8/19/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1979 Cronk 892 6

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8/19/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1979 Cronk 892 6

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A L C O H O L SI N TA P E KETAN F E R M E N TAT I O N 8 9 3

q u a l i t a t i v e l ya n d q u an t i t a t i v e l y t h eh i g h e r a l -c o h o l sw h i c hc o n t r i b u t et o t h e u n i q u ef l a v o ro ft a p 6 k e t a n .

M AT E R L A L SAND METHODS

M i c r o o r g a n i s m sa n d s u b s t r a t e . T h e m i c r o o r g a -n i s m s ,t h e i rs o u r c e s , a n d t h e t e c h n i q u e se m p l o y e df o rc u l t u r em a i n t e n a n c ea n d i n o c u l u mp r e p a r a t i o n u s e di n t h i ss t u d yh a v e b e e nd e s c r i b e dp r e v i o u s l y 4 ) .T h ef e r m e n t a t i o ns u b s t r a t ec o n s i s t e do f h y d r a t e d ,p o l i s h e dw h i t e r i c e( C a r o l i n aB r a n d ) . t o t a lo f 4 0g o f r i c ea n d1 0 0 m l o f w a t e r were a d d e d t o a c i r c u l a rN a l g e n es p e c i m e nd i s h ( 1 0 5 b y 4 2 mm . D i s h e swere c o v e r e d ,s t e a m e df o r1 5 m i n , a n d s u b s e q u e n t l ya u t o c l a v e df o r1 5 m i na t 1 2 1 0 C .

Sample p r e p a r a t i o n . A s a m p l ec on s i s te d o f t h ee n t i r e c o n t e n t s o f o n e d i s h .A t e a c h s a m p l ep o i n t ,ad i s h was r e m o v e df r o mt h e i n c u b a t o r ,t i g h t l yc o v e r e d ,

a n d q u i c k l yf r o z e n a t

- 2 0 ° Cu n t i lt h e

a n a l y s i sc o u l d

b e p e r f o r m e d .B e f o r e a n a l y s i s ,s a m p l e swere b r i e f l yt h a w e da t room t e m p e r a t u r e ,q u a n t i t a t i v e l y d i l u t e da p p r o x i m a t e l y3 : 1w i t h d i s t i l l e dw a t e r a n d c o m m i -n u t e dw i t h an O m n i m i x e r .B y u s i n g a m i c r o - K j e l d a h ld i s t i l l a t i o na p p a r a t u s , 5 0 m l o f t h e c o m m i n u t e df e r -m e n t e dp r o d u c twas d i s t i l l e d ,a n d an e q u a lv o l u m eo ft h e d i s t i l l a t ewas c o l l e c t e dover an i n t e r v a lo f a p p r o x -

i m a t e l y 2 0 m i n .S a m p l e swere f u r t h e rp r e p a r e d f o ra n a l y s i sb y t h e a d d i t i o no f 0 . 1m l o f 3 - p e n t a n o l( 1 2 . 1 1m g / m l )a s an i n t e r n a ls t a n d a r dt o e a c h 1 0 - m ls a m p l eo f t h e steam d i s t i l l a t e .

Ga s c h r o m a t o g r a p h i cd e t e r m i n a t i o n .F u s e l o i la l c o h o l swere d e t e r m i n e dq u a l i t a t i v e l ya n d q u a n t i t a -t i v e l yb y ga s c h r o m a t o g r a p h y ,u s i n g t h e p r o c e d u r e( m e t h o d1 ) o f K a h n a n d B l e s s i n g e r( 8 ) .T h e ga s c h r o -m a t o g r a p h i ci n s t r u m e n tu s e d was a C a r l e m o d e l9 0 0 0e q u i p p e dw i t h a f l a m e i o n i z a t i o nd e t e c t o r .A c o i l e dc o p p e r c o l u m n( 1 0f e e t[ c a .3 . 0 5m] b y k 8 - i n c h[ c a3 . 2 -m m ] O D ,w i t h a w a l l t h ic kn e ss o f0 . 0 3 1i n c h [ c a .0 . 7 9mm] was f i t t e di n t ot h e i n j e c t i o np o r t t o a l l o w on -

c o l u n mi n j e c t i o n .T h e c o l u m np a c k i n g was 2 . 0 % g l y c e r o l - 2 %1 , 2 , 6 -

h e x a n e t r i o l ( w t / w t ) on G a s C h r o m 1 0 0 / 1 2 0m e s h .T h e c o l u m nwas p r e p a r e db y d i s s o l v i n g0 . 2g e a c h o fg l y c e r o la n d 1 , 2 , 6 - h e x a n e t r i o li n a s m a l l v o l u m eo fm e t h y l a l c o h o l .T h e a l c o h o l i cs o l u t i o no f t h e twol i q u i dp h a s e s was a d d e dt o an e v a p o r a t i n gd i s h c o n -

t a i n i n g9 . 6g o f G a s C h r o m w h i c hh a d b e e n p r e v i -o u s l y m o i s t e n e dw i t h m e t h y la l c o h o l .A f t e r t h o r o u g hm i x i n g , t h e m e t h y la l c o h o l was s l o w l y b o i l e d o f fb yg e n t l y h e a t i n gt h e m i x t u r ei n a steam b a t h w i t h c o n -

t i n u o u ss t i r r i n gu n t i lc o m p l e t er e m o v a lo f t h e s o l v e n to c c u r r e d .A f t e r p a c k i n g , t h e c o l u m nwas c o n d i t i o n e db y h e a t i n g o v e r n i g h ta t 7 8 ° Cw i t h t h e d e t e c t o r e n dd i s c o n n e c t e db u t m a i n t a i n i n gc a r r i e r ga s f l o w .T h ec o l u m no v e n was m a i n t a i n e da t 7 8 ° C ,w i t h t h e i n j e c t o rp o r t a n d d e t e c t o r a p p r o x i m a t e l y1 ° Ch i g h e r .

T h e c a r r i e rga s ( n i t r o g e n )was m a i n t a i n e da t a f l o wr a t e o f 2 5 m l / m i n .T h e c o m b u s t i o ngases were h y d r o -ge n a n d a i rm a i n t a i n e da t 2 5 a n d 3 0 0m l / m i n ,r e spec -

t i v e l y .

2 - t o 3 - p 1s a m p l ewas

i n j e c t e di n t o t h e i n s t r u -m e n t w i t h tw o n o. 7 0 1 H a m i l t o ns y r i n g e s .T h e i n s t r u -m e n t s e n s i t i v i t ywas m a i n t a i n e da t 5 x 1 0 ` 0AFS.

H e w l e t t - P a c k a r dm o d e l 3 3 7 0 Ai n t e g r a t o rc o n -

n e c t e di n s e r i e st o t h e ga s c h r o m a t o g r a p h i ci n s t r u m e n twas u s e d t o d e t e r m i n ep e a k areas . A v i s u a l r e c o r d o ft h e c h r o m a t o g r a mwas a c h i e v e db y u s i n g a H o u s t o n

O m i n i s c r i b es t r i pc h ar t r e c o r d er 1 m V; 1 i n c h [ c a .2 . 5 4c m ] / m i n ) .

T h r e e s t a n d a r d s o l u t i o n sc o n t a i n i n gv a r y i n gc o n -c e n t r a t i o n so f n - p r o p a n o l ,i s o b u t a n o la n d i s o a m y la n da c t i v ea m y la l c o h o l sw e r ep r e p a r e d .T o e a c h s o l u t i o nw a s a d d e da c o n s t a n t a m o u n to f 3 - p e n t a n o la s t h ei i t e r n a ls t a n d a r d .

Th e r e s p o n s ef a c t o rf o re a c h a l c o h o li n e a c h s t a n -d a r d w a s c a l c u l a t e df r o m t h e p e a k a r e a r a t i oa n d t h ec o n c e n t r a t i o nr a t i o so f t h e a l c o h o l a n d i n t e r n a ls t a n -d a r d b a s e do n t h e a v e r a g eo f t h r e e d e te r mi n at i on s .Th e c o n c e n t r a t i o no f t h e a l c o h o l sw a s d e t e r m i n e da c c o r d i n gt o t h e f o l l o w i n ge q u a t i o n :C o n c e n t r a t i o no fa l c o h o l= r e s p o n s ef a c t o rx c o n c e n t r a t i o no f i n t e r n a ls t a n d a r dx p e a ka r e a r a t i ox d i l u t i o nf a c t o r .R e t e n t i o nt i m e s w e r e 4 . 9 1 ,5 .4 3 , 9 .9 0 ,a n d 1 0 . 2 6m i n f o ri s o b u -t a n o l ,3 - p e n t a n o l ,a c t i v ea m y l a l c o h o l ,a n d i s o a m y la l c o h o l ,r e s p e c t i v e l y .E t h y l a c e t a t e w a s a l s o d e t e r -

m i n e dq u a n t i t a t i v e l ya s pa r t o f t h e f u s e lo i l a l c o h o lc h r o m a t o g r a m( r e t e n t i o nt i m e ,1 . 2 1m i n ) .

R E S U LT S AND DISCUSSIONT h e f u s e lo i l a l c o h o l sa n d t h e q u a n t i t i e so f

e a c h p r o d u c e di n t h e f e r m e n t a t i o no f r i c eb yv a r i o u s y e a s t s ,e a c h i n c o m b i n a t i o n w i t hA .r o u x i i ,a r e p r e s e n t e di n T a b l e 1 . N o n - p r o p a n o lwas d e t e c t e d i n t h i ss t u d y .C o n c e n t r a t i o n so f

TA B L E 1 . F u s e lo i la l c o h o l sp r o d u c e db y A . r o u x i ii n c o m b i n a t i o nw i t h v a r i o u sy e a s t s on r i c e

f e r m e n t e da t 3 0 ° C

A m t o fa l c o h o l( m g /l i t e r )i n p r o d u c td i s -t i l l a t ea f t e rt h e f o l -

O r g a n i s m s A l c o h o l l o w i n gf e r m e n t a t i o nt i m e s ( h ) : a

3 6 4 8 9 6 1 9 2

A . r o u x i i E .f i - I s o b u t a n o l 1 3 4 1 1 3 5 1 7 5b u l i g e r A c t i v ea m y l 1 3 2 7 6 5 8 6

I s o a m y l 4 7 1 1 9 2 6 1 2 9 8To t a l 7 2 1 8 6 4 6 1 5 5 8

A . r o u x i i C . I s o b u t a n o l 4 7 1 1 6 2 1 3 2 8 0l a c t o s a A c t i v ea m y l 1 7 3 0 4 8 7 8

I s o a m y l 8 7 1 0 9 1 7 3 2 4 1To t a l 1 5 1 2 5 5 4 3 4 6 0 0

A . r o u x i i C . I s o b u t a n o l 3 8 1 0 4 2 2 9 2 8 0m e l i n i i A c t i v ea m y l 9 2 6 6 0 8 6

I s o a m y l 4 0 1 0 6 2 0 3 2 5 3To t a l 8 7 3 2 4 4 9 2 6 1 8

A . r o u x i i C a n - I s o b u t a n o l 3 6 1 1 6 2 3 0 2 9 3d i d a p a r a p s i - A c t i v ea m y l 7 2 3 4 5 6 6l o s i s I s o a m y l 3 9 9 9 1 8 3 2 3 2

To t a l 8 2 2 3 8 4 5 9 5 9 0A . r o u x i i H . a n - I s o b u t a n o l 2 5 4 8 6 7 6 5

o m a l a A c t i v ea m y l 4 1 0 1 8 1 6I s o a m y l 2 1 5 0 7 7 6 3To t a l 5 0 1 0 9 1 6 3 1 4 3

A . r ou x i i Han- I s o b u t a n o l 2 0 5 7 1 1 2 1 0 0s e n u l am a - A c t i v ea m y l _ b 8 2 5 2 3l a n g a I s o a m y l 3 7 6 2 1 4 3 1 2 6

To t a l 5 7 1 2 8 2 8 02 4 8

A . r o u x i i H . I s o b u t a n o l 2 1 5 6 8 0 8 4s u b p e l l i c u l o s aA c t i v ea m y l 1 4 3 8 2 4

I s o a m y l 1 7 4 6 8 0 6 0To t a l 3 8 1 1 6 1 9 8 1 6 8

a E a c hv a l u e i s a m e a n o f t h re e a n a l y s e s .b - , D e t e c t a b l eb u t n o t m e a s u r a b l e .

V O L .3 7 ,1 9 7 9

onM

ar c h 1

5 ,2

0 1

6 b y g u e s t

h t t p: / / a

em. a

s m

. or g /

D ownl o

a d e d f r om

8/19/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1979 Cronk 892 6

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A P P L . E N V I R O N .M I C R O B I O L .

t o t a l f u s e lo i l a l c o h o l sa t 3 6 h r a n g e df r o m 3 8m g / l i t e r ,p r o d u c e db y H a n s e n u l as u b p e l l i c u -l o s a p l u s A . r o u x i i ,t o 1 5 1m g / l i t e r ,p r o d u c e db yC a n d i d al a c t o s a p l u s A . r o u x i i .A t 4 8 h , t h e

maximum c o n c e n t r a t i o n( 3 2 4m g / l i t e r )was p r o -d u c e d b y C a n d i d am e l i n i i ,a n d t h e minimumc o n c e n t r a t i o n( 1 0 9m g / l i t e r )was p r o d u c e db yH a n s e n u l aa n o m a l a ,b o t h i n c o m b i n a t i o nw i t hA . r o u x i i .T h e s e same c o m b i n a t i o n so f orga-n i s m sa t s u b s e q u e n ti n t e r v a l sc o n t i n u e dt o p r o -

d u c e t h e h i g h e s t a n d l o w e s t c o n c e n t r a t i o n so ff u s e lo i la l c o h o l s ,r e s p e c t i v e l y .

W i t h e a c h y e a s t ( i n c o m b i n a t i o nw i t h A .r o u x i i ) ,e x c e p tt h e H a n s e n u l as p e c i e s ,t h e r e was

a p r o g r e s s i v ei n c r e a s ew i t h t i m ei n t h e t o t a l f u s e lo i l a l c o h o l c o n c e n t r a t i o n s . I n r i c e f e r m e n t e dw i t h t h e H a n s e n u l ay e a s t s , t h e m a x i m u m c o n -

c e n t r a t io n s o ff u s e lo i la l c o h o l swere o b s e r v e da t9 6 h . B y 1 9 2h , t h e s e c o n c e n t r a t i o n sd e c r e a s e d ,a l t h o u g hh i g h e r c o n c e n t r a t i o n smay h a v e b e e nr e a c h e db e f o r eo r a f t e r9 6 h . O f a l l y e a s t s s t u d i e di n c o m b i n a t i o nw i t h A . r o u x i i ,t h e Hansenulas p e c i e sp r o d u c e dt h e l o w e s t c o n c e n t r a t i o n so ff u s e lo i la l c o h o l sa t e a c ht i m e i n t e r v a le x a m i n e d .

A t 4 8 h i n t y p i c a lt a p e k e t a n ,t h e t o t a lq u a n -

t i t i e so f f u s e lo i la l c o h o l sp r o d u c e d ,e x c e p t w i t hC .m e l i n i i p l u s A . r o u x i i ,were c o m p a r a b l et o or

l e s st h a n t h e q u a n t i t i e si n g r a p e w i n e s ,w h i c hr a n g e f r o m2 0 0 t o 3 0 0 m g / l i t e r 3 ) .T h e l e v e lo f

f u s e lo i l a l c o h o l s n e v e r e x c e e d e d3 0 0 m g / l i t e rf o r any o f t h e r i c ef e r m e n t e db y H a n s e n u l aspecies p l u s A . r o u x i i .F o r a l l o t h e r y e a s t s ,t h el e v e lo f t h e s e a l c o h o l se x c e e d e d4 0 0 m g / l i t e r b y9 6 h a n d 5 0 0m g / l i t e r b y 1 9 2 h .

B y 9 6 h t h e f e r m e n t e dr i c emay s t i l lb e c o n -

sumed a s t a p e k e t a n ,b u t more c o m m o n l yt h el i q u i dp o r t i o nw o u l db e s e p a r a t e df r o mt h e s o l i da n d u s e d f o r t h e p r o d u c t i o no f brem o r a r a k .B r e m i s c o n s u m e da s a s o l i d c a n d y p r e p a r e db y s u n d r y i n g ;a r a k c o n s t i t u t e s an a l c o h o l i cb e v -e rage p r e p a r e dt h r o u g hd i s t i l l a t i o n .Consumed

a s e i t h e r o f t h e s e p r o d u c t s ,t h e l e v e lo f f u s e lo i la l c o h o l s w o u l db e a p p r e c i a b l yh i g h e r t h a n t h ev a l u e sp r e s e n t e di n T a b l e 1 .

O f t h e i n d i v i d u a lf u s e lo i la l c o h o l s ,i s o b u t a n o la n d i s o a m y la l c o h o lwere p r o d u c e di n t h e g r e a t -e s t a m o u n t s .W i t h i n a p a r t i c u l a rf e r m e n t a t i o n ,t h e r e was a l s oa t e n d e n c yf o re i t h e ri s o b u t a n o lo r i s o a m y la l c o h o l t o p r e d o m i n a t et h r o u g h o u tt h e f e r m e n t a t i o n .T h e r e f o r e ,i n a d d i t i o n t o t h et o t a lc o n c e n t r a t i o no f f u s e lo i la l c o h o l s ,t h e s p e -

c i e so f y e a s t a l s oi n f l u en ce d t h ea m o u n t o f an

i n d i v i d u a l a l c o h o l p r o d u c e d . S i m i l a r o b s e r v a -t i o n swere r e p o r t e d b y We b b a n d K e p n e r( 1 1 )a n d R a n k i n e 9 ) .

T h e t o t a la n d i n d i v i d u a lq u a n t i t i e so f f u s e lo i la l c o h o l sp r o d u c e di n t h e f e r m e n t a t i o no f r i c eb yA . r o u x i i s e p a r a t e l ya n d i n c o m b i n a t i o nw i t h E .

b u r t o n i iw e r e i n f l u e n c e db y t e m p e r a t u r e( Ta -b l e s2 a n d 3 ) .Q u a n t i t i e so f t h e h i g h e r a l c o h o l swere s i m i l a rf o rr i c ef e r m e n t e db y m o l da n d b ym o l d p l u sy e a s t when c o m p a r e da t t h e same

t e m p e r a t u r e .I n b o t h f e r m e n t a t i o n s ,t h e c o n c e n -t r a t i o no f t h e f u s e lo i l a l c oh ol s i n c r e a s e dw i t hf e r m e n t a t i o nt i m e a t 2 5 ° C .A t 3 0 a n d 3 5 0 C ,t h el e v e l sr e a c h e da maximum a t 9 6 h a n dd e c r e a s e dt h e r e a f t e r .

D u r i n g t h e f i r s t3 6 h o f f e r m e n t a t i o n ,t h ec o n c e n t r a t i o no f f u s e lo i la l c o h o l si n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gt e m p e r a t u r ef o rr i c ef e r m e n t e d b o t hb y m o l da n d b y m o l d p l u s y e a s t . A t 4 8 h t h ec o n c e n t r a t i o n si n c r e a s e d w i t h an i n c r e a s e i nt e m p e r a t u r ef r o m2 5 t o 3 0 0 C ,b u t d e c r e a s e d w i t ha f u r t h e r i n c r e a s et o 3 5 0 C .A t b o t h 9 6 a n d 1 4 4ht h e r e was a c o n s i s t e n t d e c r e a s e i n c o n c e n t r a -t i o n sw i t h i n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e .

Th e c o n c e n t r a t i o n so f t h e h i g h e ra l c o h o l sp r o -

d u c e db y t h e f e r m e n t a t i o no f r i c ew i t h A . r o u x i ia l o n ea t 3 0 0 C( T a b l e2 )t e n d e dt o b e h i g h e rt h a nt h e c o n c e n t r a t i o n sp r o d u c e db y H a n s e n u l as p e -

c i e sp l u s A . r o u x i i a n d l o w e r t h a n t h o s e p r o -

d u c e db y a l l o t h e r y e a s t s p l u sA . r o u x i i ( Ta b l e1 ) .Th e c o n c e n t r a t i o n so f f u s e lo i l a l c o h o l si nr i c ef e m e n t e db yE n d o m y c o p s i sb u r t o n i ip l u s A .r o u x i ia t 3 0 ° C( Ta b l e 3 ) were g e n e r a l l y h i g h e rc o m p a r e dw i t h t h e c o n c e n t r a t i o n sf o rt h e H a n -s e n u l as p e c i e sa n d l o w e rc o m p a r e dw i t h E n d o -m y c o p s i sf i b u l i g e ra n d C a n d i d as p e c i e s .

Th e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o no f t h e f u s e lo i l a l -c o h o l s i n t a p 6 k e t a n f e r m e n t e df o r4 8 h was

p r o d u c e da t 3 0 0 C , w h i c h c o r r e s p o n d st o t h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o no f e t h a n o l ,3 . 0 ,p r o d u c e du n d e r t h e same c o n d i t i o n s 4 ) .A n i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r eo f 3 5 0 Ca p p e a r s t o l o w e r t h e l e v e l

TABLE 2 . I n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r eo n f u s e lo i la l c o h o l sp r o d u c e db y A . r o u x i io n r i c e

A m t o f a l c o h o l( m g / l i t e r )i np r o d u c td i s t i l l a t ea f t e rt h e

Te m p A l c o h o l f o l l o w i n gf e r m e n t a t i o nt i m e s( O C ) h :

3 6 4 8 9 6 1 9 2

2 5 I s o b u t a n o l _ b 9 2 1 3 9 1 4 6A c t i v ea m y l 7 2 0 2 7I s o a m y l 5 4 1 0 2 1 0 2T o t a l 1 5 2 2 6 2 2 7 5

3 0 I s o b u t a n o l 6 2 1 0 9 1 3 2 1 3 2A c t i v ea m y l 1 1 2 2 2 1I s o a m y l 2 8 6 8 1 0 2 9 6To t a l 9 0 1 8 8 2 5 6 2 4 9

3 5 I s o b u t a n o l 6 1 9 0 9 1 7 8A c t i v ea m y l 4 1 5 2 0 1 8I s o a m y l 4 0 7 3 8 2 7 6To t a l 1 0 6 1 7 7 1 9 2 1 7 0

a E a c hv a l u e i s a mean o f t r i p l i c a t ea n a l y s e s .b - , D e t ec t a b l e b u tn o t m e a s u r a b l e .

8 9 4 CRONK E T A L .

onM

ar c h 1

5 ,2

0 1

6 b y g u e s t

h t t p: / / a

em. a

s m

. or g /

D ownl o

a d e d f r om

8/19/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1979 Cronk 892 6

http://slidepdf.com/reader/full/appl-environ-microbiol-1979-cronk-892-6 4/5

A L C O H O L SI N TA P E KETAN F E R M E N TAT I O N 89 5

o f f u s e lo i l a l c o h o l si n p r o d u c t ss u c h a s brema n d a r a k w h e r et h e f e r m e n t a t i o nc o n t i n u e sb e -y o n d ' 4 8h .

T e m p e r a t u r ei n f l u e n c e dt h e r a t i oo f a c t i v e

a m y lt o i s o a m y la l c o h o lp r o d u c e db y A . r o u x i is e p a r a t e l ya n d i n c o m b i n a t i o n w i t hE . b u r t o n i i( Ta b l e4 ) .F o r r i c ef e r m e n t e db o t h b y m o l da n db y m o l dp l u s y e a s t , t h e r a t i o si n c r e a s e da s t h ef e r m e n t a t i o np r o g r e s s e da t 2 5 a n d 3 0 0 C ,i n d i c a -t i v eo f a h i g h e r r a t e o f a c t i v ea m y l a l c o h o lp r o d u c t i o nc o m p a r e dw i t h i s o a m y la l c o h o l .A t4 8 h t h e r a t i o sf o rb o t h f e r m e n t a t i o n si n c r e a s e dw i t h an i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e .T h e r a t i oo fa c t i v ea m y l t o i s o a m y la l c o h o l f o rt a p e k e t a nf e r m e n t e df o r4 8 h a t 3 0 0 Cb y A . r o u x i ia l o n ea n d i n c o m b i n a t i o nw i t h a l l y e a s t s s t u d i e dr a n g e df r o m0 . 1 2 9t o 0 . 3 0 4 .T h e s ee x t r e m e s ,b o t hp r o d u c e db y s p e c i e so f H a n s e n u l a( e a c hin com-

b i n a t i o n w i t h A . r o u x i i ) ,i n d i c a t et h e i n f l u e n c ew h i c ht h e s p e c i e so f y e a s t may h a v eon t h e t a s t ea n d o d o r o f t h e f e r m e n t e dp r o d u c t .

T h e p r e s e n c e o f e t h y la c e t a t e was d e t e c t e do n l y in r i c e f e r m e n t e db y H . a n o m a l aa n d H .s u b p e l l i c u l o s a ,e a c h i n c o m b i n a t i o n w i t hA .r o u x i i ( Ta b l e 5 ) .T h e s eq u a l i t a t i v ef i n d i n g sb yga s c h r o m a t o g r a p h ya r e i na c c o r dw i t h t h e e a s i l yr e c o g n i z e d ,s t r o n g o d o ro f e t h y l a c e t a t e t h a t was

p r e s e n t o n l y i n t h e r i c ef e r m e n t e db y t h e s e twoo r g a n i s m s .

E s t e r s ,p a r t i c u l a r l ye t h y la c e t a t e , a r e i m p o r -t a n t c o n s t i t u e n t so f f e r m e n t e df o o d sa n d b e v e r -a g e s . E t h y la c e t a t e a ta l e v e lb e l o w2 0 0m g / l i t e rt e n d s t o i m p a r t a d e s i r a b l e o d o r i n w i n e s , b u th i g h e rc o n c e n t r a t i o n st e n d t o b e a s s o c i a t e dw i t hs p o i l a g e 2 ) .To t a l e s t e r s ( a se t h y l a c e t a t e )o f

TA B L E 3 . I n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r eon f u s e lo i la l c o h o l sp r o d u c e db y A . r o u x i i i n c o m b i n a t i o n w i t h

E . b u rt on i ion r i c eA m t o f a l c o h o l( m g / l i t e r )i n

p r o d u c td i s t i l l a t ea f t e rt h e f o l - emp A l c o h o l lowing ferment tion times

00 ( h ) : a

3 6 4 8 9 6 1 9 2

2 5 I s o b u t a n o l _ b 9 0 1 3 1 1 3 0A c t i v ea m y l 7 1 9 2 1I s o a m n y l 1 1 1 6 1 4 1To t a l 1 5 8 2 6 6 2 9 2

3 0 I s o b u t a n o l 4 2 8 7 1 2 8 1 2 6A c t i v ea m y l 9 1 7 1 7I s o a m y l 2 8 6 6 1 1 5 1 0 4T o t a l 6 9 1 6 2 2 6 0 2 4 7

3 5 I s o b u t a n o l 4 9 8 7 1 4 3 9 4

A c t i v ea m y l

9 1 6 1 1I s o a m y l 3 2 6 0 9 4 7 5T o t a l 8 1 1 5 6 2 5 3 1 7 9

aEach v a l u e i s a mean o f t r i p l i c a t ea n a l y s e s .b -, D e t e c t a b l eb u t n o t m e a s u r a b l e .

TA B L E4 . I n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r eo n t h e r a t i oo fa c t i v ea m y lt o i s o a m y la l c o h o lp r o d u c e db y A .

r o u x i i a l o n e a n d i n c o m b i n a t i o nw i t h E . b u r t o n i io nr i c e ,

R a t i oo f a c t i v e

a m y lt o i s o -

Te m p a m y la l c o h o la f t e rt h e f o l l o w -O r g a n i s m ( s )( O C ) i n gf e rm e n t a t i o n t i me s h ) :

3 6 4 8 9 6 1 9 2

A . r o u x i i 2 5 0 . 1 3 00 . 1 9 60 . 2 6 53 0 0 . 1 6 20 . 2 1 50 . 2 1 93 5 0 1 0 00 . 2 0 50 . 2 4 40 . 2 3 7

A . r o u x i i E . 2 5 0 . 1 1 50 . 1 6 40 . 1 4 9b u r t o n i i 3 0 0 . 1 3 60 . 1 4 80 . 1 6 3

3 5 0 1 5 0 0 . 1 7 00 . 1 4 7

TABLE 5 . Q u a n t i t i e so f e t h y la c e t a t ep r o d u c e di nr i c ef e r m e n t e db y A . r o u x i ii n c o m b i n a t i o nw i t h H .

a n o m a l aan d H . s u b p e l l i c u l o s aa t 3 0 ° C

A m t o f e t h y la c e t a t e( m g / l i -t e r )i n p r o d u c td i s t i l l a t e

a f t e rt h e f o l l o w i n gf e r m e n t a -O r g a m s m s 5 t i o nt i m e s h ) : a

3 6 4 8 9 6 1 9 2

A . r o u x i i H . a n o m - 1 9 9 5 4 3 8 5 9 3 6 9a l a

A . r o u x i i H . s u b p e l - 1 4 5 5 3 7 9 0 5 3 5 4l i c u l o s a

E a c hv a l u e i s a mean o ft r i p l i c a t ea n a l y s e s .

w i n e s a n a ly z e db y A m e r i n e( 1 ) r a n g e d f r o ma b o u t2 0 0 t o 4 0 0m g / l i t e r .

A l t h o u g ha h i g h e rc o n c e n t r a t i o no fe t h y la c e -t a t ew a s p r o d u c e da t 3 6 h b y H . a n o m a l at h a nb y H . s u b p e l l i c u l o s a ,t h e l e v e l sw e r e c o m p a r a -b l ea t e a c h i n t e r v a lt h e r e a f t e r .A f t e r 3 6 h o ff e r m e n t a t i o n ,t h e o d o r o fe t h y la c e t a t e w a s e x -c e e d i n g l ys t r o n ga n dw o u l db e c o n s i d e r e do b j e c -t i o n a b l e .A s u b s t a n t i a ld e c r e a s ei n t h e c o n c e n -t r a t i o no f e t h y la c e t a t e o c c u r r e db e y o n d9 6 h .A t 1 9 2h t h e f e r m e n t e dr i c ew h i c hw o u l db e u s e df o rt h e p r o d u c t i o no f b r e mo r a r a k c o n t a i n e dal e v e lo fe t h y la c e t a t ew i t h i nt h e r a n g ef o rv a r i o u sw i n e s 1 ) .

T h e r e s u l t so f t h i ss t u d y d e m o n s t r a t et h a ta p p r e c i a b l eq u a n t i t i e so f i s o b u t a n o la n d a c t i v ea m y la n d i s o a m y la l c o h o l sa r e p r o d u c e dd u r i n gt h e f e r m e n t a t i o no fr i c eb y A . r o u x i i ,s e p a r a t e l yo r i nc o m b i n a t i o nw i t h v a r i o u sy e a s t s .T h e t o t a lq u a n t i t yo f t h e f u s e lo i la l c o h o l s ,a s w e l la s t h eq u a n t i t i e so f i n d i v i d u a la l c o h o l s ,w e r ei n f l u e n c e db y t h e t e m p e r a t u r ea n d t h e s p e c i e so f y e a s t .E t h y l a c e t a t e was a l s os h o w nt o b e p r o d u c e di nh i g h c o n c e n t r a t i o n sb y t w o s p e c i e so f H a n s e n -

u l a . L I T E R AT U R EC I T E D

1 . A m e r i n e ,M . A . 1 9 5 4 C o m p o s i t i o no f w in e s . I . O r g a n i cc o n s t i t u e n t s .F o o dR e s . 5 : 3 5 3 - 5 1 0 .

2 . A m e r i n e ,M. A . ,H . W . B e r g , a n d W . V . C r u e s s . 1 9 6 7 .

V O L .3 7 ,1 9 7 9

onM

ar c h 1

5 ,2

0 1

6 b y g u e s t

h t t p: / / a

em. a

s m

. or g /

D ownl o

a d e d f r om

8/19/2019 Appl. Environ. Microbiol. 1979 Cronk 892 6

http://slidepdf.com/reader/full/appl-environ-microbiol-1979-cronk-892-6 5/5

8 9 6 CRONK ET A L .

T h e t e c h n o l o g yo fw i n em a k i n g ,2 n de d .A V I P u b l i s h i n gC o . ,I n c . ,We s t p o r t ,C o n n .

3 . B ou t h i l e t , R .J . , an d W . L o w e r y .1 9 5 9 .T h e u s e o ft h eg a s c h r o m a t o g r a p hi n t h e d e t e r m i n a t i o no ff u s e lo i li ng r a p e b r a n d y .J . A s s o c . O f f .A g r i c .C h e m .4 2 : 6 3 4 - 6 3 7 .

4 . C r o n k ,T . C . ,K . H . S t e i n k r a u s ,L . R . H a c k l e r ,a n d L .R . M a t t i c k . 1 9 7 7 .I n d o n e s i a nt a p e k e t a n f e r m e n t a t i o n .A p p l . M i c r o b i o l .3 3 : 1 0 6 7 - 1 0 7 3 .

5 . D j i e n , K . S . 1 9 7 2 .T a p e f e r m e n t a t i o n .A p p l . M i c r o b i o l .2 3 : 9 7 6 - 9 7 8 .

6 . E l l i s ,J J . , L. J . R h o d e s ,a n d C . W . H e s s e l t i n e . 1 9 7 6 .Th e g e n u sA m y l o m y c e s .M y c o l o g i a6 8 : 1 3 1 - 1 4 3 .

7 . H e s s e l t i n e ,C . W . 1 9 6 5 .A m i l l e n n i u mo f f u n g i ,f o o d ,a n df e r m e n t a t i o n .M y c o l o g i a5 7 : 1 4 9 - 1 9 7 .

8 . K a h n ,J . H . ,an d E . T . B l e s s i n g e r1 9 7 2 .C o l l a b o r a t i v es t u d y o f t h e q u a n t i t a t i v eg a s - l i q u i dc h r o m a t o g r a p h i c

A P P L .E N V I R O N .M I C R O B I O L .

d e t e r m i n a t i o no f f u s e lo i l a n d o t h e r componen ts i nw h i s k e y .J . A s s o c .O f f .A g r i c .C h e m .5 5 : 5 4 9 - 5 5 6 .

9 . R a n k i n e ,B . C . 1 9 6 7 .F o r m a t i o no f h i g h e r a l c o h o l sb yw i n ey e a s t s , a n d r e l a t i o n s h i pt o t a s t e t h r e s h o l d s .J . S c i .F o o dA g r i c .1 8 : 5 8 3 - 5 8 9 .

1 0 . S a o n o , S . , I . G a n d j a r , T . B a s u k i , an d H . K a r s o n o .1 9 7 4 .M i c r o f l o r ao f r a g i a n d some o t h e r t r a d i t i o n a lf e r m e n t e df o o d s o f I nd o ne s ia .A n n . B o g o r . 4 : 1 8 7 - 2 0 4 .

1 1 .Webb, A . D . ,a n d R . E . K e p n e r .1 9 6 1 .F u s e l o i la n a l y s i sb y m e a n so fg a s - l i q u i dp a r t i t i o nc h r o m a t o g r a p h y .A m.J . E n o l .V i t i c .1 2 : 5 1 - 5 9 .

1 2 . W e n t , F . A . F . C . ,a n d H . C . P r i n s e n G e e r l i g s . 1 8 9 5 .B e o b a c h t u n g e nu b e r d i eH e f e a r t e nu n d Z u c k e r b i l d e n -d e n P i l z ed e r A r a c k f a b r i k a t i o n .V er h. K . A k a d . W e t .A m s t e r d a mA f d . N a t u n r k d .R e e k s2 4 : 3 - 3 1 .

onM

ar c h 1

5 ,2

0 1

6 b y g u e s t

h t t p: / / a

em. a

s m

. or g /

D ownl o

a d e d f r om