Apndice normativo B.Mtodos de Pruebandice1 Determinacin de cafena en bebidas saborizadas no alcohlicas Determinacin de materia e!tra"a en bebidas saborizadas no alcohlicas# Determinacin de $uinina en bebidas carbonatadas%Determinacin de sulfitos en alimentos. Mtodo optimizado de Monier&'illiams.(Determinacin de sulfitos por )ravimetra *opcional+., Determinacin de sodio *-a+. An/lisis microbiol)ico de productos ob0eto de esta norma..1Procedimientoparalapreparacinydilucindemuestrasdealimentosparasuanlisismicrobiolgico... Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa...# Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa...% Mtodo para la determinacin de Salmonella spp.en alimentos...( Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable...,De la estimacin de la densidad microbiana por la tcnica del nmero ms probable.Determinacindebacteriascoliformes, coliformesfecalesyEscherichiacolipor latcnicadediluciones en tubo multiple.... Preparacin de la muestra para la determinacin de Vibrio cholerae...1 Tcnicas y procedimientos para la investigacin de Vibrio cholerae...2 Mtodo para la determinacin de taphylococcus aureus en productos ob!eto de esta norma..13 Determinacin de enteroto"ina estafilocccica por el mtodo de Elisa.1Mtododepruebaparaladeterminacindecadmio4 plomo4 fierro5zincenproductosob0eto de esta norma alimentos por espectrometra de absorcin atmica.11. D6768M9-A:9;- D6 :A89?ADA= -> A@:>A;@9:A=.Principio del mtodo.#a cafe$na es e"tra$da de la muestra con cloroformo y determinada espectromtricamente a unalongitud de onda de %&' nm.1.1 E(uipo.Espectrmetro de )*+*isible disponible para utili,arse a %&' nm.-alan,a anal$tica con una precisin de .,/ mg.Materiales.Matraces volumtricos de /.. m#.Probetas de /.. m#.*asos de precipitados de %0. m#.Embudos de separacin de /%0 m#.Pipetas graduadas de / y /. m#.1. 1eactivos.Todos los reactivos deben ser grado anal$tico a menos (ue se indi(ue otra especificacin y poragua se entiende agua destilada.ulfito de sodio an2idro 34a%567Tiocianato de potasio 38947.:cido fosfrico 3;6P5m#.Disolver e"actamente /.. mg de cafe$na en cloroformo y llevar a un volumen de /.. m# con elmismo solvente.olucin de permanganato de potasio al /,0?.Pesar /,0 g de 8Mn5< y disolver en /.. m# de agua.1.#Procedimiento.1.#.1Preparacin de la curva patrn.1.#.1.1Medir los siguientes volmenes desolucinpatrn decafe$na, de acuerdo con la Tablanmero / y llevar a un volumen de /.. m# con cloroformo.Tabla 4o. /Matra, m# solucin patrn de cafe$na mg cafe$na>/.. m#/ .,.. -lanco% .,/. .,/.6 .,%0 .,%02< .,0. .,0.0 /,.. /,..' /,0. /,0.& %,.. %,..1.#.1.Determinar la absorbancia de cada una de las soluciones patrn a %&' nm.1.#.1.#Elaborar una grfica de la lectura de absorbancia para cada una de las soluciones patrnen funcin de su concentracin 3en mg>/..m#7. :!ustar la curva mediante regresin lineal 3mtodode m$nimos cuadrados7.#o anterior, puede llevarse a cabo en e(uipos (ue se programan directamente en los cuales sloes necesario leer los estndares y marcar su concentracin terica.1.#. Preparacin de la muestra.1.#..1Eliminar el gas3cuando lo contenga7 de la muestra por agitacin o con ultrasonido.1.#..Medir/.m# demuestraenunembudodeseparacinde/%0m#, adicionar0m# desolucin de permanganato de potasio al /,0? y me,clar.1.#..#Despus de e"actamente 0 minutos, a@adir /. m# de la solucin reductora y me,clar.1.#..% :dicionar / m# de solucin diluida de cido fosfrico, me,clar, a@adir / m# de solucin de2idr"ido de sodio y me,clar.1.#..( E"traer con 0. m# de cloroformo durante un minuto. De!ar separar las fases y drenar la faseinferior filtrando a travs de papel filtro. 9olectar en un matra, volumtrico de /.. m#.1.#.., :@adir de %+6 m# de cloroformo al embudo de separacin y drenar a travs del papel.1.#...#avar el papel con %+6 m# de cloroformo. E"traer nuevamente con /.. m# en la muestra.b A 5rdenada al origen.Despe!ar " y obtener directamente los mg de cafe$na>/.. m# de bebida. mg cafe$na>/.. m# A mg de cafe$na>/.. m# obtenidos de la curva D /.. D E.D. /. dondeCE.D. A Eactor de dilucin.1.( E"presin de resultados.3mg cafe$na>/.. m#. D6768M9-A:9;- D6 MA7689A 6B78ACA..1 Principio del mtodo.#a materia e"tra@a se separa de la muestra mediante flotacin o sedimentacin de acuerdo a lanaturale,a del producto y posteriormente se filtra para su identificacin al microscopio.. E(uipo.-alan,a granataria con una precisin de ../ g.E(uipo de filtracin al vac$o.Microscopio binocular estereoscpico con ob!etivos (ue pueden ser de 6, ', & y /.D y ocularesapareados de amplio campo visual de /., 6. y /..D, respectivamente.#mpara para el microscopio o lu, natural e(uivalente.Parrilla de calentamiento con agitacin magntica..# Materiales.Matra, trampa de Fildman, formado por un matra, Erlenmeyer de / o % #, provisto de una varillametlica con un tapn de mbolo de 2ule en un e"tremo.Embudo de ;irsc2 o -uc2ner para filtracin al vac$o.9a!a de Petri.Papel de filtracin rpida del nmero = rayado para conteo o rayado a lpi, con l$neas paralelas deapro"imadamente 0 mm de separacin.:gu!a de diseccin.Material de uso comn en el laboratorio..%1eactivos.Todos los reactivos deben ser grado anal$tico a menos (ue se indi(ue otra especificacin y poragua se entiende agua destilada.;eptano 39&;/'7.:cido clor2$drico 3;9l7 de 6',0 a 6=,.? de pure,a.:ceite mineral. :ceite de parafina, blanco y ligero. 9on un peso espec$fico de .,= #.%. D6768M9-A:9;-D6=E@=6- A@9M6-7>=. MF7>D>>P79M9?AD>D6M>-968&'9@@9AM=.%.1Principio del mtodo.7El mtodo mide sulfitos libres ms porciones reproducibles de sulfitos ligados, tales comoproductos carbon$licos, en alimentos.#amuestraescalentadaconcidoclor2$drico3;9l7 enreflu!oparaconvertir el sulfatoa5%3sulfitos7.El nitrgeno introducido a la solucin arrastra el 5% a travs del condensador enfriadopor agua y pasa a una solucin del ;%5% al 6? donde el 5% se o"ida a cido sulfrico 3;%5v7 y me,clar. #icuarsolo 2asta (ue el alimento pueda pasar por la !unta %ml de 4aB en la muestra- A Qg>ml de 4aB en el blanco9 A ml de aforo de la muestraD A peso de la muestra en g tomada para el anlisis,.1 ensibilidad del mtodo.,/0 Qg>ml para /? de absorcin12.. A-J@9=9= M9:8>B9>@;H9:> D6 P8>DE:7>= >BK67> D6 6=7A ->8MA..1 P8>:6D9M96-7> PA8A @A P86PA8A:9;- L D9@E:9;- D6 ME6=78A= D6 A@9M6-7>=PA8A =E A-J@9=9= M9:8>B9>@;H9:>...1.1 LntroduccinEsta proporciona las gu$as generales para la preparacin de diluciones para el e"amenmicrobiolgico de alimentosy bebidas. En vista de la gran cantidad de productos en este campo deaplicacin, estas gu$as pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y para otrosre(uerirseotrosmtodosdiferentes. inembargo, entodosloscasosdondeseaposibleserecomienda apegarse a estas gu$as y modificarse nicamente cuando sea necesario.#adilucinprimariatienepor ob!etoobtener unadistribucinlomsuniformeposibledelosmicroorganismos contenidos en la muestra destinada para el anlisis.#a preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como ob!etivo reducirel nmero de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, laobservacin de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso deplacas...1. 1eactivos y materiales..1..1 1eactivos#os reactivos (ue a continuacin se mencionan deben ser grado anal$tico. 9uando se indi(ue aguadebe entenderse como agua destilada.Preparacin de reactivosolucin de 2idr"ido de sodio /,. 4E51M)#:L4H1EDLE4TE 9:4TLD:DE;idr"ido de sodio 8HA-9=M>= :>@98M6= 7>7A@6= 6- P@A:A...#.1 LntroduccinEl grupo de los microorganismos coliformes es el ms ampliamente utili,ado en la microbiolog$a delos alimentosy bebidas como indicador de prcticas 2iginicas inadecuadas.El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse paraC#a deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el mane!o y en la fabricacin de los alimentosybebidas.#a evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aun(ue su presencia nonecesariamente implica un riesgo sanitario.Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e 2iginicas del e(uipo.#acalidadsanitariadel aguay2ieloutili,adosenlasdiferentesreasdel procesamientodealimentos.#a demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede reali,arse mediante el empleode medios de cultivos l$(uidos o slidos con caracter$sticas selectivas o diferenciales...#. EundamentoEl mtodo permite determinar el nmero de microorganismos coliformes presentes en una muestra,utili,ando un medio selectivo 3agar ro!o violeta bilis7 en el (ue se desarrollan bacterias a 60O9 enapro"imadamente %< 2, dando como resultado la produccin de gas y cidos orgnicos, los cualesviran el indicador de p; y precipitan las sales biliares...#.# 1eactivos y materiales ..#.#.1 1eactivos#os reactivos (ue a continuacin se mencionan, deben ser grado anal$tico y cuando se indi(ueagua debe entenderse como agua destilada.20i+ oluciones diluyentesolucin reguladora de fosfatos 3solucin concentrada7Ermulaingredientes 9antidades Eosfato monopotsico 6/.. g multiplicar por /.....,.#. 9lculo apro"imado del 4MP y K0? de l$mite de confian,a.Debido a la in2erente comple!idad para calcular los l$mites de confian,a del 4MP lo ms comn esel uso de tablas. Heneralmente estas tablas estn limitadas al uso de 6, 0 y /. tubos por dilucin,incluso usando unmtodo aceptado, pueden presentarsedatos irregulares oaccidentes delaboratorio (ue causan prdida de / o ms tubos de dilucin. En este caso una serie de dilucionesdepore!emploC 0,34 T7/>%DondeC P es el nmero de tubos positivos, 4 es la cantidad total de muestra 3g7 en todos los tubosnegativos y T es la cantidad total de muestra 3g7 en todos los tubos.Por e!emplo, considerando (ue se tuvieran serie de diluciones al dobleCM)ET1: 3g7 4o. DE T)-5 4o. DE T)-5 P5LTL*5=/.. g y el l$mite inferior es elantilogaritmo 3+.,%67 A .,0K>g o 0K>/.. g. 9uando se compara con las tablas el 4MP podr$a ser.,6/>g con l$mites de confian,a de .,/'>g y .,0&>g.Tabla 4o. / eleccin del 4MP con un l$mite de confian,a de K0? para la prueba de fermentacinutili,ando 6 tubosC con porciones de .,/, .,./ y .,../ g 3ml7 de muestra.524o. de tubos positivos K0? de l$mite de confian,a.,/ .,./ .,../ 4MP>g 3ml7bLnferior uperior. . . 6 + +. / . 6B / /&/ . . < / %// . / &B % %&/ / . & % %=/ % . //B < 60% . . K % 6=% . / /