apostila de imunologia

APOSTILA DE

IMUNOLOGIA

ESTAGIO OBRIGATORIO

7º PERIODO

Profa: Laís de Paula

INTRODUÇÃO

A Imunologia é o estudo das respostas do organismo que fornecem imunidade, ou seja, proteção às doenças. Ainda que o sistema imune seja muito complexo, certos componentes do sistema imune são facilmente detectados, como por exemplo, os anticorpos.O sistema imunológico baseia-se nas relações Antígeno-Anticorpo.

Antígenos (Ag) são substâncias estranhas que induzem uma resposta imune por causar uma produção de anticorpos e/ou linfócitos sensibilizados que reagem especificamente com a substância; Imunógeno.Anticorpo (Ac) - Proteína do soro que foi induzida por e reage especificamente a uma substância estranha (antígeno); Imunoglobulina.

Todos os testes baseados em reações Ag/Ac ou dependem da formação de rede ou teremos de encontrar forma de evidenciar a formação de complexos Ag/Ac. Todos os testes baseados em reações Ag/Ac podem ser usados para detectar tanto o Ag ou Ac.

VDRL (Venereal Diseases Research Laboratory)

PRINCÍPIO DE AÇÃO

Metodologia: Reação de floculação.A combinação de lecitina, colesterol e cardiolipina possui semelhança imunológica com antígenos de Treponema pallidum, consistindo em um antígeno não treponêmico.A interação dos anticorpos da amostra com este antígeno produz floculação que pode ser detectada ao microscópio óptico.

AMOSTRA

Preparo do PacienteColher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.Amostras utilizadasSoro ou líquido cefalorraquidiano (límpido e isento de fragmentos de coágulos). Não utilizar soros hemolisados ou lipêmicos, pois podem produzir aglutinação inespecífica.A amostra é estável por 05 dias entre 2 e 8 °C. Não é preciso inativar o soro. É recomendável jejum de 8 horas antes da coleta de sangue.Estabilidade e armazenamento da amostraA amostra é estável por 05 dias entre 2 e 8 °C. Não é preciso inativar o soro.

COMPONENTES DO KIT

Número 1 - Antígeno para VDRL em suspensão - conservar entre 2 e 8 ºC. Não congelar. Homogeneizar bem antes de usar. Contém: Cardiolipina 0,44 μmol/L, lecitina 3,12 μmol/L e colesterol 23,2 μmol/L em tampão fosfato 10 mmol/L pH 6,0.Preparo do Reagente de TrabalhoO Reagente Nº 1 é pronto para o uso. Agitá-lo antes da execução do teste.

ESTABILIDADE.Os reagentes são estáveis até a da data de validade impressa no rótulo quando conservados de acordo com a temperatura recomendada. Evitar a contaminação do produto durante o uso para não afetar a sua estabilidade.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES ESPECIAIS

1 - Somente para uso diagnóstico in vitro;2 - O Antígeno (Reagente Nº 1) e a amostra devem estar à temperatura ambiente no momento do uso;3 - Não congelar o reagente;4 - Não utilizar plasma;5 - O descarte do material utilizado deverá ser feito obedecendo-se os critérios de biossegurança de acordo com a legislação vigente.6 - O reagente não deve entrar em contato com materiais de borracha.

LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Estima-se que 1 a 2% dos pacientes com sífilis secundária apresentam VDRL negativo ou fracamente positivo quando se utiliza o soro não diluído. A positivação do exame somente ocorrerá nas diluições maiores - efeito prozona. Recomenda-se, portanto, testar todas as amostras sem diluir e diluídas 1:10 com NaCl 0,85%.Pode ocorrer resultado falso-positivo em certas patologias como: tuberculose, mononucleose infecciosa, hanseníase, hepatite, doenças do colágeno (lúpus eritematoso, artrite reumatóide), doenças auto-imunes, malária e câncer.

EQUIPAMENTOS

Técnica Manual

Condições de Reação

Lâmina Escavada Microscópio Agitador rotativo Pipetas para medir amostras e reagentes Cronômetro

PROCEDIMENTO DO TESTE

Procedimento ManualEm um poço da placa escavada, pipetar:Amostra sem diluir.........................50 μLReagente Nº 1 ................. 1 gota (20 μL)

Em outro poço da placa escavada, pipetar:Amostra diluída 1:10*.........................50 μLReagente Nº 1 ...................... 1 gota (20 μL)

* Além do teste sem diluição é realizado também um teste com uma diluição de 1:10 com NaCl 0,85% (para todos os testes), a fim de evitar o efeito prozona. Vide Limitações do Processo. (250ul de salina/25ul soro)

Em seguida agitar manualmente com movimentos circulares ou em um agitador por 4 minutos a 180 rpm. Em seguida, examinar no microscópio no aumento de 100 X (ocular de 10x e objetiva de 10x).

RESULTADOS

Positivo - Reativo: ocorre floculação com formação de grumos de tamanhos variáveis. Suspensão de aspecto heterogêneo. Neste caso, proceder a diluição da amostra e realizar a prova semi-quantitativa.Negativo - Não Reativo: ausência de floculação, suspensão de aspecto homogêneo.

SIGNIFICADO CLÍNICO

O método é indicado para teste de triagem. O diagnóstico final não deve ser baseado somente no resultado laboratorial, devendo ser correlacionado com os sinais e sintomas do paciente.Pacientes com infecção sifilítica tratada podem apresentar resultados positivos em títulos baixos (cicatriz sorológica).O VDRL pode ser utilizado para acompanhar a terapêutica, pela rápida resposta representada pela queda de títulos ou mesmo pela negativação e modificações mais lentas ou mesmo inexistentes para os testes treponêmicos.

ASLO (Antiestreptolisina O)


Metodologia: Látex.Partículas de látex revestidas com estreptolisina O purificadas e estabilizadas mostram nítida aglutinação quando misturadas, em uma área do cartão-teste, com um soro contendo níveis elevados de anticorpos antiestreptolisina.

AMOSTRA

Preparo do PacienteColher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.Amostras utilizadasUtilizar soro, sem prévia diluição. Estabilidade e armazenamento da amostraA temperatura de armazenamento deverá ser de 2 a 8° C.Não congelar.Manter ao abrigo da luz e evitar umidade.

COMPONENTES DO KIT

NegativoPositivo

Número 1 - Látex ASO - conservar entre 2 e 8 °C. Não congelar. Contém:Partículas de Látex sensibilizadas em suspensão.Número 2 - Controle Positivo - conservar entre 2 e 8 °C. Contém:Soro com concentração > 200 UI/mL, Azida sódica 15,38 mmol/L.Número 3 - Controle Negativo - conservar entre 2 e 8 °C. Contém:Soro com concentração inferior a 100 UI/mL, Azida sódica 15,38 mmol/L.Os controles positivo e negativo foram analisados para detecção de anticorpos anti HIV e antígeno HBs, com resultados negativos. Entretanto, para maior segurança, considerar e manusear como Potencialmente Infectantes.

ESTABILIDADE

Os reagentes são estáveis até a da data de validade impressa no rótulo quando conservados entre 2-8º C. Deixar em temperatura ambiente antes de utilizar. Homogeneizar bem antes de usar. Não congelar. Evitar a contaminação do produto durante o uso para não afetar a sua estabilidade.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES ESPECIAIS

1 - Somente para uso diagnóstico in vitro;2 - Seguir com rigor a metodologia proposta para obtenção de resultados exatos;3 - A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes;4 - Não congelar os reagentes;5 - Usar sempre os reagentes do mesmo lote;6 - Não utilizar soro lipêmico. Não utilizar soro hemolisado. Não utilizar plasma;7 - Manusear com cuidado os Reagentes No 2 e 3, pois contém Azida sódica;8 - Os controles positivo e negativo são líquidos humanos e foram analisados para detecção de anticorpos Anti-HIV e Anti-HBs, com resultados negativos. Entretanto, para maior segurança, considerar e manusear como Potencialmente Infectantes;9 - O descarte do material utilizado deverá ser feito obedecendo-se os critérios de biossegurança de acordo com a legislação vigente.

EQUIPAMENTOS

Técnica Manual

Lamina ou placa de fundo escuro Espátulas Pipetas para medir amostras e reagentes Cronômetro

PROCEDIMENTO

Procedimento Manual

Em cada círculo da placa colocar:

Círculo Nº 1 Círculo Nº 2 Círculo Nº 3Controle negativo 25μL ---- ----Controle positivo ---- 25μL ----Soro ---- ---- 25μLBIO - LÁTEX ASO 25μL 25μL25μL(previamente homogeneizado)

Homogeneizar com o auxílio de uma espátula utilizando toda a extensão de cada círculo da lâmina. Logo após, agitar a lâmina com movimentos circulares por dois minutos. Efetuar a leitura com uma luz artificial, utilizando um fundo escuro para facilitar a interpretação do teste. Uma aglutinação clara indica a presença de Anti-estrepitolisina O numa concentração igual ou superior a 200 UI/mL. Neste caso, realizar a prova semi quantitativa.

PROVA SEMI QUANTITATIVA

1 - Realizar diluições da amostra com salina, a partir da amostra inicial (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc);2 - Seguir o processo descrito na prova qualitativa para cada uma das diluições.Será considerado como título, a maior diluição do soro que apresentar aglutinação.

RESULTADOS

POSITIVO: Nítida aglutinação.NEGATIVO: Ausência de aglutinação (suspensão homogênea).

CÁLCULOSOs valores serão expressos em UI/mL.Amostra Concentração UI/mLSem diluição.................................200 1:2............................................400 1:4............................................800 1:8............................................1600O resultado pode ser expresso em título ou em UI/mL.UI/mL = 200 x título da última diluição (nº da diluição).Teste negativo: expressar o resultado como negativo ou menor que 200 UI/mL.Unidade de Medida: UI/ML

VALORES DE REFERÊNCIAAté 200 UI/mLEstes valores devem ser usados como orientação, sendo que cada laboratório deverá criar sua faixa de valores de referência, de acordo com a população atendida.

SIGNIFICADO CLÍNICO

A Estreptolisina O é uma exoenzima imunogênica tóxica produzida por muitos estreptococos ß-hemolíticos do grupo A. Tendo em conta a grande quantidade de exoenzimas liberadas in vivo, a determinação da resposta dos anticorpos frente à presença de Estreptolisina O converteu- se em um procedimento rotineiro para o diagnóstico e tratamento da febre reumática, glomerulonefrite aguda, escarlatina, amigdalite, erisipela, sepsis puerperal e outras infecções estreptocócicas do grupo A.

LIMITAÇÕES DO MÉTODO

Não utilizar plasma, soros hemolisados ou lipêmicos, pois podem produzir aglutinação inespecífica.Ao correlacionar métodos para determinação da Antiestreptolisina O, verificar a sensibilidade dos reagentes.Os resultados obtidos só devem ser comparados quando expressos em UI/mL.

FATOR REUMATÓIDE (FR / LÁTEX)


Metodologia: Látex.Quando a suspensão de látex é misturada em uma área do cartão-teste com soro contendo níveis aumentados de fator reumatóide, observa-se uma aglutinação nítida no período máximo de minutos. A aglutinação é visível em amostra com concentração igual ou superior a 8 UI/mL, de acordo com as referências estabelecidas pelos Padrões Internacionais da OMS.

AMOSTRA

Preparo do PacienteColher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.Amostras utilizadasUtilizar soro, sem prévia diluição. Estabilidade e armazenamento da amostraA temperatura de armazenamento deverá ser de 2 a 8° C.Não congelar.Manter ao abrigo da luz e evitar umidade.

COMPONENTES DO KITNúmero 1 - Látex FR - conservar entre 2 e 8 °C. Não congelar. Contém:Partículas de Látex sensibilizadas em suspensão.Número 2 - Controle Positivo - conservar entre 2 e 8 °C. Contém:Soro com concentração igual ou superior a 8 UI/mL, Azida sódica 15,38 mmol/L.Número 3 - Controle Negativo - conservar entre 2 e 8 °C. Contém:Soro com concentração inferior a 8 UI/mL, Azida sódica 15,38 mmol/L.

Os controles positivo e negativo foram analisados para detecção de anticorpos anti HIV e antígeno HBs, com resultados negativos. Entretanto, para maior segurança, considerar e manusear como Potencialmente Infectantes.

ESTABILIDADEOs reagentes são estáveis até a da data de validade impressa no rótulo quando conservados de acordo com a temperatura recomendada. Evitar a contaminação do produto durante o uso para não afetar a sua estabilidade.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES1 - Somente para uso diagnóstico in vitro;2 - Seguir com rigor a metodologia proposta para obtenção de resultados exatos;3 - A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes;4 - Não congelar os reagentes;5 - Usar sempre os reagentes do mesmo lote;6 - Não utilizar soro lipêmico. Não utilizar soro hemolisado. Não utilizar plasma;7 - Manusear com cuidado os Reagentes No 2 e 3, pois contém Azida sódica;8 - Os controles positivo e negativo são líquidos humanos e foram analisados para detecção de anticorpos Anti HIV e AntiHBs, com resultados negativos. Entretanto, para maior segurança, considerar e manusear como Potencialmente Infectantes;9 - O descarte do material utilizado deverá ser feito obedecendo-se os critérios de biossegurança de acordo com a legislação vigente.

EQUIPAMENTOS

Técnica Manual Lamina ou placa de fundo escuro Espátulas Pipetas para medir amostras e reagentes Cronômetro

PROCEDIMENTOProcedimento ManualEm cada círculo da placa colocar:

Círculo Nº 1 Círculo Nº 2 Círculo Nº 3Controle negativo 25μL ---- ----Controle positivo ---- 25μL ----Soro ---- ---- 25μLBIO - LÁTEX FR 25μL 25μL25μL(previamente homogeneizado)

Homogeneizar com o auxílio de uma espátula utilizando toda a extensão de cada círculo da lâmina.

Logo após, agitar a lâmina com movimentos circulares por dois minutos. Efetuar a leitura com uma luz artificial, utilizando um fundo escuro para facilitar

a interpretação do teste. Uma aglutinação clara indica a presença de Fator Reumatóide numa concentração igual ou superior a 8 UI/mL. Neste caso, realizar a prova semi quantitativa.

PROVA SEMI QUANTITATIVA1 - Realizar diluições da amostra com salina, a partir da amostra inicial (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, etc);2 - Seguir o processo descrito na prova qualitativa para cada uma das diluições.Será considerado como título, a maior diluição do soro que apresentar aglutinação.

RESULTADOSPOSITIVO: Nítida aglutinação.NEGATIVO: Ausência de aglutinação (suspensão homogênea).

CÁLCULOSOs valores serão expressos em UI/mL.Amostra Concentração UI/mLSem diluição...................................8 1:2............................................ 16 1:4............................................ 32 1:8............................................ 64 1:16............................................128O resultado pode ser expresso em título ou em UI/mL.UI/mL = 8 x título da última diluição (nº da diluição).Teste negativo: expressar o resultado como negativo ou menor que 8 UI/mL.

VALOR DE REFERÊNCIAAté 8 UI/Ml. Estes valores devem ser usados como orientação, sendo que cada laboratório deverá criar sua faixa de valores de referência, de acordo com a população atendida.

SIGNIFICADO CLÍNICOFator Reumatóide refere-se a um grupo de macroglobulinas (antiglobulinas) que reagem com o fragmento Fc das Imunoglobulinas IgG. Na artrite reumatóide o achado do Fator Reumatóide representa o dado sorológico mais importante, presente em cerca de 75% dos pacientes. O seu nível plasmático pode estar significativamente aumentado na velhice, doenças do tecido conjuntivo, hepatopatias crônicas, sífilis, tuberculose, hanseníase, endocardite bacteriana mononucleose, sarcoidose, calazar, rubéola, neoplasias, infestações parasitárias, transfusões de sangue, transplante renal, síndrome de Sjögren.

LIMITAÇÕES DO MÉTODONão utilizar plasma, soros hemolisados ou lipêmicos, pois podem produzir aglutinação inespecífica.Ao correlacionar métodos para determinação do Fator Reumatóide, verificar a sensibilidade dos reagentes.Os resultados obtidos só devem ser comparados quando expressos em UI/mL.

PROTEÍNA C REATIVA- PCR

PRINCÍPIO DE AÇÃOMetodologia: Látex.O método fundamenta-se em uma reação de aglutinação de partículas de látex recobertas com Gama-globulinaanti-PCR, especialmente tratadas para evitar aglutinações inespecíficas. A aglutinação é visível em amostra com concentração de PCR igual ou superior a 6,5 mg/L, de acordo com as referências estabelecidas pelos Padrões Internacionais da OMS.

AMOSTRA

Preparo do PacienteColher sangue pela manhã após jejum de 8 horas, salvo orientações médicas.

Amostras utilizadasUtilizar soro, sem prévia diluição.

Estabilidade e armazenamento da amostraO analito é estável por 2 dias entre 2 e 8 °C.

COMPONENTES DO KIT

Número 1 - Látex PCR - conservar entre 2 e 8 °C. Não congelar. Contém: partículas de látex sensibilizadas em suspensão.Número 2 - Controle Positivo - Conservar entre 2 e 8 °C. Contém: soro com concentração igual ou superior a 6,5 mg/L, Azida sódica 15,38 mmol/L.Número 3 - Controle Negativo - Conservar entre 2 e 8 °C. Contém: soro com concentração inferior a 6,5 mg/L, Azida sódica 15,38 mmol/L.Os controles positivo e negativo foram analisados para detecção de anticorpos anti HIV e antígeno HBs, com resultados negativos. Entretanto, para maior segurança, considerar e manusear como Potencialmente Infectantes.

ESTABILIDADEOs reagentes são estáveis até a da data de validade impressa no rótulo quando conservados de acordo com a temperatura recomendada. Evitar a contaminação do produto durante o uso para não afetar a sua estabilidade.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES ESPECIAIS1 - Somente para uso diagnóstico in vitro;2 - Seguir com rigor a metodologia proposta para obtenção de resultados exatos;3 - A água utilizada na limpeza do material deve ser recente e isenta de agentes contaminantes;

4 - Não congelar os reagentes;5 - Usar sempre os reagentes do mesmo lote;6 - Não utilizar soro lipêmico. Não utilizar soro hemolisado. Não utilizar plasma;7 - Manusear com cuidado os Reagentes No 2 e 3, pois contém Azida sódica;8 - Os controles positivo e negativo são líquidos humanos e foram analisados para detecção de anticorpos Anti HIV e AntiHBs, com resultados negativos. Entretanto, para maior segurança , considerar e manusear como Potencialmente Infectantes;9 - O descarte do material utilizado deverá ser feito obedecendo-se os critérios de biossegurança de acordo com a legislação vigente.

EQUIPAMENTOSTécnica Manual Lâmina ou placa de fundo escuro Espátulas Pipetas para medir amostras e reagentes Cronômetro

PROCEDIMENTOProcedimento ManualEm cada círculo da placa colocar:

Círculo Nº 1 Círculo Nº 2 Círculo Nº 3Controle negativo 25μL --- ---Controle positivo --- 25μL ---Soro --- --- 25μLBIO - LÁTEX PCR 25μL 25μL25μL(previamente homogeneizado)

Homogeneizar com o auxílio de uma espátula utilizando toda a extensão de cada círculo da lâmina. Logo após, agitar a lâmina com movimentos circulares por dois minutos. Efetuar a leitura com uma luz artificial, utilizando um fundo escuro para facilitar a interpretação do teste.

Uma aglutinação clara indica a presença de Proteína C Reativa numa concentração igual ou superior a 6,5 mg/L. Neste caso, realizar a prova semi quantitativa.

PROVA SEMI QUANTITATIVA1 - Realizar diluições da amostra com salina, a partir da amostra inicial (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 etc);2 - Seguir o processo descrito na prova qualitativa para cada uma das diluições.Será considerado como título a maior diluição do soro que apresentar aglutinação.

RESULTADOSPOSITIVO: Nítida aglutinação.NEGATIVO: Ausência de aglutinação (suspensão homogênea).

CÁLCULOSOs valores serão expressos em mg/L. Amostra Concentração mg/LSem diluição............................6,5 1:2.......................................13 1:4.......................................26 1:8.......................................52 1:16.....................................104 1:32.....................................208O resultado pode ser expresso em título ou em mg/L.mg/L = 6,5 x título da última diluição (nº da diluição).Teste negativo: expressar o resultado como negativo ou menor que 6,5 mg/L.Unidade de Medida: mg/L

VALORES DE REFERÊNCIAAté 6,5 mg/LEstes valores devem ser usados como orientação, sendo que cada laboratório deverá criar sua faixa de valores de referência, de acordo com a população atendida.

SIGNIFICADO CLÍNICOA Proteína C Reativa é um útil indicador de processo inflamatório em atividade, quer seja de origem infecciosa (pneumonia, tuberculose) ou não infecciosa (febre reumática em atividade, artrite reumatóide, lúpus eritematoso). Está presente também, em várias outras condições patológicas como no infarto agudo do miocárdio, doenças neoplásicas, trauma intenso, viroses, queimaduras. A determinação de sua concentração plasmática constitui um teste eficaz no acompanhamento da terapêutica utilizada e prognóstico das inflamações.

LIMITAÇÕES DO MÉTODONão utilizar plasma, soros hemolisados ou lipêmicos, pois podem produzir aglutinação inespecífica.Ao correlacionar métodos para determinação da Proteína C Reativa, verificar a sensibilidade dos reagentes. Os resultados obtidos só devem ser comparados quando expressos em mg/L.

BETA-hCG – Imunocromatografia

PRINCÍPIO DO TESTEO teste β-hCG é um teste imunocromatográfico rápido, para detecção qualitativa de Gonadotrofina Coriônica Humana β (β-hCG) em amostras de urina ou soro humano, indicado para o diagnóstico precoce da gravidez.

AMOSTRAPreparo do Paciente

Pode ser utilizada uma amostra colhida a qualquer hora do dia. Entretanto é preferível usar a primeira amostra da manhã, que contém concentração mais elevada de hCG. Usar recipientes limpos e secos, que não contenham traços de detergente ou sabão. Centrifugar ou filtrar toda urina turva.

Amostras utilizadasUrina e/ou soro.O teste deve ser executado o mais rápido possível, de preferência nas primeiras 24 horas após a coleta. Para análises tardias, armazenar a amostra a 2-8ºC por no máximo 72 horas.

Estabilidade e armazenamento da amostraO hCG é estável na urina por 2 dias entre 2-8 °C ou até um mês na amostra congelada.

COMPONENTES DO KIT

Tiras reagentes

MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOSRecipiente para coleta da amostracronômetro

CUIDADOS E PRECAUÇÕES ESPECIAIS- Não comer ou fumar durante a manipulação das amostras.- Calçar luvas de proteção durante a manipulação das amostras.- Lavar as mãos após o procedimento.- Evitar respingos ou formação de aerossol.- Descontaminar e descartar todas as amostras, componentes do kit de reação e materiais potencialmente contaminados, como se fossem lixo contaminado, em um recipiente apropriado.- Não usar o kit de testes se a embalagem estiver danificada ou o selo violado.- Todas as amostras devem ser tratadas como potencialmente contaminadas.- Somente abrir a embalagem da tira reagente na hora de sua utilização.- Executar o teste imediatamente após retirar a tira reagente da bolsa de alumínio.- Não reutilizar a tira reagente.- Se for utilizar amostras refrigeradas ou congeladas, deixar que as amostras atinjam a temperatura ambiente antes de iniciar os procedimentos.- Recomenda-se deixar as amostras a temperatura ambiente por 20 a 30 minutos antes de realizar o teste. Homogeneizar a amostra.- Não misturar os componentes do kit, não utilizar números de lotes diferentes.- O teste foi desenvolvido para ser conservado a uma temperatura entre 15 -30oC (não é recomendado o armazenamento deste produto em refrigerador).

LIMITAÇÕES DA METODOLOGIA

1- Nos resultados duvidosos deve-se repetir o teste com nova amostra de urina, colhida 3 a 5 dias após a coleta anterior.2- Em caso de gravidez extra-uterina, toxemia, morte fetal ou ameaça de aborto, a excreção de hCG é frequentemente diminuída. Essas condições podem levar a um resultado falso negativo.3- Na gravidez precoce com muito baixa concentração de β-hCG o resultado pode ser negativo. Neste caso, o teste deve ser repetido em uma nova amostra colhida após 48 horas.4- Como níveis elevados de β-hCG são também encontrados em doenças trofoblásticas gestacional e não-gestacional (mola hidatiforme, coriocarcinoma e neoplasma não trofoblástico), o diagnóstico de gravidez deve ser confirmado após afastar estas patologias.5- Níveis elevados de β-hCG podem permanecer detectáveis por várias semanas após parto normal, cesárea e aborto espontâneo ou terapêutico.6- Amostras de urina que não sejam a primeira da manhã podem não conter uma concentração suficiente de β-hCG para positivar o teste. Desta forma, um resultado negativo, onde ainda suspeita-se do diagnóstico da gravidez, deve ser confirmado com uma nova amostra da primeira urina da manhã.7- Se a amostra de urina estiver diluída devido ao uso de diuréticos ou ingestão excessiva de água, os níveis de hCG decrescem artificialmente e podem não ser detectados. Se a gravidez é ainda suspeita, o teste deve ser repetido com a primeira urina alguns dias depois.8- Como em qualquer procedimento diagnóstico, o resultado deste teste deve ser sempre interpretado com outras informações clínicas disponíveis.9- Urina de mulheres em tratamento com certos medicamentos podem dar falsos resultados positivos ou negativos.

PROCEDIMENTO DO TESTEAmostra de urina:

1. Coletar a urina em qualquer recipiente limpo e seco.2. Remover a tira reagente do envelope tocando apenas na parte escrita hCG;3. Colocar cuidadosamente a tira no coletor de plástico contendo a urina. Segurar

a tira na posição vertical durante 10-20 segundos.4. Respeitar o limite máximo da tira indicado pela seta.5. Remover a tira reagente de dentro da amostra e colocá-la em uma superfície

plana e seca. Aguardar o resultado.6. Interpretar o resultado do teste em até 5 minutos. Não interpretar o resultado

após 5 minutos. Qualquer reação que ocorra na tira após 5 minutos não deve ser considerada.

Amostra de soro:1. Coletar e preparar a amostra seguindo as normas de Biossegurança locais.2. Separar uma alíquota do soro (1ml) e transferir para um tubo de ensaio limpo e

seco.

3. Colocar cuidadosamente a tira na amostra. Segurar a tira na posição vertical durante 10-20 segundos.

4. Respeitar o limite máximo da tira indicado pela seta.5. Remover a tira reagente de dentro da amostra e colocá-la em uma superfície

plana e seca. Aguardar o resultado.6. Interpretar o resultado do teste em até 5 minutos. Não interpretar o resultado

após 5 minutos. Qualquer reação que ocorra na tira após 5 minutos não deve ser considerada.

RESULTADOS

NEGATIVO: quando aparecer somente uma linha colorida na janela de resultados: a Linha Controle “C”. Como indicado na ilustração a seguir, esta linha deve aparecer sempre.

POSITIVO: Quando aparecer duas linhas coloridas na janela de resultados: a linha Controle “C” e a Linha Teste “T” como indicado na ilustração a seguir.

INVÁLIDO: Quando nenhuma linha aparecer na janela de resultados dentro de 5 minutos; ou quando a Linha Controle C não aparecer na janela de resultados dentro de 5 minutos (conforme ilustrado abaixo). Neste caso, considere o teste inválido. Repetir o teste com uma nova tira.

INTERFERÊNCIASAs seguintes substâncias podem provocar interferências nos resultados:Acetaminofeno 20mg/dLÁcido acetilsalicílico 20mg/ dLÁcido ascórbico 20mg/ dLAtropina 20mg/ dLBilirrubina (no soro) 40mg/ dLTriglicérides (no soro) 1200mg/ dLCafeína 20mg/ dLÁcido Gentísico 20mg/ dL

Glicose 2g/ dLHemoglobina 1mg/ dLBilirrubina 2mg/ dL

SIGNIFICADO CLÍNICOA gonadotrofina coriônica humana (hCG) é um hormônio glicoprotéico produzido pela placenta durante a gravidez.Homens sadios e mulheres sadias não-grávidas não possuem níveis de hCG detectáveis.Normalmente, encontra-se presente no soro e urina de mulheres grávidas após o sétimo dia da concepção.O hCG é secretado 6 a 8 dias após a concepção, aumentando rapidamente até um pico de 50.000 a 200.000 mUI/mL na 6ª a 8ª semana. A partir de então, sua concentração começa a cair, atingindo após a 20ª semana, um plateau de 5.000 a 20.000 mUI/mL para o restante da gravidez.Após o parto, o nível de hCG cai rapidamente e geralmente volta ao normal dentro de alguns dias.Além da gravidez, valores altos de hCG podem ser encontrados em enfermidades trofoblásticas de origem gestacional e não gestacional (Mola Hidatiforme). Essas situações devem ser identificadas antes de se fazer o diagnóstico de uma gravidez.

FENOTIPAGEM ABO

PRINCÍPIO DO TESTEDetectar a presença ou a ausência dos antígenos A e B nas hemácias. A prova direta se baseia na aglutinação das hemácias da amostra em teste em presença de anti-soros conhecidos contendo anticorpos Anti-A e Anti-B.

AMOSTRANão é necessário nenhum preparo prévio do doador ou paciente para a coleta das amostras de sangue. Para melhores resultados utilizar, de preferência, amostras recentemente colhidas ou em conformidade com os critérios locais de aceitação de amostras. As amostras de sangue devem ser anticoaguladas com Citrato EDTA ou CPD-A.

COMPONENTES DO KITConservar entre 2-8°C.Anticorpos monoclonais, prontos pra uso, em frascos de 10ml- Soro anti-A- Soro anti-B

MATERIAIS Tubos para suspensão Suporte para tubos Pipetas

Centrifuga de tubos

ESTABILIDADEOs reativos são estáveis até o vencimento da data de validade impressa no rótulo do produto e na caixa quando conservados entre 2-8°C. Manter os frascos bem vedados na temperatura recomendada e evitar a contaminação durante o uso.

CUIDADOS E PRECAUÇÕES ESPECIAIS- Os reagentes não podem ser congelados, pois o congelamento promove a liberação do anticorpo.- Não trocar as tampas dos frascos.- Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.- Recomendamos o uso das Boas Práticas em Laboratório Clínico para a execução do teste.- De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.- Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.- Recomendamos o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) como avental, óculos de segurança, luvas descartáveis e outros que se fizerem necessários para a realização do teste.- Não deve ser utilizada a boca para pipetagem de reagentes, amostra ou qualquer outra substância.

LIMITAÇÕES Reações fracas podem ocorrer quando: recém-nascidos que não

tenham antígenos A ou B bem expressos; nas leucemias e outras doenças malignas; pacientes recentemente transfundidos e detecção fraca das variantes A ou B que requerem leitura microscópica.

Na presença de crioaglutininas, lavar os eritrócitos de 4 a 6 vezes com solução fisiológica a 0,85% aquecida a 37oC, para permanecer somente os caracteres ABO.

O antígeno B pode ser ocasionalmente adquirido em pacientes do grupo A, devido à deacetilação do antígeno A por enzimas bacterianas, particularmente associadas com infecção intestinal. Estes pacientes serão AB com a presença de anti-B no sangue. A redução do pH do sangue para 6.0 reduzirá ou eliminará o antígeno B adquirido.

Em algumas patologias é comum a formação de aglutinação das hemácias observadas à microscopia. Esta anormalidade é causada por alterações na superfície das células. Este fenômeno é habitualmente encontrado em hiperproteinemias tais como Mieloma Múltiplo, Macroglobulenemia de Waldenstrom, Síndrome de Hiperviscosidade e Cirrose.

Resultados falso-positivo ou reações fracamente positivas podem ocorrer com amostras de sangue de subgrupos A e B ou após estocagem prolongada.

Variáveis relativas ao procedimento técnico, tais como: técnica; suspensões muito concentradas ou diluídas; centrifugações ou incubações inadequadas; amostra e salina contaminadas ou vidraria suja podem causar falsas reações positivas ou negativas.

PROCEDIMENTO DO TESTEPREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUEPreparar a suspensão de hemácias a 5% em suspensão salina isotônica com a seguinte técnica:

1- Dispensar 1 mL de salina isotônica no tubo de suspensão.2- Pipetar 50 μL de concentrado de hemácias e homogeneizar

PROCEDIMENTOSTeste em tubo

1- Identificar 2 tubos: um com o A e outro com o B (além do número do paciente).2- Pipetar 50 μL (1 gota) da suspensão de hemácias a 5 % em cada tubo.3- Pipetar 50 μL (1 gota) do Anti-A e 50 μL (1 gota) do Anti-B nos respectivos

tubos.4- Homogeneizar.5- Centrifugar por 1 minuto a 1000 rpm ou 20 segundos a 3400 rpm.6- Ressuspender suavemente as suspensões de hemácias e observar a aglutinação

macroscópica.

RESULTADOS:

a) PrincípioPositivo: excluindo-se as limitações do teste (vide a seguir), a aglutinação dos eritrócitos pelo reagente indica a presença de antígeno correspondente.Negativo: excluindo-se todas as limitações do teste, a ausência de aglutinação dos eritrócitos pelo reagente indica a ausência de antígeno correspondente.

b) Reações para grupos ABO

Anti- A Anti- B Grupo Sanguíneo+ negativo A

negativo + B+ + AB

negativo negativo O

Reações fracas podem indicar a presença de subgrupos de A (ABO1) ou B (ABO2), o que requer procedimentos adicionais. Para uma interpretação correta, deve-se fazer

uma fenotipagem completa (prova direta com anti-A, anti-B e prova reversa com hemácias A1, A2, B e O).

TIPAGEM REVERSA

Enquanto a tipagem direta do grupo sanguíneo ABO (descrito acima) é realizado com hemácias do paciente suspensas em solução fisiológica contra soros comerciais (anti-A, anti-B e anti-AB); a TIPAGEM REVERSA utiliza o soro ou plasma do paciente contra hemácias fenotipadas A1 e B (comerciais). Além destas duas hemácias A1 e B, o serviço poderá utilizar hemácias A2 e O (comerciais).

AMOSTRANão é necessário nenhum preparo prévio do doador ou paciente para a coleta das amostras de sangue. Para melhores resultados utilizar, de preferência, amostras recentemente colhidas ou em conformidade com os critérios locais de aceitação de amostras. As amostras de sangue podem ser colhidas com anticoagulantes (Citrato EDTA ou CPD-A) ou sem anticoagulante.

COMPONENTES DO KITConservar entre 2-8°C.Hemácias fenotipadas, prontas para uso, em frascos de 10ml- Hemácias A1- Hemácias B

MATERIAIS Tubos para suspensão Suporte para tubos Pipetas Centrifuga de tubos


CUIDADOS E PRECAUÇÕES ESPECIAIS- Os reagentes não podem ser congelados, pois o congelamento promove a lise das hemácias.- Não trocar as tampas dos frascos.- Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e amostra biológica.- Recomendamos o uso das Boas Práticas em Laboratório Clínico para a execução do teste.

- De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.- Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.- Recomendamos o uso de equipamentos de proteção individual (EPI) como avental, óculos de segurança, luvas descartáveis e outros que se fizerem necessários para a realização do teste.- Não deve ser utilizada a boca para pipetagem de reagentes, amostra ou qualquer outra substância.

PROCEDIMENTOSTeste em tubo

1. Identificar 2 tubos: um com o A1 e outro com o B (além do número do paciente).

2. Pipetar 100 μL do plasma do paciente em cada tubo.3. Pipetar 50 μL (1 gota) da hemácia A1 e 50 μL (1 gota) da hemácia B nos

respectivos tubos.4. Homogeneizar.5. Centrifugar por 1 minuto a 1000 rpm ou 20 segundos a 3400 rpm.6. Ressuspender suavemente as suspensões de hemácias e observar a aglutinação

macroscópica.

RESULTADOS:a) PrincípioPositivo- presença de aglutinaçãoNegativo- ausência de aglutinação

A1 B Grupo Sanguíneonegativo + A

+ negativo B+ + O

negativo negativo AB

FENOTIPAGEM RhD

PRINCÍPIO DO TESTEA fenotipagemRhD se baseia na aglutinação das hemácias da amostra em teste em presença de anti-soroanti-D

AMOSTRANão é necessário nenhum preparo prévio do doador ou paciente para a coleta das amostras de sangue. Para melhores resultados utilizar, de preferência, amostras recentemente colhidas ou em conformidade com os critérios locais de aceitação de

amostras. As amostras de sangue devem ser anticoaguladas com Citrato EDTA ou CPD-A.

COMPONENTES DO KITConservar entre 2-8°C.Anticorpos monoclonais, prontos pra uso, em frascos de 10ml- Soro anti-D- Soro controle Rh




PROCEDIMENTOS

Teste em tubo1- Identificar 2 tubos: 1 para o anti-soroanti-D e 1 para o soro controle-Rh e com o

número do paciente;2- Adicione 1 gota da suspensão de hemácias a 5% da amostra a cada um dos

tubos;

3- Coloque 1 gota do anti-soroanti-D no tubo D e 1 gota do soro controle Rh no tubo Rh e homogeneíze;

4- Centrifugue os tubos por 1 minuto a 1000 rpm ou 20 segundos a 3400 rpm.5- Agitar suavemente os tubos para pesquisar ou não a presença de aglutinação.

Observação: Se houver aglutinação no controle Rh o resultado da fenotipagem estará INVÁLIDO. A reação com controle Rh deve ser sempre NEGATIVA.

RESULTADOS

Anti-D Controle Rh Interpretação

+ ou - + Resultado inválido

+ negativo RhD Positivo

negativo negativo Determinar D fraco

DETERMINAÇÃO DO D FRACO

PRINCÍPIO DO TESTEO antígeno D fraco é determinado através do teste indireto da antiglobulina humana (AGH). O teste indireto da AGH para a determinação do antígeno D fraco se baseia na aglutinação de hemácias sensibilizadas com anticorpos anti-D, em presença de soro antiglobulina humano.

AMOSTRANão é necessário nenhum preparo prévio do doador ou paciente para a coleta das amostras de sangue. Para melhores resultados utilizar, de preferência, amostras recentemente colhidas ou em conformidade com os critérios locais de aceitação de amostras. As amostras de sangue devem ser anticoaguladas com Citrato EDTA ou CPD-A.

COMPONENTES DO KITConservar entre 2-8°C.- Soro anti-IgG (soro de Coombs)O produto é fornecido em frascos de 10 ml acompanhados de conta-gotas. Cada gota equivale a 50μl.




PROCEDIMENTO DO TESTE

1- Colocar em um tubo de ensaio uma gota de reagente anti-D e identificá-lo. Em um segundo tubo, colocar uma gota de controle Rh como controle negativo.

2- A cada tubo acrescentar uma gota de suspensão de hemácias a 5% previamente preparada em solução fisiológica. Misturar bem.

3- Incubar os dois tubos a 37º C durante 15 minutos.4- Centrifugar a 3.400 r.p.m. por 15 segundos ou a 1.000 r.p.m. por um minuto.5- Agitar suavemente os dois tubos para pesquisar ou não a presença ou não de

aglutinação.6- Lavar as hemácias dos dois tubos por três vezes com solução fisiológica. Após a

última lavagem, desprezar o sobrenadante, secando as bordas do tubo para retirar toda solução fisiológica.

7- A cada tubo adicionar duas gotas de Soro Anti-IgG (SORO DE COOMBS). Misturar bem.

8- Centrifugar a 3.400 r.p.m. por 15 segundos ou a 1.000 r.p.m. por um minuto.9- Agitar suavemente os tubos para pesquisar ou não a presença de aglutinação.

RESULTADOS:- Se não houver aglutinação em nenhum dos tubos, o sangue deve ser classificado como Rh negativo.

- Se houver aglutinação apenas no tubo que recebeu o reagente Anti-D, o sangue é portador do Fator Du e deve ser considerado Rh positivo.- Se houver aglutinação em ambos os tubos, a determinação do Fator Du fica prejudicada e portanto, estaremos diante de hemácias já sensibilizadas por algum anticorpo. Se o sangue for de um doador, o mesmo não poderá ser usado para fins transfusionais. - Se não ocorrer aglutinação no tubo anti-D e se o controle Rh estiver negativo, é preciso validar esse resultado com o controle de Coombs, para garantir que o anti-soro AGH está funcionando e o teste foi bem realizado.

VALIDAÇÃO DOS RESULTADOS COM CONTROLE DE COOMBS

1- Adicione uma gota de reagente controle de Coombs aos tubos anti-D com resultado negativo com anti-soro AGH;

2- Homogeneíze e centrifugue os tubos de reação;

3- Leia e interprete os resultados

RESULTADOS

Anti- D Controle Rh Controle de Coombs

Interpretação

+ ou negativo + Não realizado Resultado inválido

+ negativo Não realizado Rh positivo (D fraco)

negativo negativo + Rh negativo

negativo negativo negativo Resultado inválido

COOMBS INDIRETO

PRINCÍPIO DO TESTEA prova de Coombs indireto é atualmente chamada de pesquisa de anticorpos irregulares (PAI). Esta prova avalia a presença de anticorpos irregulares circulantes no soro de doadores de sangue, receptores, gestantes, pacientes com suspeita de anemia hemolítica por presença de anticorpos, entre outros.O teste antiglobulina humano baseia-se na aglutinação de hemácias sensibilizadas previamente com anticorpos humanos ou frações do complemento através do anti-soro AGH (SORO DE COOMBS).

AMOSTRANão é necessário nenhum preparo prévio do doador ou paciente para a coleta das amostras de sangue. Para melhores resultados utilizar, de preferência, amostras recentemente colhidas ou em conformidade com os critérios locais de aceitação de amostras. As amostras de sangue podem ser colhidas com ou sem a adição de anticoagulantes.

COMPONENTES DO KITConservar entre 2-8°C.- Soro anti-IgG (soro de Coombs)O produto é fornecido em frascos de 10 ml acompanhados de conta-gotas. Cada gota equivale a 50μl.

MATERIAIS- Tubos de vidro- Pipetas Pasteur- Banho-Maria a 37ºC- Centrífuga- Salina Isotônica.

PROCEDIMENTO DO TESTEEste teste é utilizado na pesquisa de anticorpos bloqueadores (incompletos), os quais se fixam as hemácias “in vitro”, mas não as aglutinam. Para que a reação seja observada é necessário a adição do Soro Anti-IgG (SORO DE COOMBS) ao teste.O teste de Coombs Indireto é realizado em pesquisas de anticorpos bloqueadores, pesquisa de antígenos (usando o soro classificador apropriado) e provas de compatibilidade, desde que tais reações não dependam do complemento para sua detecção.

1- Colocar em tubo de ensaio uma gota de suspensão de hemácias a 5% escolhidas para o teste (geralmente “O positivo”), previamente preparadas em solução fisiológica.

2- Adicionar duas gotas de soro a ser utilizado no teste.3- Acrescentar 2 gotas de albumina bovina a 22%.4- Incubar o tubo em Banho-Maria durante 15-30 minutos a 37º C.5- Preparar também os controles positivo e negativo**6- Lavar as hemácias do tubo por três vezes em solução fisiológica, secando as

bordas do tubo a última lavagem para retirar toda solução.7- Acrescentar duas gotas de Soro Anti-IgG (SORO DE COOMBS). Misturar bem.8- Centrifugar a 3.400 r.p.m. por 15 segundos ou a 1.000 r.p.m. por 1 minuto.9- Agitar suavemente o tubo para pesquisar a presença ou não de aglutinação.

**Controle positivo e controle negativo para o teste de Coombs Indireto1- Na execução do teste de Coombs Indireto é de primordial importância realizar

em paralelo os controles Positivo e Negativo.2- Colocar em 2 tubos de ensaio uma gota de suspensão a 5% de hemácias O Rh

Positivo, previamente preparadas em solução fisiológica. Identificá-los.

3- Adicionar ao tubo Controle Negativo uma gota de solução fisiológica e ao Controle Positivo uma gota de reagente Anti-D.

4- Executar o mesmo procedimento técnico descrito para o teste de Coombs Indireto a partir do item nº 3.

RESULTADOS

Positivo (presença de aglutinação): Presença de anticorpos livres no soro do paciente, os quais correspondem a um ou mais antígenos presentes nas hemácias usadas no teste.

LIMITAÇÕESI- Resultados FALSO-NEGATIVOS podem ocorrer:1- Quando as hemácias não forem apropriadamente lavadas ou globulinas

humanas estiverem presentes na vidraria, resultando numa neutralização das antiglobulinas humanas.

2- Quando os anticorpos se eluem das hemácias durante incubação inadequada, não permitindo uma apropriada sensibilização dos glóbulos.

3- Quando hemácias e/ou reagente não são adequadamente conservados na temperatura indicada, perdendo sua reatividade.

4- Quando o Soro Anti-IgG (SORO DE COOMBS) foi omitido durante o teste

II- Resultados FALSO-POSITIVO podem ocorrer:1- Quando hemácias do teste de Coombs Direto Positivo são usados durante o

procedimento técnico do teste de Coombs Indireto.2- Quando são utilizadas Amostras de sangue contaminado.3- Quando foi realizada uma centrifugação excessiva.4- Quando o soro, as hemácias e Soro anti-IgG (SORO DE COOMBS) estiverem

excessivamente frios, detectando a presença de aglutininas frias.

COOMBS DIRETO

PRINCÍPIO DO MÉTODO:Este teste é empregado na pesquisa de anticorpos (gamaglobulinas) já fixados às hemácias, como ocorre na Doença Hemolítica do Recém-Nascido, Anemia Hemolítica Adquirida e em pacientes que tenham recebido transfusões incompatíveis.

PROCEDIMENTO:1. Colocar em um tubo de hemólise uma gota da suspensão de hemácias do

paciente a 5%, previamente preparadas em solução fisiológica ou no próprio soro.

2. Lavar as hemácias do tubo por três vezes com solução fisiológica. Desprezar o sobrenadante, secando as bordas do tubo, na última lavagem para retirar toda solução.

3. Acrescentar duas gotas do Soro Anti-IgG (Soro de Coombs). Misturar bem.4. Centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos ou a 1000 rpm por 1 minuto.5. Agitar suavemente o tubo para pesquisar a presença ou não de aglutinação.

RESULTADOS:Positivo: presença de aglutinaçãoNegativo: ausência de aglutinação

Sorologia para Dengue

O teste ELISA Panbio de captura para IgMAnti-Dengue destina-se à detecção qualitativa de anticorpos IgM contra dengue, como auxiliar no diagnóstico clinico laboratorial de pacientes com sintomas clínicos compatíveis com a febre da dengue.


Metodologia: Ensaio imunoenzimáticoQuando presentes, os anticorpos séricos da classe IgM se combinam com anticorpos IgM ligados à superfície de poliestireno dos micropoços das tiras do teste.Uma mistura do concentrado de antígenos 1 a 4 do vírus da Dengue é diluído com o diluente do antígeno para se obter o volume de trabalho correto (os antígenos são produzidos usando um sistema de expressão da célula do inseto e imunopurificação por anticorpo monoclonal (MAb) específico). Adiciona-se ao antígeno diluído um igual volume do anticorpo monoclonal conjugado à HRP (enzima), o que permitirá a formação de complexos antígenos-MAb. Após a lavagem da placa para remoção do soro residual, adiciona-se à placa o complexo antígeno-MAb.Após incubação, os micropoços são lavados e adiciona-se um sistema de substrato incolor (tetrametilbenzidina/peróxido de hidrogênio- cromógeno TMB). O substrato é hidrolisado pela enzima (HRP), e o cromógeno adquire cor azul. O desenvolvimento de cor é indicativo da presença de anticorpos IgMAnti-Dengue na amostra sob teste.

apostila de imunologia

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