m m ) w a sa s e p t i c a l l y f i l l e d a n d h e a t d i s i n f e c t e d a t 7 0 C f o r 0 . 5 h . T h eq u a l i t y c o n t r o l p a r a m e t e r s w e r e b a s e d o n t h e f o l l o w i n gc r i t e r i a ; t h e t e s t m u s t d e t e c t 1 CFU/100 m l i n 2 4 h i ne n v i r o n m e n t a l i s o l a t e s o f E . c o l i , K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ,E n t e r o b a c t e r c l o a c a e , a n d C i t r o b a c t e r f r e u n d i i a n d n o t b es u b j e c t t o i n t e r f e r e n c e b y a t l e a s t 1 0 , 0 0 0 C F U o f P s e u d o m o -n a s , F l a v o b a c t e r i u m , a n d Aeromonas s p p . p e r m l . A h i g hp r o p o r t i o n ( 1 . 5 % ) o f t u b es was c h o s e n f o r q u a l i t y c o n t r o l .E a c h o f t h e t e s t s p e c i e s w a s d i l u t e d t o 1 CFU/100 m l , a n d a nMPN a n a l y s i s was p e r f o r m e d . I n a d d i t i o n , s p e c i e s o f h e t e r -o t r o p h s a t c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 , 0 0 0 / m l w e r e m i x e d w i t ht h e s e b a c t e r i a l c o n c e n t r a t i o n s i n s e p a r a t e t e s t t u b e s . P o s i -t i v e ( y e l l o w o r y e l l o w a n d f l u o r e s c e n t ) h a d t o b e o b se r v e d i n2 4 h .T h e AC m e t h o d w a s p e r f o r m e d a s f o l l o w s : 1 0 m l o f w a t e rw a s a d d e d t o e a c h t u b e , d i s s o l v i n g t h e p o w d e r a f t e r a g i t a t i o na n d p r o d u c i n g a c o l o r l e s s s o l u t i o n . The t e s t t u b e s w e r ei n c u b a t e d a t 3 5 C f o r 2 4 h . D e v e l o p m e n t o f a y e l l o w c o l o ra f t e r i n c u b a t i o n i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t o t a l c o l i f o r m s i nt h e t e s t t u b e . E a c h p o s i t i v e t o t a l c o l i f o r m t e s t t u b e w a se x p o s e d t o a h a n d - h e l d f l u o r e s c e n t ( 3 6 6 - n m ) l i g h t (EdmundS c i e n t i f i c C o . , B a r r i n g t o n , N . J . ) F l u o r e s c e n c e i n t h e t e s ts p e c i f i c a l l y d e n o t e d t h e p r e s e n c e o f E . c o l i . T h e r e f o r e , as e p a r a t e MPN a n a l y s i s was o b t a i n e d f o r t o t a l c o l i f o r m s a n dE . c o l i b y t h e 1 0 - t u b e AC m e t h o d . I t was d e s i g n e d s o t h a t n oc o n f i r m a t o r y o r c o m p l e t e d t e s t s n e e d b e p e r f o r m e d w i t h t h eA C t e s t .MTF t e s t . T h e 1 0 - t u b e MTF t e s t was p e r f o r m e d w i t h e a cht u b e c o n t a i n i n g 1 0 m l o f d o u b l e - s t r e n g t h l a u r y l t r y p t o s eb r o t h ( L T B ; D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) . P o s i t i v et u b e s w e r e c o n f i r m e d i n b r i l l i a n t g r e e n l a c t o s e b i l e b r o t h(BGLB b r o t h ; D i f c o ) ( 4 ) . T h e n u m b e r o f c ol i f o r ms p e r 1 0 0m l was e s t i m a t e d f r o m a 1 0 - t u b e MPN t a b l e ( 1 ) . T e s t s t h a tc o n f i r m e d i n i t i a l p o s i t i v e r e s u l t s w e r e i n c l u d e d i n t h e d at ab a s e .HPC. An HPC w a s d e t e r m i n e d f o r e a c h w a t e r s a m p l ea c c o r d i n g t o S t a n d a r d M e t h o d s u s i n g R2A a g a r i n c u b a t e d a t3 5 C f o r 4 8 h ( 1 ) .E v a l u a t i o n p r o t o c o l . S u f f i c i e n t w a t e r w a s c o l l e c t e d f r o me a c h l o c a t i o n t o p e r f o r m a s i m u l t a n e o u s s p l i t s a m p l e a n a l y -s i s b y t h e AC t e s t a n d t h e MTF t e c h n i q u e . F o r e ac h w a t e rs a m p l e , t h e f o l l o w i n g m i c r o b i o l o g i c a l a n a l y s e s w e r e p e r -f o r m e d : H P C , a 1 0 - t u b e AC MPN a n a l y s i s , a n d a n MTF t e s t

( F i g . 1 ) . W i t h i n t h e g u i d e l i n e s o f t h e Handbook f o r E v a l u a t -i n g W a t e r B a c t e r i o l o g i c a l L a b o r a t o r i e s ( 1 3 ) , s a m p l e s w e r ep r e s c r e e n e d f o r t h e p r e s e nc e o f c o l i f o r m s b ef or e b ei nga n a l y z e d . T h e U . S . E .P .A . e q u i v a l e n c y p r o t o c o l c a l l e d f o rf o u r r e p l i c a t e a n a l y s e s o f e a c h m e t h o d f r o m e a c h s a m p l e .A c c o r d i n g l y , f o u r r o w s o f 1 0 L T B t u b e s a n d f o u r r o w sc o n t a i n i n g 1 0 A C t u b e s w e r e i n o c u l a t e d f r o m e a c h 1 - l i t e rw a t e r s am p l e . LTB t u b e s w e r e e x a m i n e d f o r p o s i t i v i t ya c c o r d i n g t o S t a n d a r d M e t h o d s ( 1 ) . C o n f i r m a t i o n t e s t s w e r ea l s o p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o S t a n d a r d M e t h o d s ( 1 ) . T h e A Ct u b e was e x a m i n e d a t 2 4 h . Any y e l l o w c o l o r was d e s i g n a t e d

1 5 9 6 E DB E RG ET AL .

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D E F I N E D S UB S T R A T E AND MTF 1 5 9 7

I litersample

* , HPC

T e n Tube MTF (

10 Autoanalysis Colilerts M l iT / F oNEG >-STOP

on f i r m edom p l etedor API)

i lo r Y

F I G . 1 . N a t i o n a l e v a l u a t i o n comparing t h e d e f i n e d s u b s t r a t e method (AC) MPN and S t a n d a r d l M e t l l o d s MTF. MF. S c r e e n i n g membranef i l t e r , x 4 , f o u r repeats f r o m t h e same s a m p l e . Y / F , y e l l o w / f l u o r e s c e n t AC t e s t : Y . y e l l o w o n l y AC t e s t : M a i l , s u b c u l t u r e sent to the referencel a b o r a t o r y f o r i d e n t i f i c a t i o n as t o s p e cies; P O S . . p o s i t i v e : NEG. negative.

as p o s i t i v e f o r t o t a l c o l i f o r m s ; f l u o r e s c e n c e d e n o t e d E . c o l i .From a t l e a s t one p o s i t i v e MTF or AC t u b e per row, as u b c u l t u r e was made t o e n s u r e t h e presence o f a t o t a lc o l i f o r m b y i d e n t i f y i n g t h e b a c t e r i a l i s o l a t e ( s ) as t o s p e c i e s .A l l b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n s were p e r f o r m e d b y t h e A PI 20 Esystem ( A n a l y t a b P r o d u c t s , P l a i n v i e w , N . Y . ) ( 7 ) .

S t a t i s t i c a l a n a l y s i s . The d a t a were a n a l y z e d b y u s i n gs e v e r a l s t a t i s t i c a l t e s t s . The S t a t i s t i c s S e c t i o n o f t h e D e p a r t -m en t o f E p i d e m i o l o g y o f Y a l e U n i v e r s i t y a n a l y z e d m u c h o ft h e d a t a . F i r s t , b y u s i n g t h e c r i t e r i a o f t h e U . S . E . P . A . , tt e s t s were p e r f o r m e d . The t t e s t s were c a l c u l a t e d f o r e a c hp a r t i c i p a t i n g u t i l i t y a n d f o r t h e u t i l i t i e s as an a g g r e g a t e . T h et t e s t s were p e r f o r m e d in tw o p a r t s : f i r s t , b y c o n s i d e r i n g t h a tt h e s a m p l e s c o n s i s t e d o f f o u r r e p l i c a t e s o f 1 0 t u b e s f o r e a c hm e t h o d a n d s e c o n d , b y c o n s i d e r i n g e a c h a n a l y s i s t o b e as i m p l e 4 0 - t u b e MPN a n a l y s i s ( 2 , 1 2 ) .S e c o n d , s in ce t h e t t e s t i s more a p p r o p r i a t e t o c h e m i c a lt h a n b a c t e r i a l a n a l y s i s , in w h i c h v a l u e s are continuousr a t h e r t h a n i n c r e m e n t a l , t h e d a t a were a l s o e x a m i n e d b yc h i - s q u a r e a n a l y s i s . T w o c h i - s q u a r e t e s t s were c a l c u l a t e d :t h e M a n t e l - H a e n z e l a n d P e a r s o n ( 2 , 1 2 ) . The M a n t e l -H a e n z e l t e s t generates a s e p a r a t e 2 x 2 t a b l e f r o m e a c hr e p l i c a t e , w i t h a l l s t a t i s t i c s f r o m a l l t a b l e s c o m b i n e d t op r o d u c e a s i n g l e t e s t s t a t i s t i c . The P e a r s o n t e s t c o m b i n e s a l ls a m p l e s i n t o on e 2 x 2 t a b l e ( 2 , 1 2 ) .T h i r d , t h e tw o m e t h o d s were a n a l y z e d b y r e g r e s s i o na n a l y s i s ( 2 , 1 2 ) . A l l s t a t i s t i c s were g e n e r a t e d t o i n c l u d e a n de x c l u d e a l l t u b e s , p o s i t i v e a n d n e g a t i v e .

R ES ULTSC o m p a r i s o n o f S t a n d a r d Method MTF a n d AC t e s t . ( i )Number o f t ub es p o s i t i v e . A t o t a l o f 4 6 d i s t r i b u t i o n water

s a m p l e s were a n a l y z e d f r o m t h e f i v e s i t e s . A t o t a l o f 1 , 0 8 6t u b e s were p o s i t i v e b y MTF, a n d 1 , 2 7 9 were p o s i t i v e b y AC .F o r t h e MTF a n a l y s i s , t h e m e d i a n number o f t u b e s p o s i t i v ep er 4 0 i n o c u l a t e d f r o m a s a m p l e was 2 4 , t h e mean was 2 3 . 6 ,a n d t h e s t a n d a r d error was 2 . 0 . F o r t h e AC t e s t , t h e m e d i a nwas 3 4 . 5 , t h e mean was 2 4 . 8 , a n d t h e s t a n d a r d error was 2 . 1 .The number o f p o s i t i v e t u b e s f o r e a c h o f t h e f o u r MPN

rows f o r e a c h u t i l i t y i s p r e s e n t e d i n T a b l e 2 . T h i s measurea l l o w s an o v e r a l l c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e tw o m e t h o d s , a n di t p e r m i t s t h i s c o r r e s p o n d e n c e , r e g a r d l e s s o f t h e v a r i a t i o n i nan i n d i v i d u a l a n a l y s i s .

( i i ) E f f e c t o f HPC on t o t a l c o l i f o r m recovery. T o t a l HPCsr a n g e d f r o m 3 b a c t e r i a p er m l t o g r e a t e r t h a n 4 , 0 0 0 / m l .H e t e r o t r o p h i c i n t e r f e r e n c e o c c u r r e d i n f o u r f e r m e n t a t i o nt e s t a n a l y s e s . MTF t u b e s d i d n o t y i e l d a c o l i f o r m on s u b c u l -t u r e f r o m t h e s e p o s i t i v e t u b e s . In e a c h o f t h e s e cases, t h eHPC was g r e a t e r t h a n 1 , 5 0 0 / m l . HPC s u p p r e s s i o n o f c o l i -f o r m g r o w t h r e s u l t e d i n a l o s s o f b e t w e e n 1 7 a n d 2 4 t u b e s o u to f a p o s s i b l e 4 0 p er s a m p l e ( T a b l e 3 ) . P o s i t i v e a u t o a n a l y s i st u b e s d i d n o t d e m o n s t r a t e t h e g r o w t h o f h e t e r o t r o p h s whens a m p l e s were t a k e n f o r s u bc ul t ur e b u t d i d y i e l d a c o l i f o r m .

S t a t i s t i c a l a n a l y s e s . ( i ) t t e s t s . The t t e s t a n a l y s i s i s u s e d b yt h e U . S . E . P . A . t o e v a l u a t e a p r o p o s e d method f o r c e r t i f i -c a t i o n as an a l t e r n a t i v e t e s t i n g p r o c e d u r e . t s t a t i s t i c s werec a l c u l a t e d f o r a l l s i t e s as an a g g r e g a t e a n d f o r e a c h s i t ei n d i v i d u a l l y , f i r s t e x c l u d i n g s a m p l e s w h i c h y i e l d e d e i t h e r a l lp o s i t i v e t u b e s or a l l n e g a t i v e t u b e s . T h e r e was no s t a t i s t i c a ld i f f e r e n c e i n u t i l i z i n g t h i s measure between MTF a n d t h eAC , w i t h an o v e r a l l P v a l u e o f < 0 . 0 0 1 . The t t e s t was a l s oc a l c u l a t e d i n c l u d i n g s a m p l e s t h a t y i e l d e d e i t h e r a l l p o s i t i v et u b e s or a l l n e g a t i v e t u b e s . By p a i r e d t t e s t s , which i n c l u d e ds a m p l e s y i e l d i n g a l l p o s i t i v e or n e g a t i v e t u b e s , S t a n d a r - d

TABLE 2 . C o m p a r i s o n o f S t a n d a i r d M e t l h o d s a n d AC MPN r e s u l t s f r o m s p l i t t r a n s m i s s i o n w a t e r s a m p l e s "N o . " o f p o s i t i v e t u b e s f r o m :

Row S i t e A ( 1 1 ) ' S i t e B ( 1 1 ) S i t e C ( 8 ) S i t e D ( 8 ) S i t e E ( 8 )S t a i d c a r d AC S t a n d a i r d AC S t a n d a r d AC S t a t i d a i r d AC S t a n t d a r c d ACM e t l i o d s M e t h l o d s M e t h o d s M e t l h o d s M e t h o d s1 7 4 7 2 5 2 7 2 6 6 6 7 3 4 4 6 4 7 6 12 7 5 7 3 4 4 7 8 6 4 7 1 3 7 3 9 5 2 5 93 7 4 6 8 4 9 7 8 6 9 7 2 3 1 4 3 5 0 5 74 6 3 7 3 5 6 7 7 6 4 7 1 3 3 4 3 5 2 5 4MPN t e s t s were i n o c u l a t e d f r o m s p l i t s a m p l e s t o 4 rows c o n t a i n i n g 1 0 t u b e s e a c h ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) .b T h e number o f p o s i t i v e t u b e s f r o m t h e 1 0 t u b e s i n o c u l a t e d i n t h a t r o w , m u l t i p l i e d b y t h e number o f r o w s i n o c u l a t e d .

C Number o f d i s t r i b u t i o n water s a m p l e s t e s t e d at t h e s i t e . S i t e C i n c l u d e s tw o g e o g r a p h i c a l l y c l o s e u t i l i t i e s i n t h e s a m e U . S . E .P .A . r e g i o n .

Vo - . 5 4 , 1 9 8 8

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1 5 9 8 E D B E RG E T AL .TABLE 3 . R e c o v e r y o f H P C - s u p p r e s s e d S t a n d a r d M e t h o d st u b e b y AC

S t a n d a r d M e t h o d s N o . p o s i t i v e HP CS a m p l e n o . b C (F/iN o . p o s i t i v e N o . s u p p r e s s e d b y AC ( C F U / m l )1 6 1 1 1 7 2 8 > 3 , 0 0 02 2 1 7 2 2 3 9 > 4 , 5 0 03 0 2 2 1 8 4 0 > 1 , 0 0 04 2 2 2 4 2 6 > 2 , 5 0 0

M e t h o d s MPN gave a mean a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n o f 2 3 . 6 0 9+ 1 3 . 8 8 1 ( c o m p a r e d w i t h 2 7 . 8 0 4 + 1 4 . 1 2 0 b y A C ) , w i t h 4 6p a i r e d o b s e r v a t i o n s ; t h e t s t a t i s t i c was - 4 . 1 9 6 , w i t h 4 5d e g r e e s o f f r e e d o m a n d 0 . 0 0 0 s i g n i f i c a n c e . A l t h o u g h t h e ACm e t h o d a p p e a r e d t o y i e l d s o m e w h a t h i g h e r MPN v a l u e s( T a b l e 2 ; a l s o see F i g . 2 ) , t h e r e was no d i f f e r e n c e b e t w e e nt h e tw o m e t h o d s b y t h i s a n a y l s i s , w i t h a P v a l u e o f < 0 . 0 0 1 .( i i ) C h i - s q u a r e a n a l y s e s . The tw o m e t h o d s w e r e a l s o com-p a r e d b y tw o c h i - s q u a r e s t a t i s t i c s . F i r s t , t h e P e a r s o n c h i -square t e s t f o r t h e o v e r a l l p r o p o r t i o n o f p o s i t i v e t u b e s wasd e t e r m i n e d . By t h i s a n a l y s i s , t h r e e o f t h e u t i l i t i e s d e m o n -s t r a t e d t h a t t h e AC was more s e n s i t i v e t h a n t h e S t a n d a r dM e t h o d s MTF ( P > 0 . 0 5 ) ; t h e r e was a p o s i t i v e b i a s , w i t hs l i g h t l y g r e a t e r AC s e n s i t i v i t y o v e r a l l . The M a n t e l - H a e n z e lt e s t c o m p a r e d t h e tw o m e t h o d s b y d e t e r m i n i n g t h e d i f f e r -e n c e b e t w e e n t h e p o s i t i v e t u b e s f o r e a c h m e t h o d a n d s u b -t r a c t i n g f r o m i t t h e e x p e c t e d n u m b e r o f p o s i t i v e t u b e s a n da n a l y z i n g t h e d i f f e r e n c e s . T h i s s t a t i s t i c y i e l d e d t h e samer e s u l t s as t h e P e a r s o n t e s t ( T a b l e 4 ) .( i i i ) R e g r e s s i o n a n a l y s i s . D a t a w e r e a n a l y z e d i n s i m p l e a n dm u l t i p l e r e g r e s s i o n f o r m a t s w i t h t h e AC MPN b e i n g t h e xv a r i a b l e a n d S t a n d a r d M e t h o d s MTF b e i n g t h e y v a r i a b l e .T h e tw o m e t h o d s a g r e e d w i t h e a c h o t h e r t o y i e l d an r v a l u eo f 0 . 8 8 3 a n d an r 2 v a l u e o f 0 .7 7 9 ( F i g . 2 ) . The a d j u s t e d r 2v a l u e was 0 . 7 7 4 , a n d t h e s t a n d a r d error was 6 . 5 9 ( F i g . 2 ) .A n a l y s i s o f v a r i a n c e d e m o n s t r a t e d no d i f f e r e n c e b e t w e e nt h e tw o m e t h o d s , w i t h t h e F t e s t y i e l d i n g a P v a l u e o f 0 . 0 0 1 .Th e b e t a c o e f f i c i e n t t a b l e f o r t h e s i m p l e r e gr e ss i o n y i e l d e d as l o p e o f 0 . 8 6 8 , a s t a n d a r d error o f 0 . 0 7 , a s t a n d a r d v al ue o f0 . 8 8 3 , a t v a l u e o f 1 2 . 4 7 , a n d a P v a l u e o f 0 . 0 0 0 1 . T h e r e f o r e ,t h e r e was n o d i f f e r e n c e b y r e g r e s s i o n a n a l y s i s b e t w e e n t h eS t a n d a r d M e t h o d s MTF a n d A C MPN, a l t h o u g h some b i a si n f av o r o f t h e A C t e s t was e v i d e n t .( i v ) P r e c i s i o n . F o r e a c h o f t h e tw o m e t h o d s , a s s u m p t i o n so f n o r m a l i t y a n d h o m o g e n e i t y o f s a m p l e v a r i a n c e werep e r f o r m e d . Th e r e s p o n s e a n a l y z e d was t h e p r o p o r t i o n o fp o s i t i v e s a m p l e s u n d e r an a r c s i n t r a n s f o r m a t i o n . F o r t h el o c a t i o n s m e e t i n g t h e s e r e q u i r e m e n t s , an F t e s t was u s e d t oa n a l y z e m e t h o d p r e c i s i o n . I f n o t , S c h e f f e t e s t was e m p l o y e d .P r e c i s i o n a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h e AC t e s t was s i g n i f i c a n t l y

120000 0

0 010 0

05.

0~~~~~~

0 1 ' 5 25 3 1 0 40 45C o l i l e r tNumb on th e axes are p o s i t i v t i u b e s pe r s a m p l e

F I G . 2 . C o m p a r i s o n o f t h e AC a n d S t a n d a r d Methods MPN b yr e g r e s s i o n a n a l y s i s . Shown i s t h e s i m p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s ( y =0 . 8 6 8 x -. 5 2 4 , w i t h r 2 =0 . 7 7 9 ) . T h e r e was no d i f f e r e n c e when t h ec o m p a r i s o n was made b y m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s .

more p r e c i s e t h a n MTF i n tw o o f t h e f i v e s i t e s ( T a b l e 5c o u r t e s y o f R . F r e y b e r g a n d T . G r a d y , U . S . E . P . A . E n v i -r o n m e n t a l M o n i t o r i n g a n d S u p p o r t L a b o r a t o r y ) .( v ) L i k e l i h o o d r a t i o t e s t . The l i k e l i h o o d r a t i o t e s t c o m par est h e e s t i m a t e s o f mean b a c t e r i a l d e n s i t y o b t a i n e d f r o m d i f -f e r e n t s e t s o f d a t a ( 2 0 ) . I f one assumes t h a t t h e d i s t r i b u t i o no f t h e number o f p o s i t i v e res pon ses a t a g i v e n d i l u t i o n a l l e v e lf o r t h e MPN m e t h o d i s b i n o m i a l , t h e n t h e l i k e l i h o o d f u n c t i o nmay b e c al c ul a t e d t a k i n g i n t o a c c o u n t t h e v o l u m e o f d i l u e n t ,f a c t o r s , e t c . C a l c u l a t i o n o f t h e l i ke li h oo d r a t i o ( A ) f r o m t h ei n d i v i d u a l l i k e l i h o o d f u n c t i o n L ( X ) b y t h e f o r m u l a A =L ( A ) IL ( ) . . . L x ( X x ) showed a s l i g h t b i a s i n f a v o r o f t h e AC m e t h o d ,-2 I n A s i g n i f i c a n t a t 0 . 5 % .

TABLE 4 . MPN m e t h o d c o m p a r i s o n s b y p a i r e d t t e s t s e x c l u d i n g s a m p l e s y i e l d i n g a l l p o s i t i v e o r n eg at i ve t u b e sMean d i f f e r e n c e SE T P r o b a b i l i t y o f [ t ]S i t e NO G r o u p l b G r o u p 2 " G r o u p 1 G r o u p 2 G r o u p 1 G r o u p 2 G r o u p 1 G r o u p 2

A l l 3 5 7 . 6 8 3 . 8 8 1 . 5 9 9 6 5 0 . 9 0 5 8 7 4 . 8 0 4 . 2 8 0 . 0 0 0 1 0 . 0 0 0 11 6 1 2 . 7 7 4 . 8 1 4 . 4 8 1 4 1 2 . 2 6 5 2 2 2 . 8 5 2 . 1 2 0 . 0 1 5 9 0 . 0 2 7 22 6 5 . 9 5 2 . 9 3 2 . 5 9 9 2 0 1 . 6 0 1 0 7 2 . 2 9 1 . 8 3 0 . 0 7 0 8 0 . 1 2 6 83 5 8 . 3 1 2 . 9 9 5 . 4 1 8 9 2 2 . 2 8 6 0 4 1 . 5 3 1 . 3 1 0 . 2 2 2 8 0 . 2 8 2 44 1 0 1 1 . 7 4 7 . 9 5 3 . 3 5 5 6 4 1 . 8 1 2 6 9 3 . 5 0 4 . 3 8 0 . 0 0 6 7 0 . 0 0 1 85 8 0 . 6 3 - 0 . 1 8 1 . 2 5 9 5 3 1 . 0 0 1 8 1 0 . 5 0 - 0 . 1 8 0 . 6 3 2 6 0 . 8 6 1 6" N u m b e r o f t e s t s , e x c l u d i n g a l l p o s i t i v e o r n e ga t iv e t u b e s .b G r o u p 1 c o n s i d e r e d t h e s a m p l e s a s o n e r e p l i c a t e o f 4 0 t u b e s , w h e re a s g r o up 2 c o n s i d e r e d t h e s a m p l e s a s f o u r r e p l i c a t e s o f 1 0 t u b e s .

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

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D E F IN E D S U BS T RA T E AND MTF 1 5 9 9TABLE 5 . P r e c i s i o n o f t h e t w o m e t h o d s b y s o u r c e

P v a l u eL o c a t i o n F t e s t S c h e f f e t e s tCobb C o u n t y , G a . 0 . 2 2 6 6M o n t e r e y , C a l i f . 0 . 0 1 3 1 aT i n t o n F a l l s , N . J . 0 . 1 5 3 4New H a v e n , C o n n . 0 . 0 0 0 6 "P i t t s b u r g , P a . 0 . 5 7 2 5

a S t a n d a r d M e t h o d s MTF w a s s i g n i f i c a n t l y l e s s p r e c i s e t h a n t h e ACm e t h o d .

P e r f o r m a n c e c h a r a c t e r i s t i c s . T h e o r i g i n a l p e r f o r m a n c eg o a l s f o r w h i c h t h e AC w a s d e s i g ne d w e r e m e t , a n d a d d i -t i o n a l b e n e f i t s b e c a m e a p p a r e n t . T h e c o l l a b o r a t o r s f e l t t h a tt h e y e l l o w c o l o r p r o d u c e d b y t h e t o t a l c o l i f o r m s a n d t h ef l u o r e s c e n c e g e n e r a t e d b y E. c o l i w e r e d i s t i n c t , e a s y t o r e a d ,a n d a p pa r en t w it h i n t h e t i m e f r a m e w o r k o f t h e t e s t ( 2 4 h ) .T h e y a l s o n o t e d t h a t t o t a l c ol i f or m c o u nt s g r e a t e r t h a n 2 5 /1 0 0 m l y i e l d e d r e s u l t s i n 1 6 t o 1 8 h . S e p a r a t e MPN s f o r t o t a lc o l i f o r m s a n d E . c o l i w e r e p r o d u c e d s i m u l t a n e o u s l y . A l lp a r t i c i p a n t s a f f i r m e d t h e e a s e o f o n e - s t e p i n o c u l a t i o n a n dc l a r i t y o f i n t e r p r e t a t i o n o f p o s i t i v e t e s t r e s u l t s . T h e y s u b -s t a n t i a t e d t h e a u t o a n a l y t i c a l n a t u r e o f t h e t e s t b y v e r i f y i n gt h e g o a l t h a t c o n f i r m a t o r y t e s t s n e e d n o t b e p e r f o r m e db e c a u s e o f t h e s p e c i f i c i t y o f t h e i n g r e d i e n t s .B a c t e r i a i s o l a t e d . B a c t e r i a i s o l a t e d f r o m e a c h s p l i t s a m p l ew e r e i d e n t i f i e d a s t o s p e c i e s ( T a b l e 6 ) . B a c t e r i a c o m m o n l yc o n s i d e r e d p a r t o f t h e t o t a l c o l i f o r m g r o u p w e r e f o u n d f r o mb o t h S t a n d a r d M e t h o d s MTF a n d A C t u b e s . K . p n e u m o n i a ewas t h e m o s t c o m m o n s p e c i e s i s o l a t e d , f o l l o w e d b y E .c l o a c a e a n d C . f r e u n d i i . T h e r e w e r e m i x e d c u l t u r e s o f t o t a lc o l i f o r m s p r e s e n t i n b o t h MTF a n d AC t u b e s . T h e h i g h e r t h eb a c t e r i a l c o u n t i n t h e w a t e r s am p l e , t h e g r e a t e r t h e n u m b e ro f s p e c i e s f o u n d . T h e r e d i d n o t a p p e a r t o b e a s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e i n t h e d i s t r i b u t i o n o f b a c t e r i a l s p e c i e s i n e i t h e rm e t h o d .DISCUSSIONT h e AC t e s t i s b as e d o n a new t e c h n o l o g i c a l p r i n c i p l e i nw h i c h a n i n d i c a t o r - n u t r i e n t i s a n e s s e n t i a l f o o d s o u r c e f o r

TABLE 6 . S p e c i e s o f t o t a l c o l i f o r m s i s o l a t e d '% o f a l l i s o l a t e sb e l o n g i n g t o s p e c i e s

S p e c i e s b y m e t h o d :S t a n d a r d A CM e t h o d s

K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e 3 1 2 8K . o x y t o c a 3 6E n t e r o b a c t e r a g g l o m e r a n s 1 9 1 6E n t e r o b a c t e r s p e c i e s 3 7E . c l o a c a e 1 0 1 1E. a e r o g e n e s 1 1C i t r o b a c t e r f r e u n d i i 1 6 1 2S e r r a t i a p l y m u t h i c a 3 4S . f o n t i c o l a 1 1S . r u b i d a e a 3 4S . o d o r i f e r a 2 3H a f n i a a l v e i 1 1E s c h e r i c h i a c o l i 1 1C DC g r o u p s 3 4U n i d e n t i f i e d E n t e r o b a c t e r i a c e a e 3 3

a A l l i s o l a t e s c o n f i r m e d i n BGLB.

t h e t a r g e t m i c r o b e ( Ed b e r g a n d E d b e r g , i n p r e s s ) . B e c a u s e ac h r o m o p h o r e i s r e l e a s e d e ac h t i m e a n i n d i c a t o r - n u t r i e n tm o l e c u l e i s h y d r o l y z e d , c o l o r p r o d u c t i o n i s d i r e c t l y r e l a t e dt o t h e g r o w t h o f t h e t a r g e t b a c t e r i a . In t h e a p p l i c a t i o n o f t h i st e c h n o l o g y t o d r i n k i n g w a t e r a n a l y s i s , t h e i n d i c a t o r - n u t r i -e n t s a r e O N PG ( f o r t o t a l c o l i f o r m s ) a n d MUG ( f o r E . c o l i ) .U n l i k e c l a s s i c a l enzyme a s s a y s , w h i c h u s e ONPG o r MUGo n l y a s s u b s t r a t e s f o r c o n s t i t u t i v e enzyme t e s t s , t h e a u t o a n -a l y s i s t e c h n o l o g y u s e s t h e s e c o m p o u n d s b o t h a s a n e s s e n t i a lg r o w t h s u b s t a n c e a n d a s a n i n d i c a t o r s y s t e m ( c o l o r f o r m a -t i o n a n d f l u o r e s c e n c e ) . T h e r e f o r e , t h e r e i s n o t a d i r e c tc o r r e s p o n d e n c e b e t w e e n t e s t s i n w h i c h O N P G a n d MUG a r eu s e d a s s u b s t r a t e s i n c o n s t i t u t i v e e n z y m e t e s t s ( e . g . , C o l i -f e r m ; M i l l i p o r e C o r p . , W a l t h a m , M a s s . ) a n d t h e g r o w t h -d e p e n d e n t AC t e s t . F o r e x a m p l e , s p e c i e s i n t h e g e n e r aA e r o m o n a s , P s e u d o m o n a s , o r F l a v o b a c t e r i u m t h a t may b ep o s i t i v e i n a c o n s t i t u t i v e ONPG o r MUG enzyme a s s a y w i l ln o t b e p o s i t i v e i n t h e 2 4 - h o u r g r o w t h - b a s e d A C t e s t , u n l e s sa h i g h d e n s i t y ( . 2 0 , 0 0 0 b a c t e r i a p e r m l ) i s p r e s e n t ( E d b e r ga n d E d b e r g , i n p r e s s ) .I n c o n v e n t i o n a l m e d i u m , s e v e r a l s e c o n d a r y r e a c t i o n sm u s t o c c u r b ef o r e a c h a n g e i n t h e i n d i c a t o r i s v i s i b l e . T h et a r g e t m i c r o b e m u s t t r a n s p o r t t h e s u b s t r a t e ( e . g . , l a c t o s e )t h r o u g h t h e c e l l m e m b r a n e , t r a n s f o r m t h e s u b s t r a t e t o g l u -c o s e , m e t a b o l i z e g l u c o s e t h r o u g h t h e g l y c o l y t i c c y c l e t op y r u v a t e , a n d t h e n c o n v e r t p y r uv a t e t o t h e d e s i r e d e n dp r o d u c t , e i t h e r a c i d o r g a s . B e c a u s e c o n v e n t i o n a l t e s t i n gr e q u i r e s t h e m i c r o b e t o g o t h r o u g h many s t e p s t o y i e l d ap o s i t i v e v i s i b l e e n d p o i n t , a n u m b e r o f a n o m a l o u s r e s u l t smay o c c u r , s u c h a s f a l s e - n e g a t i v e g a s p r o d u c e r s ( i . e . , a n a e -r o g e n i c E . c o l i ) o r f a l s e - p o s i t i v e t e s t s ( i . e . , a c i d f r o m l a c t o s eb y s o m e c l o n e s o f Aeromonas h y d r o p h i l i a ) . O N P G - p o s i t i v en o n c o l i f o r m s d o n o t y i e l d a p o s i t i v e AC t e s t , b e c a u s e t h ef o r m u l a d o e s n o t s u p p o r t t h e i r m e t a b o l i s m . T h e r e f o r e , t h ed e t e c t i o n o f t h e , B - g a l a c t o s i d a s e s y s t e m o f h e t e r o t r o p h s w i l lo c c u r o n l y a t e x t r e m e l y h i g h m i c r o b i a l c o n c e n t r a t i o n s ( > 2 0t o 1 0 0 , 0 0 0 / m l ) . T h i s p h e n o m e n o n w i l l b e s e e n w i t h a p p r o x -i m a t e l y 1 0 % o f m e m b e r s o f t h e g e n u s A e r o m o n a s .T h e s p e c i f i c i t y o f t h e d e f i n e d s u b s t r a t e a u t o a n a l y s i s t e c h -n o l o g y e l i m i n a t e s t h e n e e d t o p e r f o r m c o n f i r m a t o r y a n dc o m p l e t e d t e s t s . I n c o n v e n t i o n a l m e t h o d o l o g y , t r a n s f e r sf r o m t h e o r i g i n a l p o s i t i v e t u b e o r p l a t e m u s t b e m a d e i n t oBGLB b r o t h f o r c o n f i r m a t o r y t e s t i n g a n d a s e c o n d t r a n s f e rm u s t b e m a d e t o s o l i d o r l i q u i d medium f o r a c o m p l e t e d t e s t .As s u b s t a n t i a t e d i n t h i s n a t i o n a l e v a l u a t i o n ( T a b l e 6 ) , t h e2 4 - h AC t e s t i s a s s p e c i f i c a s t h e m u l t i p l e d a y c o n f i r m e d a n dc o m p l e t e d S t a n d a r d M e t h o d s MTF a n a l y s i s .S p e c i e s i d e n t i f i c a t i o n f r o m p o s i t i v e t u b e s c o n f i r m e d t h es p e c i f i c i t y o f t h e AC t e s t . From p o s i t i v e AC t u b e s , m e m b e r so f t h e t o t a l c o l i f o r m g r o u p were r e c o v e r e d . T h e r e f o r e ,y e l l o w t e s t t u b e s w e r e o n l y t h e r e s u l t o f t h e g r o w t h o f t h et a r g e t m i c r o b e ( s ) . L i k e w i s e , E . c o l i was r o u t i n e l y r e c o v e r e df r o m t u b e s t h a t f l u o r e s c e d .I n a d d i t i o n t o s p e c i f i c i t y , t h e a u t o a n a l y s i s t e c h n o l o g y wass h o w n t o h a v e e q u a l s e n s i t i v i t y w i t h S t a n d a r d M e t h o d sMTF. S t a n d a r d M e t h o d s M T F t e s t i n g w i l l e n u m e r a t e o n e( . 1 . 1 f o r a 1 0 - t u b e t e s t ) t o t a l c o l i f o r m p e r 1 0 0 m l ( 1 ) . T h e ACt e s t a l s o d e m o n s t r a t e d t h i s l e v e l o f s e n s i t i v i t y , e v e n i n t h ep r e s e n c e o f h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a . I th a s b e e n n o t ed t h a t c u r r e n t m e t h o d s a r e s u b j e c t t o h e t e r o -t r o p h i n t e r f e r e n c e a b o v e 5 0 0 t o 1 , 0 0 0 HPC p e r m l ( 4 ) .B e c a u s e t h e AC t e s t d o e s n o t s u p p o r t t h e g r o w t h o f h e t e r o -t r o p h s i n t h e d e n s i t i e s f o u n d i n w a t e r , t h e s e b a c t e r i a d i d n o ti n t e r f e r e .T h e r e d i d n o t a p p e a r t o b e a l o s s i n s e n s i t i v i t y d u e t o t h ei n a b i l i t y t o e n u m e r a t e i n j u r e d c o l i f o r m s . P r e v i o u s l a b o r a t o r y

V O L . 5 4 , 1 9 8 8

7/28/2019 Appl. Environ. Microbiol.

7/8

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

a n a l y s i s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e AC t e s t can enumerate i n -j u r e d c o li f o r m s w it h i n 2 4 h , a l t h o u g h t h e i n t e n s i t y o f c o l o rp r o d u c t i o n i s l e s s , c o m p a r e d w i t h t h a t o f n o n i n j u r e d c o l i -f o r m s ( E d b e r g a n d E d b e r g , i n p r e s s ) .S e v e r a l b e n e f i t s o t h e r t h a n t h o s e d e s c r i b e d a b o v e weren o t e d b y p a r t i c i p a t i n g water u t i l i t i e s d u r i n g t h e n a t i o n a le v a l u a t i o n . T h e a u t o a n a l y t i c a l n a t u r e o f t h e m e t h o d m a d e i tmu ch m ore p r a c t i c a l a n d e f f i c i e n t t o p e r f o r m t h a n c u r r e n tc o l i f o r m m e t h o d s . T h e p a r t i c i p a n t s f e l t t h a t i n t e r p r e t a t i o n o ft h e AC t e s t w as l e s s s u b j e c t i v e t h a n t h a t o f t h e S t a n d a r dM e t h o d s p r o c e d u r e . I t w as mu ch e a s i e r t o s e e w h e t h e r ay e l l o w c o l o r or f l u o r e s c e n c e w as p r o d u c e d t h a n t o d e c i d ew h e t h e r LTB t u b e s were p o s i t i v e . T h e d e t e r m i n a t i o n o f g a sw as o f t e n s u b j e c t i v e a n d n o t e n h a n c e d b y a n a d d i t i o n a l 2 t o4 h o f i n c u b a t i o n . B e c a u s e t h e c o l o r s were d i s t i n c t , i t w asp o s s i b l e t h a t a m o d e r a t e l y t r a i n e d i n d i v i d u a l c o u l d i n t e r p r e tt h e AC t e s t . F u r t h e r m o r e , s i n c e t h e r e w ere no a d d i t i o n a lt e s t s n e e d e d , an a n a l y s i s d i d n o t e x t e n d t h r o u g h w e e k e n d s ,w h i c h c o u l d r e s u l t i n a d e l a y o f 2 t o 5 d a y s i n o b t a i n i n gd e f i n i t i v e r e s u l t s . A l s o , i n c o n t r a s t t o o t h e r m e t h o d s i nw h i c h w e e k e n d s a d d e d 2 o r more d a y s t o t h e a n a l y s i s ,s e v e r a l p a r t i c i p a n t s s a i d t h a t t h e y w o u l d b e w i l l i n g t o t e s twater on F r i d a y a n d h a v e someone b r i e f l y s t o p i n onS a t u r d a y t o r e a d t h e r e s u l t s , t h u s a d d i n g o n l y 1 d a y t o t h et e s t i n g r e g i m e n . V i r t u a l l y a n y water u t i l i t y e m p l o y e e c o u l da c c u r a t e l y r e a d a n d r e c o r d t h e AC t e s t r e s u l t s .B e c a u s e t h e i n g r e d i e n t s a r e i n p o w d e r f o r m a n d h av e anu n r e f r i g e r a t e d s h e l f l i f e o f a t l e a s t 1 y e a r , t h e p a r t i c i p a n t s f e l tt h a t t h e y c o u l d s t o c k a l a r g e n u m b e r o f t u b e s . T h i s w o u l de n a b l e t h e u t i l i t i e s t o r e s p o n d q u i c k l y t o e i t h e r c h a n g e s i nt h e w o r k f l o w o r e m e r g e n c i e s .A s t r e n g t h o f t h e A C t e s t i s i t s a p p l i c a b i l i t y t o u s e b y t h es m a l l u t i l i t y . F i r s t , t h e A C t e s t can b e i n o c u l a t e d i n t h e f i e l d .O n c e t h e f o r m u l a i s h y d r a t e d , t h e b a c t e r i a b e g i n t o g r o w ,a l t h o u g h more s l o w l y a t a m b i e n t t h a n i n c u b a t o r t e m p e r a -t u r e . M o r e o v e r , one a v o i d s a n y c h a n g e i n t h e b a c t e r i a lc o m p o s i t i o n o f t h e water s a m p l e d u r i n g s t o r a g e a n d t r a n s -p o r t . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e c h a r a c t e r i s t i c n a t u r e o f t h e c o l o r sm a k e s i t p o s s i b l e f o r t h e s m a l l - u t i l i t y o p e r a t o r t o d e t e r m i n et h e p r e s e n c e o f b o t h t o t a l c o l i f o r m s a n d E . c o l i . T h i si m m e d i a t e r e a d i n g o f r e s u l t s c o u l d e l i m i n a t e , w i t h s t a t ea p p r o v a l , t h e i n h e r e n t d e l a y i n s e n d i n g s a m p l e s t o commer-c i a l l a b o r a t o r i e s . P r o l o n g i n g s a m p l e t r a n s i t t i m e s r e s u l t s i nq u e s t i o n a b l e o r u n a c c e p t a b l e r e s u l t s ( 6 ) . I n a d d i t i o n , s i g n i f -i c a n t m o n e t a r y s a v i n g s can b e r e a l i z e d b y t h e s m a l l u t i l i t y ,b e c a u s e t h e i r o n l y c o s t f o r b a c t e r i o l o g i c a l water m o n i t o r i n gi s t h e c o s t o f t h e t e s t i t s e l f . I f s t a t e c e r t i f y i n g a g e n c i e sr e q u i r e i n d e p e n d e n t v e r i f i c a t i o n o f t h e t e s t , t h e s m a l l u t i l i t yc an f o r w a r d t h e A C t u b e t o a r e f e r e n c e l a b o r a t o r y . T h et a r g e t m i c r o b e s r e m a i n v i a b l e i n t h e t e s t f o r a t l e a s t 7 d a y sa n d can b e a n a l y z e d b y a n o t h e r l a b o r a t o r y , i f r e q u i r e d . T h ed o u b l e - s t r e n g t h l a c t o s e b r o t h ( D S L B ) c a n a l s o b e i n o c u l a t e di n t h e f i e l d . H o w e v e r , t h e d e t e r m i n a t i o n o f a p o s i t i v e r e s u l tf r o m DSLB i s m uch more s u b j e c t i v e t h a n t h e r e a d i n g o f a nA C t u b e . F u r t h e r m o r e , once c o l o r f o r m s i n t h e AC t u b e i t i sp e r m a n e n t ; e x t e n d e d i n c u b a t i o n o f t h e DSLB c a n r e s u l t i nc h a n g e s i n t h e m e d i u m w h i c h m a k e i t d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t .T h e c o s t o f t h e AC t e s t f o r a s i n g l e w a t e r s a m p l e i sb e t w e e n 2 0 a n d 1 0 0 % l e s s t h a n S t a n d a r d M e t h o d s MTFt e s t i n g , d e p e n d i n g u p o n w h e t h e r t h e u t i l i t y p e r f o r m s t h ea n a l y s i s i t s e l f o r s e n d s i t t o a n o u t s i d e l a b o r a t o r y ( c o m m e r -c i a l or r e g u l a t o r y ) . T h e p a r t i c i p a n t s f e l t t h a t t h e m a j o r c o s ts a v i n g a ss o ci at e d w i t h t h e t e s t l i e s i n d e c r e a s e d l a b o r a n db e t t e r q u a l i t y c o n t r o l .T h e AC t e s t p r o v i d e s t h e s i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f t h em a j o r f e c a l c o l i f o r m , E. c o l i , f o r no a d d i t i o n a l c o s t o r e f f o r t .

C u r r e n t S a f e W a t e r D r i n k i n g A c t R e g u l a t i o n s d o n o t c u r -r e n t l y r e q u i r e t h e r o u t i n e a n a l y s i s f o r t h i s s p e c i e s . H o w e v e r ,t h e new r e g u l a t i o n s may m a n d a t e i t ( 1 1 ) . I t i s g e n e r a l l yt h o u g h t t h a t E . c o l i i s a m uch more s p e c i f i c i n d i c a t o r o f t h ef e c a l p o l l u t i o n o f f r es h wa te r t h an a r e t o t a l c o l i f o r m s . T h et o t a l c o l i f o r m g r o u p i s u s e d n o w , b e c a u s e i t h a s b e e nt e c h n i c a l l y d i f f i c u l t t o a n a l y z e w a t e r d i r e c t l y f o r t h i s s p e c i e s( 5 ) . P u b l i c h e a l t h a u t h o r i t i e s g e n e r a l l y f e e l t h a t t h e a b s e n c eo f E. c o l i , e v e n when d i s t r i b u t i o n w a t e r h a s t o t a l c o l i f o r m s i na b i o f i l m r e g r o w t h s i t u a t i o n , i n d i c a t e s t h a t t h e f i n i s h e d w a t e ri s a c c e p t a b l e f o r c o n s u m p t i o n ( 1 7 ) . T h e r e f o r e , t h e a b i l i t y t os i m u l t a n e o u s l y a s s a y f o r b o t h t o t a l c o l i f o r m s a n d E. c o l i i sa n a d d e d d i m e n s i o n t o w a t e r a n a l y s i s n o t p r e v i o u s l y a v a i l -a b l e . I t w i l l p r o v i d e u t i l i t i e s a n i m m e d i a t e m e a s u r e o fw h e t h e r a s a m p l e h a s b e e n s u b j e c t t o f e c a l c o n t a m i n a t i o n .T h e u t i l i t y w o u l d n o t h a v e t o p e r f o r m f e c a l c o l i f o r m a n a l y s e so r b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n s o n c o l o n i e s a f t e r s u b c u l t u r e o f t h ep r i m a r y t e s t , a s t h e y d o n o w . T h i s a d d i t i o n a l t e s t i n g c o u l dd e l a y a d e f i n i t i v e a n s w e r f o r s e v e r a l d a y s , a n u n d e s i r a b l es i t u a t i o n e n g e n d e r e d b y t h e c u r r e n t a v a i l a b l e t e c h n o l o g y . Inmany c a s e s , a d d i t i o n a l w a t e r s a m p l e s h a v e t o b e t e s t e d i fo n e w i s h e d t o p u r s u e a p o s si b l e p o l l u t i o n e v e n t f u r t h e r t od e t e r m i n e w h e t h e r E . c o l i w a s p r e s e n t i n t h e p o s i t i v e s a m -p l e ; w i t h t h e A C m e t h o d , t h i s w o u l d n o t b e n e c e s s a r y . T h ea n a l y s t w o u l d know w h e t h e r t o t a l c o l i f o r m s , f o r r e g u l a t o r yp u r p o s e s , a n d E. c o l i , f o r p u b l i c h e a l t h p u r p o s e s , w e r ep r e s e n t i n t h e s a m e s a m p l e .I t s h o ul d b e n o t e d t h a t t h e A C t e s t h a s s p e c i f i c l i m i t a t i o n s .F i r s t , w h i l e i t h a s b e e n f o u n d t o b e r e f r a c t o r y t o t h e d e n s i t yo f h e t e r o t r o p h s e n c o u n t e r e d i n t h e n a t i o n a l e v a l u a t i o n , i nt h e l a b o r a t o r y o n e s p e c i e s o f b a ct e r i u m, A . h y d r o p h i l i a , wasf o u n d t o y i e l d a p o s i t i v e e n d p o i n t ( y e l l o w c o l o r ) a f t e r 3 2 h o fi n c u b a t i o n a t v e r y h i g h d e n s i t i e s . A t o t a l o f 2 0 Aeromonasi s o l a t e s w e r e t e s t e d , a n d a w i d e r a n g e o f a c t i v i t y waso b s e r v e d ; h o w e v e r , 2 i s o l a t e s s h o w e d p o s i t i v e t o t a l c o l i f o r mr e a c t i o n s a t i n o c u l a t i o n d e n s i t i e s o f 2 0 , 0 0 0 / m l a t 3 2 - a n d 3 6 - hi n cu b at i o n , r e s pe ct i v e ly ( E d b e r g a n d E d b e r g , i n p r e s s ) .W h i l e t h e s e Aeromonas c o n c e n t r a t i o n s a r e u n l i k e l y t o b ee n c o u n t e r e d i n d r i n k i n g w a t e r , a n d t h e t e s t s h o u l d n o te x t e n d b e y o n d a 2 4 - t o 2 8 - h i n c u b a t i o n p e r i o d , i t i s r e c o m -m e n d e d t h a t a n y AC t e s t i n c u b a t e d f o r m o r e t h a n 3 0 h a n dt h e n n o t e d a s p o s i t i v e s h o u l d b e c o n f i r m e d b y a BGLBb r o t h , o t h e r S t a n d a r d M e t h o d s c o n f i r m a t i o n , o r s p e c i e si d e n t i f i c a t i o n .I s o l a t e s o f P s e i u d o m o n a s a n d F l a v o b a c t e r i u m s p e c i e s d i dn o t d e m o n s t r a t e p o s i t i v e t o t a l c o l i f o r m o r E . c o l i t e s t s a tc o n c e n t r a t i o n s u p t o 5 0 , 0 0 0 b a c t e r i a p e r m l . P e t z e l a n dH a r t m a n ( 2 2 ) d i d r e p o r t F l a v o b a c t e r i u m s p . i s o l a t e s t h a ty i e l d e d a p o s i t i v e c o n s t i t u t i v e e n z y m e MUG t e s t f r o mb a c t e r i a l c o l o n i e s . T h e s e w e r e t e s t e d ( c o u r t e s y o f E u g e n eR i c e , U . S . E . P . A . ) a n d d i d n o t y i e l d a p o s i t i v e r e s u l t u n t i ld e n s i t i e s u n l i k e l y t o b e f o u n d i n d r i n k i n g w a t e r ( . 1 0 0 , 0 0 0b a c t e r i a p e r m l ) w e r e r ea c h ed ( u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . I ta p p e a r s t h a t a t v e r y h i g h b a c t e r i a l d e n s i t i e s , t h e A C t e s t maya c t a s a n e n z y m e a s s a y a n d b e c o m e p o s i t i v e , n o t t h r o u g h ag r o w t h m e c h a n i s m, b u t b y d i r e c t e n z y m e m e a s u r e m e n t .T h e r e f o r e , t h e A C t e s t s h o u l d n o t b e u s e d a s a c o n f i r m a t o r yt e s t f r o m e i t h e r MTF b r o t h s o r c o l o n i e s f r o m p l a t e s .S e c o n d , l a b o r a t o r y t e s t i n g h a s s h o w n t h a t i n j u r e d c o l i -f o r m s e x h i b i t a l o n g e r l a g p h a s e t h a n n o r m a l c o l i f o r m s i n t h eA C t e s t ( E d b e r g a n d E d b e r g , i n p r e s s ) . I t w a s f o u n d t h a to n c e t h e i n j u r e d c o l i f o r m s r e p a i r e d t h e m s e l v e s a n d e n t e r e dl o g p h a s e t h e y g r e w a s r a p i d l y a s n o r m a l c o l i f o r m s . P r a c t i -c a l l y , t h i s m e a n t t h a t t h e i n t e n s i t y o f y e l l o w c o l o r p r o d u c e da t 2 4 h b y i n j u r e d c o l i f o r m s may b e l e s s t h a n t h a t p r o d u c e db y n o r m a l c o l i f o r m s . I f k e p t b e t w e e n 2 a n d 4 h l o ng e r t h an

1 6 0 0 EDBERG E T A L .

7/28/2019 Appl. Environ. Microbiol.

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DEFINED SUBSTRATE AND MTF 1 6 0 1t h e 2 4 - h i n c ub at i o n p e r i o d , t h e i n j u r e d c o l i f o r m s a c h i e v e dt h e s a m e c o l o r l e v e l a s n o r m a l t o t a l c o l i f o r m s . T h e r e f o r e , i ti s r e c o m m e n d e d t h a t i f n o c o l o r i s n o t e d a t 2 4 h , t h e r e s u l ts h o u l d b e c o n s i d e r e d n e g a t i v e ; i f a n y y e l l o w c o l o r i s n o t e d ,t h e r e s u l t s h o u l d b e c o n s i d e r e d p o s i t i v e . I f t h e a na l ys t i su n s u r e o f c o l o r f o r m a t i o n , h e o r s h e s h o u l d r e i n c u b a t e t h et e s t f o r a n a d d i t i o n a l 2 t o 4 h a n d e x a m i n e i t f o r a n i n c r e a s ei n y e l l o w c o l o r . T h i s a d d i t i o n a l i n c u b a t i o n p e r i o d w i l l a l s oa c c o u n t f o r t h e s l i g h t l y y e l l o w c o l o r t h a t some w a t e r s mayh a v e d u e t o h u m i c m a t e r i a l , b e c a u s e t h e se t u b e s w i l l n o ti n c r e a s e t h e i r c o l o r i n t e n s i t y a n d c a n b e c l a s s i f i e d n e g a t i v e .T h i r d , a l t h o u g h t h e A C d e t e r m i n e s t h e p r e s e n c e o f E. c o l is i m u l t a n e o u s l y w i t h t o t a l c o l i f o r m s , t h i s s h o u l d n o t b ec o n s i d e r e d t h e s a m e a s a f e c a l c o l i f o r m t e s t . E. c o l i m a k e su p a p p r o x i m a t e l y 90% o r m o r e o f f e c a l c o l i f o r m s , b u t o t h e rb a c t e r i a , n ot ab ly K . p n e u m o n i a e , may a l s o f a l l i n t o t h i sc a t e g o r y i f i t g r o w s a t 4 4 . 5 C i n E . C . b r o t h w i t h t h ep r o d u c t i o n o f g a s ( 1 ) . T h e r e f o r e , i f E . c o l i i s f o u n d b y t h e A Ct e s t , o n e may c o n s i d e r t h e s a m p l e t o b e f e c a l c o l i f o r mp o s i t i v e ; h o w e v e r , i f E . c o l i i s n o t d e t e c t e d , t h e r e may s t i l lb e f e c a l c o l i f o r m s i n t h e s a m p l e .L a s t l y , t h e n a t i o n a l e v a l u a t i o n o f t h e AC t e s t w a s l i m i t e db y d e s i g n t o d r i n k i n g w a t e r d i s t r i b u t i o n s a m p l e s . I f t h e t e s ti s t o b e a p p l i e d t o a d i f f e r e n t w a t e r s o u r c e , s u c h a s s t o r mr u n o f f , m a r i n e w a t e r s , w a s t e e f f l u e n t s , e t c . , t h e u s e r s h o u l df i r s t e s t a b l i s h t h e e f f i c a c y o f t h e t e s t i n t h e e n v i r o n m e n t .I n s u m m a r y , t h e AC t e s t c a n s i mu l ta ne o us l y d e t e c t t o t a lc o l i f o r m s a n d E . c o l i f r o m a w a t e r s a m p l e w i t h i n 2 4 h . Noc o n f i r m a t o r y o r c o m p l e t e d t e s t s n e e d b e p e r f o r m ed . HPCb a c t e r i a d o n o t i n t e r f e r e i n d e n s i t i e s l i k e l y t o b e e n c o u n -t e r e d . A l l o n e d o e s i s a d d w a t e r t o t h e t u b e s a n d i n c u b a t et h e m f o r a maximum o f 2 4 h . I n t e r p r e t a t i o n o f t h e e n d p o i n t s ,y e l l o w f o r t o t a l c o l i f o r m s a n d f l u o r e s c e n c e f o r E . c o l i , i sd i s t i n c t . A n a t i o n a l e v a l u a t i o n c o n d u c t e d a c c o r d i n g t o U . S .E . P . A . p r o t o c o l d e m o n s t r a t e d t h a t t h i s t e s t was e q u i v a l e n tw i t h S t a n d a r d M e t h o d s MTF. T h e AC i s l e s s c o s t l y t h a nS t a n d a r d M e t h o d s MTF a n d r e q u i r e s c o n s i d e r a b l y l e s sl a b o r . I t a l l o w s s m a l l u t i l i t i e s t o t e s t a s a c c u r a t e l y a s l a r g eo n e s , f u r t h e r e n s u r i n g s a f e w a t e r . T h e m e t h o d i s c u r r e n t l yu n d e r g o i n g n a t i o n a l e v a l u a t i o n a s a p r e s e n c e - a b s e n c e t e s t ,s i n c e t h i s f o r m a t may b e m a n d a t e d f o r r e g u l a t o r y p u r p o s e si n t h e f u t u r e ( 1 1 ) .

ACKNOWLEDGMENTSW e t h a n k Ramon L e e f o r h i s h e l p f u l d i s c u s s i o n s d u r i n g t h e c o u r s eo f t h i s p r o j e c t . E d w i n G e l d r e i c h , U . S . E . P . A . , i s t h a n k e d f o r h i sr e v i e w o f t h e m a n u s c r i p t . T h i s s t u d y was r e v i e w e d b y a p r o j e c ta d v i s o r y c o m m i t t e e o f J o y c e K i p p i n , I p s w i c h , M a s s . , R i c h a r dT o b i n , H e a l t h a n d P u b l i c W e l f a r e , C a n a d a , a n d D o n a l d J . R e a s o n e r ,U . S . E . P . A .T h i s w o r k was s u p p o r t e d , i n p a r t , b y t h e U . S . E . P . A . t h r o u g h ac o o p e r a t i v e a g r e e m e n t ( C R 8 1 1 3 3 5 ) w i t h t h e A m e r i c a n W a t e r W o r k sA s s o c i a t i o n R e s e a r c h F o u n d a t i o n .

LITERATURE CITED1 . A m e r i c a n P u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n . 1 9 8 5 . S t a n d a r d m e t h o d s f o rt h e e x a m i n a t i o n o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r , 1 6 t h e d . A m e r i c a nP u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n , I n c . , W a s h i n g t o n , D . C .2 . B i s h o p , Y . M . , W . E . F i e n b e r g , a n d P . W . H o l l a n d . 1 9 7 5 .D i s c r e t e m u l t i v a r i a t e a n a l y s i s : t h e o r y a n d p r a c t i c e . MI T P r e s s ,C a m b r i d g e , M a s s .3 . B i s s o n n e t t e , G . K . , J . J . J e z e s k i , a n d G . A . M c F e t e r s , a n d D . G .S t u a r t . 1 9 7 7 . E v a l u a t i o n o f r e c o v e r y m e t h o d s t o d e t e c t c o l i -f o r m s i n w a t e r . A p p l . M i c r o b i o l . 3 3 : 5 9 0 - 5 9 5 .

4 . B o r d n e r , R . , a n d J . W i n t e r ( e d . ) . 1 9 7 8 . M i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d sf o r m o n i t o r i n g t h e e n v i r o n m e n t - w a t e r a n d w a s t e s . U . S . E n v i -r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y , C i n c i n n a t i .5 . C a b e l l i , V . J . 1 9 8 2 . M i c r o b i a l i n d i c a t o r s y s t e m s f o r a s s e s s i n gw a t e r q u a l i t y . A n t o n i e van L e e u w e n h o e k J . M i c r o b i o l . 4 8 : 6 1 3 -6 1 8 .6 . C o v e r t , T . C . 1 9 8 5 . U . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y ' sM e t h o d s E q u i v a l e n c y P r o g r a m F o r D r i n k i n g W a t e r S a m p l e s .U . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n A g e n c y , C i n c i n n a t i .7 . E d b e r g , S . C . , B . A t k i n s o n , C . C h a m b e r s , M. H . M o o r e , L .P a l u m b o , C . F . Z o r z o n , a n d J . M. S i n g e r . 1 9 7 9 . C l i n i c a l e v a l u -a t i o n o f t h e M I C R O - I D , AP I 2 0 E , a n d c o n v e n t i o n a l m e d i as y s t e m s f o r i d e n t i f i c a t i o n o f E n t e r o b a c t e r i a c e a e . J . C l i n . M i c r o -b i o l . 1 0 : 1 6 1 - 1 6 7 .8 . E d b e r g , S . C . , V . P i s c i t e l l i , a n d M. C a r t t e r . 1 9 8 6 . P h e n o t y p i cc h a r a c t e r i s t i c s o f c ol i f o r m a n d n o n c o l i f o r m b a c t e r i a f r o m ap u b l i c w a t e r s u p p l y c o m p a r e d w i t h r e g i o n a l a n d n a t i o n a l c l i n i c a ls p e c i e s . A p p l . E n v i r o n . M ic ro b io l . 5 2 : 4 7 4 - 4 7 8 .9 . E v a n s , T . M . , M. W . L e C h e v a l l i e r , C . E . W a a r v i c k , a n d R . J .S e i d l e r . 1 9 8 1 . C o l i f o r m s p e c i e s r e c o v e r e d f r o m u n t r e a t e d s u r -f a c e w a t e r a n d d r i n k i n g water b y t h e m e m b r a n e f i l t e r , s t a n d a r d ,a n d m o d i f i e d m o s t - p r o b a b l e - n u m b e r t e c h n i q u e s . A p p l . E n v i -r o n . M i c r o b i o l . 4 1 : 6 5 7 - 6 6 3 .1 0 . E v a n s , T . M . , C . E . W a a r v i c k , R . J . S e i d l e r , a n d M. W .L e C h e v a l l i e r . 1 9 8 1 . F a i l u r e o f t h e m o s t - p r o b a b l e - n u m b e r t e c h -n i q u e t o d e t e c t c o l i f o r m s i n d r i n k i n g water a n d raw waters u p p l i e s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 1 : 1 3 0 - 1 3 8 .1 1 . F e d e r a l R e g i s t e r . 1 9 7 5 . N a t i o n a l i n t e r i m p r i m a r y water r e g u l a -t i o n s . F e d . R e g i s t . 4 0 : 5 9 5 6 6 - 5 9 5 8 8 .1 2 . F l e i s s , J . L . 1 9 8 1 . S t a t i s t i c a l m e t h o d s f o r r a t e s a n d p r o p o r t i o n s ,2 n d e d . J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , N ew Y o r k .1 3 . G e l d r e i c h , E . E . 1 9 7 5 . Handbook f o r e v a l u a t i n g water b a c t e r i -o l o g i c a l l a b o r a t o r i e s , 2 n d e d . U . S . E n v i r on m e n t a l P r o t e c t i o nA g e n c y , C i n c i n n a t i .1 4 . G e l d r e i c h , E . E . , H . D . N a s h , D . J . R e a s o n e r , a n d R . H . T a y l o r .1 9 7 2 . T h e n e c e s s i t y o f c o n t r o l l i n g b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s i np o t a b l e w a t e r s : c o m m u n i t y water s u p p l y . J . Am . W a t e r W o r k sA s s o c. 6 4 : 59 6 -6 0 2 .1 5 . J a c o b s , N . J . , W . L . Z e i g l e r , F . C . R e e d , T . A . S t u k e l , a n d E . W .R i c e . 1 9 8 6 . C o m p a r i s o n o f membrane f i l t e r , m u l t i p l e - f e r m e n t a -t i o n - t u b e , a n d p r e s e n c e - a b s e n c e t e c h n i q u e s f o r d e t e c t i n g t o t a lc o l i f o r m s i n s m a l l c o m m u n i t y water s y s t e m s . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 5 1 : 1 0 0 7 - 1 0 1 2 .1 6 . L e C h e v a l l i e r , M. W . , S . C . C a m e r o n , a n d G . A . M c F e t e r s . 1 9 8 3 .New medium f o r i m p r o v e d r e c o v e r y o f c o l i f o r m b a c t e r i a f r o md r i n k i n g w a t e r . A p p l . E n v i r o n . M i cr o b i ol . 4 5 : 4 8 4 - 4 9 2 .1 7 . L u d w i g , F . , A . C o c c o , S . C . E d b e r g , J . L . H a d l e r , a n d E . E.G e l d r e i c h . 1 9 8 5 . D e t e c t i o n o f e l e v at e d l e v e l s o f c o l i f o r m b a c t e -r i a i n a p u b l i c water s u p p l y - C o n n e c t i c u t . M o r b i d . M o r t a l .W e e k l y R e p . 3 4 : 1 4 2 - 1 4 4 .1 8 . M c F e t e r s , G . A . , S . C . C a m e r o n , a n d M. W . L e C h e v a l l i e r . 1 9 8 2 .I n f l u e n c e o f d i l u e n t s , m e d i a , a n d membrane f i l t e r s on t h ed e t e c t i o n o f i n j u r e d w a t e r b o r n e c o l i f o r m b a c t e r i a . A p p l . E n v i -

r o n . M i c r o b i o l . 4 3 : 9 7 - 1 0 3 .1 9 . M c F e t e r s , G . A . , a n d D . G . S t u a r t . 1 9 7 2 . S u r v i v a l o f c o l i f o r mb a c t e r i a i n n a t u r a l w a t e r s : f i e l d a n d l a b o r a t o r y s t u d i e s w i t hm e m b r a n e - f i l t e r c h a m b e r s . A p p l . M i c r o b i o l . 2 4 : 8 0 5 - 8 1 1 .2 0 . M a u l , A . , J . C . B l o c k , a n d A . H . E l - S h a a r a w i . 1 9 8 5 . S t a t i s t i c a la p p r o a c h f o r c o m p a r i s o n b e t w e e n m e t h o d s o f b a c t e r i a l enumer-a t i o n i n d r i n k i n g w a t e r . J . M i c r o b i o l . M e t h o d s 4 : 6 7 - 7 7 .2 1 . M o r g a n , G . B . , P . G u b b i n s , a n d V . M o r g a n . 1 9 6 5 . A c r i t i c a la p p r a i s a l o f t h e membrane f i l t e r t e c h n i c . H e a l t h L a b . S c i .2 : 2 2 7 - 2 3 7 .2 2 . P e t z e l , J . P . , a n d P . A . H a r t m a n . 1 9 8 6 . A n o t e on s t a r c hh y d r o l y s i s a n d 3 - g l u c u r o n i d a s e a c t i v i t y among f l a v o b a c t e r i a . J .A p p l . B a c t e r i o l . 6 1 : 4 2 1 - 4 2 6 .2 3 . S h i p e , E . L . , J r . , a n d G . M. C a m e r o n . 1 9 5 4 . A c o m p a r i s o n o ft h e membrane f i l t e r w i t h t h e mo st p r o b a b l e number m e t h o d f o rc o l i f o r m d e t e r m i n a t i o n s f r o m s e v e r a l w a t e r s . A p p l . M i c r o b i o l .2 : 8 5 - 8 8 .

VOL. 5 4 , 1 9 8 8