aplicaciÓn de electroacupuntura en el punto …
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1
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
ESPECIALIZACIÓN EN ACUPUNTURA HUMANA
APLICACIÓN DE ELECTROACUPUNTURA EN EL
PUNTO ZUSANLI (E36), ACUPUNTURA FICTICIA, Y
VALORACION DE LOS NIVELES SANGUÍNEOS DE
CORTICOSTERONA EN RATAS SOMETIDAS A ESTRÉS
TESINA PARA OBTENER EL DIPLOMA EN LA ESPECIALIZACIÓN EN
ACUPUNTURA HUMANA
PRESENTA:
MEDICO CIRUJANO Y HOMEOPATA PATRICIA LUJÁN GONZÁLEZ
ASESOR: MEDICO CIRUJANO FRANCISCO J. AEDO SANTOS
2
AGRADECIMIENTOS
A mis padres Nieves González Zaldivar y Pedro Lujan Cilia por estar
conmigo siempre en todas mis decisiones y por su infinito amor.
A mi amiga, hermana, compañera y confidente Ana Lilia Lujan González por
su carácter y amor que me han enseñado mucho.
A mi hermano Arturo Lujan González.
A mi amigo, confidente, compañero y ahora esposo Fernando García
Dolores por apoyarme incondicionalmente y por su gran amor.
Al MVZ Atona Gómez de la Facultad de Química de la UNAM que dono a
los ratones y proporciono asesoría veterinaria para la realización de esta
investigación.
Al Dr. Francisco J. Aedo Santos por haberme encaminado en la
investigación.
A mis profesores que han compartido su conocimiento.
Patty
3
INDICE
Glosario.....................................................................................................................5
Abreviaturas………………………………………………………………………8
Relación de Figuras y Tablas ................................................................................10
Resumen.................................................................................................................12
Abstract...................................................................................................................14
Introducción............................................................................................................16
Marco teórico...............................................................................................19
Vías neuroendocrinas del estrés............................................................................19
Eje hipotálamo-hipófisis-adrenal y Sistema liberador de corticotropina……..........19
Sistema Locus Cereleus-Norepinefrina/Simpático.................................................20
Circuitos cerebrales relacionados en la regulación del sistema hipotálamo hipófisis
adrenal.......................................................................................................22
El sistema del estrés y Acupuntura.........................................................................23
Conexión de acupuntura y las vías neuroendocrinas del estrés….........................26
Punto Zusanli (E36).............................................. .................................................27
Técnica de ELISA..............................................................................................28,48
Antecedentes..........................................................................................................29
Estudios realizados en animales............................................................................31
Justificación............................................................................................................36
Planteamiento del problema...................................................................................36
Hipótesis.................................................................................................................37
Objetivos.................................................................................................................37
4
Definición de variables............................................................................................37
Variables independientes........................................................................................37
Variables dependientes..........................................................................................38
Unidad de investigación..........................................................................................38
Estrategia experimental….......................................................................................38
Preparación de las ratas….....................................................................................39
Toma de muestra………………………………………………….………………...…..41
Resultados..............................................................................................................42
Discusión................................................................................................................45
Conclusión..............................................................................................................46
Perspectivas...........................................................................................................47
Anexo......................................................................................................................48
Material……………………………………………………………………………………49
Bibliografía..............................................................................................................51
5
GLOSARIO
ACUPUNTURA
Terapéutica no medicamentosa de la Medicina Tradicional China (MTCH)
que consiste en la aplicación y manipulación de agujas filiformes en determinadas
zonas del cuerpo humano llamadas puntos acupunturales para mantener o
recuperar la salud.40
PUNTO ACUPUNTURAL
Es aquel sitio específico del cuerpo humano donde se aplica acupuntura y
puede producir, reacción en otras zonas o en algún órgano interno, de manera
que se logren resultados curativos40.
ELECTROACUPUNTURA
Es una modalidad de la acupuntura, basada en la introducción de agujas en
puntos específicos donde el estimulo es mediante la aplicación de electricidad; la
frecuencia, intensidad y tipo de onda están en relación con el efecto terapéutico
deseado.
ACUPUNTURA FICTICIA
Aplicación de agujas de acupuntura en donde no se localiza ni punto
acupuntural, ni trayecto de un canal acupuntural.
6
PUNTOS ASHI
Es un punto doloroso del cuerpo humano que puede coincidir o no, con un
punto acupuntural.
VIAS NEUROFISIOLÓGICAS DEL ESTRÉS
Las vías neuroendocrinas que se han encontrado relacionadas con el
estrés son el eje hipotálamo hipófisis adrenal.
ESTRÉS
Conjunto de cambios fisiológicos como resultado de la exposición a un daño
o a una amenaza.
CORTISOL
Hormona esteroide que se produce en la zona fascicular de la corteza
suprarrenal. Esta es regulada por mecanismos de retroalimentación a nivel del eje
hipotálamo-hipófisis-adrenal.
CORTICOSTERONA
Hormona esteroide de la corteza suprarrenal. Influye en el metabolismo de
carbohidratos y electrólitos y la eficiencia muscular.
HERTZ
Unidad del sistema internacional para medir la frecuencia de la corriente
eléctrica, equivale a ciclos por segundos.
7
AMPERE
Unidad de corriente eléctrica. Un ampere representa un flujo de carga con
una rapidez de un coulomb por segundo, que pasa por un punto.
NÚCLEO ARCUATO O NÚCLEO ARQUEADO O NÚCLEO VENTRAL
POSTEROINFERIOR DEL TÁLAMO
Cualquiera de las pequeñas masas irregulares celulares en el bulbo
raquideo ventral a las pirámides.
HIPOTÁLAMO
Consiste en grupos de núcleos situados en el piso del tercer ventrículo.
Estos núcleos son divididos en grupos medio y lateral por el fórmix, cuando pasa
por el hipotálamo al dirigirse hacia los tuberculos mamilares. El grupo lateral
incluye los núcleos laterales y del túber. El grupo medio o interno se subdivide,
desde el punto de vista anatómico, en los tres grupos siguientes: 1)grupo anterior,
que incluye los núcleos preóptico, anterior, supraóptico y paraventricular, 2) grupo
medio, que contiene los núcleos dorsomedio y ventromedial (NÚCLEO
VENTROMEDIAL) y 3) grupo posterior de núcleos posterior y mamilares.
SINDROME DE CUSHING
Conjunto de manifestaciones clínicas debidas a la exposición crónica a un
exceso de cortisol o de otros corticoides afines.
8
ABREVIATURAS
ACTH = Hormona Adrenocorticotrópica
b-endorfina = Beta endorfina
E36 = Punto acupuntural estómago numero 36
FNT = Factor de Necrosis Tumoral
GABA = Acidogamaaminobutirico
HLC = Hormona Liberadora de Corticotropina
HPA = Hipotálamo-Pituitario-Suprarrenal
Hz = Hertz
IL-1 = Interleucina 1
IL-6 = Interleucina 6
LCR = Liquido cefalorraquídeo
LPS = Lipopolisacarido
NPV = Núcleo Paraventricular
MTCH = Medicina Tradicional China
POMC = Propiomelanocortina
RNAm= Ácido ribonucleico mensajero
SNC = Sistema Nervioso Central
UCI = Unidad de Cuidados Intensivos
9
mg/kg = Miligramos por kilogramo
microg/kg = Microgramos por kilogramo
mA = Microamperes
rpm = Revoluciones por minuto
10
RELACION DE FIGURAS Y TABLAS
FIGURAS
Fig.1 Diagrama del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal conexión con
electroacupuntura………………………………………………………………………..26
Fig.2 Diagrama de flujo de la estrategia experimental............................................39
Fig.3 Muestra sanguínea extraída con capilar........................................................41
Fig.4 Grupo A (electroacupuntura).........................................................................41
Fig.5 Punto Zusanli (E36) con electroacupuntura ..................................................42
Fig.6 Grupo B (acupuntura ficticia).........................................................................42
Fig.7 Niveles de corticosterona en ratones Wistar.................................................44
TABLAS
Tabla 1 Patologías relacionadas con hiperactivación del eje hipotálamo-hipófisis-
adrenal…….……………………………………………………………………………...30
Tabla 2 Patologías relacionadas con hipoactivación del eje hipotálamo-hipófisis-
adrenal………..…………………………………………………………………………..31
Tabla 3 Estudios donde utilizaron Punto Zusanli (E36) y electroacupuntura.........32
Tabla 4 Estudios donde utilizaron Electroacupuntura y Corticosterona.................33
Tabla 5 Estudios donde relacionan el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, estrés y
corticosterona.........................................................................................................34
11
Tabla 6 Muestra comparaciones post-hoc indicando la media de los diferentes
grupos en la tercera sesión del tratamiento............................................................43
Tabla 7 Muestra comparaciones post-hoc indicando la media de los diferentes
grupos en la séptima sesión del tratamiento….......................................................43
12
RESUMEN
Se ha relacionado el estrés a diversos padecimientos físicos y psicológicos.
El estrés abarca el área cognitiva, emocional y conductual así como el área
fisiológica. En el área fisiológica los efectos del estrés se pueden encontrar datos
en dos vías neurofisiológicas principales: la del factor liberador de corticotropina
(FLC)- eje hipotálamo hipófisis adrenal- y la del locus cereleus-norepinefrina.
Estas vías tienen efectos diversos sobre el sistema inmune, el sistema endocrino y
el sistema nervioso central (SNC). Estos efectos podrían explicar las
enfermedades que se han visto relacionadas con el estrés. Las investigaciones
con electroacupuntura han estudiado principalmente el dolor, sin embargo, los
hallazgos permiten observar que existen efectos potenciales sobre sistemas
fisiológicos del estrés.
Se utilizaron 20 ratones de raza Wistar. Se dividieron en 4 grupos. Grupo A:
Acupuntura Real (se utilizo Punto Zusanli {E36} con electroacupuntura a 4 Hertz
por 20 minutos e inmovilización). Grupo B: Acupuntura Ficticia (se utilizo no-punto
e inmovilización). Grupo C Inmovilización. Grupo D Control. Se aplicaron 12
sesiones diarias de acupuntura durante 14 días y se midieron las concentraciones
plasmáticas de corticosterona por medio de la técnica de ELISA. Se encontró que
después de tres sesiones de tratamiento hubo un aumento de las concentraciones
plasmáticas de corticosterona estadísticamente significativa (p < 0.05) para los
cuatro grupos. Después de 7 sesiones se observó una mayor disminución en los
niveles plasmáticos de corticosterona en el grupo A en comparación con los otros
grupos. A las doce sesiones de tratamiento, (14 días de iniciado el estudio),
13
continuo la disminución de las concentraciones de corticosterona en el grupo A,
sin embargo, no se encontró una diferencia estadísticamente significativa entre los
grupos. En este estudio se encontró un efecto biológico de la electroacupuntura de
baja frecuencia sobre los niveles plasmáticos de corticosterona. Todos los grupos
presentaron una elevación de las concentraciones plasmáticas de corticosterona
a las tres sesiones de tratamiento y este efecto perduró durante las doce sesiones
de tratamiento. En este estudio se observó un aumento significativo en la
concentración plasmática de corticosterona en el grupo tratado con
electroacupuntura. También se observó que existió una disminución de la
corticosterona la cual puede deberse a los mecanismos de adaptación o a la
regulación por cambios en los receptores del hipotálamo.
14
ABSTRACT
The stress has been related with emotional, cognitive and behavioral areas
and psychological conditions. The stress embraces the cognitive, as well as the
physiologic areas. In the physiologic area the effects of the stress akin in two main
ways in neurophysiology: the corticotrophin liberated factor (CRF) – hypothalamic-
hypophyseal adrenal axis - and the locus cereleus –norepinephrine. These
pathways have diverse effects on the immune system, the endocrine system and
the central nervous system (CNS). Those effects could explain illnesses that have
been related with stress. Investigations with electroacupunture have focused
mainly in the pain. However, other findings allows to point out that potential effects
may exist on physiologic systems producing stress.
For experiments in this study 20 Wistar rats were used. They were divided in
4 groups with different treatment. Group A: electroacupunture (Point Zusanli {E36}
4 Hertz for 20 minutes and immobilization). Group B: fictitious acupuncture (non-
point and immobilization). Group C: Immobilization alone. Group: D untreated not
immobilized rats. Twelve sessions of acupuncture, once a day were applied during
14 days and the plasmatic concentrations of corticosterone were measured by
ELISA tests. We have found that after three sessions of treatment, a statistically
significant increase (p < 0.05) of the plasmatic concentrations of corticosterone
was observed in the four groups. After 7 sessions a decrease of the plasmatic
levels of corticosterone was observed in the group A (electro-acupuncture) in
15
comparison with the other groups. At twelve treatment sessions, (14 days after
initiation of the study), decrease of the corticosterone concentrations continued in
the group A. However, there was not statistically significant difference among the
groups. In this study there was a biologic effect elicited by low frequency
electroacupuncture modifying plasmatic levels of corticosterone. All the groups
showed elevation from the basal plasmatic concentrations of corticosterone
manifested by the third treatment session, and this effect lasted during the twelve
sessions. In this study the increase in the plasmatic concentration of
corticosterone was higher in the group A treated with electroacupuncture. The
decrease of corticosterone observed in other cases, could be attributed to the
mechanisms of adaptation or by regulatory changes in the receptors of the
hypothalamic system.
16
INTRODUCCIÓN
El estrés es uno de los factores de riesgo más importante para la mayoría
de las enfermedades más frecuentes que se manifiestan en el final de este siglo,
presentándose tanto en trastornos del corazón, como en hipertensión arterial,
cáncer, diabetes, alteraciones metabólicas y hormonales.
El organismo humano desarrolla distintas habilidades para adaptarse a los
estímulos a que es sometido por su entorno, por medio de cambios internos, que
incluyen, entre otras cosas, la liberación de hormonas (por ejemplo como la
corticosterona en ratones y en humanos el cortisol).
La respuesta del organismo es diferente según se esté en una fase de
estrés inicial, en la que hay una activación general del organismo y en la que las
alteraciones que se producen son fácilmente reversibles, si se suprime o mejora la
causa, o estrés prolongado, en la que los síntomas se convierten en permanentes
y desencadena la enfermedad A.
Según un estudio de la Fundación Europea para la Mejora de las
Condiciones de Vida y Trabajo (1999) el 28% de los trabajadores europeos
padece estrés. Una estimación moderada de los costos que origina el estrés
relacionado con el trabajo apunta a unos 20,000 millones de euros anuales.
A http://www.monografias.com/trabajos10/estre/estre.shtml
17
Las personas estresadas acuden generalmente en primera instancia al
médico. Sus quejas más habituales suelen ser ansiedad, dolor y depresión. En el
año 2001, si tenemos en cuenta los datos "sólo" de la receta médica oficial, en
España se consumieron casi 35 millones de envases de fármacos de tipo
ansiolítico o tranquilizante. Casi un envase por habitante B.
Por lo anterior es importante investigar que otras alternativas presentan la
medicina actual ante esta problemática de salud. La terapéutica con acupuntura
podría convertirse en una opción eficaz y de bajo costo para el tratamiento.
Este tipo de trabajo se realizo para investigar el efecto de la
electroacupuntura en un modelo de estrés animal, para ser más confiables
nuestros resultados, se cuantificó la corticosterona en niveles plasmáticos por
método de ELISA.
Nuestros resultados sugieren fuertemente que existe una estimulación a
nivel del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, el cual observamos mediante los
cambios en las concentraciones plasmáticas de la corticosterona, lo cual fue
significativo al comparar con los ratones de control, sin embargo en este grupo al
final del estudio aumentaron los niveles plasmáticos de corticosterona
probablemente por que permanecieron mas tiempo en las cajas, provocando otro
B http://www.ucm.es/info/seas/estres_lab/epidem_y_costes.htm
18
tipo de estrés como en el estudio que realizo Masuda en Japón en el año del 2004
21.
Por otro lado, este estudio es el primero con relación al efecto de la
electroacupuntura en un modelo de estrés animal, ya que principalmente se han
hecho estudios enfocados a los efectos analgésicos de la electroacupuntura.
19
MARCO TEÓRICO
VIAS NEUROENDOCRINAS DEL ESTRÉS
Son circuitos que se encuentran relacionados a la respuesta del estrés.
Sistema hipotálamo-hipófisis-adrenal y Sistema Liberador de Corticotropina
La hormona liberadora de corticotropina (HLC) es producida principalmente
en el núcleo paraventricular del hipotálamo, el tallo cerebral, la corteza cerebral y
sistema límbico. El ritmo de secreción de esta hormona, es estimulado por estados
de estrés, como enfermedad, traumatismo corporal o excitación emocional. En
dosis moderadas despierta una respuesta fisiológica y conductual que ayuda al
organismo para responder ante un estrés. En dosis altas la HLC tiene efectos
ansiogénicos2.
La activación de la HLC a nivel del núcleo paraventricular del hipotálamo,
estimula la secreción de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) y B-endorfinas
que son vertidas a la circulación, a través de su precursor común, la
Propiomelanocortina (POMC). La ACTH se dirige a la circulación sistémica y a su
vez a nivel de la corteza suprarrenal, activando la producción de glucocorticoides,
siendo estos, los que afectan el metabolismo de la glucosa, proteínas y grasas. La
corteza suprarrenal secreta varios glucocorticoides diferentes, pero casi toda la
20
actividad de glucocorticoides se debe al cortisol; cuando hay grandes cantidades
de éste, en la sangre tiene un efecto de retroalimentación sobre hipotálamo y
células de la hipófisis en la región anterior, para reducir el ritmo de secreción de
ACTH, lo que constituye un mecanismo de retroalimentación negativa para
controlar la concentración de cortisol en la sangre36.
En condiciones de homeostasis, los niveles mas altos en plasma de
glucocorticoides se obtienen durante la mañana. Este ritmo diurno es controlado,
por uno de los relojes biológicos cerebrales que es el núcleo supraquiasmático38.
Sistema Locus Cereleus – Norepinefrina / Simpático
Los estímulos que tienen un intenso estrés inducen la expresión de
proencefalina a nivel del núcleo paraventricular.
En animales la estimulación del locus cereleus produce ansiedad intensa,
hipervigilancia e inhibición de la conducta de exploración. El aumento espontáneo
se observa en situaciones de estrés, y por el contrario se observa una disminución
de su actividad en el sueño y la alimentación2, 20.
La división simpática del sistema nervioso autónomo proporciona un
mecanismo rápido de respuesta que ayuda a controlar la reacción aguda del
organismo ante el factor estresante. Además la acetilcolina, norepinefrina y
21
epinefrina ambas del simpático; las divisiones del parasimpático y del sistema
nervioso autónomo secretan una variedad de neuropeptidos como la
somatostatina, encefalina, neurotensina, adenosintrifosfato y óxido nítrico. La
combinación particular de estas substancias en las neuronas del sistema nervioso
autónomo durante la respuesta de estrés es fuertemente afectado por el sistema
nervioso central y la interacción del eje hipotálamo-pituitaria-adrenal, así como la
aplicación de la HLC en el locus cereleus aumenta su actividad. Las conexiones
nerviosas recíprocas existen entre la HLC y neuronas de catecolaminas del
sistema nervioso central, y hay autorregulación negativa en las neuronas de HLC
ejercida por HLC y en las neuronas de las catecolaminas, ejercida por las fibras
colaterales de norepinefrina y receptores presinapticos. La HLC y neuronas
noradrenergicas son estimuladas por serotonina y acetilcolina e inhibidas por
glucocorticoides, acidogamaaminobutirico (GABA), corticotropina (ACTH) y
opióides péptidos35.
Recientemente se encontró que la secreción de corticosterona tiene una
cresta que precede a la elevación de ACTH inducida por el estrés al inmovilizar.
Como el sistema nervioso simpático responde antes que el eje HPA ante el
estrés, es posible que el adelanto en la fase de respuesta de la corticosterona por
encima de la ACTH sea explicado por un estimulo a nivel del nervio esplacnico
que llega antes a la corteza suprarrenal 3.
22
CIRCUITOS CEREBRALES RELACIONADOS EN LA REGULACIÓN DEL
SISTEMA HIPOTÁLAMO HIPÓFISIS ADRENAL
Los estímulos de intenso estrés, inducen la expresión de proencefalina
fuertemente dentro del núcleo paraventricular del hipotálamo.
Una vía proviene de las neuronas modulares catecolaminérgicas del tracto
del núcleo solitario, ventrolateral y dorsomedial de la médula. La mayoría de estos
núcleos se sabe que procesan transmisión de información interoceptiva visceral.
Otras vías provienen del núcleo tegmental, el núcleo parabraquial y algunas de la
sustancia gris. Otros aferentes encontrados, incluyen el órgano subfornical, el
órgano vascular de la lámina terminal y el núcleo preortico. En el hipotálamo, a
nivel de las neuronas parvicelulares del NPV, se produce la HLC, arginina y
vasopresina; recíprocamente es inervada por un péptido opioide que es la
propiomelanocortina (POMC), esta es producida por el núcleo arcuato del
hipotálamo; en los núcleos mamilares medial y lateral del núcleo supraortico. Al
parecer el principal neurotransmisor involucrado NPV es el GABA lo que sugiere
que estas neuronas están bajo un estricto sistema inhibitorio36.
La activación del sistema de estrés estimula al hipotálamo, que a su vez
estimula la secreción de la POMC que recíprocamente inhibe la actividad del
sistema del estrés y además a través de las proyecciones de la medula espinal
produce analgesia32.
23
EL SISTEMA DEL ESTRÉS Y LA ACUPUNTURA
Las vías neuronales que son estimuladas por la analgesia acupuntural son
tres centros: el cerebro medio, la medula espinal y la hipófisis. La acupuntura
activa las fibras nerviosas musculares siendo está las que envían impulsos para
estimular estos tres centros. En el cerebro medio las encefalinas activan el
sistema descendente del rafe inhibiendo el dolor mediante receptores de
noradrenalina y serotonina. En la médula espinal las altas frecuencias liberan
encefalinas y dinorfinas, causando inhibición presinaptica lo que bloquea el dolor,
disminuyendo la corriente de flujo de calcio en el potencial de acción de las células
terminales. La sustancia gris periacueductual libera encefalinas que desinhiben
neuronas en el cerebro medio produciendo activación del rafe, a su vez produce
impulsos hacia el tracto dorso lateral de la médula a través de la liberación de
monoaminas30.
Cheng y colaboradores observaron que la analgesia acupuntural de baja
frecuencia libera b-endorfinas en LCR y sangre 8.
La ACTH y las b-endorfinas son liberadas por la hipófisis durante la
analgesia acupuntural. Las lesiones en hipófisis inhiben la analgesia acupuntural.
La ACTH viaja a la corteza adrenal liberando cortisol. La liberación de b-endorfinas
de la pituitaria al LCR y la sangre produce analgesia a distancia, lo que explica
que al utilizar los puntos ashí en acupuntura, se opera a nivel de médula espinal y
24
la acupuntura aplicada a distancia actúa en cerebro medio y eje hipotálamo
hipófisis adrenal causando analgesia en todo el cuerpo. La electroacupuntura local
de baja frecuencia (2-4 Hz) y alta intensidad estimula a nivel de medula espinal y
cerebro medio7.
La acupuntura de baja frecuencia y alta intensidad producen efectos
acumulativos por lo tanto al repetir el tratamiento se obtienen mejores resultados.
La analgesia acupuntural de baja frecuencia estimula el núcleo arcuato el cual se
conecta mediante axones con la sustancia gris periacueductal para liberar b-
endorfinas, además promueve la producción de la POMC localmente. Takeshige
divide en 2 categorías la analgesia acupuntural: la primera incluye analgesia que
es reversible con naloxona, desaparece con la hipofisectomía, persiste mucho
tiempo la analgesia después de que se ha terminado la estimulación de los puntos
y exhibe variación y efectividad individual por lo tanto es dependiente del eje
hipotálamo hipófisis adrenal. La segunda categoría es la analgesia que no es
bloqueada por naloxona, no es bloqueada por hipofisectomía y no exhibe variación
individual por lo tanto es independiente del eje hipotálamo hipófisis adrenal 39.
La parte posterior del núcleo arcuato tiene estrecha relación con el núcleo
ventromedial el cual participa en la vía analgésica inhibitoria descendente a través
del núcleo del rafé y el paragigantocelular reticular que inhiben el dolor a nivel
medular a través de la serotonina y noradrenalina respectivamente. En la segunda
categoría actúan la parte media y anterior del núcleo arcuato que a través de
25
conexiones con la eminencia media y el área preóptica se activa la producción de
b-endorfina y ACTH de la hipófisis 1.
Schwartz y colaboradores en el año de 1999, estudiaron recién nacidos
prematuros, donde el factor de estrés era un examen oftalmológico para evaluar
retina, midieron el cortisol en plasma como en la saliva, el cortisol proporciona un
marcador fisiológico de la actividad del eje HPA, especialmente en el estrés.
Después del estimulo oftalmológico la concentración en el plasma de 20 a 30
minutos, dio un aumento en el cortisol extraído de saliva. Los puntos utilizados
fueron Hegu (IG4) y Taichong (H3), escogidos basándose en la Teoría de la
Medicina Tradicional China refiriendo que existe una forma de energía universal
fluyendo a lo largo del cuerpo en forma de causes, es decir por los meridianos,
que sirven para contener la energía con la primera respiración del infante. El
resultado fue que encontraron un aumento significativo en cortisol tomado de la
saliva, como consecuencia refleja un aumento en la actividad del eje HPA 34.
Vermes y col en el año de 1994, realizaron estudios en pacientes de la
Unidad de Cuidados Intensivos (UCI), donde encontraron que hay niveles altos de
cortisol y ACTH en las primeras horas de internamiento, posteriormente solo el
cortisol se mantenía alto junto con la hormona antidiurética y endotelina 1 42.
26
CONEXIÓN DE LA ACUPUNTURA Y LAS VÍAS NEUROENDOCRINAS DEL
ESTRÉS
La conexión entre las vías neuroendocrinas relacionadas con las
respuestas al estrés, y las vías involucradas con la analgesia acupuntural, en
particular la relacionada con electroestimulación de baja frecuencia actúa a nivel
del núcleo arcuato del hipotálamo, para estimular la liberación del POMC y así
liberar la HLC a nivel del núcleo paraventricular del hipotálamo 17. En conjunto el
HLC y la POMC provocan la liberación simultanea de ACTH y b-endorfinas y a su
vez la liberación del cortisol 11 (Fig.1).
Fig.1 Diagrama de la vía del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, realiza la conexión
con el estimulo de baja frecuencia que se produce en esta vía, dando como
resultado la liberación del cortisol.
ESTRES
HIPOTÁLAMO Núcleo paraventricular y arcuato
HIPÓFISIS
CORTISOL
HLC,B-ENDORFINAS, ACTH
Electroestimulación de baja Frecuencia
27
PUNTO ZUSANLI (E36) EN HUMANO
El punto Zusanli (E36) fue utilizado en nuestro estudio por que es de fácil
acceso y se ha comprobado tener un buen efecto analgésico también abarca una
gran sintomatología que esta relacionada con el estrés y por que es el punto que
más refieren en los artículos donde se observa analgesia, secreción de B-enorfina,
ACTH, cortisol y GABA después de la aplicación de la electroacupuntura.
Localización: Acostado el paciente se toma como referencia la prominencia
tibial anterior, un dedo por abajo y uno lateral.
Anatomía. Músculo tibial anterior, Músculo extensor largo digital, Músculo
flexor profundo digital, nervio peroneal.
Manipulación. La aguja se coloca perpendicular.
Indicaciones: Dolor de estomago, vómito, distensión abdominal,
desnutrición, diabetes, indigestión, borborigmos, diarrea, constipación, disentería,
mareo, trastornos mentales, hemiplejia, dolor de la articulación de la rodilla y
pierna, gastritis aguda o crónica, mala digestión, anorexia, pérdida de peso,
trastornos del habla, enfermedades de la boca, peritonitis, flatulencia, anuria,
arteriosclerosis, congestión opresiva del cuello, fatiga, dolor de miembros, cefalea,
afecciones oculares, asma por baja de energía. El uso adecuado y regular de este
punto conserva la robustez y la vitalidad 29.
28
TECNICA DE ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal:
es versátil, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue,
mediante el uso de la fase sólida, da una separación fácil entre la fracción retenida
y la fracción libre (Ver anexo).
29
ANTECEDENTES
La exposición a traumatismos extremos, definidos como acontecimientos
asociados con muerte o amenaza de muerte, o lesiones de uno mismo o de otros,
pueden inducir al desarrollo de ansiedad. La reacción se produce poco después
de la exposición ( trastorno agudo por estrés) o de manera tardía y en forma de
episodios recidivantes ( trastorno por estrés postraumático). En ambos síndromes,
la persona experimenta síntomas asociados de distanciamiento y restricción
afectiva. El paciente puede sentirse despersonalizado e incapaz de recordar los
aspectos específicos de la experiencia causal, pero típicamente la experimenta de
nuevo mediante pensamientos, sueños o episodios disociativos (flashbacks)
especialmente ante claves que recuerdan el episodio. En consecuencia, estos
pacientes tienden a evitar los estímulos que precipitan el recuerdo del
acontecimiento traumático y presentan un aumento de las respuestas de
vigilancia, alerta y sobresalto. Los pacientes con trastornos por estrés tienen
mayor riesgo de desarrollar otros trastornos por ansiedad, del estado de ánimo o
asociados a sustancias psicoactivas. Entre el 5% y el 10% de todos los
norteamericanos satisfacen todos los criterios del trastorno por estrés traumático
en algún momento de su vida, siendo mayores, a este respecto, las probabilidades
de las mujeres, en comparación con las de los varones 19.
La activación crónica del sistema del estrés podría causar efectos adversos
acumulativos en el organismo, siendo resultado de una exposición prolongada a
glucocorticoides o catecolaminas.
30
Los individuos que son vulnerables y que son expuestos a estrés constante,
se observan cambios progresivos de envejecimiento prematuro, en la memoria
hay déficit a corto plazo y aumento continuo de glucocorticoides que puede
provocar lesiones de atrofia cerebral, se ha demostrado que la zona más afectada
es el hipocampo principalmente en el Síndrome de Cushing, enfermedad
depresiva recurrente, esquizofrenia y demencia. También se ha mencionado que
los individuos severamente dañados, el volumen del hipocampo es
significativamente más pequeño comparado con el de los sanos. El hipocampo es
una zona primaria para los esteroides suprarrenales en el cerebro, por lo tanto han
mostrado que afecta la plasticidad neuronal del hipocampo y perdida de neuronas
en isquemia 22.
Varias enfermedades pueden ser representativas de desregulaciones del
sistema del estrés, ya sea una hiperactivación o hipoactivación del eje hipotálamo
hipófisis adrenal.
Tabla 1. Patologías relacionadas con la hiperactivación del eje hipotálamo hipófisis
adrenal
Insomnio Síndrome de Cushing
Anorexia nerviosa Estrés crónico
Abstinencia a alcohol y
narcóticos
Síndrome de intestino irritable
31
Depresión Desorden obsesivo
compulsivo
Diabetes mellitus Síndrome premenstrual
Hipertiroidismo Ataques de Pánico
Obesidad Alcoholismo crónico
Tabla 2. Patologías relacionadas con la hipoactivación del eje hipotálamo hipófisis adrenal
Abstinencia a la nicotina Hipotiroidismo
Artritis reumatoide Insuficiencia adrenal
Depresión estacionaria Periodo postparto
Síndrome post – Cushing Síndrome de fatiga crónica
Fibromialgia
Estudios realizados en animales:
Los estudios que están más relacionados con nuestro trabajo son los
siguientes, en donde se busca un tratamiento con acupuntura enfocado hacia el
estrés tomando como parámetro cuantitativo la corticosterona (Tabla 3, 4 y 5).
32
Tabla 3. Estudios donde utilizaron el punto Zusanli (E36) y Electroacupuntura.
Liao y colaboradores en 1979
26.
Fue significativo el incremento en cortisol y corticosterona con electroacupuntura en
conejos.
Fu y colaboradores en 1980
16.
La analgesia de la electroacupuntura no es afectada por la hipofisectomía en ratones.
Liao y colaboradores en 1980
25.
Evaluaron el efecto de la electroacupuntura, en la producción de ACTH con estrés.
Encontrando un incremento de ACTH.
Liao y colaboradores en 1981
24.
Observaron un aumento de la producción de la hormona adrenocortical con
electroacupuntura.
Chen en 1996 9. La analgesia inducida por estimulación eléctrica a 2 Hz es mediada por dos tipos de
receptores opioides que pertenecen a los deltas.
33
Tabla 4. Estudios donde utilizan Electroacupuntura y valoran Cortisol o corticosterona.
Cheng y colaboradores en 1980 8. En caballos realizaron una estimulación a 5 Hz durante 30
minutos dando una elevación de cortisol sanguíneo, en
comparación con un grupo de acupuntura ficticia.
Cao y colaboradores en 1983 6. Se encontró como hallazgo, que los niveles de cortisol en
plasma aumentaban después de la estimulación con
electroacupuntura en conejos.
Bossut y colaboradores en 1983 5. Midió la B-endorfina encontrando una elevación
concomitante al cortisol.
Bossut y Mayer en 1991 4. La B-endorfina y ACTH se liberan al torrente sanguíneo
durante la estimulación con electroacupuntura .
Yun-Hui y Yan-Zhong, en el 2001 44. Utilizaron Tingong (ID19) y Quchi (IG11) bilateral con
electroacupuntura a 2 Hz por 30 minutos. Encontrando que el
efecto antagonista de la electroacupuntura es mediado por B-
endorfinas y GABA dentro neuronas noradrenergicas
proyectadas a la medula ventrolateral.
34
Tabla 5. Estudios donde relacionan el Eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, Estrés y Corticosterona.
Gadek-Michalska y Bugajski
en el 2003 13.
Sujeción dos veces al día por 3 a 7 días y otro grupo se colocaba en tubos de metal
apretándolas por 7 días, incrementó la ACTH y corticosterona, estimulando el eje
hipotálamo-hipófisis-adrenal y hay una fase adaptativa de estrés sobre la respuesta del eje
hipotálamo-hipófisis-adrenal en el estrés agudo.
Zelena y colaboradores en el
2003 46.
Evaluaron el rol del hipotálamo dentro de la regulación de la respuesta del estrés crónico, la
activación del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal durante la sujeción repetitiva es impulsada
centralmente. La lesión a nivel del núcleo paraventricular inhibe a la ACTH y la
corticosterona primero sube para después tener una restricción por aproximadamente un
50%.
Figueiredo y colaboradores
en el 2003 15.
La exposición repetida de un depredador induce la activación del eje hipotálamo-hipófisis-
adrenal, núcleo paraventricular, RNAm de c-fos y la secreción de corticosterona después
del sexto o del treceavo día de expuesto.
35
Tabla 5. Estudios donde relacionan el Eje hipotálamo-hipófisis-adrenal, Estrés y Corticosterona.
O’Carroll y colaboradores en el 2003 28. Dentro del hipotálamo en el núcleo paraventricular
parvocelular, el estrés repetitivo y agudo ejerce una
influencia que estimula la expresión de RNAm del gen APJ
y a nivel del hipotálamo puede ser dependiente de niveles
básales de glucocorticoides que se encuentran en la
circulación.
Zelena y colaboradores en el 2004 44. La arginina y vasopresina no son indispensables para la
activación del hipotálamo-pituitaria-adrenocortical por
estrés crónico.
36
JUSTIFICACIÓN
Una de las respuestas del estrés oxidativo durante el daño celular, es el
aumento en la secreción de glucocorticoides. Dentro del tratamiento con
acupuntura uno de los efectos deseables, es la disminución en los niveles
plasmáticos de corticosterona.
La finalidad de esta investigación es poder probar que la acupuntura es útil
en la disminución del estrés.
La estimulación del núcleo arcuato por medio de la electroacupuntura de
baja frecuencia (4Hz), puede provocar efectos sobre las vías relacionadas con el
estrés y secundariamente en enfermedades relacionadas con el. Por lo anterior se
medirá una sustancia endógena, como es la corticosterona en niveles plasmáticos
para determinar el efecto cuantitativo de la electroacupuntura sobre este mediador
químico del estrés.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El problema del estrés es el aumento de la corticosterona y se pretende
disminuir este indicador, para lo cual proponemos un tratamiento con acupuntura.
¿La electroacupuntura de baja frecuencia (4 Hz) modificara los niveles
plasmáticos de corticosterona en ratones sometidos a estrés?
37
HIPÓTESIS
La electroacupuntura de baja frecuencia (4 Hz) aplicada en el punto Zusanli
(E36) probablemente sea capaz de modificar los niveles plasmáticos de
corticosterona en ratones sometidos a estrés.
OBJETIVOS
Determinar si la electroacupuntura de baja frecuencia (4 Hz) aplicada en
punto Zuzanli (E36) modifica los niveles plasmáticos de corticosterona en ratas
Wistar sometidas a estrés, comparando con controles apropiados.
DEFINICION DE VARIABLES
VARIABLES INDEPENDIENTES
Electroacupuntura.
Conceptual: Es una modalidad de la acupuntura tradicional, basada en la
introducción de agujas en puntos específicos, donde el estimulo es producido
mediante electricidad, la frecuencia, intensidad y tipo de onda están con relación
al efecto terapéutico deseado.
Operacional: Se utilizó el punto Zusanli (E36) con electroacupuntura de baja
frecuencia (4 Hz) durante 20 minutos.
Acupuntura ficticia
Conceptual: Aplicar agujas de acupuntura, en donde no se localiza ni punto
acupuntural, ni trayecto de un canal acupuntural.
38
Operacional: Se realizó la inserción de las agujas con aplicador en el no-
punto.
VARIABLES DEPENDIENTES
Cortisol Plasmático.
Conceptual: Es una de las hormonas producidas por la estimulación de las
vías neuroendocrinas (Eje hipotálamo hipófisis adrenal) que se han relacionado
con el estrés.
Operacional: Medición de los niveles plasmáticos de corticosterona por
medio de la técnica de Elisa, a los 3, 7 y 14 días después del tratamiento.
UNIDAD DE INVESTIGACIÓN
Sección de postrado de la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía del
Instituto Politécnico Nacional y la Facultad de Química de la Universidad Nacional
Autónoma de México.
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Se utilizaron 20 ratas de raza Wistar de un peso aproximado de 300
gramos, entre seis y ocho meses de edad, donados por la Facultad de Química de
la Universidad Nacional Autónoma de México.
39
PREPARACIÓN DE LAS RATAS
Las ratas fueron divididas en cuatro grupos como a continuación se muestra:
20 RATAS WISTAR
Peso aproximado de 300 g
Fig. 2 Diagrama de flujo de la estrategia experimental
Las ratas fueron pretratados durante una semana con manipulación, un
minuto por día (se tocaban con las manos y se cambiaron 4 veces de caja, esto
fue para que se acostumbraran a la manipulación y no se alterara el estudio) y
para minimizar reacciones de estrés. Tuvieron acceso libre a comida y agua, con
un medio ambiente controlado: un ciclo de luz y oscuridad de 12 por 12 horas ( la
luz fue programada a partir de las 7:00 p.m. para que nosotros trabajáramos con
A Electroacu-puntura en punto Zusanli (E36) 4 Hz durante 20 minutos.
Divididas en 4 grupos de 5 ratones
B Acupuntura ficticia en no-punto
C Control con Sujeción
D Control sin tratamiento
40
los ratones en su ciclo de actividad). Se manipularon todos las ratas al mismo
tiempo por día, para evitar cualquier alteración en el ciclo circadiano.
Se aplico una sesión diaria de tratamiento durante doce días dejando
descansar dos días (para que el efecto inflamatorio después de extraer la muestra
no afectara los resultados) dando un total de catorce días.
La toma de muestra sanguínea fue al tercer día, al séptimo y catorceavo
día de tratamiento, se determinaron estos días de toma de muestra por que es el
tiempo mínimo que los ratones para recuperarse de la perdida sanguínea, esto se
hizo por recomendación del MVZ Atona Gómez de la Facultad de Química de la
UNAM que proporcionó asesoría veterinaria en este trabajo.
________1___2___3___4___5___6___7___8___9___10___11___12___13___14
1 semana * * * D * * * * D * * * * *
pretratados + + +
Días que tuvieron sesión con tratamiento ( * )
Días que se dejaron descansar ( D )
Días que se extrajo muestra sanguínea ( + )
41
TOMA DE MUESTRA
La muestra sanguínea se tomó del plexo supraorbital con una técnica de
microcapilaridad, tomando 20 gotas que descendían a un tubo con anticoagulante
(EDTA), después de 30 minutos de haber realizado la electroacupuntura, la
acupuntura ficticia y la sujeción en los grupos correspondientes. La muestra
sanguínea se centrifugó a 2000 rpm durante 20 minutos, separando el plasma, el
cual inmediatamente se colocó en hielo para su conservación, para
posteriormente practicarle la técnica de Elisa.
Fig. 3 Toma de muestra,sanguínea extraída con capilar en la parte posterior del ojo
Fig. 4 Grupo A (electroacupuntura)
42
Fig. 5 Punto Zusanli (E36) con electroacupuntura
Fig.6 Grupo B (acupuntura ficticia)
RESULTADOS
Con el objeto de evaluar los cambios plasmáticos, de los niveles de la
corticosterona, se llevó a cabo la medición de la misma por medio de la técnica de
ELISA.
Después de 3 sesiones de tratamiento se encontró una diferencia
estadísticamente significativa con una p < 0.05 en las concentraciones
plasmáticas de corticosterona para los tres grupos [F(3,12)=10.54 p=.001]. El
aumento de la corticosterona fue mayor en el grupo A (Ver Tabla 6).
43
Tabla 6. Muestra comparaciones post-hoc indicando la media de los diferentes
grupos en la tercera sesión del tratamiento.
Grupos de Estudio Valores promedio de corticosterona en
la 3era sección en pg/ml
A (Electroacupuntura de baja
frecuencia)
77011.33 + / - 3813.11
B (acupuntura ficticia) 65326.06 + / - 7970.47
C (Control con sujeción) 75483.75 + / - 7288.04
D (Control sin tratamiento) 47426.30 + / - 12251.52
Después de 7 sesiones de tratamiento la elevación en los niveles de
corticosterona en el grupo A mostró una disminución, comparada con la medición
a las 3 sesiones de tratamiento. Todos los grupos mostraron una diferencia
estadísticamente significativa al tratamiento con una p <0.05 [F(3,12)=11.00
p=.001] (Ver Tabla 7).
Tabla 7. Muestra comparaciones post-hoc indicando la media de los diferentes
grupos en la séptima sesión del tratamiento.
Grupos de Estudio Valores promedio de corticosterona en
la 7ma sección en pg/ml
A (Electroacupuntura de baja frecuencia) 63272.37 + / - 9071.78
B (acupuntura ficticia) 65692.96 + / - 7936.14
C (Control con sujeción) 82872.35 + / - 3849.71
D (Control sin tratamiento) 36904.16 + / - 19069.87
44
A las doce sesiones de tratamiento, la disminución de las concentraciones
de corticosterona en el grupo A continuó, sin embargo, no se encontró una
diferencia estadísticamente significativa entre los grupos, principalmente debido a
una elevación en los niveles de corticosterona en el grupo C (Ver Fig.7).
020000400006000080000
100000
Aelectroacu
B ficticia C sujeciónD control
NIVELES DE CORTICOSTERONA EN RATAS WISTAR
3ra.SESION 7ma.SESION 12va.SESION
Fig. 7 Diferencias en los niveles plasmáticos de corticosterona sérica de ratones
Wistar en la 3ra, 7ma.y 12va sesión de tratamiento en los diferentes grupos.
Grupo A (electroacupuntura en punto Zusanli E36), Grupo B (acupuntura ficticia),
Grupo C (control con sujeción), Grupo D (control sin tratamiento).
45
DISCUSIÓN
Debido a la importancia actual del estrés y al auge que ha presentado la
terapéutica con acupuntura para combatirlo, es necesario establecer las pautas
para la medición de sus efectos terapéuticos sobre el estrés.
Los estudios clínicos han demostrado la efectividad de la acupuntura contra
el dolor, así como alguna base fisiológica para esta terapia 41,18 por ejemplo, se ha
establecido que las diferentes frecuencias de electroacupunctura inducen la
liberación de varios neuromoduladores químicos como la b-endorfina, serotonina,
ACTH y noradrenalina en diferentes núcleos cerebrales 33,37, algunos de ellos
relacionados con el estrés, humor y conducta 23.
En este trabajo se observó la disminución de las mediciones plasmáticas de
corticosterona en diferentes días de tratamiento, encontrando que en las primeras
sesiones hubo una elevación comparable a la que obtuvieron Cao y colaboradores
en 1983 en Shanghai, China 6 y Bossut en 1983 en EU 5 en donde observaron que
los niveles plasmáticos de cortisol aumentaban después de la estimulación con
electroacupuntura.
Después de varias sesiones con electroacupuntura puede haber una
regulación del eje hipotálamo- hipófisis- adrenal debida a mecanismos de
retroalimentación o a cambios en el ámbito de los receptores del hipotálamo (sin
46
embargo, estas hipótesis requieren ser contrastadas científicamente). También
cabe mencionar que pudiera haber una fase adaptativa de estrés sobre la
respuesta del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal en el estrés agudo como la que
obtuvieron Gadek-Michalska y Bugajski 13 se sugiere realizar un estudio a largo
plazo para observar si se modifican las cifras de corticosterona o permanecen
igual.
CONCLUSIÓN
Nuestros resultados sugieren que existe una estimulación a nivel del eje
hipotálamo-hipófisis-adrenal, la cual observamos mediante los cambios en las
concentraciones plasmáticas de la corticosterona, lo cual fue significativo al
comparar con los ratones que de los grupos control, sin embargo en el grupo D al
final del estudio aumentaron los niveles plasmáticos de corticosterona
probablemente por que permanecieron mas tiempo en las cajas, provocando otro
tipo de estrés como en el estudio que realizo Masuda en Japón en el año del 2004
21, en el cual observaban que al colocar ratas dentro de cajas pequeñas había un
aumento en la liberación de acetilcolina y corticosterona, para evitar esto podría
ser colocar a los ratones en cajas mas grandes.
Por otro lado este estudio es el pionero en relación al efecto de la
electroacupuntura en un modelo de estrés animal, ya que principalmente se han
hecho estudios enfocados a los efectos analgésicos de la electroacupuntura. El
estudio de los efectos de la acupuntura en el sistema del estrés puede
47
potencialmente conducir a mejores protocolos de tratamiento para las
enfermedades relacionadas a la hiperactivación o hipoactivación del sistema del
estrés.
Durante las primeras sesiones de tratamiento con electroacupuntura hay un
aumento de la corticosterona y con sesiones continuas de tratamiento, la
corticosterona tiende a un descenso más rápido.
PERSPECTIVAS
Sería interesante observar el efecto que provoca la electroacupuntura en
las ratas por un tiempo más prolongado. Y el siguiente paso sería realizar un
ensayo clínico en seres humanos en la clínica de acupuntura.
48
ANEXO
TECNICA DE ELISA
La técnica de ELISA (Enzyme linked InmunoSorbent Assay) está
fundamentada en el uso de anticuerpos marcados con una enzima, para detectar
la sustancia complementaria (antígeno o anticuerpo) o bien determinar su
concentración en la muestra de estudio. Entre las variantes de la técnica de Elisa
están los métodos: directo, indirecto, competitivo, de captura, de tipo sándwich y
de doble sándwich, que tienen en común las siguientes etapas: el anticuerpo va
acoplado a una enzima (fosfatasa alcalina o peroxidasa) que reacciona con un
sustrato cromógeno, dando origen a un producto coloreado, que se detecta a
simple vista o bien al microscopio óptico. El cambio de color se puede cuantificar
midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro.
Procedimiento
1. Las diluciones de muestras y estándares se realizaron en tubos del
polipropileno. Se agregaron 100 µL de muestra (suero de los ratones) con un
diluyente apropiado, en cada pozo. Se mezcló suavemente la placa durante 1
minuto. Se cubrió con una tira adhesiva y se incubó por 2 horas a temperatura
ambiente.
2. Se aspiró y lavó la placa.
49
3. Se agregó 100 µL del anticuerpo diluido a cada pozo. Se cubrió con una nueva
tira adhesiva y se incubó a 2 horas a temperatura ambiente en el empaque que
trae el Kit.
4. Se aspiró y lavó la placa.
5. Se agregó 100 µL Streptavidin-HRP a cada pozo. Se cubrió la placa y se incubó
durante 20 minutos a temperatura ambiente en el empaque que trae el Kit.
6. Se aspiró y lavó la placa.
7. Se agregó 100 µL de solución de substrato a cada pozo. Se incubó por 20 - 30
minutos a temperatura ambiente en el empaque que trae el Kit.
8. Se agregó 50 µL de solución de paro a cada pozo (para detener la reacción y
realizar una buena medición). Se mezclo suavemente para asegurar el mezclando
completo.
9. Se determinó la absorbancia de cada pozo.
La absorbancia se determinó en un espectrofotómetro a 570 nanómetros.
Además se realizó la curva estándar para calcular las concentraciones de
corticosterona sobre la base de estándaresC.
MATERIAL
Ratas Wistar machos de aprox. 300 gr, entre 6 y 8 meses de edad
Tablas de madera para fijación de 20 X 20 cm.
Hilos para realizar fijación C http://www.rndsystems.com/
50
Tubos de ensayo con anticoagulante
Capilares
Algodón
Frascos de vidrio
Marcadores indelebles
Frigoríficos
Éter
Electroestimulador
Centrífuga
Agujas de acupuntura de 0.22 x 15 mm marca AcuZone
51
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