anvisa 2 bioequivalencia

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Director General de Inspección y Control de Medicamentos y ProductosAntônio Carlos da Costa Bezerra

Coordinación de Inspección en Centros de bioequivalenciaCláudia Franklin de Oliveira

Email: [email protected]

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Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria

Manual para una buena biodisponibilidad y

Bioequivalencia

Prácticas

Volumen II

Brasilia

2002

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Derechos reservados de la Agencia Nacional de Vigilancia SanitariaSEPN 515, edificio Omega, Bloco B, Brasilia (DF), CEP 70770502.Internet: www.anvisa.gov.br

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Copyright © 2002 Agencia de Vigilancia Sanitaria del Brasil.Se permite la reproducción total o parcial de esta obra siempre que se cite la fuente.

Primera edición 2002

ISBN: 8588233061

Agencia Nacional de Vigilancia SanitariaRealizado por: Inspección Coordinación de Centros de bioequivalencia Dirección General de Inspección y Control de Medicamentos y ProductosCoordinación General: Cláudia Franklin de Oliveira / Coordinación de Inspección enCentros de bioequivalenciaRevisión: Karla Ferreira de Araújo / Coordinación de Inspección en Centros de bioequivalenciaDivulgación: Unidad de DivulgaciónCubiertas: Oficina João Carlos de Souza Machado / Comunicación Multimedia

Arte Gráfico, composición e impresión:. Dupligráfica Editora Ltda / DF

Impreso en Brasil

Manual de boas Práticas biodisponibilidade em: bioequivalência / AgênciaNacional de Vigilancia Sanitaria. GerênciaGeral de Inspeção correoControle de Medicamentos e Produtos. Brasilia: ANVISA, 2002.

2 v.QV38

1. Terapêutica equivalencia. 2. Bioequivalência. 3. Disponibilidadebiológica. 4. Medicamentos. I. Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria.GerênciaGeral de Inspeção e Controle de Medicamentos e Produtos.

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PRESENTACIÓN

La Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria, embebido de su misión institucional, elaboró elpresente trabajo con la intención de fomentar el debate, la educación y la conducción de la clínicaestudios en Brasil.

En cuanto a los estudios de biodisponibilidad / bioequivalencia, este compendio es parte de un contexto más grandeque está destinado a encerrar la investigación clínica en su aspecto más amplio: estudios no clínicos y

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Los estudios clínicos de fase I, fase II, fase III y IV.

En la presentación de este trabajo, la Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria agradecería la contribuciónde todos los profesionales involucrados directa e indirectamente en su consolidación, y está disponible paracríticas y sugerencias que pueden contribuir para futuras ediciones, así como, para los módulos posteriores.

Dr. Gonzalo Vecina Neto

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PRÓLOGO

Varios ensayos clínicos están siendo actualmente lleva a cabo en Brasil con el objetivo de evaluar laBiodisponibilidad / bioequivalencia de los productos farmacéuticos. En junio de 2001, la Anvisa, a través de laCoordinación de Inspección en Centros de bioequivalencia unido a la Dirección General de Inspeccióny Control de Medicamentos y Productos comenzó la evaluación de dichos centros por medio de la publicacióninspecciones con el fin de asegurar la calidad de los ensayos.

Durante las actividades de inspección, originalmente para fines de orientación, la coordinación observó lala necesidad de aclarar algunos aspectos que todavía plantean cuestiones técnicas a los centros, especialmente en relación conla estandarización de los métodos de análisis, el análisis estadístico de los ensayos, el almacenamiento de armas biológicasmuestras, el confinamiento de los voluntarios y los estudios de estabilidad de los medicamentos y otros.

Cuando se identificó como requisito y en un intento de evitar perjudicar la calidad de las obrasllevado a cabo, la coordinación estimuló la creación de núcleos de discusión destinados a llevar a cabo laexplicación de todos los aspectos relacionados con la conducción de los estudios y la integración de su

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fases. Tales núcleos contaban con la participación de 40 expertos de la Farmacia, Medicina,Estadísticas y campos de la química.

Este "Manual para una buena biodisponibilidad / bioequivalencia Prácticas" fue creado bajo tal contextoy comprende seis temas principales que se presentan de una manera didáctica, tratando de aplastar a los centros 'dificultades y, como resultado, se complementan las directrices previstas en la legislación sanitaria brasileñapara la realización de ensayos.

Los núcleos de trabajo comenzaron las discusiones en septiembre de 2001. Cada núcleo se dedica a unouna de las tres fases del proceso fases clínicas, analíticas y estadísticas bajo la coordinaciónde la Dra. Cláudia Franklin de Oliveira y la colaboración inestimable de la profesora Silvia Storpirts.Durante los meses siguientes, se celebraron varias reuniones con el fin de promover debates técnicos yllegar a un consenso en torno a estos debates. En consecuencia, cada grupo preparó un conjunto de relevantestemas que deben incluirse en el manual. Todos los temas tales fueron sometidos a investigaciones cuidadosas ylos resultados que se mencionan a fin de permitir una buena comprensión de la población objetivo. La completaManual tomó 11 meses para ser terminado. Este proceso contó con la participación de alrededor de 50profesionales en total desde diversas áreas del conocimiento, incluyendo investigadores de las universidades públicas,técnicos de Anvisa y fabricantes de instrumentos y equipos de laboratorio. ANVISA esagradecido a todos sus asociados por haber contribuido a un trabajo tan excelente.

La estructura final se compone de dos volúmenes con tres módulos cada uno. El primer volumen técnicamentedetalla cada fase de los estudios de biodisponibilidad / bioequivalencia en la secuencia natural de conducción:Módulo 1: Fase Clínica, Módulo 2: Fase Analítica y Módulo 3: Fase de Estadística. El segundovolumen abarca los aspectos importantes relativos a la instrumentación y equipos de laboratorio utilizadospara llevar a cabo la fase analítica y considerado como crítico para el proceso. En ese volumen, Módulo 1se refiere a los principios y el funcionamiento de Micropipetas, Módulo 2 se refiere al agua, fuente de Química

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Los análisis instrumental y el contenido del Módulo 3 se relaciona con el Visible UltravioletaEspectrofotometría, cromatografía líquida (LC), cromatografía de gases (GC), cromatografíaLos sistemas conectados a detectores de masas y comprobación de Instrumentación Analítica rendimiento.

Vale la pena subrayar el carácter internacional de la novedad de la recopilación de información de variossujetos en un solo compendio encaminadas a sintetizar todos los aspectos relacionados con la BuenaBiodisponibilidad / Bioequivalencia Prácticas.

Es evidente que el principal objetivo de este trabajo es mejorar la calidad de la Biodisponibilidad /Los ensayos de bioequivalencia llevaron a cabo en Brasil y, como resultado, contribuir a la calidad de los medicamentos genéricosdisponible en el mercado al ofrecer subsidios técnicos ampliamente estudiados y cuidadosamente preparados. ConDesde esta perspectiva, esperamos contribuir a capacitar a los Centros de biodisponibilidad / bioequivalencia, enAdemás de desarrollar los monitores de estudio para la industria farmacéutica nacional y ayudar en elformación de agentes multiplicadores del conocimiento en las universidades brasileñas.

La preparación de este manual fue sólo posible gracias a la labor crucial de varias personas. YOle gustaría pedir disculpas de antemano por posiblemente olvidando cualquier nombre. Los editores José PedrazzoliJúnior (USF / Unifag) y João Antônio Saraiva Fittipaldi (Pfizer) eran esenciales, así como lacooperadores Fernanda Maria Villaça Boueri (Anvisa), Eliana Regina Marques Zlochevsky (Anvisa),Cláudia Simone Costa da Cunha (Ministerio de Salud) y Beatriz Helena Carvalho Tess (Ministeriode Salud), para la Fase Clínica módulo; el editores Cláudia Franklin de Oliveira (GGIMP / Anvisa),Rui Oliveira Macedo (UFPA), Flávio Leite (T & E Analítica) y Pedro Eduardo Froehlich (UFRGS),y la cooperadores Pedro de Lima Filho (GGMEG / SP), Davi Pereira de Santana (UFPE), RafaelEliseo Barrientos Astigarraga (Cartesius), Silvana Calafatti de Castro (Unifag), Thaís Reis Machado,

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Jaime Oliveira Ilha (Cartesius), Itapuan Abimael Silva (Anvisa), Karen Noffs Brisolla (Anvisa), MarceloCláudio Pereira (Anvisa), para la fase analítica módulo; los editores Arminda Lucia Siqueira(UFMG), Chang Chiann (GGMEG / SP), Cicilia Yuko Wada (Unicamp), Karla Ferreira de Araújo(Anvisa) y Gilberto Bernasconi (USF / Unifag), y los cooperadores Reinaldo Charnet (Unicamp)y Renato Almeida Lopes (Anvisa), para la Fase de Estadística módulo; los editores Melissa M. Silva(Nova Analítica) y Walter Pereira (Nova Analítica), los principios y el funcionamiento de Micropipetas;el editor José Muradian Filho (Millipore), Agua para análisis clínicos; los editores Ivan Jonaitis(Agilent), Renato García Peres (Flowscience), Ricardo Lira (Flowscience), Renato Gouveia, JoséAparecido Soares (Varian), Josué DMNeto (Sinc Brasil) JuarezAraújo Filho (Sinc Brasil), AlexandreRosolia (Waters), Adauto Silva (Varian) y Reinaldo Castanheira (Agilent), AnalíticaInstrumentación; y el equipo de coordinación integrado por Cláudia Franklin de Oliveira (GGIMP /Anvisa), Marcelo Cláudio Pereira (GGIMP / Anvisa), Max Weber Marques Pereira (GGIMP / Anvisa),Karla de Araújo Ferreira (GGIMP / Anvisa), Karen Noffs Brisolla (GGIMP / Anvisa), Itapuan Abimaelda Silva (GGIMP / Anvisa) y Renato Almeida Lopes (GGIMP / Anvisa).

Dr. Gonzalo Vecina Neto

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Volumen II Módulo 1 Micropipetas: Principios y Operación

Editores:

• Melissa M. Silva Nova Analítica

• Valter A. Pereira Nueva Analítica

Coordinación:

• Cláudia Franklin de Oliveira ANVISA

• Itapuan Abimael da Silva ANVISA

• Karen de Aquino Noffs Brisolla ANVISA

• Karla de Araújo Ferreira ANVISA

• Marcelo Cláudio Pereira ANVISA

• Max Weber Marques Pereira ANVISA

• Renato Almeida Lopes ANVISA

PERSONAL TÉCNICO

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RESUMEN

1. DEFINITION ................................................................................................................................... 5

1.1. Tipos de pipettes........................................................................................................................... 5

PRINCIPIO 2. FUNCIONAMIENTO .............................................................................................................. 6

2.1. Desplazamiento de aire pipettes............................................................................................................. 6

2.2. Desplazamiento positivo pipettes..................................................................................................... 8

3. FUNCIONAMIENTO TECHNIQUE......................................................................................................... 11

3.1. Cómo almacenar la pipeta ........................................................................................................... 11

3.2. El ajuste del volumen ..................................................................................................................... 11

3.3. Tipguarnición ..................................................................................................................................... 12

3.4. Preenjuague de la punta .................................................................................................................. 13

3.5. Aspiration..................................................................................................................................... 13

3.6. Dispensing.................................................................................................................................... 14

3.7. Consejos ejection................................................................................................................................. 14

4. TIPS...................................................................................................................................................... 15

4.1. Consejos para el desplazamiento de aire pipettes............................................................................................. 15

4.2. Consejos para pipetas de desplazamiento positivo ............................................. ....................................... 15

5. MANTENIMIENTO ............................................................................................................................. 16

5.1. Cleaning........................................................................................................................................ 16

5.2. Regiones replacement........................................................................................................................ 17

5.3. La comprobación del rendimiento ................................................................................................................ 20

6. SUGERENCIAS DE PROCEDIMIENTO ............................................. ............................................... 21

7. ANEXO I: EJEMPLO DE PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA ...................................... 22

7.1. Disassembling.............................................................................................................................. 22

7.2. Cleaning........................................................................................................................................ 23

7.3. Assembling................................................................................................................................... 23

8. ANEXO II: Norma de Desempeño VERIFICACIÓN .............................. 24

8.1. General ......................................................................................................................................... 24

8.2. Condiciones de la sala de pruebas ............................................................................................................ 24

8.3. Operador ....................................................................................................................................... 25

8.4. Consejos ............................................................................................................................................... 25

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8.5. El equipo utilizado en el test........................................................................................................ 25

8.6. La comprobación procedure............................................................................................................. 27

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9. ANEXO III: Procedimientos de descontaminación ........................................... . 38

9.1. Química ..................................................................................................................................... 39

9.2. Microbiología y celular culture.................................................................................................... 40

9.3. La biología molecular ....................................................................................................................... 41

9.4. Métodos espectro de action..................................................................................................... 44

9.5. Ventajas y desventajas ............................................... .................................................. . 45

9.6. El tratamiento en autoclave .................................................................................................................................. 46

9.7. UV irradiation.............................................................................................................................. 46

9.8. Químico solutions...................................................................................................................... 46

10. ANEXO IV: DEFINICIONES ............................................ ............................................... 50

11. Glosario y abreviaturas ............................................. ........................................... 51

12. Referencias .................................................................................................................................. 52

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Volumen II / Módulo 1 Micropipetas: Principios y Operación

1. DEFINICIÓN

Pipetas de émbolo que funcionan con equipos utilizados para aspirar y dispensar volúmenes específicos de los líquidos.Las pipetas monocanal tienen un solo pistón. Las pipetas multicanal tienen simultáneamentevarios recipientes. Las pipetas pueden ser para dispensar un cierto volumen de dado o volúmenes ajustados de fábricaseleccionado por el usuario dentro de un rango de volumen específico, por ejemplo, entre 10 l y 100 l. Pistónpipetas operadas pueden ser de dos tipos: de desplazamiento de aire y de desplazamiento positivo.

1.1. Tipos de pipetas

Las pipetas pueden ser diseñados como sigue:

En cuanto el volumen:

Volumen fijo, diseñado por el fabricante para dispensar sólo su volumen nominal, por ejemplo,100 pl.

La variación de volumen, diseñado por el fabricante para dispensar volúmenes seleccionados por el usuario dentro deun rango de volumen específico.

En cuanto el pistón:

Puede haber una capa de aire entre el pistón y la superficie del líquido (pipetas de desplazamiento de aire). El pistón está en contacto directo con el líquido (desplazamiento positivo o desplazamiento directo

pipetas). El capilar y el pistón pueden ser reutilizables o desechables.

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PRINCIPIO 2. FUNCIONAMIENTO

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La punta de plástico o de vidrio está acoplado a la pipeta. Con el pistón en el límite inferior (aspiración inferiorposición), que moje la punta en el líquido que se va a transferir. Cuando el pistón se mueve hacia arriba a la parte superiorposición de aspiración, se extrae el líquido. El volumen de líquido se dispensa cuando se empuja el pistónde nuevo a la posición inferior.

El principio de funcionamiento se detalla a continuación de acuerdo con el tipo de pipeta (desplazamiento de aire ode desplazamiento positivo).

2.1. Pipetas de desplazamiento de aire

Cuando se pulsa el botón de una pipeta de desplazamiento de aire, el pistón situado dentro del equipomueve hacia abajo y desplaza el aire en contacto con ella fuera de la pipeta (el volumen de aire expulsado esigual al volumen situado en la pipeta). El volumen de aire que queda dentro de la pipeta es inversamenteproporcional al volumen de la muestra: cuanto menor es el volumen de aire dentro de la pipeta, mayor es lavolumen de líquido que se extrae.

a) Ajuste de volumen (válido para las pipetas de volumen variando solamente)

El usuario ajusta el volumen deseado. El pistón se mueve a la posición apropiada.

Observaciones: En las pipetas de volumen fijo, este posicionamiento se proporciona en la fábrica.

Volumen seleccionado,por ejemplo, 100 ml

Zona de llenadocon el aire

Punta

Pistón

Posición del pistón después de volumenajuste

Titular Cono

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b) Preparación para la aspiración

Se pulsa el botón. El pistón se mueve hacia abajo y expulsa un volumen de aire igual a la seleccionadavolumen (en pipetas de volumen fijo, el volumen de aire expulsado es igual al volumen nominal de lapipeta).


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c) la aspiración de líquidos

Sumerja la punta en el líquido hasta que se sumerge el taladro. Al soltar el botón, los rendimientos de pistóna la posición inicial y un vacío parcial se forma en el interior de la pipeta. La presión atmosféricaobliga a la entrada de líquido a través del orificio de la punta.

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El pistón se mueve a lalímite inferior

Volumen de aire expulsado(Igual al volumen seleccionado)

Taladro Sugerencia sumergidaen el líquido

El pistón vuelve a laposición inicial

Vacío parcialestá formado

Volumen delíquido dibujado

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d) de dispensación de líquido

Se vuelve a pulsar el botón. El pistón se mueve hacia abajo desplazando el aire y aumenta la pipetapresión interna. El aire comprimido expulsa el líquido de la punta.


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e) Segunda etapa

En algunas pipetas de desplazamiento de aire, el pistón puede ser desplazado justo debajo del límite inferior (por lo tantodesplazando una cantidad adicional de aire), lo que permite la expulsión de las últimas gotas de líquido. La mayor partetérmino común empleado por los usuarios de este desplazamiento adicional es "segunda etapa".

2.2. Pipetas de desplazamiento positivo

Las pipetas de desplazamiento positivo funcionan como una jeringa. No hay volumen de aire entre el pistón yel líquido. Puesto que no hay aire para contraer o expandir, la fuerza de aspiración es siempre constante epermanece sin modificaciones en las propiedades físicas del líquido sean manipuladas. Este tipo de equipoes ideal para la manipulación de líquidos viscosos o de alta densidad.

Contenedor de destino

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b) Preparación para la aspiración

a) Ajuste de volumen

El usuario ajusta el volumen deseado. El pistón se mueve hacia abajo a la posición inicial.


Volumen seleccionado,por ejemplo, 100 μ L Titular Cono

Capilar

Pistón

Posición inicial

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Se pulsa el botón. El pistón se mueve hacia abajo hasta el extremo del capilar.

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c) la aspiración de líquidos

El orificio capilar está sumergido en el líquido. Al soltar el botón, el pistón se mueve hacia arribay la presión ambiente obliga a la entrada del líquido a través del orificio capilar.

d) de dispensación de líquido

Se vuelve a pulsar el botón. El pistón se mueve hacia abajo y expulsa el líquido fuera del capilar.


Capilar sumergido

Pistón en la posición inicial

Volumen extraído

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Contenedor de destino

Volumen dispensado

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TÉCNICA 3. FUNCIONAMIENTO

Una buena técnica de pipeteo es esencial para asegurar buenos resultados. Una secuencia de comandos en algunos aspectos de latécnica para ser considerado durante la operación se mostró siguiente.

3.1. Cómo almacenar la pipeta

La pipeta debe ser almacenado en la posición vertical por dos razones:

Evita que entre en contacto con las superficies que pueden estar contaminadas, por ejemplo, el trabajobanco (al colocar la pipeta en el banco o en un mueble con cajones, los contaminantes pueden sertransferida al cuerpo del instrumento y posteriormente transferido a la experimento).

Si los consejos no son expulsados y si una cantidad residual de líquido permanece dentro de los consejos, este líquidopuede entrar al instrumento cuando la pipeta se establece, contaminando y dañandolas partes internas y / o el soporte de cono.

Ejemplos de soportes:


3.2. El ajuste del volumen

Con el fin de evitar un error de paralaje, el volumen debe ser ajustada con la pipeta en la horizontalposición. Si el operador prefiere ajustar el volumen con la pipeta en posición vertical,uno de los ojos deben estar cerrados.

Cuando se reduce el volumen, alcanzar cuidadosamente la cantidad deseada y no superar la marca.

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Al aumentar el volumen, superar la cantidad deseada por 1/3 de un ciclo y luego cuidadosamentereducido el volumen hasta que se alcanza la cantidad deseada. No superar la marca.

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3.3. Tipguarnición

La punta está equipado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, asegurando así un cierre hermético adecuadoentre la punta de la pipeta y el soporte de cono.

Observación: Sello significa un anillo opaco formado alrededor de todo el collar de la extremidad, lo que indica una conexión perfectaentre el soporte de cono y la punta. Un sello incompleta dará lugar a resultados imprecisos.

Se dan algunas sugerencias para el montaje de los siguientes consejos:

consejos sueltos:

Mantenga la punta de su collar (tenga cuidado de no tocar el extremo) y colóquela en el soporte de cono. Presione la puntacontra el soporte de cono siguiendo un movimiento de rotación, como se indica en la figura siguiente. Esteasegura una conexión perfecta entre la punta y el soporte del cono (el sello mencionado anteriormente esformado).

Consejos sobre bastidores:

Montar el soporte de cono en la punta y pulse la pipeta hacia abajo byfollowing un movimiento de rotacióncomo se indica en la figura.


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Multicanal apropiado:

Para un ajuste simultáneo en todos los canales, la posición de los soportes para cucuruchos en los cuellos de punta. Haga una Toy de movimiento como se muestra en la figura, asegurando así una conexión adecuada de todos los consejosen todos los canales.

3.4. Preenjuague de la punta

Cuando se coloca una nueva punta (o cuando se aumenta el volumen que se extrae), es necesario para preservarenjuague la punta. Para ello, acaba de dibujar y entregar el líquido un par de veces.

El preenjuague de la nueva punta asegura la exactitud y precisión del volumen a ser posteriormentetransferido. Esto es porque una película se forma en la pared interior de punta en la elaboración de un líquido. Lala naturaleza de esta película, que causa un error en la primera medición, depende en el ser líquidatransferido. Sin embargo, esta película se mantiene relativamente constante después de algunas operaciones de pipeteado utilizandola misma punta. Es necesario preenjuague la punta con el fin de maximizar el rendimiento de las pipetas.

3.5. Aspiración

La aspiración debe ser lenta y constante, manteniendo siempre la misma profundidad de inmersión de la punta(Durante la aspiración y entre las muestras). Se recomienda que la profundidad de inmersión esalrededor de 2 a 3 mm por debajo de la superficie del líquido. Algunos fabricantes sugieren que la profundidad de inmersióndebe variar de acuerdo con el volumen de trabajo, tal como se describe en la tabla siguiente:

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La pipeta debe mantenerse en posición vertical durante la aspiración completa. Espere 1 a 2segundos antes de retirar la punta del líquido. Si las gotas de líquido aún permanecen fuera de la punta, limpiausando papel suave (si la metodología lo permite). Tenga cuidado de no tocar el taladro de punta.

3.6. Dosificación

Toque el extremo de la punta en la pared interior del recipiente y la inclinación de la pipeta de aproximadamente 30 ° a45 °;

Presionar continuamente el botón hasta el final de la primera etapa. Espere algunos segundos (de 1 a 3 dependiendo de la viscosidad del líquido) y después pulse el botón hasta que la segunda etapa (purga) aeliminar las gotas que puedan haber quedado en la punta;

Mantenga pulsado el botón hasta el final. Retire la pipeta del envase manteniendo la punta entoque con la pared interior del recipiente ("cero" el extremo de la punta en la pared interior del recipiente).

3.7. Consejos de eyección

Deseche la punta presionando el botón eyector consejos; Tomar todas las precauciones necesarias cuando se trabaja con materiales contaminados y / o radioactivos.

El procedimiento adecuado debe ser definido por el laboratorio de acuerdo con el tipo de materialpipeteado, teniendo la seguridad de los usuarios y el lugar de trabajo en consideración.

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4. CONSEJOS

La calidad de los resultados se ve directamente afectada por la calidad de la punta utilizada. Buenos resultados no requierensólo consejos de buena calidad, sino también consejos que son más apropiadas para el modelo y la marca de la pipetautilizado.


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4.1. Consejos para pipetas de desplazamiento de aire

El fabricante debe indicar que la marca de la punta el usuario debe emplear para cumplir conlas especificaciones indicadas en el manual de uso de la pipeta.

Las puntas de plástico para pipetas de desplazamiento de aire se deben utilizar dispuesta después de su uso.Estos consejos no deben limpiarse ni reutilizarse, ya que sus características metrológicas no pueden serasegurada.

4.2. Consejos para pipetas de desplazamiento positivo

El fabricante debe indicar que la marca de la punta el usuario debe emplear para cumplir conlas especificaciones indicadas en el manual de uso de la pipeta.

El ajuste entre el pistón y el capilar (sellado perfecto entre el capilar y elpistón), así como el desplazamiento del pistón en el interior del capilar, debe ser óptima para asegurar unaincluso dispensación del líquido dibujado.

Estos consejos pueden ser reutilizados o eliminados (al cambiar la punta, el capilar y el pistón debeser cambiado de forma simultánea).

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5. MANTENIMIENTO

Este capítulo cubre tres pasos esenciales del procedimiento de mantenimiento: limpieza, cambio depiezas y la comprobación del rendimiento.

OBSERVACIÓN

Es necesario adaptar la información de este capítulo en el manual de instrucciones del fabricante.En particular, los siguientes aspectos deben ser considerados:

Pedido de si las partes que figuran en el presente documento pueden ser lavados; Montaje y procedimiento de la pipeta desmontaje; ¿Cómo cambiar las piezas dañadas;


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Pedido de si cualquiera de estos procedimientos alteran la calibración de pipetas.

Si lo hacen el cambio, es necesario verificar el funcionamiento del instrumento (ver anexo II) eocasionalmente ajustar el equipo (de acuerdo con las instrucciones del fabricante).

5.1. Limpieza

Es necesario para crear una rutina de limpieza y la inspección de las partes de la pipeta. Así que la mejorLos resultados son siempre alcanzado, las partes de pipetas tienen que estar en buenas condiciones de funcionamiento. Hay dosdiferentes situaciones que requieren diferentes procedimientos de limpieza:

a) limpieza "Standard"

Los aerosoles formados durante el pipeteado se asientan en el interior de la pipeta, perjudicando así su funcionamiento normal.Además de obstruir el orificio de soporte de cono y poner en peligro el desplazamiento de aire dentro de la pipeta, estoasentamiento puede dañar las partes internas, por ejemplo, el pistón (que conduce a arañazos o corrosión). Enambos casos, la pipeta no funcionarán en el cumplimiento de las especificaciones.

Con el fin de evitar esta situación, las partes internas de la pipeta (soporte de cono, eyector, el pistón, el sello yjunta tórica) debe ser limpiado. Siga el procedimiento recomendado por el fabricante. Adjunto Idescribe un ejemplo de un procedimiento de limpieza.

La limpieza es la principal herramienta para permitir a los usuarios a extender la vida de la pipeta y asegurar resultados confiables.No hay horario de limpieza a ser adoptado por el laboratorio (esto dependerá del tipode material manipulado, la rutina a la que se somete la pipeta, el número de usuarios de lamisma pipeta y errores aceptables para el procedimiento). Con el fin de asegurar resultados fiables, laspipeta debe ser sometido a pruebas de rendimiento, además de ser limpiado con frecuencia(Anexo II).

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b) Pipetear utiliza para el manejo de materiales ácidos o corrosivos

Las condiciones de pistón interfieren directamente con las especificaciones de pipeta. Si se raya el pistón ocorroído, no se cumplen los estándares de exactitud y precisión. Materiales de ácido (por ejemplo, sulfúricoácido, ácido clorhídrico, ácido nítrico, fenol) o materiales corrosivos (por ejemplo hidróxido de sodio,disolventes clorados) pueden dañar el pistón. Un pistón dañado conduce a resultados poco fiables.

Con el fin de evitar daños en el pistón, se recomienda limpiar las partes de pipeta después de manipulareste tipo de líquido.

Contrariamente al procedimiento descrito en el punto "a", esta limpieza no requiere el uso de un producto químicoagente. El agua destilada debe ser suficiente.

• Desmontar la pipeta de acuerdo con las instrucciones del fabricante.• Vierta agua destilada en las siguientes partes: eyector, soporte de cono, el pistón y juntas de pistón.• Deje que se seque a temperatura ambiente o en un horno de hasta 40 °.• Montar la pipeta de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

OBSERVACIONES Certificar que dichas partes se pueden lavar y si este procedimiento afectarán su calibración (que

es decir, si es necesario seguir el procedimiento de comprobación de rendimiento justo después de la limpieza).


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El procedimiento descrito en el punto "b" anterior está especialmente indicado para pipetas con metálicopistón. Para pistones hechos de otros materiales (vidrio, plástico, cerámica) el uso de grasa de silicona parafines de sellado es común. Por lo tanto, se recomienda verificar y seguir los procedimientos específicoscontenida en el manual.

5.2. Sustitución de piezas

Algunas partes de la pipeta tienen que ser reemplazados periódicamente, ya que se desgastan y interfieren directamentecon el rendimiento de las pipetas.

5.2.1. Juntas de pistón

Esta parte o partes proporcionan un sellado entre el pistón y el soporte de cono (parte superior). Conuso, microvellosidades se forman en la superficie de estas partes y el sellado se vuelve imperfecta, por lo tantomenoscabar la precisión del instrumento. Estas partes deben ser cambiadas una vez al año (véase la sustituciónprocedimiento en el manual del fabricante).

5.2.2. Titular Cono

Otro punto importante es el sellado de la zona de contacto entre el soporte de cono y la punta. Con eluso, la superficie de soporte de cono lleva a cabo en la parte de la punta de ajuste y el contacto entre ellasse vuelve insuficiente y perjudica la medición (pérdida de precisión). Se requiere reemplazo

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siempre que la parte de la punta de ajuste se lleva a cabo o en caso de daño parcial (roto, raspado). Compruebe enel manual del fabricante si el procedimiento afecta a la calibración del instrumento.

5.2.3. Otras partes

Otras partes interfieran con la pipeta rendimiento. Un procedimiento de comprobación muy simple se describeabajo para ayudar a reconocer las partes dañadas. Algunos procedimientos se deben seguir segúnel manual del fabricante (por ejemplo: el desmontaje, montaje). Destacamos de nuevo laimportancia de certificar si es necesario volver a calibrar la pipeta después de uno de estos procedimientos(Esta información se puede encontrar en el manual del fabricante).

1er PASO: ASPECTO GENERAL


Barra de Operaciones

Volúmetro

Titular Cono

Botón

Botón eyector

Consejos eyector

Punta

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• Verifique que no hay ningún defecto aparente.

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2º PASO: PRUEBAS DE FUNCIONES

• Gire el volúmetro plenamente con el fin de ir a través de la gama completa volumétrica de la pipeta.Verificar si los volúmenes mínimos y máximos ajustables coinciden con el volumétrica realgama de la pipeta.

Los problemas y las causas:

El ajuste no es posible Pipeta en autoclave *Ajuste de volumen incorrecta ajuste incorrecto o ensamblar de la volúmetro


* Algunas pipetas pueden ser esterilizados en autoclave, otros no pueden. Consulte el manual del fabricante.

• Con la volúmetro fijado en el valor máximo especificado para el modelo de pipeta, pulse el botóntotalmente para verificar la facilidad de movimiento, sentir obstrucciones ocasionales o variaciones de fricción quepuede causar daños, como la corrosión del pistón o la barra de operaciones torcida. Escucha la primaverael ruido que puede indicar su posición incorrecta.

Los problemas y las causas:

Movimiento desigual Daños del anillo de fricciónLa falta de desplazamiento La barra de operaciones está torcidaMovimiento inapropiado Corroída, pistón sucio o rayado

• Colocar una punta en la pipeta y presione el botón de sugerencias eyector para verificar la eficacia de la inyección.

La falta de movimiento El daño del mecanismo de eyecciónAjuste indebido de la punta Mala colocación del expulsorEliminación Difícil Corrosión

3er PASO: PRUEBAS DE FUGA

Para pipetas que tiene un volumen máximo por encima de 200 l, ajuste el volumen en el valor máximo ysacar agua para llenar la punta de la pipeta. Observe la punta durante 20 segundos. Una gota en el extremo de la puntasignifica la ocurrencia de fugas. Esto también es cierto para pipetas con gamas de volumen por debajo de 200 l;

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para este rango de volumen, sin embargo, el siguiente procedimiento debe ser adoptado: después de observar lapresencia de una gota por 20 segundos, sumergir el extremo de la punta en el agua en el recipiente. El nivel de aguadentro de la punta no debe ser cambiado. La presencia de fugas se confirma si el nivel disminuye.

La causa de las fugas puede ser:• Juntas de pistón dañados;• rasguñada o pistón corroído;

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• Química o daños mecánicos en el soporte de cono en la parte de la punta de ajuste;• Uso de los consejos no recomendados por el fabricante (véase el capítulo 4).

4º PASO: DESARMAR

Este proceso debe adoptarse en caso de cualquier fuga en el paso 3. Al desmontar la pipeta,se puede evaluar las partes internas y averiguar la causa del problema (pistón dañado, falta odeterioro de los sellos, etc.) y definen qué se deben reemplazar partes. Un ejemplo de desmontajerutina adoptado para ciertos modelos de pipetas se mostró a continuación. Asegúrese de seguir el fabricante deinstrucciones para desmontar y montar la pipeta.

Tire hacia abajo y retire el expulsor de puntas (en algunos modelos, el eyector no es desmontable); Retire la tuerca de conexión; Retire con cuidado el pistón; Verifique que la superficie del pistón (si está corroído y / o rayado), así como los sellos.

5º PASO: MONTAJE

Montar la pipeta de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

OBSERVACIÓN

Le recomendamos los pasos 1 a 3 para llevar a cabo todos los días antes de comenzar el trabajo y grabado para elde control del laboratorio. Si se detectan anomalías, llevar a cabo los pasos 4 y 5.

Algunas partes pueden ser modificados por el propio usuario sin comprometer la calibración del instrumento.Tras el cambio de algunas otras partes, es necesario comprobar la calibración del instrumento yocasionalmente ajustarlo. Esta información está contenida en el manual de instrucciones de pipeta.

5.3. La comprobación del rendimiento

Además de las partes de limpieza y procedimientos de reemplazo, el usuario tiene que verificar la pipetarendimiento con el fin de asegurar mediciones confiables. Tal comprobación analiza tanto la exactitud(Error sistemático) y la precisión (error aleatorio).

La comprobación de rendimiento, de hecho, evalúa la pipeta set + punta + operador (técnica de pipeteo).Con el fin de llegar a resultados de pruebas fiables, el operador debe estar capacitado y calificado (técnica de pipeteodescriben en el capítulo 3) y los consejos deben ser los recomendados por el fabricante de la pipeta.

El usuario debe definir una programación para probar las pipetas con base en: requisitos en términos deexactitud y precisión, frecuencia de uso, número de usuarios de una misma pipeta, el número de ciclos enque se usa la pipeta y la naturaleza de los líquidos pipeta. En el anexo II, se describe lamétodo gravimétrico para evaluar el desempeño pipetas (Referencia norma ISO / FDIS 8655 pistón


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aparatos volumétricos operado Parte 6 Métodos de ensayo gravimétricos).

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6. SUGERENCIAS DE PROCEDIMIENTO

• pipetas de émbolo que funcionan con equipos para la elaboración y dispensación de volúmenes específicos de los líquidos.• Con el fin de asegurar la fiabilidad de los resultados, es necesario implementar la siguiente rutina:

Comprobación del aspecto general, las pruebas de las funciones y las pruebas de fugas (pasos 1, 2 y 3)descrito en el punto 5.2.3. en el presente documento. Si las anomalías se encuentran fuera, siga los pasos 4 y 5 de lamismo procedimiento.

La limpieza periódica de las piezas de la pipetaLa periodicidad de limpieza debe establecerse en función de la frecuencia de uso, númerode usuarios de una misma pipeta, el número de ciclos en los que se utiliza la pipeta y la naturaleza delos líquidos con pipeta. Recomendamos laboratorios para seguir el procedimiento de limpiezacada tres meses (si la suciedad se acumula en estos tres meses, reducir los intervalosentre cada procedimiento de limpieza). Es muy importante para el laboratorio para grabar laprocedimientos de limpieza; dichos registros deberán contener el número de serie de la pipeta, fecha limpiezay el procedimiento utilizado.

Sustitución de piezasLas juntas de pistón deben ser reemplazados anualmente (si el número de ciclos de pipeteado exceda100.000, los sellos deben sustituirse en un plazo de tiempo más corto que ser estimado por ellaboratorio de rutina). El soporte de cono debe ser reemplazado cada 2 años o cuando el consejo:parte de ajuste se lleva a cabo. Tales reemplazos deben registrarse (registro debe contenerel número de serie de la pipeta, fecha de sustitución y la información sobre la parte nueva lote o elnúmero de venta). Piezas que afectan el rendimiento de la pipeta (por ejemplo: pistón, volumeter, varilla)reemplazo o reparación que requiere deberán ser remitidas a la asistencia técnica especializada; latrabajos de reparación debe ser debidamente registrado, además de la nueva calibración de la pipeta.

Controlar periódicamente el rendimiento de las pipetas (exactitud y precisión) como se describe en el archivo adjuntoII. Esta verificación debe hacerse cada 3 meses y debidamente registrado (ejemplo grabaciónEn el anexo II punto 8.6.5. en el presente documento). Los errores máximos encontrados pueden ser hasta dos veces más altaque los errores definidos en las tablas 1 y 2 en el presente documento (anexo II, punto 8.6.4.). Al reemplazarpartes que afectan a la calibración de pipetas, el procedimiento de comprobación se debe seguir (ver punto"Sustitución de piezas" más arriba).

Pruebas de OperadorDado que la técnica de operación es crucial para obtener buenos resultados, es necesario para probar ygrabar técnica de pipeteo del operador. Para ello, utilizando un equipo que opera dentro dellas especificaciones del fabricante, realizar 10 mediciones con el mínimo máximo evolumen especificado para ese modelo de pipeta. Evaluar la exactitud y precisión de lamediciones obtained.The errores máximos encontrados deben ser hasta el doble de los valores especificadosEn los cuadros 1 y 2 en el presente documento (anexo II, punto 8.6.4.). Registrar datos en un informe (un ejemplo esEn el Adjunto II punto 8.6.5.) la identificación del operador de la prueba.

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7. ANEXO I: EJEMPLO DE PROCEDIMIENTO DE LIMPIEZA

El ejemplo siguiente se puede utilizar para varios modelos de pipeta, en particular los que tienen un metálicapistón sin grasa; para otros modelos, se requiere una adaptación. Siga el fabricante deinstrucciones contenidas en el manual del usuario. Asegúrese de certificar que los pasos descritos en este documento noponer en peligro la calibración de pipetas.

¡Advertencia! No mezcle partes de una pipeta con partes de otro pipeta

7.1. Desmontaje

Es necesario desmontar la pipeta para la limpieza (use guantes cuando el riesgo de contaminación esinvolucrados). Un esquema general de las partes pipetas se mostró a continuación:

LISTA DE PIEZASLas figuras 1 y 2

La BotónB ManejarC Titular ConoD Consejos eyectorE PuntaF Tuerca de conexión

G y H Juntas de pistón

Observaciones: Este esquema puede tener variaciones de acuerdo con el modelo y la marca de la pipeta. Paraobtener más detalles, consulte el manual del fabricante.

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Retirar el eyector puntas (D) tirando de él; Desconectar la tuerca de conexión (F) separando así el cuerpo de la pipeta (B) del soporte de cono

(C); Retire el pistón establecer cuidadosamente y separar las juntas de pistón (G y H), manteniendo el cono

titular con la mejor parte de abajo.


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Las juntas de pistón son capturados con frecuencia dentro del soporte del cono. Para eliminarlos, coloque el pistónnuevo y presionarlo contra el soporte de cono como si usted está pipeta. Al retirar el pistón, elprecintos se adjuntan a la misma.

7.2. Limpieza

Coloque el soporte de cono, el conjunto de pistón, el eyector consejos, las juntas (no coloque el mango) en unvaso de precipitados y completar el volumen con solución de detergente neutral 4% a 8% con agua caliente (±50 ° C);

Colocar el vaso en un baño de ultrasonidos durante unos 15 minutos (si la ecografía no está disponible,mantener el vaso de precipitados en la solución durante 40 minutos);

Deseche la solución de detergente utilizado; Lavar cada parte con agua corriente; Coloque las piezas en un recipiente limpio y lavar por última vez con agua destilada; Secar en un horno a unos 50 ° C (no sobrepasar esta temperatura) durante un máximo de 2 horas, o

deje que se seque a temperatura ambiente.

OBSERVACIONES

Use una solución de detergente neutro al 4% para la limpieza de pipetas ligeramente sucias y una solución de 8% parapipetas muy sucias.

Para las pipetas sigue sucio después del lavado, el uso de algodón humedecida con alcohol isopropílico. Ten cuidadode no dañar el pistón.

Después de utilizar la pipeta en ácido y / o soluciones corrosivas, siempre lave todas las piezas con agua destiladaagua o etanol.

7.3. Montaje

Coloque la junta y la junta tórica en el pistón por primera colocar la junta; Usando una de las manos, sujete el cuerpo de la pipeta en posición vertical y coloque el pistón; Montar el soporte de cono en el cuerpo de la pipeta; A continuación, el lugar y el hilo de la tuerca de conexión; Coloque el eyector de puntas; La pipeta está listo para su uso.

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8. ANEXO II: Verificación STANDARD

8.1. General

Este accesorio se describe el procedimiento de comprobación de rendimiento pipetas utilizando el método gravimétrico(Según la regla ISO / FDIS 8655 pistón que funciona con aparatos volumétricos Parte 6: gravimétricopruebas) .El uso de los procedimientos descritos en este método asegura el cumplimiento de la internacionalespecificaciones de exactitud y precisión.

La prueba de cumplimiento para el control de la exactitud y precisión es aplicable a cualquier pipeta (definiciones encapítulo 1). Esta prueba está en acuerdo con los estándares internacionales, analiza el sistema de pipeteo como


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conjunto: la pipeta, la punta y el operador.

El método descrito en este documento incluye un procedimiento para la corrección de las pérdidas por evaporación para la pequeñavolúmenes (por debajo de 50 l). Además, al convertir al volumen de masas obtenidos en el equilibrio,correcciones están realizados en relación con la temperatura y la presión en el momento de la prueba.

El usuario debe definir una rutina para probar las pipetas con base en: requisitos en términos de precisióny precisión, frecuencia de uso, número de usuarios de una misma pipeta, el número de ciclos en los que lapipeta se utiliza y la naturaleza de los líquidos pipeteadas. No hay ningún intervalo estandarizada entrecada uno de cheques. Es responsabilidad del usuario para definir un intervalo tal. Regla ISO / FDIS 8655define una periodicidad mínima de una vez al año.

La pipeta debe ser desmontado y montado (de acuerdo con el manual del fabricanteinstrucciones) al menos una vez al año antes de la prueba de comprobación. La pipeta debe ser manejado de acuerdoel manual del fabricante.

8.2. Condiciones de la sala de pruebas

La sala de pruebas (de laboratorio) se debe limpiar y la temperatura y humedad controlada de maneraque las condiciones de la habitación en que la verificación se llevará a cabo y la temperatura del equiposon estables y homogéneas, tanto antes como durante el procedimiento.

La pipeta y el agua utilizada en el ensayo gravimétrico deben estabilizarse en la sala de comprobacióntemperatura de al menos 2 horas antes de comenzar el procedimiento. Idealmente, la verificación debe realizarsebajo las siguientes condiciones:

1) Temperatura estable (el agua, la pipeta y habitación) entre 15 ° y 30 ° C;2) humedad relativa superior al 50%.

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8.3. Operador

8.3.1. Uso de la pipeta

Un procedimiento de pipeteado adecuada contribuye de manera significativa para la reproducibilidad de la verificaciónresultados de la prueba. Los operarios sin experiencia pueden tener fluctuaciones significativas en los resultados. Para fiableresultados, el operador debe estar debidamente capacitado y calificado. Los aspectos de técnica de pipeteo erandiscutido en el capítulo 3.

8.3.2. Entrenamiento

Un operador calificado debe tomar la prueba de cumplimiento. Si es necesario, póngase en contacto con una empresa especializada parasolicitar el programa de instrucción del explotador.

8.4. Consejos

La pipeta a ensayar debe ser manejado de acuerdo a las instrucciones proporcionadas en la operación demanual. Una vez más, con base en el manual de operación de la pipeta, certifico que la pipeta está limpio, correctamentemontado y que las puntas recomendados por el fabricante se utilizan antes de comenzar la prueba.


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Véase el capítulo 4 para obtener más detalles.

8.5. El equipo utilizado en la prueba

Para asegurar la integridad procedimiento de verificación, todos los equipos utilizados durante el procedimiento debería serverificada regularmente.

8.5.1. Equilibrio

Los balances deben ser calibrados y certificados personal byskilled con pesas certificadas bydomesticautoridades (Empresas / Instituciones acreditados por INMETRO y miembros de la Rede Brasileira deCalibração RBC ).

La legibilidad equilibrio debe ser elegido de acuerdo con el volumen seleccionado en la pipeta se está probando.

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En la práctica, el volumen nominal (seleccionable volumen más alto por el usuario) se puede utilizar para la elección de laequilibrio.

8.5.2. Otros equipos

Termómetro: máxima incertidumbre de medida de 0,2 ° C Higrómetro: medida máxima de incertidumbre de 10% Barómetro: máxima incertidumbre de medida de 0,5 kPa

8.5.3. Contenedores

Los recipientes utilizados durante el procedimiento:

Contenedor OrigenEl recipiente que contiene el agua que se utilizará en las mediciones (el volumen de un recipiente taldebería ser suficiente para todas las mediciones).

Recipiente de pesajeEl recipiente que se utiliza para la medición (para ser colocado en el platillo de la balanza de pesada).

Contenedor DisposiciónUn tercer contenedor para recoger las alícuotas no ponderado.

Especialmente para probar el volumen más bajo de la pipeta, se recomienda una relación promedio de 3: 1 ael diámetro y la altura de contenedor para los propósitos de pesaje o que el recipiente está provisto de una tapa.Algunas empresas de suministro de kits de contenedores adecuados para el ensayo gravimétrico.


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8.5.4. Agua

La prueba requiere agua destilada o desionizada. En ambos casos, el agua debe ser desgasificado (grado 3agua de acuerdo con el artículo ISO 3696) a la temperatura de la habitación en que la verificación se llevará alugar. Con el fin de evitar las fluctuaciones de temperatura del agua, utilice un recipiente origen suficientemente grande para contenerel agua para todas las mediciones.

8.6. El procedimiento de control

La comprobación de rendimiento analiza tanto la precisión (error sistemático) y precisión (al azarerror). Las condiciones, procedimientos y requisitos previamente descritos en este documento deben serimplementado con el fin de asegurar la validez de los resultados de las pruebas. Después de enjuagar la punta, realice 10carreras individuales de pesaje * para cada volumen seleccionado. Para las pipetas de volumen variable, tres diferentesvolúmenes deben ser seleccionados de acuerdo con la que se evalúa el rango de volumen del modelo. Tal

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* O el usuario puede seleccionar el número de medidas de acuerdo a las especificaciones de exactitud y precisión aceptados porsu metodología.

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volúmenes deben ser el volumen nominal (máximo), 50% del volumen nominal (Intermediovolumen) y el volumen mínimo de la gama de volumen de modelo (estos volúmenes se definen en elel manual de pipeta). Para las pipetas de volumen fijo, se emplea sólo el volumen nominal.

1. Ajuste el volumen de la prueba en la pipeta (este volumen debe mantenerse durante todo el procedimiento).2. Estimar la tasa de evaporación (para volúmenes pequeños, por debajo de 50 l). Consulte el procedimiento siguiente.3. Ejecute la prueba de comprobación: grabar las masas en el Informe de desempeño de Comprobación.4. Calcular: registrar los resultados en el Informe de Verificación de Desempeño.5. Compare los resultados con las especificaciones de exactitud y precisión mostraron en las tablas 1 y 2

(Punto 8.6.4).

Estos pasos se detallarán más adelante.

8.6.1. La estimación de la tasa de evaporación (masa media evaporó por ciclo de pesaje)

Para volúmenes inferiores a 50 l, es necesario utilizar un recipiente con tapa. El objetivo es reducir al mínimo,controlar y cuantificar la pérdida por evaporación durante el ciclo de pesaje. El uso de pinzas para la manipulacióneste recipiente es también recomendable.

La evaporación se puede estimar mediante una secuencia de cuatro simulaciones de pesaje donde el pesajeciclo se repite sin surtir el agua en el pesaje diferencia total container.The atribuidoa la evaporación se calcula y se divide por 4 para obtener la media. La gama se expresaen mg / ciclo (en caso de un solo ciclo, que debe ser expresada en mg). El manejo excesivo de laenvase debe ser evitado. El uso de pinzas para manipular el recipiente de pesada es aconsejable.

Las tasas de evaporación son por lo general entre 0.010 mg y 0.025 mg por ciclo de pesaje. Recalcularla tasa de evaporación siempre que se cambien las condiciones (temperatura, presión e humedad).

1. Añadir agua al recipiente un peso de hasta 1/3 de su volumen.2. Coloque el recipiente tapado en el platillo de la balanza.3. El uso de la pipeta, dibuje el alícuota del contenedor origen.4. Tare la balanza y retire el recipiente de pesaje de la placa (el uso de abrazaderas para

eliminación es aconsejable).5. Vierta la alícuota en el contenedor de eliminación o devolverlo al contenedor de origen. No


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dispensar en el recipiente de pesaje.6. Anote el resultado e

1.

7. Repita los pasos 3 a 8 tres veces a fin de obtener e2, e3y e

4.

8. Calcular la pérdida / ciclo: e = (e1+ E

2+ E

3+ E

4) / 4 (mg).

9. La evaporación por e ciclo (mg) debe añadirse al peso promedio antes de calcular lavolumen medio.

* O usuário pode selecionar o Número de Medidas de acordo com como Especificaciones de exatidão e Precisão aceitaspela sua metodologia.

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Un ejemplo de cálculo de la tasa de evaporación se mostró al final de este capítulo.

8.6.2. Control gravimétrico

La aspiración y dispensación técnicas se describen en el capítulo 3. Aunque varias alternativasmétodo de pipeteo son posibles, siga siempre el modo normal (modo directo, no utilice el reversomodo). Para todas las pipetas, evitar la celebración o calentar el soporte de cono con la mano durante la prueba.

Para pipetas multicanal, encajar los consejos en cada canal; sin embargo, probar cada canal individualmente.Anote los resultados para cada canal.

1. Preparación

1.1. Transferir el agua desde el recipiente de origen hasta el recipiente de pesaje a una profundidad de al menos 3mm.

1.2. Medir y registrar la temperatura del agua contenedor origen ( t1), La presión del aire y relativa

la humedad de la habitación. Si el recipiente de la balanza tiene una tapa, colocarla.1.3. Montar la nueva punta.1.4. Seleccione y ajuste el volumen a probar (este volumen no se puede cambiar durante la prueba).1.5. Preenjuague la punta dibujando una alícuota del contenedor de origen y la dispensación en la

contenedor disposición 5 veces para equilibrar la humedad del aire en el interior de la atmósfera de la pipeta.1.6. Ponga el recipiente con agua en el platillo de la balanza y de tara (m

0= 0).

2. Ciclo de Pruebas

Cada ciclo de pruebas debe tener menos de 1 minuto. Sin embargo, un ritmo constante durante la ponderaciónoperación debe mantenerse (el ritmo del ciclo y el ritmo entre los ciclos).

2.1. Colocar una nueva punta de la pipeta.2.2. Preenjuague la punta mediante la elaboración y dispensación en el recipiente disposición una vez.2.3. Dibuja el volumen a ensayar como se especifica en el capítulo 3.2.4. Si el recipiente de la balanza tiene una tapa, retírela.2.5. Dispensar el volumen de prueba en el recipiente de pesaje y reemplazar la tapa con la ayuda de la

abrazaderas.2.6. Registrar la masa m

1del volumen de prueba.

2.7. Tare la balanza.

3. Repita la prueba descrita más arriba (de la partida 02.01 a 02.07) hasta 10 mediciones (m1a

m10).

4. Después de la última medición, verifique y registre la temperatura del agua contenedor origen(T), La presión atmosférica y la humedad relativa de la habitación.


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8.6.3. Cálculos

1. Cálculo del valor promedio de temperatura

Calcula la temperatura media ( t ) de la destiladaagua (fluctuación máxima entre t

1yt

2: 0.2 ° C)

2. Cálculo del valor promedio de presión

Use la presión barométrica media ( B ) y eltemperatura media ( t ) para determinar lacorrespondiente Zfactor en la tabla.

3. El cálculo del volumen de la masa

Después de las correcciones pérdidas por evaporación (para volúmenespor debajo de 50 l), multiplicar las masas (mg) bythe Factor Zpara obtener los volúmenes (mu l).

4. Cálculo del valor promedio de volumen

Después de calcular la ponderación de volumen individual,calcular el volumen promedio (resultado expresado en l).


B = (B1+ B

2) / 2

Vyo= Z (m

yo+ E)

Vyo= volúmenes individuales (mu l)

myo= masas individuales (mg)

e = tasa de evaporación (mg)Z = factor de Z (l / mg)

t = (t1+ T

2) / 2

5. Precisión (error sistemático)

La diferencia entre el volumen medio de prueba yel volumen ajustado en la pipeta. Por volumen fijopipetas, reemplace V

scon V

o= Volumen nominal. La

exactitud puede ser expresado en mL o ...

... Como porcentaje:

es= V V

ses= Promedio de error

'V = volumen medioVs= Volumen ajustado

es= 100% (V V

s) / V

s

V i = volúmenes individualesV = volumen promedion = número de ponderaciones

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6. Precisión (error aleatorio)

La dispersión de los volúmenes dispensado alrededor de lavolúmenes dispensados promedio. También conocido (de acuerdoal contexto) como la desviación estándar, la reproducibilidado repetibilidad.

Vi = volúmenes individuales

V = volumen medio (calculado comoen el punto anterior)

n = número de medicionesSD = desviación estándar

CV = (SD / V) x 100%Como porcentaje, también conocido como coeficiente de variación(CV).

SD

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Cálculos: factor de ZZ = factor de conversión (ml / mg), t (° C) = media de la temperatura *, B = presión atmosférica (hPa)

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* Este promedio se obtiene a partir de la temperatura del agua contenedor de origen medido al comienzode la prueba (t

1) Y la temperatura del agua contenedor de origen medido al final de la prueba (t

2).

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8.6.4. Especificaciones

TABLA 1

Esta tabla de especificaciones se aplica a las pipetas de volumen de desplazamiento de aire fijos y positivapipetas de desplazamiento utilizando capilares reutilizables y pistones.

Esta tabla puede también ser utilizado para las pipetas de volumen de desplazamiento de aire variables. El nominalvolumen en estas pipetas es el mayor volumen seleccionable por el usuario y especificada por elfabricante. Por ejemplo: una pipeta con un rango de volumen especificado de 10 l a 100 l, lavolumen nominal es 100 l. Los errores máximos aceptables para el volumen nominal se aplican a todoslos volúmenes dentro del intervalo especificado: si tenemos en cuenta una pipeta con una gama de volumen de 10 l


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a 100 l, el error sistemático máximo aceptable para cualquier volumen seleccionado es de 0,8 l y lamáximo error aleatorio aceptable para cualquier volumen seleccionado es 0,3 l.

Para volúmenes intermedios a los que se señalan en la tabla, el valor absoluto de inmediato mayor de lavolumen máximo deben aplicarse los límites aceptables. Por ejemplo: para determinar el máximoerrores aceptables para 25 l, se utilizan los valores especificados para 50 l.

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TABLA 2

Esta tabla de especificaciones se aplica a las pipetas de desplazamiento positivo usando capilares reutilizables ypistones y / o pipetas de volumen fijo.

Para volúmenes intermedios a los que se señalan en la tabla, el valor absoluto de inmediato mayor de lavolumen máximo deben aplicarse los límites aceptables.


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OBSERVACIONES

El usuario puede definir los errores máximos aceptables (sistemáticos y aleatorios) en función de sumetodología.

El usuario puede comprobar con regularidad el equipo, por ejemplo, cada tres meses. Otros intervalos de tiempoentre las pruebas se pueden establecer (siempre que no excedan de un año) en base a lasiguientes aspectos: la frecuencia de uso, el número de usuarios de la pipeta, la naturaleza agresiva de lamaterial transferido, los errores máximos aceptados por el usuario.

Cuando se lleva a cabo la prueba después de que el mantenimiento de los equipos o la reparación, el máximo aceptableerrores (sistemáticos y aleatorios) deben seguir las tablas que figuran en el presente documento (tablas 1 y 2).

8.6.5. Comprobación informe procedimiento

Después de la prueba, la información tiene que ser grabada. Adjuntamos una plantilla de informe, sin embargo, el usuariopueden preparar su propia plantilla siempre que contenga la siguiente información:

Identificación de pipetas; Fecha; Condiciones de ensayo (temperatura, presión, humedad relativa); Las mediciones obtenidas para cada volumen probado; Los resultados de los cálculos '; El resultado de la comparación con la tabla de especificaciones.

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PLANTILLA:

Identificación de pipetasModelo Número de serie Consejos utilizados en el ensayo en

Identificación TécnicoEmpresa Nombre Teléfono / Correo electrónico

Técnico Nombre Teléfono / Correo electrónico

CondicionesFecha / hora de prueba Ubicación

Temperatura (° C) Humedad (%) Presión (hPa)

EquilibrioModelo Número de serie Sensibilidad

Resultados de la prueba


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COMPARACIÓN CON LAS ESPECIFICACIONES: APROBADOFALLADO

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8.6.6. Rendimiento comprobar ejemplo numérico

Ahora vamos a dar un ejemplo de los cálculos para la comprobación del rendimiento. Vamos a estar basada enuna verificación hipotético de 10 l en una pipeta de volumen de desplazamiento de aire variable.

1. Dado que el volumen evaluados es inferior a 50 l, la velocidad de evaporación debe ser determinada (punto8.6.1.).

Número de mediciones: 04 (e1, E2, E3, E4)

Tasa de evaporación media: e

2. La temperatura inicial de prueba y la presión se registran:Tyo= 21,5 ° C

Pyo= 1013

3. Diez mediciones (punto 8.6.2.) Se llevan a cabo y los resultados registrados.

e1= 0,016 e

3= 0,021

e2= 0,018 e

4= 0,017

e = (e1+ E

2+ E

3+ E

4) / 4 (mg)

e = (0.016 + 0.018 + 0.021 + 0.017) / 4

e = 0.018 mg / por ciclo

W1 = 9,84W2 = 9,90W3 = 9,91W4 = 9,86W5 = 9,87

W6 = 9,90W7 = 9,92W8 = 9,93W9 = 9,95W10 = 9,92

4. La temperatura final de prueba y la presión se registran:

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TF= 21,5 ° CPF= 1013

5. La presión y temperatura de cálculo media:

T = ( Ti + Tf) / 2T = (21,5 + 21,5) / 2T = 21,5 ° C

P = ( Pi + Pf) / 2P = (1013 + 1013) / 2P = 1,013

Estos resultados promedios de temperatura y presión se utilizarán para determinar la conversiónfactor de Z.

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6. La conversión de masa a volumen:Vi = (Wi +) x Z

Para una temperatura de 21,5 ° C y una presión atmosférica de 1013 hPa, el factor Z es 1,0032 l /mg.

7. Cálculo del valor promedio de volumen

V = (9,89 + 9,95 + 9,96 + 9,91 + 9,92 + 9,95 + 9,97 + 9,98 + 10,00 + 9,97) / 10V = 9,95 l

Análisis 8. Precisión El error sistemático EE = V VoVo es el valor establecido en la pipeta (volumen nominal). En este ejemplo, es 10μL.E = 9,9510E = 0,05 l

Error relativo E%E% = (V Vo) x 100 / VoE =% (0,05 * 100) / 10E =% 0,50%

9. Análisis de precisión (repetibilidad error aleatorio) Desviación estándar SD

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SD SD

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SD2v= 1/9 x [(9,89 9,95) 2+ (9,95 9,95) 2+ (9,96 9,95) 2+ (9,91 9,95) 2+ (9,92 9,95) 2+ (9,95 9,95) 2+ (9,97 9,95) 2+ (9,98 9,95) 2+ (10,00 9,95) 2+ (9,97 9,95) 2+]

SDv= 0,03 μ L

Coeficiente de variación CVCV = (DP / V) x 100%CV = (0,03 / 9,95) x 100%CV = 0,34%

10. Los resultados se transfieren al informe (artículo 8.6.5).

Las siguientes especificaciones para 10 l se muestran en el cuadro 1 (punto 8.6.4.):

Basta comparar los resultados obtenidos (informe) con los que se especifican en la tabla. En este caso, elpipeta probado es aprobado.

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9. ANEXO III: Procedimientos de descontaminación

Los procedimientos descritos a continuación pueden utilizarse para algunos modelos de pipeta, en particular los que tienen unapistón metálico. Por lo tanto, es esencial para leer las instrucciones del fabricante antes de aplicar cualquiera deLos métodos aquí descritos.

INTRODUCCIÓN

Este documento describe una serie de métodos para la descontaminación de la pipeta, especialmente los que tienenun pistón metálico. Tales métodos pueden ser físicos (autoclave o irradiación UV) o químicos. Conformepara el tipo de aplicación, el método de descontaminación más eficiente debe ser elegido.

Sin embargo, teniendo en cuenta el espectro de acción, así como las ventajas y desventajas de estosmétodos, llegamos a la conclusión de que el producto químico es el más eficaz. Soluciones químicas comercialesque contienen detergentes tales como desinfectantes, aseguran una descontaminación eficiente.

El método de descontaminación química es recomienda para los procedimientos de descontaminación de rutinaya que es eficaz, rápido y fácil.

Procedimiento de descontaminación

Los tipos de contaminación incluyen: a partir de la muestra para el operador, de una muestra a otra o dela muestra a la pipeta. Esto puede afectar a la seguridad del operador, la muestra y, en consecuenciael resultado experimento o, eventualmente, la pipeta.

Hay varios métodos para la eliminación de contaminantes; Sin embargo, hay algunas dudas sobresu eficiencia y compatibilidad con las pipetas.

Este documento pretende solucionar duda relacionada con el proceso de descontaminación, teniendo los diversosaplicaciones de las pipetas en consideration.Thus, diferentes campos de aplicación serán comentadas(Química, microbiología y biología molecular) y la industria química o métodos físicos discutieron.La eficiencia de un método puede ser explicado por medio de su mecanismo de acción. Cuando másque se propone un método, habrá una comparación para ayudar a elegir el más adecuado.Una vez elegido el método de descontaminación, leer los protocolos al final de este capítulo.

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El campo de aplicación


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9.1. Química

Por el simple lavado las pipetas con agua destilada elimina contaminaciones por ácidos, álcalis, tampónsoluciones o disolventes orgánicos.

Puede ser necesario para eliminar otros productos tales como aceites y grasas. Entonces, el uso de detergentesse requiere. Los detergentes (tensioactivos aniónicos) son moléculas orgánicas que tienen un extremo polar hidrófiloy un extremo hidrófobo no polar. Debido a su estructura, convierten los residuos insolubles (grasa, paraejemplo) en los residuos solubles, por lo tanto, convertirse en agentes de limpieza eficaces.

9.1.1. Procedimiento estándar de limpieza (para más detalles, véase el anexo I)

Este procedimiento debe ser utilizado para eliminar los contaminantes derivados de la utilización de la pipeta (paraejemplo: proteínas y soluciones tampón) y que no requieren de un tratamiento especial para su eliminación,tales como microorganismos, radiactividad y otros que veremos más adelante.

Retirar el eyector consejos tirando de él; Desconecte la tuerca de conexión separando así el cuerpo pipeta del soporte de cono; Retire el pistón fijado cuidado y por separado la junta (s), manteniendo el soporte de cono con la más fina

las porciones hacia abajo; Coloque el soporte de cono, el conjunto de pistón, el eyector consejos, la junta (s) en un vaso (no coloque el

cuerpo pipeta) y completar el volumen con solución de detergente 4% a 8% en agua caliente (±50 ° C);

Colocar el vaso en un baño de ultrasonidos durante unos 15 minutos (si la ecografía no está disponible,mantener el vaso de precipitados en la solución durante 40 minutos);

Deseche la solución de detergente utilizado;

Los sellos son capturados con frecuencia en el interior del soporte de cono. Para eliminarlos, coloque el pistón de nuevoy apoyarlo sobre el soporte de cono como si usted está pipeta. Al retirar el pistón, los sellos de la voluntadse le atribuye.

Coloque las piezas en un recipiente limpio y lavar por última vez con agua destilada; Secar en un horno a unos 50 ° C (no sobrepasar esta temperatura) durante un máximo de 2 horas, o

deje que se seque a temperatura ambiente.

OBSERVACIONES

Use una solución de detergente 4% para la limpieza de pipetas ligeramente sucias y una solución de 8% para pesadamentepipetas sucias.

Para las pipetas sigue sucio después del lavado, el uso de algodón humedecida con alcohol isopropílico. Ten cuidadode no dañar el pistón.

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Después de utilizar la pipeta en ácido y / o soluciones corrosivas, siempre lave todas las piezas con agua destiladaagua o etanol.

Montar la pipeta.

9.2. Microbiología y cultivo celular

En estos campos es esencial para eliminar varios microorganismos (por ejemplo: virus, bacterias y / ohongos, tales como levaduras).


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Varias técnicas con diferentes espectros y mecanismos de acción pueden ser utilizados.

9.2.1. El tratamiento en autoclave

Las características del ciclo de esterilización dependen de la cantidad inicial de microorganismos (lala llamada carga microbiana). Es generalmente aceptado que la posibilidad de un organismo viable para serpresente en un elemento autoclave está por debajo de 1 en 1 millón (Nivel de Aseguramiento de Esterilidad 106).

9.2.2. Irradiación UV

La longitud de onda UV es de entre 100 nm y 400 nm. Hay 3 tipos de radiación UV, de acuerdoa la longitud de onda: UVC (200 nm a 290 nm), UVB (290 nm a 320 nm) y UVA (320 nm a 400nm).

Objetivos Letal para la mayoría de los microorganismos19(Tabla § 2.1)Acción Cambios fotoquímicos de enzimas celulares (UVA) y ADN (UVC) véase detalles

en la tabla § 1.3.2.

9.2.3. Los agentes químicos

Una solución química se debe elegir teniendo en consideración el tipo de microorganismo paraser eliminado.

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Objetivos Cualquier célula vegetativa o endospora19.La cinética que conducen a la inactivación de virus todavía no está claro9.

Acción El calor se degrada ácidos nucleicos, enzimas y otras proteínas esenciales.La membrana celular puede estar dañado.

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Nivel de actividad: +++: fuerte, ++: medio, +: débil, : no hay actividad.

Los mecanismos de acción de estos productos químicos se describen en la siguiente tabla:


La siguiente tabla muestra los principales microorganismos y algunos agentes químicos comunes. Cuando especialse manejan, se deben tomar cuenta las cepas con respecto a los productos comerciales específicos utilizadospara destruirlas y también certificar la compatibilidad química de la pipeta y el correspondientequímica (véase el § 3.3).

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9.3. La biología molecular

Los bioquímicos y biólogos moleculares están familiarizados con las fuentes de contaminación, tales comoproteasas contaminantes, ácido nucleico (ADN, ARN), nucleasas (RNasas, DNasas) y radiactividad.

9.3.1. Las proteasas

Las proteasas son enzimas que degradan las proteínas. Varios métodos de descontaminación y sus mecanismosde acción se detallan en la siguiente tabla:

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9.3.2. Los ácidos nucleicos (ADN y ARN)

La especificidad y la sensibilidad de las técnicas de PCR y RTPCR implican una desventaja: fácilcontaminación de los reactivos y muestras, lo que conduce a errores sistemáticos7.

Otro método:

Tampón de glicina / HCl (pH = 2). La acción de esta solución no está documentada (véase el protocolo más adelante)


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Nota: todos estos métodos degradan los ácidos nucleicos en las moléculas que tienen pesos moleculares más bajosque normalmente no se amplifica; Sin embargo, estos métodos no hacen limpio.

9.3.3. Nucleasas

Las nucleasas son enzimas que degradan los ácidos nucleicos. Tienen una amplia distribución y se encuentran encélulas procariotas como eucariotas, vegetales y animales (piel, agua). DNasas no son muy resistentesy no son esenciales para la mayoría de las aplicaciones en biología molecular, mientras que las RNasas son másduradero y resistente al calor.

DNasas necesitan iones metálicos para su actividad y pueden inactivarse fácilmente usando algunos tampón apropiadosoluciones (tales como agentes quelantes, por ejemplo, EDTA). RNasas no requieren iones metálicos, ya queutilizar el grupo 2hidroxilo como reactivo; por lo tanto, no son fáciles de inactivar.

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Método agente / Química Acción

El tratamiento en autoclave No siempre es suficiente para inactivar RNasas que pueden recuperarsu actividad después de varios métodos de tratamiento(Punto de ebullición, por ejemplo)

Irradiación UV La falta de datos al leer.DEPC Residuos de histidina alquilatos de los sitios catalíticos de

(Pirocarbonato de dietilo) RNasas A, inactivando así ellos.Este es un fuerte agente; Sin embargo, no es un inhibidor absoluta.

9.3.4. Los comentarios sobre los ácidos nucleicos y nucleasas

Todos los métodos descritos se degradan parcialmente los ácidos nucleicos y nucleasas, sin embargo, ninguno de ellos mostró100% de efectividad.

La precaución es la mejor manera de evitar la contaminación en la biología molecular:

Separar las áreas y juegos de pipetas para preparar las muestras y llevar a cabo los ensayos. Usar puntas provisto de filtros con el fin de evitar la contaminación por aerosoles. O utilizar pipetas de desplazamiento positivo provistos de capilares desechables y pistones (en total

la protección contra la contaminación cruzada). Para los protocolos de PCR críticos, el uso de positivoSe requiere pipetas de desplazamiento cuando no hay contaminación está involucrado.

9.3.5. Radioactividad

En caso de contaminación radiactiva débil, detergentes específicos que contienen formadores de complejos pueden losser utilizado.

Comparando los métodos

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Los métodos se compararon considerando primero su eficiencia en términos de contaminantes y entonces laventajas y desventajas.

9.4. Métodos espectro de acción

Considere dos enfoques:

1. Tengo los materiales necesarios para este método en mi laboratorio. ¿Qué tan efectivas son ellos (leer la tablaverticalmente)?

2. Necesito eliminar este contaminante. ¿Qué puedo hacer (leer la tabla horizontalmente)?

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Nivel de actividad: +++: fuerte, ++: medio, +: débil, : no hay actividad, SI: no informado.

*: Detergentes específicos (con agentes complejantes).

Para la irradiación UV: +: alguna actividad, : no hay actividad.

El límite de actividad irradiación UV es difícil de evaluar ya que su acción no depende de la longitud de ondasolamente (entre 100 nm y 400 nm), sino también otros factores como: tiempo de exposición, la distancia dela lámpara, la densidad de emisión, el ángulo de la exposición y la temperatura atmosférica.

9.5. Ventajas y desventajas

Consulte la tabla siguiente. El método debe cumplir con los siguientes requisitos:

Compatibilidad con los materiales de fabricación de la pipeta. La acción rápida. Fácil y seguro de aplicar.

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* Los de PVDF. Titulares resistente a la radiación UV (hechas de PBT) están disponibles para P200y P1000.

Por lo tanto, los procedimientos químicos pueden ser considerados como los más apropiados para pipetas descontaminación.

Protocolos

De acuerdo con el método utilizado, las diferentes partes de la pipeta pueden ser descontaminados.

Método Porción de la pipeta

El tratamiento en autoclave Titular Cone, tuerca de conexión, consejos eyectorIrradiación UV Porciones externasSoluciones químicas Los diferentes niveles, dependiendo de la solución usada

(Parte externa, inmersión completa)

Nota: Use guantes desechables durante todo el procedimiento de descontaminación.

9.6. El tratamiento en autoclave

Retire el eyector consejos y desenroscar la tuerca de conexión. Limpie el soporte de cono, la conexióntuerca y el eyector de puntas con un detergente y luego autoclave durante 20 minutos a 121 ° C, 0,1 Mpa. Permitirlas piezas se sequen o colocarlos en un horno a 50 60 ° C durante unos 30 minutos.

Nota: No autoclave dichas piezas a 134 ° C, ya que se pueden dañar. No esterilizar en autoclave partes distintas de las enumeradas anteriormente.

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9.7. Irradiación UV

Lámparas UV se pueden instalar en la parte superior del banco o en una campana de bioseguridad donde se permite la manipulación.La combinación de 254 nm y 300 nm bombillas durante 20 minutos puede destruir el ADN de doble hebra(Secuencias largas son más fáciles de inactivar)7.

9.8. Soluciones químicas

Antes de utilizar una solución química, estar seguro de la compatibilidad de los materiales utilizados para la fabricación delas pipetas. El fabricante debe proporcionar una lista de los materiales utilizados para la fabricación de la pipeta.Algunos ejemplos se muestran a continuación:

PVDF, PBT, PC, PE, POM, caucho nitrilo, acero inoxidable, ABS, PEI y PMP. Consulte "Glosario yAbreviaturas ".

Nota: no es aconsejable remojar el sello y la junta tórica.

9.8.1. Titular Cone, consejos eyector y conexión tuerca descontaminación

Dos ejemplos de soluciones químicas y sus protocolos se mostraron a continuación.

El hipoclorito de sodio

El hipoclorito de sodio tiene una amplia actividad antimicrobiana, rápida acción antibacteriana e también desnaturalizaproteasas, ADN y ARN. Además, es un atóxico fácil de uso y agente químico de bajo coste en elconcentraciones utilizadas.

Es muy importante limpiar la pipeta (usando un detergente, por ejemplo, Mucapur) antes de desinfectarel uso de hipoclorito de sodio, ya que el método puede perder eficacia en presencia de altaconcentraciones de material orgánico.

• Limpieza

Retirar el eyector consejos, desenroscar la tuerca de conexión y quitar el pistón soporte de cono. Diluir el detergente con agua caliente a 5060 ° C en:

a) Un baño de ultrasonido o enb) Un vaso de precipitados.

Coloque el soporte de cono, el eyector consejos y la tuerca de conexión:a) En un baño de ultrasonidos durante 15 minutos.

ob) En el vaso de precipitados las partes deben ser cepillados.

Retire las piezas y enjuagar muy bien.

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Antes de eliminar la solución de limpieza, añadir 10% de hipoclorito de sodio a la solución y permitir que sereaccionar durante 10 minutos. Este procedimiento descontaminar la solución de limpieza antes de entrar en elred de agua local.

• Desinfección

Diluir el hipoclorito de sodio en agua destilada a una concentración de 10% y colocarlo en unavaso de precipitados grande.

Coloque el soporte de cono, el eyector consejos y la tuerca de conexión en el vaso y deje que sereaccionar durante 30 minutos.

Lavar bien con agua corriente y luego con agua destilada. Deje que se seque a 50ºC 60ºC durante aproximadamente 30 minutos. Mantener a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de montar la pipeta (para que la

piezas se enfríen antes de montar la pipeta).

Nota : la solución de hipoclorito se debe desechar después de 3 días.

Glicina / HCl Buffer (pH 2 = 2)

Preparar la solución de la siguiente manera:

10x tampón: NaCl 30,6 g; glicina 39,2 g, completa con agua destilada hasta el volumen de 523 ml.Añadir HCl 1 N en una cantidad suficiente para alcanzar un volumen final de 1000 ml.

Retire consejos o eyector, desenroscar la tuerca de conexión y quitar el pistón soporte de cono. Coloque el soporte de cono, la tuerca de conexión y el eyector de puntas en el tampón diluido 1x (1/10

dilución de la memoria intermedia se ha mencionado anteriormente) a 95 ° C durante 30 minutos. Lavar bien con agua corriente y luego con agua destilada. Deje que se seque a 50ºC 60ºC durante 30 minutos. Mantener a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de montar la pipeta.

9.8.2. Descontaminación de la porción y el cuerpo de la pipeta menor

Para la mayoría de las aplicaciones, la descontaminación de la parte y el cuerpo de la pipeta inferior basta.

Una mezcla de los agentes químicos se recomienda (detergente y desinfectante en un solo producto).

El cuerpo de la pipeta debe limpiarse con una solución compatible (ver punto 3.3) en la superficie sólo(No sumerja el cuerpo de la pipeta en la solución descontaminante). La porción inferior de lapipeta, incluyendo el pistón, el eyector consejos, el titular de cono y la tuerca de conexión (excepto para elsellos de pistón) debe ser también limpiado (utilizando pequeños cepillos para limpiar el interior titular de cono) o puede serinmerso según los siguientes procedimientos:

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Retirar el eyector consejos, desenroscar la tuerca de conexión y quitar el pistón soporte de cono. Diluir el agente químico elegido (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) en un vaso de precipitados. Cuando desmontado, coloque las partes inferiores (pistón, consejos eyector, soporte de cono y conexión

tuerca) en el vaso de precipitados. Lavar bien con agua corriente y luego con agua destilada. Secar a 50 ° C 60 ° C durante 30 minutos. Mantenga las piezas a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de montar la pipeta.

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Conclusión

El método de descontaminación de la pipeta se selecciona de acuerdo al tipo de aplicación. Para la mayoría delas aplicaciones, sólo descontaminar a fondo las partes inferiores y limpiar el cuerpo de la pipeta usandouna solución elegida (ver § 3.3.2).

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Apéndice 1

¿Qué pasa con los materiales desechables (puntas, capilares, pistones y Distritips)?Los métodos utilizados para la esterilización de los plásticos de consumo de las pipetas

En el laboratorio, la esterilización en autoclave es el método más común para la esterilización de las puntas. Sin embargo, esteproceso lleva su tiempo: el propio período de autoclave, el ciclo de secado y estabilización a temperatura ambientedurante algunas horas.

Nota: el proceso de esterilización en autoclave debe llevarse a cabo a 121 ° C (20 minutos, 1 MPa). No lo esrecomendado a autoclave a 134 ° C como plásticos pueden resultar dañados.

Dependiendo del tipo de material, otros métodos son utilizados por el fabricante para esterilizarconsumibles: óxido de etileno o con más frecuencia de irradiación (rayos gamma:60Co, o beta rayos: los electroneshaz).

Como se automatiza este proceso de fabricación, incluyendo el paso final, consejos "limpias" son en general

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producido sin contacto manual.

Método Acción

El óxido de etileno Alquilatos el extremo amino de los aminoácidos, lo que resulta en ella muerte celular11.

Irradiación La ionización de los componentes celulares importantes (incluyendo aminoácidos)11.La inactivación de ADN de plantillas a través de los radicales libres.

Comentarios

El óxido de etileno es altamente tóxico y las autoridades de control mutagenic.Therefore, salud y medio ambienteen varios países havequestioned su uso. La irradiación se utiliza en los procesos de esterilización industrialesno hace que los materiales radiactivos. La dosis se eligieron en base a la experimental regularesdeterminaciones.

Apéndice 2

Materiales pirogénicos

La contaminación por materiales pirógenos puede ser problemático en algunos procedimientos farmacéuticos endispositivos médicos que se utilizan en las preparaciones parenterales (mencionado en varios métodos de laPharmacopeia) 4.

Los pirógenos son endotoxinas producidas por bacterias Gram negativas y son químicamente y físicamenteestable. Muy poco se ha publicado sobre la forma de eliminarlos.

El uso de rayos gamma a altos niveles de energía (mínimo de 25 kGy) parece eliminar los riesgosde contaminación de pirógenos. En otras palabras, un producto tiene que ser fabricado y controlado como unadispositivo médico con el fin de ser certificado como "libre de pirógenos.

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10. ANEXO IV: DEFINICIONES

Precisión (error medio o error sistemático): la diferencia entre el volumen dispensadoy el volumen nominal o el volumen seleccionado en la pipeta.

Calibración: conjunto de operaciones que establecen la relación entre el volumen dispensado y elvolumen nominal o el correspondiente volumen seleccionado en la pipeta.

Volumen de aire Dead: en pipetas de desplazamiento de aire, el volumen de aire entre la parte inferior de lapistón y la superficie del líquido.

Tasa de evaporación: la pérdida de agua estimado causado por evaporación durante el proceso de ponderación.

Análisis gravimétrico: procedimiento general basado en la determinación de la masa del aguaalícuotas dispensados por una pipeta. Los valores se corrigen respecto a la pérdida por evaporación; entonces, lamasa real y el volumen se calculan en base a la densidad del agua a temperaturas específicas concorrecciones a la presión atmosférica ambiente (factor Z).

Volumen nominal: el mayor volumen seleccionable por el usuario y especificada por el fabricante.

Nota: por lo tanto, para una pipeta de volumen variable con un rango de volumen útil de 10 l a 100 l, suvolumen nominal es 100 pl.

Volumen seleccionada: el volumen establecido por el usuario para dispensar el volumen elegido dentro de la utilidadrango de volumen.

Nota: para las pipetas de volumen fijo, el volumen seleccionado corresponde al volumen nominal.


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Precisión (error aleatorio): dispersión de los volúmenes dispensados por los volúmenes dispensadospromedio. También conocido (de acuerdo con el contexto) como la desviación estándar, reproducibilidad o repetibilidad.

Repetibilidad: la dispersión entre los resultados de mediciones sucesivas (llevada a cabo dentro de uncorto período de tiempo) sin cambio de parámetros o condiciones.

Reproducibilidad: la dispersión entre los resultados de las mediciones realizadas en condiciones diferentes(Diferente ubicación u operador), los parámetros son constantes.

Especificaciones volumétricas (errores máximos aceptables): los límites permitidos (superior e inferior)para la desviación entre el volumen dispensado y el volumen nominal o el volumen seleccionado.

Útil rango de volumen: parte del volumen nominal que puede ser dispensada dentro del máximoerror especificado en la Norma Internacional ISO / DIS 8655. El valor superior del volumen útilgama es siempre el volumen nominal. El valor inferior es 10% del volumen nominal si no lo contrarioespecificado por el fabricante.

La recalibración (operador ajustados): un procedimiento definido por el fabricante que puede ser seguidopor parte del usuario final para asegurar que la pipeta trabaja de acuerdo a las especificaciones publicadas.

Ponderación: sopesar medios para determinar la masa de una alícuota.

Factor de Z: factor de conversión (l / mg) teniendo en cuenta la densidad del agua en contacto con el aire cuandouna función de la temperatura y la presión.

Ex: Designación (abreviatura) de un instrumento diseñado para dispensar volúmenes.

En: Designación (abreviatura) de un instrumento diseñado para dibujar volúmenes.

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11. GLOSARIO Y ABREVIATURAS

Glosario

Detergente: moléculas orgánicas que convierten los residuos insolubles en residuos solubles (aceites y grasas).Son agentes de limpieza eficaces (la mayoría de ellos no matan a los microorganismos).

Descontaminación: desinfección de artículos infectados, lo que permite su manejo / uso (reducción demicroorganismos a un nivel aceptable).

Nota: la descontaminación química requiere un proceso de limpieza anterior utilizando un detergente de manera que laproceso de descontaminación puede ser eficaz.

Desinfección: eliminación selectiva de algunos tipos de microorganismos con el fin de evitar la transmisión(Reducción del número de microorganismos que infectan por debajo del nivel requerido para causar una infección).

Esterilización: eliminación completa de todos los organismos (por ejemplo: células, esporas y virus).

Abreviaturas

ADN: Ácido desoxirribonucleicoEDTA: Etileno tetraacético DiaminaARN: ácido ribonucleico

Materiales

ABS: acrilonitrilo butadieno estirenoPBT: tereftalato de polibutileno


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PC: policarbonatoPE: PolietilenoPEI: poliéter imidaPMP: polimetilpentenoPOM: PolioximetilenoPP: PolipropilenoPVDF: fluoruro de polivinilideno

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12. Referencias

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Parte 2: pipetas *


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'Evitar Ribonucleasa contaminación ". ' neb.com '.

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PERSONAL TÉCNICO

Volumen II Módulo 2 Agua de Análisis Instrumental Química

Editor:• José Muradian Filho Millipore

Coordinación:• Cláudia Franklin de Oliveira ANVISA• Itapuan Abimael da Silva ANVISA• Karen de Aquino Noffs Brisolla ANVISA• Karla de Araújo Ferreira ANVISA• Marcelo Cláudio Pereira ANVISA• Max Weber Marques Pereira ANVISA• Renato Almeida Lopes ANVISA

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RESUMEN

1. AGUA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS INSTRUMENTALES ........................................... .......... 51.1. Introduction................................................................................................................................... 51.2. Los contaminantes del agua ...................................................................................................................... 5

1.2.1. Compuestos inorgánicos disueltos ............................................... ....................................... 61.2.2. Compuestos orgánicos disueltos ............................................... .......................................... 61.2.3. Partículas y 61.2.4. Microorganismos .................................................................................................................. 71.2.5. Los gases disueltos 7

1.3. Seguimiento y control de la calidad del agua purificada .......................................... .................... 71.3.1. El monitoreo de contaminantes iónicos inorgánicos conductividad y resistividad .............. 81.3.2. El monitoreo de los contaminantes orgánicos TOC carbono total oxidable .................. 10

1.4. Calidad specifications.................................................................................................................. 111.5. Tecnologías de purificación de agua para laboratorios ............................................. ....................... 12

1.5.1. Destilación 121.5.2. Deionization...................................................................................................................... 131.5.3. La ósmosis inversa ................................................................................................................ 141.5.4. Continuo electrodeionization...................................................................................... 161.5.5. Ultrafiltration..................................................................................................................... 181.5.6. Microfiltración de membrana ................................................ ............................................... 191.5.7. Carbón activado 201.5.8. La radiación ultravioleta (UV) ............................................. .................................................. 20

2. ESPECIFICACIONES agua purificada ............................................. ......................................... 232.1. Purpose......................................................................................................................................... 232.2. El monitoreo de la calidad de varios tipos de agua ......................................... ..................... 242.3. Calibración y qualification...................................................................................................... 242.4. Recomendaciones de almacenamiento ......................................................................................................... 252.5. Purificación de agua de mantenimiento de equipos .............................................. .............................. 252.6. Control forms.............................................................................................................................. 252.7. Documentos de referencia ................................................................................................................. 25

3. REFERENCIAS ................................................................................................................................... 29

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1. AGUA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS INSTRUMENTALES

1.1. Introducción

El agua, como se encuentra en la naturaleza, contiene varias sustancias distintas de la HO molécula: sales, orgánica

Volumen II / Módulo 2 Agua de Análisis Instrumental Química

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2compuestos, microorganismos, partículas, gases disueltos. Esto se atribuye básicamente a un nivel muy conocidacaracterística: el agua es un disolvente universal.

En el laboratorio, los diversos usos del agua requieren un grado mayor o menor de la pureza. Este gradose define como una función de la aplicación, el método de análisis, de interferencia y de su sensibilidad y límitede la detección. Es por ello que el agua purificada y su calidad son factores esenciales para la preparaciónde soluciones en general, soluciones tampón, fases móviles en cromatografía, espacios en blanco E también otroaplicaciones comunes, pero no menos importantes, como el lavado de vidrio (enjuague final).

Definir, a sabiendas, la eliminación y el control de los contaminantes del agua son pasos críticos para con eficaciay económicamente obtener agua purificada en el laboratorio, especialmente el cumplimiento de la solicitudrequisitos.

Información y conceptos se presentarán a continuación en cuatro temas para ayudar a la consecución de tales fines ydecidir lo que es una especie de agua que se utilizará en un análisis instrumentales específicos:

• Los contaminantes del agua• Seguimiento y control de la calidad del agua purificada• Las especificaciones de calidad• Las tecnologías que se pueden utilizar para purificar el agua en los laboratorios

1.2. Los contaminantes del agua

Como se ha mencionado, los contaminantes tienen una relación directa con el análisis en curso, así como lasensibilidad y límite de detección del método utilizado. Por ejemplo, en HPLC High PerformanceCromatografía de líquidos los análisis utilizando un detector ultravioleta son sensibles a los compuestos orgánicospresente en el (componente de la fase móvil) que absorben el agua y en la longitud de onda utilizada. Estecompromete los resultados y la propia curva de calibración. Además, los compuestos orgánicos no detectadosen esta longitud de onda puede ser retenido y se acumulan en la columna de la HPLC, perjudicando así su eficienciay la funcionalidad, dando lugar a los llamados "picos fantasma" en un cromatograma.

Para fines didácticos, se dividió a los contaminantes del agua en cinco categorías:

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1.2.1. Compuestos inorgánicos disueltos

Básicamente consisten en sales disueltas en agua, los iones inorgánicos presentes. Pueden estar presentes como cationes oaniones.

Los aniones:

El contenido de cloro (Cl), Ion hipoclorito (HClO ), Nitratos, nitritos, carbonatos, sulfatos, silicatos, etc ...

Los cationes:

De sodio (Na+), Calcio y magnesio (Ca ++, Mg++, Hierro (Fe++), Aluminio (Al +++), metales pesados(Pb, Ni, Cr, Hg), etc ...


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1.2.2. Compuestos orgánicos disueltos

Esta clase de contaminantes se puede encontrar en la naturaleza o el resultado de la contaminación o la potabilidad del aguaproceso en sí mismo para el consumo humano.

De origen natural

Incluya materiales orgánicos resultantes de la descomposición vegetal y animal. Descomposición Vegetales muy común en fuentes abiertas (presas, embalses), donde se captura el agua para su posteriortratamiento. Entre otros ejemplos, podemos mencionar los taninos, ligninas, fenoles, ácidos húmicos (complejomezcla de macromoléculas que tienen estructura de polímero fenólico). También incluya proteínas, enzimas(Nucleasas, por ejemplo), los aminoácidos ae sus derivados.

Origen no natural

Incluye compuestos orgánicos originados por las actividades humanas. Se puede destacar todo tipo depesticidas solubles en agua (fungicidas, insecticidas, herbicidas), hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP),bifenilos policlorados (PCB), EDTA (agente quelante siempre presentes en jabones, detergentes yformulaciones de cosméticos), citratos (en las regiones próximas a los cultivos de cítricos).

1.2.3. Las partículas y coloides

Las partículas pueden ser rígidos (arena, piedras, tierra) o deformable (desechos vegetales). Se caracteriza como unacontaminante por ser un escudo protector para los microorganismos contra la acción de los rayos UV yagentes desinfectantes. Son también un vehículo para tales microorganismos, ya que las bacterias, por ejemplo,puede adherirse a las partículas.

En los análisis instrumentales, las partículas también pueden causar problemas graves directos. En HPLC, por ejemplo,siempre hay un riesgo de obstrucción de la columna y daños a la bomba de inyección piston.Further, partículasinmovilizada en la entrada de la columna puede convertirse en otra fase estacionaria, por lo tanto inesperadamentemenoscabando las características de retención de columna y la propia separación.

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Los coloides son suspensiones estables de partículas orgánicas o inorgánicas con tamaño que varía de 0,1 a 0001mm. Todas las partículas tienen la misma carga y señal. La repulsión resultante mantiene la suspensiónestable. Ellos son difíciles de eliminar por filtración microporosa, pero pueden ser fácilmente retenidos por inversaósmosis inversa o ultrafiltración.

1.2.4. Microorganismos

Los microorganismos bacterias, hongos (moho y levaduras) y virus están comúnmente presentes en el agua potableagua distribuida en una ciudad. Aunque las empresas de tratamiento de procesar el agua a fin de eliminarmicroorganismos peligrosos para la salud humana, el agua suministrada no es estéril en absoluto. El otromicroorganismos que quedan después del proceso de potabilidad del agua pueden afectar los análisis.

1.2.5. Los gases disueltos

Podemos encontrar todos los gases existentes en la atmósfera disuelto en agua.

El gas más importante disuelta en agua es dióxido de carbono (CO2). Se equilibra con carbónico

ácido que, a su vez, está equilibrado con el ion bicarbonato de:


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Este equilibrio genera un ión importante, bicarbonato, que puede interferir con los análisis ydeteriorar los procesos de purificación.

Colorado2velocidad de disolución y su concentración en el agua dependen de la temperatura (menor es la

temperatura, mayor es la velocidad de disolución y absorción) y en el CO2presión parcial en

el medio ambiente al que está expuesto el agua.

Otros efectos de otros gases en el aire:

• Oxígeno: causa corrosión en tanques, tuberías, etc.• Amoníaco: contaminante resultante de la fertilización agrícola.• SO

2 Contenidas en los automóviles escapar los gases y las emisiones industriales.

1.3. Seguimiento y control de la calidad del agua purificada

Como se mencionó anteriormente, los contaminantes contenidos en el agua pueden interferir significativamente con la analíticadeterminaciones. Por lo tanto, es importante cuantificar ellos y asegurarse de que cumplen con la calidadespecificaciones. Además, esta cuantificación es una medida de la eficiencia de la purificación de aguaproceso.

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En este tema se tendrá en cuenta fundamentalmente la detección de inorgánicos (iones) y contaminantes orgánicos.

Hay una amplia gama de contaminantes inorgánicos y analizar de forma individual sería extremadamenteduro y laborioso. Es posible determinar el total Total contaminación iónica de una solución acuosasolución usando un solo parámetro: la conductividad que es la conductancia específica o su recíproco,la resistividad (resistencia específica).

Igualmente, hay varios contaminantes orgánicos contenidos en el agua purificada. Aquí, también, unoparámetro solo se puede utilizar para cuantificarlos: Orgánico Total / oxidable de carbono (o TOC TotalOxidable de carbono).

Las bacterias y otros microorganismos se cuantificaron utilizando métodos que emplean filtración en microporosomembranas y posterior incubación utilizando medios de cultivo o, más recientemente, quimioluminiscencia.Los resultados se expresan en ufc / ml (unidades formadoras de colonias por ml).

La cantidad de partículas puede ser controlado bymeans de tecnologías de eliminación específicos (microfiltración,ultrafiltración y ósmosis inversa). En los procesos de purificación de agua, esto es suficiente y, en generalno hay preocupaciones sobre la cuantificación de partículas utilizando tecnologías apropiadas y asegurandoque se eliminan todas las partículas de un cierto tamaño.

1.3.1. Seguimiento de los contaminantes iónicos inorgánicos conductividad y resistividad

La conducción de la corriente eléctrica depende de los iones contenidos en el agua. Cuanto más pura es el agua,menor es la concentración de tales iones y, por lo tanto, menor es la conductividad. Para bajoconductividad, se aplica el recíproco, de alta resistividad, ya que son diferentes expresiones de la mismafenómenos.

Por lo tanto: C = 1 / R o R = 1 / C


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Unidades de medida:Conductividad microhm / cm o microSiemens / cmResistividad Megohm.cm

La conductividad del agua en el límite teórico de purificación, es decir, cuando casi todos los iones han sidoeliminado y sólo H +y OH sigue siendo, es 0.055 microsiemens / cm o 18,2 Megohm.cm, a 25º C.Esto se llama de tipo I agua ultrapura (ASTM).

El gráfico 1 muestra que la temperatura es un aspecto importante en la medición de la conductividad. Cuanto menor esla temperatura, mayor es la resistividad (por lo tanto, menor es la conductividad). Esto es porque enbajas temperaturas, una menor movilidad de iones en solución se lleva a cabo y esta movilidad es inversamenteproporcional a la resistividad o directamente proporcional a la conductividad.

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Gráfico 1. Resistividad y conductividad Variación como una función de la temperatura

Es por ello que la temperatura del agua debe ser conocido cuando se comparan estas mediciones. Conductividadmetros y metros de resistividad instalados en equipos de purificación de agua en general, tienen una temperaturacircuito de desplazamiento de 25 ° C, lo que permite una lectura directa.

Como el agua se vuelve más pura, es decir, como disminuye su conductividad o resistividad aumenta, es más propensay más rápido a los contaminantes agregados del medio ambiente, volviendo así a su estado natural. Paraesa razón, es fundamental que el agua ultrapura no se almacena y obtuvo justo antes de su uso.

El gráfico 2 muestra la tendencia del agua altamente purificada para recaptación contaminantes, evidenciado por una agudadisminución de la resistividad de algunos minutos después de la purificación. Esta disminución de la resistividad es debido a lala contaminación de dióxido de carbono atmosférico que se equilibra con el ion bicarbonato, la presenciade los cuales conduce a un aumento en la conductividad (o disminuir la resistividad).

Gráfico 2. Contaminación de agua ultrapura por los gases atmosféricos CO2(20º C)


A 25 ° C, la resistividad del agua ultrapura es

18,2 M Ω .cm

Resistividad(Megohm.cm)

Temperatura (° C)

Resistividad (M Ω .cm)

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1.3.2. El monitoreo de los contaminantes orgánicos TOC carbono total oxidable

Actualmente hay dos tipos de analizadores de TOC. Analizadores utilizando oxidación fisicoquímicas yanalizadores utilizando una tecnología patentada por Anatel Corporation.

Determinación TOC por métodos fisicoquímicos primera implica la eliminación de CO2desde el agua

para ser probado mediante purga con nitrógeno. Esto conduce a un problema: es difícil eliminar todo el CO2.

El segundo paso consiste en la adición de reactivos (peróxidos) y la acción de un catalizador (UV ocalor) para iniciar la reacción de oxidación. Una vez que esta oxidación es completa, el dióxido de carbono producidose retira de la muestra de agua por burbujeo con nitrógeno y se recoge por adsorción en unacolumna. A continuación, la columna se desorbe mediante el aumento de la temperatura y el arrastre usando un flujo denitrógeno puro. La presencia de CO

2es detectada por espectrometría infrarroja y la concentración

determinado por la integración de picos.

Este método tiene varias limitaciones en la medición de TOC en agua ultrapura:

En primer lugar, existe el riesgo de contaminación durante el muestreo y el método no puede ser fácilmente adaptadopara mediciones en línea.

Como se mencionó anteriormente, es difícil removedor las últimas trazas de CO2en la etapa de purga.

Los compuestos orgánicos volátiles pueden ser también prorrogados bynitrogen y, por lo tanto, no son tenidosen el TOC total.

Los reactivos de oxidación utilizados se mantienen en una habitación normal y, por lo tanto, sujeto a CO2

contaminación. Los materiales orgánicos que son adsorbidos y sin control liberan lentamente y de forma acumulativa

contaminada la tubería de instrumento y la columna. Por último, la técnica requiere el uso de una gran cantidad de nitrógeno de alta pureza, lo que está muy

caro.

La segunda técnica, desarrollada por Anatel Corporation, es simple y consiste en la orgánicacompuestos oxidados por la radiación UV. La radiación UV a una longitud de onda de 185 nm convierte O

2en ozono (O

3) Que es un agente oxidante fuerte. Con la ayuda de la radiación UV a 254 nm, el ozono, en

a su vez, reaccionar con agua para formar radicales libres hidroxilo que luego reaccionar con compuestos orgánicos,oxidante por lo tanto en dióxido de carbono. La disminución resultante de la resistividad (o un aumento deconductividad) se mide y se correlaciona con la lectura de la TOC entonces.

La ventaja principal es que tal método permite un rápido e automáticas mediciones en línea, siendomuy sensible (<1 ppb COT), reproducible, no utiliza reactivos y definir todas las clases de orgánicocompuestos, inclusivo los volátiles.

Sin embargo, este método es adecuado para aguas que tienen una resistividad por encima de 3 Megohm.cm.

La concentración de COT se expresa como ppb partes por mil millones.


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1.4. Las especificaciones de calidad

Una serie de especificaciones autoridades de normalización havequality destina a cubrir las actividades específicasa los cuales están dedicados. Las especificaciones de la ASTM Sociedad Americana para Pruebas y Materiales Están destinados a cubrir la instrumentación analítica y la industria electrónica. Los Estados UnidosPharmacopeia (USP) especificaciones cubren la producción de drogas y el ISO InternationalOrganización de Normalización. Además, el NCCLS Comité Nacional de Laboratorio ClínicoNormas, en coordinación con la PAC Colegio de Patologists estadounidenses, especifica los tipos de agua utilizadosen los laboratorios clínicos.

Norma ASTM, la referencia D119399, es el más adecuado para la especificación de los tipos deagua que se utiliza en química laboratorios e, especialmente, el análisis instrumental.

Históricamente, ASTM fue la primera entidad de proponer normas para agua de laboratorio, dividiendo el agua encuatro grados, de acuerdo con las aplicaciones:

Tipo I como se conoce como agua ultrapura o agua de grado reactivo, que se utiliza en el laboratorio críticoaplicaciones, incluidos los análisis instrumentales HPLC.

Tipo II para aplicaciones menos exigentes, tales como enjuague cristalería, análisis cualitativo osíntesis orgánica.

Tipo III para aplicaciones generales de laboratorio: preparación de medios de cultivo y la finalcristalería lavado en aplicaciones no críticas.

Tipo IV Suministro de sistemas de producción de agua grado reactivo.

Microbiológica Contaminación cuando el nivel de bacterias requiere un control, el tipo de grado debe serproporcionado de la siguiente manera:

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1.5. Tecnologías de purificación de agua para laboratorios

Con el fin de purificar el agua a los niveles especificados en la norma ASTM y otras autoridades, varias tecnologíasestán disponibles:

• Destilación• Desionización• La ósmosis inversa• Electrodesionización continua (EDI)• La ultrafiltración• microfiltración de membrana• Carbón Activado• Radiación Ultravioleta

1.5.1. Destilación

La destilación es un proceso de purificación de agua clásico que se aplica cambio de agua desde el líquido al gasestado, con condensación en fase líquida. Al utilizar el proceso de destilación, varios contaminantes soneliminado, sin embargo todavía no es posible obtener de tipo I agua ultrapura.

Las sustancias orgánicas que tienen un punto de ebullición bajo también se convierten en agua destilada. Azeotrópicamezclas también se forman e incluso compuestos de alto peso molecular se transfieren con elvapor. Además, cuando el cloro reacciona con los compuestos orgánicos naturales a altas temperaturas,compuestos organoclorados se forman y también prorrogados por el vapor.

La sílice se extrae de los destiladores de vidrio, así como otros iones en destiladores de metal.

Además, el proceso de destilación consume una gran cantidad de electricidad y agua de refrigeración.

DESTILACIÓN

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Ventajas

• Elimina un gran porcentaje de todos los tipos decontaminantes

• Produce agua con resistividad entre 0,2y 1 Megohm.cm.

• Inversión de Mediano• Comúnmente conocida y de fácil manejo

proceso

Desventajas

• No todos los contaminantes se eliminan ymuchos de ellos se producen durante elproceso.

• La calidad del agua no se controla.• Alto costo de la operación: la electricidad y el agua.• Regular y mantenimiento pretratamiento son

esencial para asegurar el rendimiento.

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1.5.2. Desionización


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El proceso de desionización se realiza mediante resinas de intercambio iónico globulares porosos que tienen diámetrosentre 0,3 y 0,8 mm. Tales resinas se fabrican con las cadenas poliméricas que contienen estirenoy divinilbenceno enlaces cruzados en el que los grupos químicos cargados están unidos.

En resinas aniónicas, es decir, las resinas de captura de aniones, estos grupos contienen amonio cuaternario. Sulfónicogrupos se utilizan en resinas catiónicas resinas cationes captura.

Al comienzo de un proceso de desionización, cuando la resina está todavía sin usar, iones unido a negativogrupos de resinas catiónicas son H+ los protones y los iones unidos a resinas aniónicas son hidroxilos OH.

Durante el proceso, los cationes contenidos en el agua (Na+, Ca++, Etc.) se unirá a la resina catiónica edesplazar el H +de protones, mientras que los aniones (Cl, NO

3) Se unirá a la resina aniónica y desplazar hidroxilos.

Desionización es un proceso muy eficiente para eliminar los iones e incluso algunos compuestos orgánicos ionizados.Sin embargo, las resinas son un excelente apoyo para el crecimiento bacteriano. Como el agua de alimentación no es estéril, laresultado es que el agua de la contaminación bacteriológica después de una columna de desionización puede ser 1000 vecesmayor que la entrada de agua.

Figura 1. Esquema del proceso de desionización lecho mixto

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Desionización


Ventajas

• Eliminación efectiva de iones(Resistividad: 1 10 Megohm.cm)

• Instalación sencilla.

• Baja inversión.

• regenerable.

Desventajas

• No elimina partículas, materia orgánica omicroorganismos. Resinas regeneradas pueden producirpartículas, materiales orgánicos o promover la bacterianacrecimiento.

• intercambio iónico estándar: el origen de resina es desconocido.• Los altos costos de operación: la regeneración /

el transporte.• La calidad del agua es variable; glóbulos dañados.

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Las resinas pueden ser regenerados en el laboratorio o en empresas contratistas que proporcionaron este servicio porcambiar una columna desgastado por uno regenerada. Esto puede ser una fuente de iónico residualcontaminación como resultado de la aplicación de la entrada de agua o del medio ambiente en que estos resinaestán expuestos.

De un solo uso, por lo tanto, no regenerable, resinas son el más indicado para evitar todos estos problemas.

1.5.3. La ósmosis inversa

Figura 2. Esquema de la ósmosis inversa y principio de ósmosis

Se supone que tenemos un tubo en forma de U con dos ramas separadas por una membrana de ósmosis. En elrama izquierda, las moléculas de agua se disuelven (representados por puntos). De acuerdo con las leyes de lala termodinámica, las moléculas se difunda desde la izquierda hacia la derecha hasta que sus concentracionesson equivalentes. Sin embargo, estas moléculas no pueden cruzar la membrana, pero las moléculas de agua pueden.Así, el agua atravesará la membrana desde la derecha hacia la rama izquierda para diluir la disuelto

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Osmosis InversaMembrana

(RO)

OsmóticoPresión

Ósmosis ReverseÓsmosis

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moléculas. Este proceso continuará hasta que se crea un diferencial de presión (presión osmótica) entrelas ramas, equilibrando así la diferencia en las concentraciones.

Una de ósmosis inversa es exactamente lo contrario de este proceso: iones de agua que contiene u otros contaminantesse somete a presión contra una membrana de ósmosis inversa; el agua pura se obtiene en el otro lado dela membrana. La presión ejercida debe ser mayor que la presión osmótica.

Membranas de ósmosis inversa típicamente rechazados 90% de la monovalente, 95% de la bivalente e 99%de los iones polivalentes. 99% de los compuestos orgánicos que tienen un peso molecular superior a 300, virusy las bacterias también son rechazados.

A fin de obtener un flujo continuo de moléculas de agua en esta membrana, los contaminantes tienen queser removido regularmente. Esto se puede lograr por el llamado flujo tangencial (figura 3) que permiteparte del flujo de agua para ir a través de la superficie de la membrana, promoviendo así un escaneo auténticay la prevención de la acumulación de contaminantes.


ReverseÓsmosisMembrana

ImpregnadoAgua

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En el equipo, este ajuste se proporciona como membranas enrolladas helicoidalmente, formando así un cartuchodonde permear y se niegan canales están perfectamente separados y apretado. Esto crea una gran separaciónárea en un volumen relativamente pequeño, lo que permite la construcción de sistemas compactos.

Sistemas de ósmosis inversa eliminan un porcentaje razonable de todo tipo de contaminantes; sin embargo,ya que esta es una eliminación percentil, no es suficiente para alcanzar incluso los niveles de pureza del agua de tipo IIrequerido para la mayoría de las situaciones. La siguiente tabla muestra las ventajas y desventajas de esteproceso.

OSMOSIS INVERSA

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Figura 3. Esquema del flujo tangencial en un sistema de ósmosis inversa

Ventajas

• Elimina un porcentaje razonable de todostipos de contaminantes del agua (iones, orgánicamateria, pirógenos, virus, bacterias, partículasy coloides).

• Bajos costos de operación como resultado de la bajael consumo de electricidad.

• Mantenimiento mínimo• Un buen control de los parámetros de operación.

Desventajas

• Los contaminantes no son suficientementeeliminado a fin de cumplir con el tipo IIlas necesidades de agua.

• Las membranas de ósmosis inversa son sujetasa incrustación y obstrucción a largo plazo (si noadecuadamente protegidos).

• Hasta hace poco, el consumo de agua erasimilar a los destiladores.

Rechazado

Alimentación

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La electricidad se emplea en este proceso para funcionar sólo la bomba de presurización; por lo tanto, una muybajo consumo si se compara con el proceso de destilación.

Las membranas de ósmosis también pueden ser incrustadas y obstruidos como resultado la precipitación de sales, principalmentecarbonato de calcio, reduciendo de este modo el flujo de salida y dañando la estructura de la membrana. Por esta razón,Se requiere el control de los iones incrustantes para evitar este tipo de problema.

1.5.4. Electrodesionización continua

Si sumergimos dos electrodos de ánodo y cátodo en una solución de NaCl, por ejemplo, y aplicamosuna diferencia de potencial entre los dos electrodos, el Na + y Cl iones migrarán hacia elcátodo y el ánodo, respectivamente.

Hay membranas llamadas membranas de intercambio de iones selectivamente permeable a los cationes o anionesy que permiten este tipo de migración que se desea controlar. Estas membranas están hechas de resina de intercambio iónicofragmentos incluidos en una matriz de polietileno. Tales fragmentos de resinas catiónicas o aniónicas, respectivamentepermiten cationes o aniones para pasar.

Si se introducen estas membranas en el sistema de NaCl y los electrodos descrito, somos capaces decontrolar la migración de Na + y Cl iones como se muestra en la siguiente figura.

Figura 4. Control de la migración de los iones a través de membranas de intercambio de iones


Membrana aniónica

Ánodo Cátodo

Catiónico Membrana

CátodoÁnodo

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En nuestro modelo, sólo los iones cloruro pueden cruzar la membrana aniónica. El contrario, sólo iones de sodiopuede cruzar la membrana catiónica. El llamado sistema de electrodiálisis se crea en un sistema dondeambas membranas se alternan y los electrodos mantienen (figura 5a).

Figura 5. sistema de electrodiálisis

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Ánodo Cátodo

ProductoA aniónicos de membranaC Membrana catiónica

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En la siguiente celda, continuando a la derecha, tanto los iones de cloruro y sodio pueden dejar. Podemos claramentenotar una disminución de iones; electroneutralidad también se mantiene ya que para cada ion cloruro existeuno de sodio salir de la misma célula.

Por el contrario, los iones son acumulando en la celda de al lado, ya que ninguna de sodio o cloruro pueden dejar.

Como resultado, hay un sistema en el que los iones se concentran en algunas células (flujo de eliminación) yprácticamente ausente en otras (el flujo del producto). Este proceso se puede utilizar para purificar el agua; sin embargo,es extremadamente lenta una vez que los iones tendrían que pasar de una célula a una membrana y hacia elelectrodo.

Con el fin de mejorar el rendimiento del sistema, las células están llenas de productos de iones de lecho mixtoresinas de intercambio aniónico (+ catiónicos). Esto permitirá una transferencia iónica desde el centro de la celdahacia la membrana semipermeable en lugar de moverse a una velocidad baja en el agua donde las colisionescausada por los movimientos brownianos disminuiría su avance. Por lo tanto, los iones saltan de unaresina sitio activo a otro hacia el electrodo que tiene una señal opuesta. Este ajuste también permitela captura de sustancias orgánicas débilmente cargadas.

Las resinas se regeneran continuamente como H + y OH se generan en el campo eléctrico creado,componiendo microambientes alrededor de las resinas.

Sin embargo, el proceso de purificación de electrodesionización continua tiene que ser alimentado con aguapreviamente purificada por ósmosis inversa y que tiene una concentración de sales atenuada.


Ánodo Cátodo

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Figura 6. Resinas de intercambio iónico de llenado de las celdas de productos

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A aniónicos de membranaC Membrana catiónica

Producto

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Electrodesionización CONTINUO (EDI)

1.5.5. La ultrafiltración

Figura 7. Representación esquemática de la sección de un ultrafiltro que muestra la relación entrela capa activa de separación (1) y la capa de soporte (100).

Ultrafiltros son membranas asimétricas poliméricos con una capa activa muy fino (1 micrómetro de espesor)en la parte superior y una capa de soporte más gruesa (100 micrómetros).

Las membranas de ultrafiltración (UF) operan bajo presión. En estas condiciones, las moléculas pequeñasserá capaz de atravesar la capa activa, mientras que se retienen las moléculas más grandes. El punto de corte se llamaNominal Molecular Límite de peso NMWL y se expresa en daltons. Este valor se utiliza paracaracterizar las membranas de UF una vez que el peso molecular es más fácil de encontrar en la literatura que latamaños moléculas.

El peso molecular está directamente relacionada con el tamaño de la molécula, sin embargo, otros factores también tienen que estarconsiderado: forma, la estereoquímica y el pH de la dispersión en la que están. Esto es esencial paraproteínas.


Ventajas

• Elimina eficazmente el material orgánico disuelto.• Requiere un mantenimiento mínimo.• No requiere la regeneración de las resinas.• Bajo costo de operación.• Excelente pretratamiento para ultrapurificación agua

sistemas

Desventajas

• Requiere prepurificación

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La siguiente tabla muestra las ventajas y desventajas de la UF.

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Figura 8. Sección transversal representación de un filtro de superficie y de la microfotografíaDurapore membrana (Foto:. cortesía de Millipore Ind e Com Ltda.).

Hay tres tipos principales de filtros: filtros de profundidad, de superficie y de membrana.

Los filtros de profundidad están hechos de fibras aglomeradas y retienen los contaminantes en todo su espesor.A pesar de tener una alta capacidad, su límite de detección no es muy clara. Su eficiencia es de alrededor de95% y varía como una función de la salida. Además, se pueden liberar contaminantes en el filtrado,generalmente fibras o material retenido.

Los filtros de superficie se hacen generalmente de varias capas de materiales no fibrosos, la captura de contaminantesprincipalmente en su superficie y que tiene una retención intermedia y la capacidad de rendimiento (98%).

Filtros de malla o membrana retienen contaminantes en su superficie por medio de un efecto de tamizado. EnA pesar de su baja capacidad, tales filtros retienen 100% de los contaminantes que tienen un tamaño por encima de sulímite de corte bien definido. Filtros de pantalla típicos son los filtros que la integridad de la membrana puede serverificada por medio de pruebas específicas, por ejemplo, punto de burbuja o difusión.

ULTRAFILTRACIÓN UF

Ventajas

• Eliminación eficaz (> 99%) de todos los orgánicamoléculas que tienen un peso molecular por encima dela NMWL. Eliminación muy eficaz depirógenos y virus, así como partículas.

• No hay riesgo de incrustación.• Bajo consumo de agua y electricidad.• Bajo mantenimiento; bien documentado /

procedimientos aceptados

Desventajas

• Casi la no eliminación de iones, gases y bajomateria orgánica de peso molecular (UFmembranas proporcionadas con una malla más estrechatener un valor de corte de 1.000 Dalton)

SuperficieFiltro

Como notado, estas membranas son muy eficientes cuando se retira de alto peso molecular orgánicacompuestos.

1.5.6. Microfiltración de membrana

Durapore®MembranaMicrofotografía

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La principal ventaja de los filtros de membrana es la eliminación total (100%) de todos los contaminantes que tieneun tamaño mayor que su diámetro de poro. Se han utilizado membranas con un diámetro de poro de 0,22 micrasen la industria farmacéutica durante varios años en la filtración esterilizante de soluciones.

1.5.7. Carbón activado

El carbón activado se utiliza principalmente debido a la capacidad para adsorber materiales orgánicos como resultado de suamplia superficie de hasta 1.000 m2/ G.

Otra función es reducir oxidantes, como el cloro libre, contenidas en el agua y que podríanafectar a membranas de ósmosis inversa o resinas de intercambio iónico. Por lo tanto, esta es una tecnología principalmentedirigido al tratamiento previo y la protección de otros pasos.

CARBÓN ACTIVO

1.5.8. La radiación ultravioleta (UV)

Radiaciones UV tienen longitudes de onda entre 100 y 400 nm, dividido en cuatro campos: ultracorta, corta(UVC), medio (UVB) y ondas largas (UVA). Estas radiaciones pueden ser fácilmente producidos por la bajalámparas de vapor de mercurio de presión que emite radiaciones en dos longitudes de onda: 185 y 254 nm.

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MICROFILTRACIÓN MEMBRANA

Ventajas

• total (100%) de eliminación de todos los contaminantes (partículas,bacterias) mayor que el tamaño de poro. Prueba de integridaddisponible.

• filtración esterilizante (0,22 mm de membrana).• Mínimo mantenimiento: simplemente reemplace según sea necesario.• Altas salidas se obtienen a bajas presiones.• Caudal de salida eficiencia independiente.

Desventajas

• efecto mínimo sobre otracontaminantes.

• Retención de la superficie: pueden estar sujetosa la obstrucción o la obstrucción.

Ventajas

• Eliminación efectiva de una amplia gama desustancias orgánicas (incluso aquellos con bajapeso) bymeans moleculares de no específicabonos (Fuerzas de Van der Waals).

• Gran capacidad como resultado de la granárea de superficie.

Desventajas

• Efecto muy débil en otros contaminantes(A excepción de algunas partículas eliminadas porfiltración en profundidad).

• Cuando todos los sitios están ocupados, se alcanza el equilibrioy los compuestos orgánicos liberados.

• Las bacterias pueden desarrollar después de algún tiempo.• Su eficiencia depende de la salida.

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Radiaciones con una longitud de onda entre 200 y 300 nm destruir microorganismos rompiendo laCadena de ADN. Esto es más intensa a 260 nm. Por lo tanto, la longitud de onda de 254 nm tiene una eficienciaque está muy cerca (80%) a la considerada como óptima para este propósito.


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Sin embargo, se requiere un diseño muy comprobada por lo que se llegó a esa realidad tal eficiencia, teniendo principalmentela capacidad de penetración de la radiación UV (en el orden de 1 cm) en la consideración. Es necesarioproporcionar un flujo de salida suficiente para permitir que esta penetración, respetando el tiempo de permanencia del agua en elcámara de exposición.

Otra aplicación muy crítico de la radiación UV es la reducción de la oxidable carbono total(TOC) niveles de agua purificada.

De hecho, la radiación UV no destruye directamente compuestos orgánicos, pero genera ozono quese oxida las sustancias contenidas en el agua.

Como puede verse en la figura de abajo, a la izquierda, dos longitudes de onda diferentes son necesarias para generarLos radicales hidroxilo libre (OH ·) que posteriormente se oxida compuestos orgánicos.

Figura 9. A la izquierda: la secuencia de reacciones para formar el radical libre hidroxilo. Porreacciones de oxidación de compuestos orgánicos: derecho. Ejemplo: metanol.

Ambos mecanismos descritos en la literatura (Norrish et al., 1965 y 1967 Banford et al.) Requierenla acción de las longitudes de onda 185 y 254 nm y la presencia de oxígeno en el agua. Ambosmecanismos havethe misma estequiometría y el resultado en la formación de el mismo número de hidroxiloradicales.

En el lado derecho de la figura, un ejemplo de la oxidación de un compuesto orgánico sin cargo(Metanol) se mostró. Esta es una de las moléculas orgánicas simples, que tiene sólo un átomo de carbono.Bajo la acción de los radicales hidroxilo libre, esta molécula se oxida sucesivamente en una crecienteescala de la oxidación: comenzando con el alcohol, y luego aldehído, ácido y dióxido de carbono y finalmenteagua.

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Como se discutió previamente, dióxido de carbono y agua se equilibran con ácido carbónico que, a su vez, esequilibrada con el bicarbonato y H +iones. Por lo tanto, las resinas de intercambio iónico eliminar el carbón.

Tenga en cuenta que mediante la conversión de carbono orgánico en un ion que es fácil de quitar por desionización, eraposible reducir el nivel de TOC agua purificada.

RADIACIÓN UV (185 + 254 nm)


Ventajas

• Conversión de trazas de orgánica

Desventajas

• Técnica Pulido solamente: puede verse afectada

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contaminantes en muestras y cargados,al final, en CO

2(185 + 254)

• destrucción limitada de microorganismos yvirus (254).

• Bajo consumo de energía eléctrica.• Fácil operación.

si la concentración de materia orgánica enel agua de alimentación es muy alta.

• Los compuestos orgánicos se convierten y noeliminado.

• efecto limitado sobre otros contaminantes.• El diseño tiene que ser apropiado para asegurar

la eficiencia.

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2. ESPECIFICACIONES agua purificada

2.1. Propósito

Esta especificación se refiere a los requisitos adecuados de las aguas que se utilizarán en el análisis químicométodos y pruebas físicas. Se ha basado en las especificaciones de la ASTM D119399, según enmendada. CuatroSe especificaron las categorías:


La medición de pH en el tipo I, II y agua grado reactivo III no está incluido en el pliego de condiciones,

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ya que el agua en estos grados de purificación no contienen componentes en cantidades suficientes para dar lugar a unacambio de pH.

Los métodos para la preparación de varios tipos de agua determinar los límites de impurezas y deberíancumplir con las siguientes especificaciones:

2.1.1. Tipo I reactivo agua de calidad debe ser preparado por un proceso de prepurificación apropiado,seguido por el pulido usando un sistema de ultrapurificación que comprende un lecho de intercambio iónico mixtoresina y un final de membrana 0,22 m. La preparación debe ser siempre llevada a cabo en eltiempo de uso. Se recomienda, pero no es obligatorio, para dotar al sistema ultrapurificación(Pulido final) con una lámpara de UV con emisión a 185 y 254 nm con el fin de reducir al máximolos niveles de TOC. Además, también es recomendable, pero no obligatorio, para proporcionar laequipos ultrapurificación (pulido final) con un medidor de TOC en línea para el monitoreo constantede contaminantes orgánicos. Suministro (pretratamiento) de la etapa final de agua debe tener unaconductividad de al menos 10 mS / cm a 25ºC.

2.1.2. Tipo II de agua de grado reactivo debe ser preparado por un proceso de ósmosis inversa combinadacon electrodesionización, destilación o intercambio iónico que tiene una conductividad por debajo de 1,0 mS / cma 25 ° C. El intercambio de iones, o de ósmosis inversa y la adsorción orgánica, pueden ser necesarios yasociada con la destilación si la pureza no es alcanzado por una sola etapa de destilación.

2.1.3. Tipo III de agua de grado reactivo debe ser preparado por ósmosis inversa seguido de continuoelectrodesionización, destilación, intercambio iónico o una combinación de los mismos, seguido bya pulidorcon un filtro de 0,45 micras membrana. Se requiere el uso de este filtro cuando microbiológicoSe requiere la contaminación.

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2.1.4. TypeIV agua de grado reactivo debe ser preparado byreverse de ósmosis, destilación, intercambio iónico,ósmosis inversa seguida por electrodesionización continua, electrólisis o una combinaciónde los mismos.

Los varios tipos anteriormente pueden ser elegidos por el método o investigación.

Esta especificación no se destina a cubrir problemas de seguridad asociados con la aplicación. Esresponsabilidad del usuario establecer la norma de seguridad apropiada y prácticas saludables y definir elaplicabilidad de los límites de uso de regulación prioritarios.

2.2. El seguimiento de la calidad de varios tipos de agua

2.2.1. Conductividad y resistividad: Para la medición de la conductividad o resistividad, la conductividado metro resistividad del equipo de purificación de agua se debe utilizar siempre que sean debidamentecalibrado. Si se utiliza un destilador que no tiene metros acoplada, la medición debe llevarse a cabo utilizandoun medidor de conductividad portátil debidamente calibrado.

2.2.2. TOC oxidable de carbono total (orgánica) A pesar de que los valores de COT para todo tipo deagua se especifican, sólo de tipo I de agua de grado es crítica, ya que esta agua estará en contacto con elequipos de análisis y niveles altos de TOC pueden conducir a resultados deteriorados. Por lo tanto, este grado aguarequiere de un seguimiento sistemático de los niveles de TOC. Le recomendamos que ultrapurificación aguaequipo (pulidores finales) está provisto de un TOC debidamente calibrada metros en línea. Si esto no esposible, la medición debe hacerse en línea utilizando equipo aplicando la fotooxidacióntécnica para resistividades por encima de 3 megohm.cm.

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2.2.3. Las mediciones de frecuencia:2.2.3.1. Resistividad y conductividad:

2.2.3.1.1. Diario de tipo I, II, III o IV agua.2.2.3.1.2. Tras la eliminación de agua para el agua de tipo I.

2.2.3.2. TOC carbono total oxidable:2.2.3.2.1. Cuando el equipo no está provisto de un metro, los niveles de TOC

se debe medir al menos una vez cada quince días.2.2.3.2.2. Cuando el equipo de ultrapurificación está provisto de un metro TOC,

la medición debe hacerse sobre la eliminación de agua.

2.3. Calibración y calificación

2.3.1. Cada sistema de purificación de agua debería haber sus medidores calibrados y se clasificó de acuerdo conla instalación, funcionamiento y los aspectos de rendimiento.

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2.4. Recomendaciones de almacenamiento

2.4.1. Escriba agua de grado I No debe almacenada debido a la degradación rápida. Debe prepararse enel momento de uso.

2.4.2. Tipo II, III y agua de grado IV se puede almacenar en un depósito protegida contra externacontaminaciones. Se recomienda encarecidamente a almacenar agua purificada por un período no superior aveinticuatro horas como de su preparación.

2.5. Mantenimiento de equipos de purificación de agua

Todas las indicaciones del fabricante debe ser seguido sobre todo en relación con el cambio de vez en cuandomaterial fungible y la limpieza necesaria. Se recomienda establecer un mantenimiento preventivoprograma para cada equipo y mantener registros para sustitución de materiales consumibles ymantenimientos realizan.

2.6. Formas de control

Anexos 1 y 2 muestran las plantillas de formulario de control para el registro de la resistividad o conductividadmediciones, así como TOC.

2.7. Documentos de referencia

Especificaciones estándar D1193 de Reactivo AguaMétodos de Ensayo D1125 para la conductividad eléctrica y la resistividad del aguaTermninology D1129 relacionados con el aguaMétodos de Ensayo D1293 de pH del aguaPráctica D4453 para manipulación de las muestras de agua ultrapuraD4779 Método de prueba para Total, Orgánica, Inorgánica y de carbono en agua de alta pureza por Ultravioleta

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(UV) o la oxidación de persulfato, o ambos, y detección de infrarrojosD5391 Método de prueba para la conductividad eléctrica y la resistividad de un fluye agua de alta pureza

MuestraD5542 Método de prueba para Trazas de aniones en agua de alta pureza por cromatografía iónicaD5997 Método de prueba para monitoreo en línea de carbono total, carbono inorgánico en el agua por

Ultraviolet, persulfato de oxidación y de membrana detección de conductividad

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Adjunto plantilla de formulario 1. Control para equipos ultrapurificación agua (últimopulido) provisto de un metro TOC.


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Adjunto plantilla de formulario 2. Control de equipos ultrapurificación agua (últimopulido) no proporcionada con un medidor de TOC.

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Adjunto plantilla de formulario 3. Control de equipos de purificación de agua para la obtención detipo II, III o agua de grado IV.

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3. REFERENCIAS


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Sociedad Americana para Pruebas y Materiales D119399, "Especificación estándar para Reactivo Agua"(1999).

Millipore, sitio de Internet: http // millipore.com / H2O.

Millipore Indústria e Comércio Ltda. Seminarios de Purificação de agua para Laboratorios.

Norrish et al., Proc.Roy.Soc.Ser. A. 288: 316 (1965).

Banford et al., Fotoquímica y cinética de reacción. PG Ashmore et al., Ed. Cambridge (1967).

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PERSONAL TÉCNICO

Volumen II Módulo 3 Instrumentación Analítica

Los editores y los Cooperadores:• Adauto Da Silva VARIAN• Celso Ricardo Camargo SINC BRASIL• Demian Rocha Ifa SINC BRASIL

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• Iván Jonaitis AGILENTTECHNOLOGIES• José Apareido Soares VARIAN• Luiz Rinalo Bizaio VARIAN• Renato Guvêa Technlogies AGILENT• Renato Eres FLOWSERVICE• Ricardo Lira FLOWSERVICE• Robson Sanches Bizi VARIAN

Coordinación:• Cláudia Franklin de Oliveira ANVISA• Itapuan Abimael da Silva ANVISA• Karen de Aquino Noffs Brisolla ANVISA• Karla de Araújo Ferreira ANVISA• Marcelo Cláudio Pereira ANVISA• Max Weber Marques Pereira ANVISA• Renato Almeida Lopes ANVISA

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RESUMEN

1. INTRODUCTION ......................................................................................................................... 7ESPECTROFOTOMETRÍA 2. ULTRA VIOLETAvisible (UVVIS) ............................. 8

2.1. Introduction................................................................................................................................ 82.2. Principio Técnica ................................................................................................................. 10

2.2.1. Espectro de luz2.2.2. Procesos de absorción ................................................ ................................................. 102.2.3. UV Vis espectro de absorción ............................................. ..................................... 122.2.4. Efecto de disolventes .......................................................................................................14

2.3. Descripción básica del sistema ............................................. ................................................ 152.3.1. Las fuentes de radiación ............................................... .................................................. .. 152.3.2. Monocromador (óptico) .............................................. ............................................. 16

2.3.2.1. Solo haz ............................................... .................................................. .. 17

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2.3.2.2. Diodos disposición ................................................ .................................... 182.3.2.3. Doble haz ............................................... ................................................. 18

2.3.3. Muestra compartments................................................................................................ 192.3.3.1. Acoplador de fibra óptica ............................................... ..................................... 192.3.3.2. Sipper 192.3.3.3. Soporte para muestras sólidas .............................................. ............................. 192.3.3.4. Accesorios de reflectancia ................................................ ................................ 20

2.3.4. Datos acquisition........................................................................................................... 202.4. Requisitos de instalación y operación mínimos ............................................. ................ 202.5. Precauciones básicas ..................................................................................................................... 21

3. cromatografía de gases (GC) ........................................... ........................................... 223.1. Introduction.............................................................................................................................. 223.2. Principio Técnica ................................................................................................................. 223.3. Descripción básica del sistema ............................................. ................................................ 23

3.3.1. Gases used.................................................................................................................... 243.3.2. Flujo y presión controladores .............................................. ..................................... 253.3.3. Injectors........................................................................................................................ 25

3.3.3.1. Almuerzos inyectores ................................................ ............................................ 253.3.3.2. Inyectores capilares ................................................ ......................................... 26

3.3.4. Columnas ....................................................................................................................... 273.3.4.1. Horno Columnas ................................................ ............................................... 28

3.3.5. Detectors...................................................................................................................... 283.3.5.1. Detector de ionización de llama (FID) ............................................ .................... 283.3.5.2. El nitrógeno y el fósforo (NPD) o detectores termoiónico específicos ......

(TSD) ............................................................................................................ 293.3.5.3. Los electrones detector de captura ECD ............................................. ............... 30

3.3.6. Adquisición de datos y procesamiento .............................................. ................................. 31

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3.4. Requisitos de instalación y operación mínimos ............................................. ................ 313.5. Precauciones básicas ..................................................................................................................... 32

4. cromatografía líquida (LC) ........................................... .................................... 334.1. Introduction.............................................................................................................................. 334.2. Principio Técnica ................................................................................................................. 33

4.2.1. Separación modes:....................................................................................................... 344.2.1.1. Cromatografía en fase normal ............................................... .................... 344.2.1.2. Cromatografía de fase inversa ............................................... .................... 35

4.3. Descripción básica del sistema ............................................. ................................................ 364.3.1. Móvil phase................................................................................................................ 374.3.2. Disolventes sistema de bombeo ............................................... ............................................ 384.3.3. Introducción de la muestra inyector .............................................. .................................... 38

4.3.3.1. Inyector manual ................................................ .............................................. 384.3.3.2. Inyector automático ................................................ ......................................... 39

4.3.4. Columnas ....................................................................................................................... 394.3.4.1. Fases estacionarias a base de sílice ............................................. ......................... 394.3.4.2. Fases modificado químicamente ............................................... .......................... 40

4.3.5. Detectors...................................................................................................................... 404.3.5.1. Detectores de UVVIS .............................................. ............................................ 414.3.5.2. Detector de fluorescencia ................................................ ................................... 434.3.5.3. Detectores electroquímicos ................................................ ............................ 43

4.3.6. Adquisición de datos y procesamiento .............................................. ................................. 44

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4.3.6.1. Porcentajes de área ................................................ ........................................... 454.3.6.2. Zona normalization........................................................................................ 454.3.6.3. Patrón externo ................................................ .......................................... 464.3.6.4. Estándar interno ................................................ ............................................ 46

4.4. Requisitos de instalación y operación mínimos ............................................. ................ 474.4.1. Requisitos Bench ................................................ .................................................. .. 474.4.2. Red eléctrica4.4.3. Condiciones ambientales ................................................ ......................................... 48

4.5. Precauciones básicas ..................................................................................................................... 48

5. sistemas de cromatografía CONECTADOS A detectores de masas .. 505.1. Introduction.............................................................................................................................. 505.2. Principio Técnica ................................................................................................................. 505.3. Descripción básica del sistema ............................................. ................................................ 51

5.3.1. Ionización5.3.1.1. Los electrones de impacto (EI) ............................................. ...................................... 515.3.1.2. Ionización química (CI) ............................................. ................................. 515.3.1.3. Electrospray (ES) .............................................. ............................................. 52

5.3.2. Analizadores de masas ............................................................................................................. 545.3.2.1. Analizadores de masas cuadrupolo ............................................... ........................... 545.3.2.2. analizadores de masas cuadrupolo "trampa de iones" ........................................... ............ 55

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5.3.2.3. Tandem espectrometría de masas ............................................... ........................... 575.3.3. Detectors...................................................................................................................... 58

5.3.3.1. Electrones multiplicadores ................................................ ..................................... 585.3.3.2. Placas de microcanal ................................................ ...................................... 595.3.3.3. Photomultiplier.............................................................................................. 60

5.3.4. Adquisición de datos y procesamiento .............................................. ................................. 605.4. Requisitos de instalación y operación mínimos ............................................. ................ 61

5.4.1. Requisitos Bench ................................................ .................................................. .. 615.4.2. Red eléctrica .......................................................................................................... 615.4.3. Condiciones ambientales ................................................ ......................................... 62

5.5. Precauciones básicas ..................................................................................................................... 625.5.1. Vacío system............................................................................................................625.5.2. Iones 635.5.3. Sistema de nitrógeno ..........................................................................................................635.5.4. Formación precauciones básicas ............................................... ........................................... 635.5.5. Archivos Autotune 63

6. INSTRUMENTOS DE ANÁLISIS Verificando el funcionamiento .. ....................... 646.1. Introduction.............................................................................................................................. 64

6.1.1. DQ Calificación de Diseño .............................................. ......................................... 656.1.2. IQ Instalación Calificación .............................................. ..................................... 656.1.3. OQ Operación Calificación .............................................. ..................................... 656.1.4. PQ Rendimiento Calificación .............................................. ................................. 66

6.2. Ultravioleta visible (UVVIS) espectrofotometría ........................................ .................... 666.2.1. Mantenimiento preventivo ................................................ ............................................. 666.2.2. Operación Cualificación (OQ) ............................................. ..................................... 676.2.3. Calificación del Desempeño (PQ) ............................................. .................................. 67

6.2.3.1. Farmacopea europea ................................................ ............................ 676.2.3.2. Farmacopea de Estados Unidos ............................................... ....................... 68

6.3. La cromatografía de gases GC ....................................................................................................686.3.1. Mantenimiento preventivo GC ............................................... ....................................... 68

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6.3.2. Calificación de la operación ................................................ .............................................. 686.3.2.1. Flujos de control ................................................ ................................................. 686.3.2.2. Controlar las temperaturas ................................................ .................................... 696.3.2.3. Detector (s) precisión de la señal ............................................ .............................. 696.3.2.4. Precisión automática sampler ............................................... ........................ 706.3.2.5. Cálculos realizados por el sistema de datos ............................................. ...................... 70

6.4. Cromatografía de líquidos HPLC .............................................. .............................................. 706.4.1. HPLC Mantenimiento preventivo ............................................... .................................. 706.4.2. Calificación de la operación ................................................ .............................................. 71

6.4.2.1. Cualificación Detector ................................................ ................................... 726.4.2.2. Bomba calificación ................................................ ........................................ 726.4.2.3. Columnas de calificación horno ............................................... .......................... 736.4.2.4. La clasificación automática de muestras ............................................... ................... 73

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6.4.2.5. Sistema de datos ................................................ .................................................. .. 736.5. Sistemas de cromatografía conectados a detectores de masas ............................................ ......... 73

6.5.1. Sistemas de detección de masas de mantenimiento preventivo ............................................. ......... 736.5.1.1. Los sistemas de vacío ................................................ ............................................ 736.5.1.2. Detector de masas ................................................ ................................................. 746.5.1.3. Chromatographer ................................................. ......................................... 74

6.5.2. Calificación de la operación ................................................ .............................................. 746.5.2.1. Precisión Inyector ................................................ ........................................... 756.5.2.2. Inyector linearity............................................................................................. 756.5.2.3. Carryover....................................................................................................... 756.5.2.4. Linealidad del detector ................................................ ........................................... 756.5.2.5. Exactitud Misa ................................................ ................................................ 756.5.2.6. Sensitivity........................................................................................................ 75

7. REFERENCES .................................................................................................................................. 76

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1. INTRODUCCIÓN

El uso de técnicas de instrumentación analítica en los laboratorios, un requisito no sólo paracaracterizar una sustancia o asegurar la calidad de un producto, sino también para aumentar los análisisproductividad; Por lo tanto, existe un número creciente de instrumentos de grado alto de automatización, quepuede ser remotamente operated.However, tenemos que ser conscientes de que para un uso y un rendimiento satisfactoriode tales instrumentos, algunas reglas básicas deben ser considerados, tales como: el propósito de uso, adecuadainstalación, pruebas de rendimiento, el personal capacitado para operar, el cumplimiento de los fabricantes deinstrucciones sobre las precauciones básicas que se deben considerar byThe operador y rutinas para la sustituciónmateriales consumibles, personal con conocimientos fiable técnica para una aplicación ocasionalde un método analítico, compatibles los programas de mantenimiento y control de funcionamiento preventivascon la rutina utilizada, parámetros de evaluación para garantizar un aseguramiento continuo de la calidad de los resultadosy, por último, una planificación detallada siempre incluyendo evidencias de las actividades actuales. Este capítuloabarca las principales técnicas de instrumentación de análisis utilizados en un laboratorio de bioequivalencia asíque el profesional en este campo puede comenzar su / sus estudios y utilizar este material como referencia.Otro objetivo era discutir la comprobación de rendimiento de cada instrumento y validación conceptosaplicada a la instrumentación analítica.

Volumen II / Módulo 3 Instrumentación Analítica

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2. ULTRA VIOLETAVISIBLE ESPECTROFOTOMETRÍA (UVVIS)

2.1. Introducción

El ultravioleta espectrofotometría visible es una técnica analítica basada en la propiedad devarios especímenes iónicas o moleculares para absorber las radiaciones ultravioletas y visibles en la solución. Radiacionesen estas regiones implicar fotones con energía suficiente para provocar la transición de electrones de valencia,como una función de las perturbaciones que se producen de inicio.

La perturbación causada por campos eléctricos y magnéticos viaja a través del espacio, creando así laradiación electromagnética expresión. Debemos tener en cuenta que los campos eléctricos y magnéticosson campos perpendiculares entre sí y que los valores de propagación en el campo 'máximos y mínimos son siempre coincidentes, es decir, los campos están en fase, tal como en una onda.Podemos ver en la figura 1 que, si bien la propagación hacia la derecha a una velocidad V, cualquier punto fijo en el Xeje comienza sucesivamente a tener picos de la onda y valles. Entonces, la longitud de onda (l) se define como ladistancia recorrida byThe waveso que ambos máximos alcanzan una longitud de onda point.The observación fijopor lo general se expresa en nanómetros (nm).

Figura 1. Longitud de onda

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El Ultraviolet radiaciones (UVVis) Visible constituyen una porción relativamente pequeña de la electromagnéticoespectro incluyendo otras formas de radiaciones como ondas de radio, de acuerdo con la figura 2. Los límites detales regiones se determinan por los límites prácticos de los métodos experimentales para la producción ydetección de radiaciones.

El regiones diferenciación espectral tiene un significado adicional para el químico, una vez físicainteracciones siguen diferentes mecanismos y ofrecen diferentes tipos de information.When una radiaciónllega una sustancia semitransparente, la radiación es sólo parcialmente transmitted.The la radiación restantees reflejada o absorbida en varios ángulos (figura 3), dependiendo de la sustancia y la radiaciónlongitud de onda.

El tipo y la cantidad de radiación absorbida es el más importante para fines analíticos.Desafortunadamente, no hay ningún método directo para determinar la radiación absorbida; sin embargo, estainformación puede ser indirectamente obtiene midiendo la radiación transmitida.

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Figura 2. Espectro electromagnético

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AbsorbidoRadiación

IncidenteRadiación

ReflejadaRadiación

TransmitidoRadiación

Figura 3. absorbida, transmitida y la radiación reflejada

Si la intensidad de una luz transmitida se representa gráficamente como una función de la longitud de onda, unase obtiene el espectro de absorción de la sustancia. Esta es la absorción selectiva radiación queproporciona la base para el análisis cuantitativo y cualitativo por absorción molecularespectrofotómetro.

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2.2. Principio Técnica

2.2.1. Espectro de luz

La luz visible es una región del espectro electromagnético, las radiaciones de los cuales son capaces desensibilizar a la retina. La radiación visible comprende las radiaciones con longitudes de onda situadas entre400 y 700 nm, aunque estos límites no son fijos como la capacidad de percepción varía según


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el observador. Dentro de este rango de longitudes de onda, los subgrupos pueden ser separados de acuerdo con el colorproducido en un pequeño rango de espectro, como la tabla de abajo.

Tabla 1. Las longitudes de onda se extiende en la región visible

2.2.2. Procesos de absorción

Teniendo en cuenta que la luz es una forma de energía, la absorción de fotones de luz por una molécula resulta en unaaumentar la energía, Δ E, de la energía contenida en la molécula. La cantidad de aumento es exactamenteigual a la energía del fotón, es decir Δ E = hn. El proceso de absorción se representa esquemáticamente en lael diagrama de niveles de energía simplificada en la figura 4.

Figura 4. Diagrama de Energía

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Si la molécula se encuentra inicialmente en un estado normal o fundamental, E0, Antes de la interacción, la absorción

proceso aumenta las energycontained en un nivel superior o en un estado excitado, E1. El energyexchange

proceso por la luz absorbida no se atenúa, se produce como por múltiples unidades de energía llamados cuántica.El quantum (gallina) es característico para cada espécimen absorbidas. Para ser absorbida por una molécula, lafotón de energía debe corresponder precisamente a la diferencia,? E, entre los dos estados de energía.

El total potencial energético total de una molécula, excepto la energía núcleo, puede ser considerado como elsuma de las energías electrónicas, de vibración y rotación. Las energías electrónicas están asociadascon las transiciones de los electrones dentro del átomo o molécula. Esta suma de energías está representado enla figura 5 como un cambio en orbitales.


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Figura 5. La energía electrónica

Las energías de vibración y rotación están asociados con las vibraciones moleculares y rotaciones. Enla figura 6 una molécula diatómica sencilla se mostró después de un movimiento de compresión y elongación(Vibración). Una rotación molecular se ejemplifica en la figura 7.

Figura 6. energía vibracional

Figura 7. energía rotacional

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La diferencia entre los estados de energía de rotación es relativamente pequeña, mucho menor que ladiferencias entre los estados de energía electrónicos. La diferencia entre la energía vibracionalestados es intermedia si se compara con los estados anteriores; entonces:

• Absorciones asociados con las transiciones entre los niveles de energía de rotación se encuentran generalmente enla energía de baja o alta región de longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, el control remotoregión infrarroja.

• Absorciones asociados con las transiciones entre niveles de energía electrónica se encuentran en el altoenergía o región de baja longitud de onda, es decir, el ultravioleta visible de la región electromagnéticaespectro.

• Absorciones asociados con transiciones entre niveles de energía de vibración se encuentran entre lados niveles mencionados anteriormente, en la región infrarroja.

Los distintos tipos de transiciones energéticas no son independientes, pero interconectadas. La energía de rotaciónestados se superponen en los estados vibracionales, y ambos se superponen en los estados electrónicos.

2.2.3. UV Vis espectro de absorción

La presencia de insaturaciones o enlaces múltiples son ampliamente conocidos como un proceso característico deabsorción ultravioleta mientras que el compuesto saturado es transparente.

Según la teoría de orbitales moleculares, los electrones implicados en enlaces simples, tales como la C


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enlace H, se llaman sigma electrones ( σ ). Los enlaces dobles, como C = O, implican pi electrones ( π ).En la región del infrarrojo cercano, las transiciones que implican pi electrones permiten una mejor observación de labandas de absorción. Los electrones no unidos a la molécula, contenido en átomos tales como oxígeno onitrógeno, se llaman n electrones, y las interacciones entre pi y n electrones son responsables deun gran número de bandas de absorción ultravioleta característicos.

Un cromóforo es un grupo que, cuando se ha introducido un hidrocarburo saturado, produce unabanda compuesto que tiene y de absorción entre 180 y 1000 nm. Por ejemplo, noctano es unahidrocarburos transparente en esta región saturado; Sin embargo, si un grupo nitrilo se introduce en eloctil radical, el compuesto octilnitrilo se produce. El grupo nitrilo se clasifica como un cromóforoy que mostrar signos de absorción de luz en el rango ultravioleta.

La Tabla 2 muestra un pequeño grupo de cromóforos sencilla con sus longitudes de onda y máximos molarcapacidad de absorción. La absortividad molar es la medida de la intensidad de la banda de absorción. Como se puedevisto, la intensidad de absorción de varios cromóforos en particular varía de un grupo a otro.Sin embargo, todos los miembros de una clase por lo general tienen bandas de absorción igual intensidad y se producen en unrango espectral relativamente estrecho. Por ejemplo, los datos mostraron para el ácido acético son típicas de saturadaácidos carboxílicos resultantes de ácido fórmico a ácido esteárico, C1 a C18, todos ellos con la absorciónbandas en la región de 204210 nm absortivities y molares de 40 a 75.

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Tabla 2. Los cromóforos Grupo

Si se producen uno o más cromóforos en una molécula, sus posiciones relativas determinar el efectoproducido en el espectro. 1hexano tiene una absortividad molar de 10.000 a 180 nm y 1,5hexadienotiene una capacidad de absorción molar de 20000 en la misma longitud de onda. 2,4hexadieno, con la banda en otroregión, tiene una absortividad molar de 25.500 a 227 nm.

La posición y la intensidad de la banda de absorción de 1,5hexadieno son aproximadamente lo quepuede esperar de dos moléculas de propileno individuales. Obviamente, los dos grupos cromóforos estánampliamente espaciados y no interactúan. Sin embargo, cuando los dos cromóforos se conjugan como en 2,4hexadieno, el efecto no es el esperado a partir de dos moléculas individuales.

Similares observaciones de un gran número de compuestos han interpretado la argumentación básica paraalgunas reglas generales:

• Cuando dos cromóforos en una misma molécula están separados por más de un átomo de carbono, elespectro de absorción es una simple suma del espectro de cada cromóforo.

• Cuando dos cromóforos en una misma molécula son adyacentes, se observa la máxima absorcióna altas longitudes de onda y se aumenta la intensidad.

• Cuando dos cromóforos en una misma molécula están unidos a un mismo átomo de carbono, el resultado esintermedio entre los de arriba.

En la espectrofotometría ultravioletavisible, los compuestos más interesantes son por lo general los que tienen


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más de un cromóforo, especialmente cuando los cromóforos están conjugados (sistemas conjugados).Los compuestos con al menos dos cromóforos conjugados absorben dentro de la gama visible. Saturadohidratos de carbono, grasas, aceites, éteres simples, ácidos, la mayoría de los hidratos de carbono y proteínas no absorbenluz en el rango visible, ya que sus estructuras no tienen cromóforos. Las moléculas con la mismacromóforo y la estructura electrónica similar tienen espectros de absorción similar.

La presencia de varios grupos cromóforos vecino cambia el espectro de absorción molecularpersonaje. Los posibles resultantes pueden ser divididos en 4 grupos:

• Efecto batocrómico. El desplazamiento de las bandas de absorción hacia el rojo de la gamaespectro, intensificando así el color.

• Efecto hipsocrómico. El desplazamiento de las bandas de absorción hacia el rango violeta de laespectro (de una longitud de onda inferior).

• Efecto hipercrómicas. Aumento de la intensidad de las bandas de absorción.• Efecto hipocrómica. Disminución de la intensidad de las bandas de absorción.

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Los auxochromes hay grupos que, cuando se introduce en un sistema como un cromóforo, aumentar lalongitud de onda de la banda de absorción máxima, los llamados auxochromes effect.The batocrómicoshaveno propia banda de absorción longitudes de onda Atlow. Por ejemplo, el grupo hidroxilo es un auxochrome.Los alcoholes son transparentes y usados como disolventes en longitudes de onda bajas, sin embargo, la introducción de unagrupo hidroxilo en un sistema que tiene un cromóforo dará lugar a un efecto batocrómico. El típicoauxochromes son los grupos amino y sus derivados sustituidos, halógenos, grupo alcalino yotros.

2.2.4. Efecto de disolventes

El análisis espectrofotométrico en la región UV generalmente se llevan a cabo en soluciones. Bajoconcentraciones del analito de interés se emplean por lo general; disolventes de calidad de alta pureza tienen que estarutilizado desde impurezas puede afectar a los resultados debido a su alta concentración en relación con el analito.Además, disolventes para espectrofotometría UV deben tener un alto grado de estabilidad óptica; Por lo tanto,No se recomienda el uso de disolventes de grado de pureza comercial que difícilmente cumplirán con ellos requisitos antes mencionados.

Carbohidratos saturados, tales como nhexano, son los disolventes más comunes en espectrofotometría UVy debe ser preparado específicamente para este propósito. Sus absorciones electrónicos causados por eltransiciones de electrones se producen fuera de la gama analizado. Solventes con heteroátomos, por ejemplo, H3COH, también se utilizan. Debido a sus transiciones electrónicas, estos disolventes tienen bandas de absorción débiles.Este problema se debe también se centró en función del grado de disolventes de polaridad.

Las bandas de absorción de varias sustancias son más claras y pueden tener estructuras muy bien cuandola medición se realiza en disolventes de baja momento bipolares. Las interacciones disolvente solutos son más fuertescuando se trata de fuertes fuerzas bipolares.

La Figura 8 muestra dos espectros obtuvo utilizando fenol en isooctano y etanol. Se puede observar lainfluencia del disolvente orgánico en la determinación de sustancias.


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Figura 8. fenol en isooctano (____) y etanol ()

Una diferencia en el pH también puede conducir a fluctuaciones en el caso de este desplazamiento de longitud de onda.

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2.3. Descripción básica del sistema

El sistema, figura 9, que incluye un espectrofotómetro UVVIS, comprende:

1. Fuente de luz2. monocromadorCompartimento 3. Muestra4. Detector5. Sistema de Lectura

Figura 9. UVVis

2.3.1. Las fuentes de radiación

La espectrofotometría UVVis requiere fuentes que pueden producir radiación continua en el espectralregiones de interés. La radiación de fuentes de energía consisten en material que puede ser excitado por eléctricacalefacción o de descarga de alta tensión. Al regresar a los niveles energéticos, los materiales excitados emitenfotones que tienen energías que corresponden a las diferencias entre las energías de excitadoestados y las energías de los estados fundamentales. Algunos materiales tienen tan numerosos y cerca energéticaniveles que las frecuencias emitidas forman una gama relativamente amplia de radiación continua.

Las fuentes de radiación utilizados en la producción de equipos de espectrofotometría UVVis debecumplir con algunos requisitos:

• La fuente debe proporcionar un haz con la suficiente potencia de radiación para permitir la detección pormedios apropiados.

• La fuente debe generar radiación continua, es decir, que comprende todas las longitudes de onda dentro de laregión espectral que el equipo funcione.


Ranura de entrada

Dispersión Elemento

Ranura de salida

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• La fuente debe ser estable, es decir, la potencia del haz de luz generado debe permanecer constantedurante las determinaciones. En el equipo de haz único, esta condición es crítica de manera que lamedidas de absorbancia se pueden reproducir. En los equipos de doble haz, que son al mismo tiempomedido; por lo tanto, una alta estabilidad de la fuente no es tan crítica.

La fuente más adecuada para la obtención de radiación continua en la región visible es el cristallámpara incandescente de tungsteno bombilla. El filamento opera a 26003000K, el suministro continuoradiación 350 a 2500 nm. La energía emitida en la región visible varía aproximadamente conel cuarto potencial de la tensión de operación; Por lo tanto, la fuente requiere un estricto control de voltajepara generar los reguladores de radiación o de tensión electrónico.

Las fuentes de radiación ultravioleta más utilizados son las lámparas de descarga de hidrógeno o deuterio conventana de cuarzo. Cuando a baja presión y sujetas a descarga eléctrica, hidrógeno produce unaviga continua en la región ultravioleta. La lámpara de deuterio produce un espectro continuo180380 nm.

Cuando se opera, las lámparas de xenón de alta frecuencia producen impulsos de radiación que cubren el espectro1801100 nm.

2.3.2. Monocromador (óptico)

Monocromadores son dispositivos basados en redes de difracción que dispersan la radiación complejos en sulongitudes de onda de los componentes y luego aislar el rango espectral deseada. Monocromadores permiten la libreaislamiento de longitud de onda espectral puro y muy estrecho varía a lo largo de la estrecha ultravioleta, visibley regiones de infrarrojos.

El rendimiento fotométrico de un espectrofotómetro está directamente relacionado con el monocromadorla calidad (sistema óptico).

El ajuste monocromador debe proporcionar alta resolución de la longitud de onda muestra analizaday, al mismo tiempo, una mayor cantidad de luz transmitida y una baja cantidad de luz espuria(Cantidad de luz que no fue debidamente aislado por el sistema óptico). El ajuste del sistema óptico tiene quepermitirá:

• · Alta eficiencia de transferencia entre la fuente de luz y el monocromador.• ranura de salida del monocromador adecuado para evitar la pérdida de luz excesiva.• Mayor enfoque del haz de la fuente de luz sobre la muestra.

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La Figura 10 muestra un monocromador utilizado normalmente en la fabricación de UVVisespectrofotómetros.

Figura 10. "Czerny Turner" monocromador

Hay, además, otros ajustes habituales, tales como: Littrow, Ebert y rejilla cóncava. Estosconfiguración monocromadores se pueden ver en los siguientes tipos de espectrofotómetros UVVIS:

• solo haz espectrofotómetros UVVis• Diodos Arreglo espectrofotómetros UVVis• Haga doble haz espectrofotómetros UVVis

2.3.2.1. De haz único

En este tipo de espectrofotómetro, la dispersión del haz de luz del monocromador está totalmente centrado enel compartimento de la muestra y, como resultado, la luz no absorbida se dirige al sistema de detecciónque comprende un detector; por lo general es del tipo fotodiodo.

La fabricación de dispositivos de un solo haz requiere componentes de precisión estable de alta calidad. Laespectrofotómetros de lectura directa operan con precisión moderada alrededor de ± 1% de transmisión;estos son relativamente baratos y fáciles y rápida de operar los dispositivos de fácil mantenimiento. La soladispositivo de haz requiere la incorporación de circuito de cero para medir la transmitancia a fin de mejorarla precisión del trabajo.

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2.3.2.2. Diodos disposición

Este tipo de espectrofotómetro tiene una configuración monocromador simple, figura 11, utilizando unarejilla de difracción individual y un sistema de detección que comprende varios fotodiodos; una luz policromáticahaz alcanza el compartimiento de la muestra y justo después de la luz transmitida se dirige a la


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monocromador; después de la dispersión, la luz llega al sistema de detección.

Figura 11. monocromador Polychromatic

2.3.2.3. Doble haz

Los espectrofotómetros de doble haz separan la radiación inicial en el espacio (por medio de un espejo)o en el tiempo (por medio de un espejo giratorio sectorial). Este tipo de espectrofotómetro se utiliza típicamenteen los análisis que requiere mayor precisión analítica. El haz de luz dispersa en el monocromador(Figura 12) está sincronizado por un dispositivo óptico que llevará a cabo la viga tanto a una muestracompartimento (también llamado haz analítica) y otro compartimento de referencia (también llamado de referenciahaz). La luz transmitida a ambos compartimentos se sincroniza de nuevo con el sistema de detección;como resultado, las interferencias pueden ser eliminados, tales como: fluctuaciones fuente de energía, tensión eléctricavariaciones, así como el disolvente utilizado en la preparación de la muestra.

Por lo tanto, las fluctuaciones de energía de origen, la respuesta del detector y la ganancia del amplificador se compensan con ladiferencia en las señales. Los espectrofotómetros de doble haz son mecánicamente y electrónicamente máscomplicado que los dispositivos de un solo haz y, como resultado, la construcción y el mantenimiento son máscaro.

Figura 12. monocromador de doble haz

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Difracción de cuadrícula

Ranura de entrada

Compartimiento de la muestra

SincronismoDispositivos Ópticos

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2.3.3. Compartimentos de la muestra

El compartimiento de muestras del espectrofotómetro UVVis cuenta con una amplia gama de conexiones yaccesorios que permiten ampliar las posibles aplicaciones del instrumento. Las muestras básicascompartimento está equipado con un soporte de la muestra rectangular para cubetas de cuarzo de 10 mm. Conformea la aplicación, es posible introducir soportes para las muestras de cubetas que varía de 1 100 mmde largo.

2.3.3.1. Acoplador de fibra óptica

En varios casos, el espectrofotómetro se utiliza clásicamente para medir soluciones, es decir, usandocubetas. Sin embargo, algunas muestras son difíciles de analizar debido a su tipo o volumen. A fin de quefacilitar el análisis de dichas muestras, un sistema de acoplador de fibra óptica se puede utilizar; algunos beneficios son


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alcanzado:

• Manipulación de muestras que serán a altas temperaturas y / o presiones o radiadas se evita.• Medición de muestras verysmall, tales como cristal, o verylargesamples, como la estructura de metal

ventanas que, de lo contrario, nunca podría hacerse uso de dispositivos con la configuración normal.• Seguimiento de los procesos químicos.• Determinaciones en sistemas cerrados (reactores).

Una serie de sensores de fibra óptica se puede utilizar para alcanzar el objetivo anterior, tales como reflectancia,de absorbancia, la transmitancia de vidrio y de fluorescencia sensores.

2.3.3.2. Sipper

Un sistema que comprende una bomba peristáltica se puede utilizar para bombear la solución de muestra a una cubeta de flujosin requerir la transferencia manual de la muestra a la cubeta, reduciendo así el manejo de la muestra.Tales cubetas de flujo se pueden colocar en soportes especiales que pueden calentar la muestra.

2.3.3.3. Soporte para muestras sólidas

Este tipo de apoyo es brindar a los resultados analíticos en muestras sólidas transparentes, como lavidrios, plásticos y lentes. Además de la conexión del instrumento fácil, este apoyo también puede teneruna versión en la que la muestra transparente viaja en frente del haz óptico a fin de obtener laperfil de la homogeneidad de la muestra.

Un dispositivo de rotación se puede utilizar para comprobar el comportamiento de esta muestra sólida y transparente, pero tenerdiferentes ángulos de radiación incidente.

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2.3.3.4. Accesorios de reflectancia

Solid muestras no transparentes pueden ser analizados y el perfil de la muestra (espectro de reflectancia) pueden serobtenido. Hay varios tipos de accesorios de reflectancia disponibles y que se pueden acoplar a laespectrofotómetros, por ejemplo: espejo de reflectancia, la reflectancia difusa, de temperatura controladay la reflectancia de presión, los polvos y cremas reflectancia y comparaciones de color de la muestra sólidas.

2.3.4. La adquisición de datos

Los dispositivos fotosensibles utilizados en aparatos de medición de transmitancia convierten la energía radianteen una señal eléctrica. Los detectores fotosensibles deben responder a la energía que irradia en unamplio rango espectral. Ellos deben ser sensibles a bajos niveles de luz e responder rápidamente al incidenteradiación. Es crucial que la señal eléctrica generada es directamente proporcional al haz incidentepoder, es decir,

R = kP + k '

Donde R es la respuesta eléctrica del detector en las unidades actuales, resistencia o emf La constante k es unmedida de la sensibilidad del detector en términos de respuesta eléctrica por unidad de radiar energía. Ciertodetectores muestran un pequeño respuesta k 'llamada corriente oscura, incluso cuando no están recibiendo incidente


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radiación. Los detectores de energía que irradia utilizan actualmente en la fabricación de mediciónequipos son fotodiodos o fotomultiplicadores.

Las señales detectadas por el fotomultiplicador o fotodiodos después de la amplificación generan una longitud de ondaX transmitancia o absorbancia intensidad gráfica llaman espectro ultravioletavisible. La identificaciónes posible mediante la comparación de este espectro con el espectro de una sustancia estándar. La cuantificaciónTambién es posible mediante la fijación de una longitud de onda y la obtención de la transmitancia o la absorbancia correspondientevalor. Este valor será proporcional a la concentración de componente de la muestra. El realconcentración se determina mediante el uso de un estándar con una concentración conocida.

2.4. Requisitos mínimos de instalación y operación

Con el fin de asegurar resultados confiables en el cumplimiento de los requisitos de la calificación de instalación (IQ),los requisitos de instalación y funcionamiento se han de cumplir; en este caso, lo siguiente puede sermencionado:

• Red eléctrica: que cumpla con las especificaciones del fabricante, con especial interés para laestabilización de la red eléctrica.

• Instrumento situado bajo condiciones de humedad y temperatura apropiadas.• Conocimiento operacional para utilizar el equipo correctamente.

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2.5. Precauciones básicas

Algunos se deben tomar precauciones para mantener la vida y el rendimiento del equipo. Tales precaucionesestán relacionadas con dos tipos de acciones: las acciones del usuario y acciones de mantenimiento preventivo que generalmente tomanel fabricante. Esta sección trata sobre las acciones del usuario. Las acciones del fabricante se describen enla sección de cheques rendimiento.

Acciones diarias a realizar por el usuario son cruciales para reducir los daños que se pueden causar a lainstrumento. Tales acciones son normalmente simples y pueden resumirse como sigue:

• Limpieza externa Equipo.• compartimentos de la muestra de la limpieza.• Cubetas de lavado.• Consulte al distribuidor manuales / equipo para aclarar las dudas de funcionamiento / mantenimiento.• Limpieza de las ventanas de la sala de interconexión los haces de luz y los compartimentos de la muestra.• El uso de material de seguridad al manipular muestras es fundamental para la seguridad del operador. El personal

equipo de protección requerido incluye: delantal seguridad, guantes quirúrgicos y de gran visión gafas.

El equipo debe tener los consumibles de forma que, se requiere, el propio operador puede tomar accionescomo el cambio de lámparas. Los principales artículos de consumo requeridos incluyen:

• deuterio y wolframio lámparas o lámpara de xenón.• cubeta de cuarzo.


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3. CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)

3.1. Introducción

La cromatografía de gases es una técnica analítica utilizada para separar mezclas de sustancias químicas.El propósito de la técnica es permitir una separación que ayuda en la identificación y la cuantificación de lasustancias contenidas en la mezcla.

Como el elemento principal utilizado en la técnica de cromatografía de gases (GC), la primera cromatográficacolumnas se envasaron en un tubo típico entre 1 a 5 m de largo y 2 a 4 mm de diámetro. Como elActualmente se utilizan analíticas instrumentación avanzada, tubos abiertos de sílice fundida (capilares), lalongitud de los cuales intervalo de 10 a 100 m y los diámetros internos de 0,1 a 0,8 mm, por lo tantoproporcionando mejores resultados.


La muestra se introduce en el sistema usando una jeringa o una válvula de inyección. La muestra se volatilizajusto después de ser introducido en el sistema de cromatografía y se disolvió en un gas portador inerte(Fase móvil). Cuando se disuelve en el gas, esta muestra se llevará a la cromatográficocolumna que contiene la fase líquida o sólida como una fase estacionaria, separando así los compuestos enesta columna. La separación se lleva a cabo debido a que los componentes de la muestra tienen diferentes afinidades conla fase estacionaria, lo que resulta en diferentes velocidades de elución de los componentes de la columna, es decir,cuanto mayor es la afinidad del componente a la fase estacionaria, más lento viajará a travésla columna y viceversa.


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Figura 1. Esquema básico de un proceso de separación por cromatografía

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Inyección Migración Elución

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Después de la separación, los componentes de la muestra alcancen el detector que genera una señal eléctrica pormedio de un fenómeno físicoquímicas (por ejemplo, la diferencia en la conductividad térmica, la llamaionización). Estos detectores pueden ser selectivo a un grupo químico determinado (por ejemplo,compuestos organoclorados) y más sensible para el análisis. Como la señal es por lo general en un muyde baja intensidad, se amplifica y se transmite a una estación de datos donde se puede ver en una señal deintensidad X gráfico de tiempo. Este gráfico se llama un cromatograma. La señal es proporcional a laconcentración o masa de cada compuesto; no debe haber diferentes respuestas de un compuestoa otro (el compuesto más abundante no siempre generar la señal superior). Por esta razón,la muestra se puede cuantificar.

El GC permite el análisis de diferentes materiales, incluyendo algunos gases inorgánicos tales como O2, CO,

Colorado2, NO

2, Etc., así como miles de sustancias orgánicas de varios grupos funcionales, tales como,

alcoholes, cetonas, aminas, compuestos aromáticos y otros. Mediante el uso de detectores altamente selectivos, es posibledeterminar cantidades muy pequeñas de componentes contenidos en la muestra, por ejemplo, en el orden depicogramos (huellas); así como mayores cantidades, por ejemplo, en el orden de porcentaje.


Un sistema básico incluye los siguientes módulos:

1. Sistema de los gases: Los gases más comunes utilizados como fase móvil (gas portador) son helio, hidrógeno,argón y nitrógeno. Otros gases pueden ser también utilizados. Se requiere el uso de gases auxiliares dependiendodel detector a ser empleado.

2. Flujo y presión controladores: Se utilizan para mantener la uniformidad de salida de la fase móvil. Ellos sonutiliza, además, para medir la relación de división de la muestra (splitter), cuando inyectores para columnas capilaresy también se utilizan para controlar el flujo de salida de los gases auxiliares de los detectores.

3. Inyectores: lugar donde una muestra se introduce efectivamente en el sistema. Los inyectores pueden serdiseñada para columnas de relleno o capilar; existen diferentes técnicas para el uso de los mismos (en sitiocolumna, vaporización instantánea, dividir, sin división, etc). La muestra puede ser también introdujo mediante muestreoválvulas, principalmente para los gases. La automatización puede ser utilizado para aumentar la productividad y reproducibilidad.

4. Columnas: Las sustancias contenidas en la muestra se separan dentro de las columnas. Las columnaspuede estar hecho de vidrio, acero inoxidable, níquel, teflón o sílice fundida; que pueden ser empacados o capilar.Las columnas capilares permiten mejores separaciones.

5. Detectores: Los dispositivos que controlan la salida de sustancias eluidas de la columna, generando unaseñal eléctrica que es proporcional a la masa de sustancia o de la concentración. Los detectores pueden serde los de tipo selectivo o universalismo. Estos detectores están conectados a amplificadores de señal, llamadaelectrómetros, que amplifican la señal y transmitirla a los dispositivos de datos de salida.

6. Los datos de adquisición y procesamiento del sistema: Un sistema que recoge los datos generados en elcromatógrafo, realiza los cálculos necesarios para cuantificar las sustancias ygenera el cromatograma. Este sistema puede ser integradores o software de integración (PC).


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Figura 2. Cromatografía de gases del sistema (GC)

3.3.1. Gases utilizados

Dos clases de gas se pueden utilizar en el sistema cromatográfico: gases portadores (fase móvil) ylos gases auxiliares.

Los gases portadores más habituales son nitrógeno, argón, hidrógeno y helio. El gas más indicadoes el helio, debido a la mejor rendimiento cromatográfico en comparación con otros gases; sin embargo,algunos aspectos decisivos al momento de elegir el gas portador se deben considerar:

• compatibilidad Detector: es crítico para determinar que el gas portador es compatible con eldetector y dar lugar a una pérdida de sensibilidad o excessivenoise. Por ejemplo, al analizar hidrógenogas en TCD, nitrógeno y argón imparten una mayor sensibilidad que el helio, como la conductividad térmicadiferencia entre los dos primeros y los gases de hidrógeno es mayor que la conductividad térmicadiferencia entre el hidrógeno y el helio;

• Costos;• Disponibilidad;• Rendimiento;• Pureza: La pureza de los gases debe ser respetada, dependiendo de la aplicación. La

manuales de los fabricantes contienen toda la información requerida.

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PortadorGas

PresiónControlador

GCNeumática

Inyector

Columna

Detector

Columna Horno

Cromatograma

Puesto de trabajo

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3.3.2. Flujo y controladores de presión

El flujo o presión del gas portador es un parámetro importante que depende del diámetro de la columnay la longitud. Se debe controlarse durante el análisis. Este control se realiza usando flujo opresión mando de válvulas. Este parámetro se puede ajustar manualmente, con la ayuda de un medidor de flujoo un medidor de burbuja, o electrónicamente mediante un software; el propósito es obtener una mejor cromatográficala eficiencia.

Para los gases auxiliares, se requiere un control desde el ajuste de flujo es fundamental para alcanzar el mejorrendimiento.

3.3.3. Inyectores

La función básica de un inyector es introducir la muestra en el sistema cromatográfico. Eninyector, los contactos de la muestra del gas portador y se disuelve en ella. Por lo tanto, en el caso demuestras líquidas, el inyector tiene que ser calentado a fin de asegurar una volatilización total de la muestra.

Hay dos categorías de inyectores: inyectores para las columnas y los inyectores para llevar para columnas capilares.Muestras gaseosas pueden ser inyectados con la ayuda de una válvula de muestreo de gas proporcionado o no con unainyector en serie con la válvula. Para cada clase de inyectores, algunas opciones están disponibles dependiendo dela aplicación.

3.3.3.1. Almuerzos para inyectores

Estos inyectores se utilizan con columnas de relleno. Se pueden utilizar en columnas capilares de tipo megabore(Diámetro interno de la columna:> 0,53 mm). Toda la muestra se inyecta directamente en la cabeza de lacolumna cromatográfica. Esto es para eliminar cualquier pérdida cuando se transfiere la muestra a lacolumna. Este inyector está indicado para limpiar y se diluye muestras, además de muestras que tienen un granvariación de la volatilidad de los compuestos.

Figura 3. Embalado inyector

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InyectorCuerpo

Tabique

GasEntrada

Columna

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3.3.3.2. Inyectores capilares

Inyectores diseñados para su uso en columnas capilares. Los inyectores principales incluyen:


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• Dividir / splitless inyector: Los inyectores más utilizados. Permite que las muestras que se dividen (split)a fin de permitir el uso de columnas capilares (ya que son capaces de recibir una pequeña cantidad dede la muestra). Hay dos modos de funcionamiento:

• Modo Split La muestra inyectada se divide entre la columna y la toma de eliminación inyector(Ventilación). La válvula a cargo de esta acción de división se llama divisor y se usa con concentradomuestras (en el orden de mg / ml).

Modo splitless Usado con muestras diluidas. En este caso, el divisor permanecerá cerrada durante elsoluto transferencia a la columna; A continuación, el divisor se abre para disponer el disolvente.

Figura 4. de Split / splitless inyector

• En la columna y / o inyector de temperatura programable: Permite dos modos de funcionamiento:• En la columna de la inyección Para muestras con amplio rango de peso molecular, lo que elimina la masa

efecto la discriminación.• inyección en columna con temperatura programable Por la baja temperatura de ebullición o baja

muestras termolábiles concentración. Conocido en el mercado como PTV o SPI inyector.

Figura 5. temperatura del inyector programable

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PortadorGasEntrada

TabiquePurga

InyectorDisposición

InyectorDisposición

Columna

TabiqueTabique PurgaGlass LinnerEnfriamiento de entrada

EnfriamientoSalida

InyectorCuerpo

Calentador PortadorEntrada de gasTuercaLavadoraColumna

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3.3.4. Columnas

La columna es la parte principal del sistema cromatográfico donde la separación de la muestracomponentes tiene lugar como resultado de las diferentes afinidades de las sustancias con el estacionariafase, migrando a diferentes velocidades a través de la columna. Las columnas se pueden clasificar en dosgrupos:

• Embalado columnas: Las columnas antiguas cromatográficas. Por lo general, hecho de acero inoxidable o de vidriotubos, sin embargo, se pueden utilizar otros materiales. Un relleno (un adsorbente o un soporte sólidoimpregnado con una película de una sustancia que tiene una presión de vapor baja) se introduce en este tubo.Actualmente, estas columnas no se utilizan con frecuencia debido a la menor rendimiento en comparación


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a las columnas capilares. Almuerzos columnas son más comúnmente utilizados en el análisis de inorgánicagases.

Columnas capilares: Las columnas más utilizados actualmente. Por lo general son de fundidotubos de sílice recubiertas externamente con una película de poliamida, con lo que la columna muy flexible. Lafase estacionaria (una película o un adsorbente sólido) se deposita en la pared interior. Este tipo de columna tienegran capacidad de separación y una amplia gama de sustancias pueden ser separados por cada tipo de columna.La elección de fase determina la selectividad de la columna. Cientos de fases estacionarias están disponibles enel mercado con varios nombres comerciales. Por lo general son elegidos en función de la polaridad de lasustancias a analizar. Fases estacionarias polares suelen ser más reactiva, por lo tanto tener un trabajola temperatura límite inferior de las columnas no polares.

Figura 6. Tipos de columnas capilares

Para elegir la columna más adecuada, los siguientes parámetros deben ser evaluados:

Columnas de longitud y el diámetro interno Espesor de la película (capilar); Fase estacionaria líquida; soportes sólidos; Fases estacionarias sólidas.

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POLIAMIDAPELÍCULA

DERRETIDOSILICATUBE

ESTACIONARIOFASE WCOT

PARED DE CINETUBO ABIERTO

SCOTSOPORTE DE PAREDTUBO ABIERTO

PARCELALecho porosoTUBO ABIERTO

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3.3.4.1. Horno Columnas

La columna cromatográfica se almacena en el horno. Para cada tipo de análisis, el horno debe serajustado a una temperatura de trabajo; A esta temperatura, los componentes de la muestra de interés se separany que tiene el tiempo de elución más corto.

Un buen horno tiene una precisión de medición y un amplio uso range.The programación rampa de criogeniapermite el análisis de los compuestos más volátiles.

3.3.5. Detectores

Hay varios tipos de detectores: detectores universales (conductividad térmica (TCD), MisaEspectrometría (MS)), y detectores selectivos o específicos (de ionización de llama (FID), electrones Capture

Tabla 1. Tipos de detectores y su uso


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Se discutirán los detectores más utilizados en la cromatografía de gases (GC).

3.3.5.1. Detector de ionización de llama (FID)

El detector más utilizado. Algunas características incluyen: fácil manejo, alta sensibilidad y la incomparablelinealidad. La siguiente figura muestra un esquema del detector FID.

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Figura 7. Detector FID

El funcionamiento del detector implica una mezcla de gases, aire e hidrógeno, formando así una llama que tieneuna temperatura de aproximadamente 2000ºC. La muestra se quema en esta llama. Un par de electrodos está posicionadocerca de la llama para capturar la señal generada por las muestras ionizados y los electrones resultantes delas sustancias quemados en la llama.

Este detector genera una señal correspondiente a los compuestos que tienen carbono e hidrógeno ensu molécula. Raras excepciones incluyen CS

2.


Cerámicoaislante

Coleccionista

Sonda de señal

Sonda de encendidoPrimavera de encendido

Punta de la llama

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El detector debe funcionar ata temperatura de unos 400º C.However, la temperatura elegidadebe asegurar que las sustancias eluidas de la columna no se condensan.

Las concentraciones típicas para ser analizados incluyen la gama de bajos (ppb) para valores altos (%).

3.3.5.2. El nitrógeno y el fósforo (NPD) o detectores termoiónico específicos (TSD)

El detector tiene respuesta selectiva a compuestos que contienen átomos de nitrógeno o de fósforo.Internamente, el detector tiene una sal de rubidio incorporado a una perla refractario sujeta a la aprobaciónde gases, el aire y el hidrógeno. Cuando calienta eléctricamente, la perla produce un plasma gaseoso a 600 a900ºC.

El plasma producido de esta manera es suficiente para hacer que los extremos N y Pque contienen sustancias responden a ladetector.

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Figura 8. TSD o detector NPD

3.3.5.3. Detector de captura de electrones ECD

Este detector es sensitiveto moléculas que tienen altos átomos de afinidad electrónicos y tiene dentro de un radiactivofuente, típicamente63Ni, que emite partículas beta. Estas partículas se ionizan el gas portador, normalmente nitrógeno,y generar una nube de electrones dentro de la célula ECD. Los electrones producen un fondo establecorriente a través de los electrodos de la celda de DIT. Esta señal es amplificada por el electrómetro detector.Cuando una muestra de electrones, absorbente pasa a través de la celda, la corriente se disminuye como unaresultado de los electrones captura por el espécimen absorbentes, disminuyendo así el número de electronesen la célula.


Coleccionista

CerámicoPerla

H2 y MaquillajeAire

Columna

Llama Sugerencia

Cerámica Aislante

Señal de la sonda

Perla Sonda

Níquel Fuente

Nube deLos electrones

Aislamiento

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Figura 9. detector ECD

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Célula

ColeccionistaElectrodo

Maquillaje

Columna

Aisladores de cerámicaSeñal de la sonda

Sonda celular

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3.3.6. Adquisición y procesamiento de datos

Adquisición y procesamiento de datos se discutieron en el punto 4.6 de la técnica HPLC.


Con el fin de asegurar resultados confiables y reproducibles en el cumplimiento de la cualificación de la instalaciónRequisitos (IQ), las condiciones del lugar de instalación deben ser verificados. Para ello, lasiguientes condiciones se pueden mencionar:

• Red eléctrica: es necesario para comprobar que la tensión de la red eléctrica es de conformidad conla especificación del equipo. Estabilización de red y la posición tapones de salida (fase invertida)deben tener una atención especial, ya que pueden interferir con el funcionamiento y la vida del equipo.

• Condiciones ambientales: El instrumento debe instalarse sólo si la humedad local ycondiciones de temperatura son apropiadas para la operación. Además, las condiciones de seguridad, tales comola proximidad a los agentes inflamables y corrosivos debe evaluarse.

• La pureza de los gases: En caso de estar de acuerdo con los requisitos del sistema de cromatografía, principalmenterelativa a los detectores.

• Gases Filtro: Debe ser utilizado para asegurar la calidad de los gases utilizados y las líneas de gas del sistema.En caso de ser reemplazado en forma periódica.

• Reguladores de presión: Debe asegurar las presiones de trabajo mínimas especificadas para el equipo.En caso de ser también provisto de dispositivos de seguridad, como de doble etapa y diafragmas metálicos.

• Conocimiento operacional de los equipos: Para el uso correcto de los equipos.

Tabla 2. La pureza de los gases


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A fin de asegurar buenos resultados, se requieren algunas precauciones cuando se trabaja con GC. Estos sonpor lo general procedimientos simples, pero importantes de modo que el equipo puede funcionar correctamente.

Una de las precauciones más comunes está cambiando el tabique inyector típicamente entre 30 y100 inyecciones, dependiendo de la técnica de inyección (manual o automático). El insertor vidrio inyectores también un elemento muy importante para el buen funcionamiento del equipo. Por lo tanto, la sustitución esrequerido de acuerdo con la aplicación y el uso.

Otra precaución relevante se refiere al uso de las columnas que deben ser condicionados ysujeto a la limpieza térmica cuando sea necesario. Al calentar la columna, se debe tener no tomarsobrepasar el límite térmico fase estacionaria.

En cuanto a los gases, además de las precauciones de pureza discutidos anteriormente, es importantereemplazar los gases de filtros cuando sea necesario y también comprobar regularmente la presión del cilindro para evitar completautilizar, evitando así la contaminación de vez en cuando por el aire del medio ambiente admitido por difusión.

Se recomienda limpiar los detectores cada seis meses o cada vez disminución de rendimientoocurre. Los procedimientos de limpieza se describen en los manuales de funcionamiento del equipo.

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4. Cromatografía líquida (LC)

4.1. Introducción

Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) se creó cuando la cromatografía líquida eraaplicada a las teorías e instrumentaciones originalmente desarrollado para cromatografía de gases.

La cromatografía líquida de alta indispensable (HPLC) se pone de relieve en la actualidad entérminos de métodos de separación modernas. La diferencia entre la cromatografía líquida y de altacromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se basa en el uso de fases estacionarias preferiblemente conmicropartículas esféricas (10.5 o 3 mm). Ya que son mucho menos permeable, se requiere que tales fasespara el uso de bombas para eluir la fase móvil.


La separación cromatográfica se basa en la migración diferencial de los componentes de una mezcla dedebido a las diferencias entre dos fases inmiscibles, las fases móvil y estacionaria, y cuandoampliación de las bandas dependiendo de los procesos físicos y no la diferencia en equilibrio. Estosinteracciones pueden tener lugar byhydrogen interacciones de bonos, las interacciones electrostáticas e hidrofóbicasy las fuerzas de Van der Waals, y otros.

Los resultados de la migración diferencial de la diferencia equilibrio entre ambos analitos inmisciblesfases, siendo determinados por factores que afectan este equilibrio: las fases móvil y estacionariacomposición y la temperatura de separación. Los cambios de cualquiera de estos factores conducen a cambios en elmigración diferencial.

La clasificación cromatografía líquida de acuerdo con la fase estacionaria dio lugar a una amplia variedad.La primera gran división fue la cromatografía de adsorción y la cromatografía de reparto,refiriéndose a las fases estacionarias sólidas y líquidas, respectivamente. Tomando la naturaleza de las interaccionesy los fenómenos anteriormente mencionados en consideración, los modos de separación pueden ser clasificados comosiguiente: cromatografía de fase inversa, cromatografía de fase normal, cromatografía de pares iónicos(Intercambio iónico) y cromatografía de exclusión.

Si el líquido, las fases estacionarias pueden ser simplemente adsorbidos sobre un soporte sólido o inmovilizados en él. Enel primer caso, la cromatografía se denomina como cromatografía de partición.

La cromatografía de reparto fue reemplazado por la cromatografía de fases ligadas químicamente porvirtud de la mayor estabilidad impartida en comparación con las fases líquidas adsorbidas. Estas fases,que tiene soportes modificados, se consideran por separado por que difiere de los otros dos modos en términosde mecanismo de separación.

El gran desarrollo cromatográfico obtenido de las fases líquida químicamente acotadas lideradosestas fases que se utilizan principalmente en HPLC analítica.

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4.2.1. Modos de separación:


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Siempre hay dependencia entre la eliminación de solutos móvil, fase y móvilsoluto estacionariainteracciones de fase en fase estacionaria. Entonces, la elección del modo de separación depende de la elecciónde las fases estacionarias y móviles para cada clase de soluto.

Se propusieron dos modos de retención en cromatografía líquida. El primero por Scott y Kucera,interacción disolvente, y el segundo por Snyder, competencia disolvente. Los dos modelos son equivalentes,ya que tanto considerar que en una separación dada, la interacción del soluto con la fase estacionariapermanece constante. Por lo tanto, la retención está determinada por la composición de la fase móvil.

4.2.1.1. Cromatografía de fase normal

La fase estacionaria es más polar que la fase móvil; Lo contrario ocurre en modo inversocromatografía. Los disolventes utilizados son generalmente una mezcla de disolventes orgánicos sin la adiciónde agua. Las fases estacionarias son adsorbentes orgánicos (sílice, alúmina) o delimitado químicamentefases polares (ciano, diol, fenilo, amino).

Ambos modelos de retención, la interacción disolventedisolvente y la competencia se han utilizado con éxito paradescribir el efecto de la fase móvil en cromatografía líquida de modo normal. Independientemente delmodelo utilizado, la retención en incrementos de fase normal a medida que disminuye la polaridad de la fase móvil.

Este modo cromatografía se aplica principalmente a moléculas neutras, aunque puede ser también utilizado paraionizante separado o moléculas iónicas.

El orden de elución respeta la siguiente secuencia: moléculas hidrofóbicas (menos polar) se eluyenen primer lugar, mientras que las moléculas hidrófilas (más polar) se conservan.

Cuando la disolución de muestra tiene problemas en disolventes polares, la inyección de fase inversa es difícil;Se recomienda entonces la separación de fases normal.

El disolvente de elución en el modo normal es seleccionado por la elección de un disolvente débil y mezclándolo con unasolvente fuerte para alcanzar la resistencia deseada.

La presencia de trazas de agua en la fase móvil es la principal causa de la mala reproducibilidad de retencióncuando se trabaja en una fase normal, especialmente cuando sílice sin modificar, se utiliza como fase estacionaria.Este problema ha sido resuelto por el uso de disolventes anhidros con un volumen conocido de agua,metanol o ácido acético para desactivar los grupos silanol más reactivos de la fase estacionaria. Ademásmejorar la reproducibilidad, sino que también mejora la forma del pico. Este mismo efecto se puede conseguir porla adición de trietilamina, un compuesto esencial en la separación de aminas en gel de sílice.

El uso sílices modificadas químicamente en elución modo normal se ha preferido, ya que ofrecensitios de interacción con el soluto, además de una superficie más homogénea en comparación a la sílicegel que tiene una variedad de grupos silanol con diferentes polaridades. Las fases delimitadas químicamente

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útil para la cromatografía de compuestos moderadamente polares. Sin embargo, estos solutos pueden ser tambiénresuelto de manera eficiente en la elución modo inverso. La elección entre elución normal o inversa modo espor lo general más dependiente de la matriz que el soluto.

4.2.1.2. Cromatografía de fase inversa

Mientras que en la cromatografía en fase normal en una fase estacionaria es más polar que la fase móvil,en el modo de invertir la fase móvil es más polar que el estacionaria. La fase inversacromatografía se utiliza más comúnmente en HPLC, ya que permite la separación de una amplia variedadde solutos y el uso de fases móviles acuosas. La fase móvil más utilizado es una mezcla de


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acetonitrilo / agua; cuando sea necesario, acetonitrilo se sustituye con metanol y tetrahidrofurano (THF).El uso de sólo tres disolventes es el resultado de la pequeña cantidad de disolventes orgánicos miscibles con agua. Enel modo normal, una gama más amplia de disolventes está disponible.

El principio de la separación de fase inversa es la hidrofobia, se atribuye principalmente a lainteracciones entre la porción no polar del soluto y la fase estacionaria, es decir, la repulsiónde esta porción del soluto por la fase móvil acuosa.

Vale la pena subrayar que la fuerza disolvente en incrementos de fase inversa como la polaridad del disolventedisminuye. Por lo tanto, la fuerza del agua (disolvente más débil) es menor que el metanol, acetonitrilo,tetrahidrofurano y fuerza diclorometano, teniendo en cuenta el orden creciente (véase el cuadro 1). Comosustancia insoluble en agua, diclorometano no se utiliza en la fase inversa; Sin embargo, comodiclorometano es un disolvente muy fuerte, a veces se utiliza para limpiar las columnas de fase inversacontaminada por solutos fuertemente retenidas.

Tabla 1. Comparación entre los puntos fuertes de distintas fases móviles

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Además de ser utilizado en un rango de baja absorción en el ultravioleta, resultados de acetonitrilo en soluciones acuosascon baja viscosidad (según se desee). Por lo tanto, junto con metanol y THF, estos son los másdisolventes comúnmente utilizado para controlar la selectividad y la separación modo de elución inversa.

Cuando por alguna razón no se utiliza agua en la fase móvil y la fase estacionaria apolar se utilizan,la cromatografía se llama cromatografía de fase inversa no acuoso. Esta cromatografíase usará cuando se trabaja con solutos altamente hidrofóbicos, tales como lípidos y polímeros; el disolventepor lo general consiste en una mezcla de disolventes polares, tales como acetonitrilo o metanol (disolvente A), con unadisolvente más débil (B), tal como THF, cloroformo, diclorometano, acetona, éter metiltbutilo. Eneste caso, la retención también se cambia por el porcentaje de disolvente B.

Hay otras modalidades de compuestos cromatografía iónica o cromatografía de exclusión por tamaño(Permeación en gel y filtración, aplicados a las separaciones de tamaño de las moléculas, por ejemplo, polímeros,biopolímeros, proteínas, péptidos, etc.). A medida que se apenas se aplican en la separación de las drogas ymedicamentos, estas modalidades no serán discutidos en el presente documento.

Otro aspecto importante participación de las separaciones cromatográficas HPLC es el modo de separación:


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isocrático o degradado. En el modo isocrático, las condiciones de separación se mantienen sin cambios a lo largoel análisis cromatográfico, limitándose a una composición solvente solo. En el modo de gradiente,hay una variación composición de la fase móvil y / o el flujo durante la serie cromatográfica.

Hay una serie de parámetros relevantes a tener en cuenta durante el desarrollo de unmétodo cromatográfico, tales como la resolución cromatográfica, selectividad, factor de retención, etc.Estos parámetros son muy importantes en el desarrollo, validación y utilización de HPLCmétodos cromatográficos.


Un sistema HPLC consiste básicamente en módulos que tienen funciones específicas y cuidadosamente diseñado paraproporcionar análisis previstos con versatilidad, rapidez, reproducibilidad y alta sensibilidad.

Equipo de HPLC actual en el mercado puede variar desde muy simple, donde las muestras son manualmenteinyectado, a sistemas más complejos provistos de un módulo de muestreo automático y controlados porsoftware informático capaz de controlar las funciones del sistema, adquirir, procesar e imprimir los datos, almacenar yorganizarlos para referencia futura.

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Para una mejor comprensión, el sistema de HPLC se puede dividir en seis módulos principales:

1. depósito Fase móvil2. Disolventes sistema de bombeo (bomba)3. Introducción de la muestra (inyector)Compartimento 4. Columna5. Sistema de Detección6. Sistema de Datos

Figura 1: Representación esquemática de un sistema de HPLC:


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4.3.1. Fase móvil

La fase móvil utilizada en la cromatografía de líquido es extremadamente importante para la obtención del deseadoseparación, ya que en contacto con el analito que se está separada, así como una columna cromatográfica y lasistema como un todo.Una amplia gama de disolventes está disponible; Sin embargo, hay algunas propiedades deseables para su uso enHPLC:

• Alta pureza;• Nodescomposición del analito y la fase estacionaria;• Compatibilidad con el sistema de detección;• Baja viscosidad;• la disolución de la muestra;• Bajo costo.

Entre los disolventes utilizados en la cromatografía líquida, es digno enfatizando las características ypureza del agua; el agua ultrapura es muy recomendable ya que los resultados altamente fiables se obtienen.Su resistividad (típicamente 18,2 MO / cm a 25 ° C) es una indicación excelente calidad. Sin embargo, la orgánicacompuestos deben ser controlados, ya que pueden interferir con la sensibilidad de los detectores UV

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comúnmente utilizado en los análisis de HPLC. Es importante recordar que el agua ultrapura debe sersiempre se utiliza de inmediato como el almacenamiento modifica sus condiciones.

4.3.2. Sistema de bombeo de disolventes

La función principal de la bomba es para empujar la fase móvil a través de la columna.

Una vez que se han compactado relleno consistente en partículas de diámetro muy pequeño, del orden de 3 a10 um, las columnas altamente resisten al paso de la fase móvil; Por lo tanto, el sistema de bombeodebe ser capaz de sobrepasar esta barrera y proporcionar un flujo constante, reproductiva sin pulsaciones.

La mayoría de las bombas utilizadas son del tipo de movimiento alternativo, también llamadas bombas de pistón o diafragma. Lafuncionamiento se basa en un motor eléctrico conectado a engranajes que se mueven de un sistema de pistones.

Como este tipo de bomba de producir flujos pulsantes debido al movimiento "aandforward" de lapistón (s), se han desarrollado algunos recursos para superar este problema; estos mecanismos se denominansilenciadores de pulso.

Bombas de análisis están diseñados para funcionar a altas presiones y tasas de flujo variables de 0,01 a 10ml / min. Por lo general son de material inerte, como el acero inoxidable (bombeo cabezas, tuberías yconexiones), zafiro, cuarzo, cerámica y titanio (pistones), rubí (válvulas de retención) y materiales inertes(sellos).

4.3.3. Introducción de la muestra inyector

El inyector es el módulo en el que se introducen las muestras en el sistema de HPLC para permitirseparación en la columna.

El inyector puede ser manual (el usuario introduce la muestra con la ayuda de una microjeringa de punta recta)o automático, también conocido como autoinyector o muestreador automático, que es capaz de inyectar automáticamente una


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gran número de muestras e incluso realizar las operaciones de suma de dilución, derivación o reactivos.

4.3.3.1. Inyector Manual

Los inyectores manuales más utilizados son básicamente los inyectores del tipo de válvula que tiene una externabucle de muestreo, definido y tuberías volumen preciso que puede ser sustituido para permitir la inyección dediferentes volúmenes de muestra.

La Figura 2 muestra el diagrama esquemático de la válvula. Los seis pequeños círculos representan los orificios internos de la válvula,mientras que el gran círculo representa la entrada de aguja de la jeringa de inyección.

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Figura 2. Diagrama esquemático de una válvula de inyección

La válvula tiene dos posiciones: CARGA e inyectar. En la posición de carga, se desvía el caudal de la bombadirectamente a la columna (entra en y sale de 2 a 3). Mientras tanto, la muestra se introduce en elbucle de muestreo (LOOP) a través del orificio de la aguja. El exceso está dispuesto inmediatamente a través de la salida 6,es decir, la precisión de inyección se determina por el volumen de la muestra en el bucle.

En la posición INYECTAR, la fase móvil ahora viaja a través del bucle arrastrando la muestra ala columna (viajes 2143).

4.3.3.2. Inyector automático

Los inyectores automáticos son dispositivos ampliamente utilizados en laboratorios con el objetivo de alta productividad, ya queoperar en un modo sin ayuda. Se proporcionan además una mejor reproducibilidad en comparación con elinyectores manuales. Algunos modelos son capaces de trabajar como un termostato para las muestras, aumentando así lala versatilidad del sistema cromatográfico.

4.3.4. Columnas

4.3.4.1. Fases estacionarias a base de sílice

La sílice es, sin duda, el material más importante utilizado en fases estacionarias para HPLC. El sílice es unmaterial versátil y su superficie pueden ser modificados por derivación química, a continuación, que da lugar a variosmateriales interesantes como fases estacionarias para cromatografía líquida. Sílice también permite el trabajo


Bomba

Columna

Jeringa

Columna

Bomba

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con diferentes mecanismos de separación.

La sílice es un material amorfo, altamente poroso y parcialmente hidratado suele prepararse hidrólisis byacidde silicato de sodio, seguido por emulsificación en una mezcla de alcohol / agua y posteriorla condensación, se lava y se seca para su uso.

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Resultados superficie de la sílice a partir de sus condiciones de preparación; sílices que tienen una alta cantidad de silanoles libresson más ácidos que sílices con grupos hidroxilados delimitadas.

La sílice es ampliamente utilizado en cromatografía de fase normal; no se recomienda en fase inversacromatografía.

4.3.4.2. Fases modificados químicamente

Actualmente, las fases más utilizados. Su aplicación a compuestos polares separados eradifundido ampliamente como resultado de las dificultades cuando se utiliza columnas basadas en sílice.

Con el advenimiento de las fases químicamente acotadas, esta brecha se llenó y en la actualidad podemos afirmarque alrededor del 90% de la separación cromatográfica se realiza usando dichas fases. Tienen unainteresante mecanismo de retención de solutos por medio de interacciones no basa exclusivamente en la polaridad.

El uso de grupos octadecilo conducen a la formación de la fase de octadecilsilano, conocido como ODS oC18. Este grupo imparte la fase de un carácter polar en comparación con la sílice sin modificar.

Retención en estas fases depende de la cantidad de carbono presente, generalmente se expresa como porcentaje.La calidad de la separación a la que se aplican dependerá de este porcentaje y elcantidad de silanoles residuales.

Por razones estéricas, esta derivación no afecta a todos los grupos silanol. En algunos casos, el restantegrupos tienen un problema con la cola picos en la interacción con el soluto. Este problema puede serresuelto mediante la reacción de sílice con trimetilclorosilano después de la derivación; como el trimetilclorosilanoes más pequeño, se puede llegar a algunos de estos grupos, formando entonces trimethylsilanes. Aunque no esposible derivar todos los grupos silanol, este proceso se denomina de protección terminal.

Algunos análisis requieren de la temperatura de la columna a ser estable y, para ese propósito, hay dispositivosdisponible en el mercado; tales dispositivos se conocen como compartimiento del horno o columna.

4.3.5. Detectores

Los detectores se transducing dispositivos conectados justo después de la salida de la columna. Ellos son responsables degenerar señales eléctricas proporcionales a los compuestos que pasan a través de ellos. Varios tipos deLos detectores se han utilizado en HPLC en función de las características físicas o fisicoquímicas de lade la muestra y la fase móvil. Un detector ideal debe tener las siguientes características:

• Alta sensibilidad y bajo límite de detección;• Respuesta rápida a todos los solutos;• Insensibilidad a cambios de temperatura y de flujo de salida de fase móvil;• respuesta independiente de la fase móvil;• Pequeño aporte para el ensanchamiento de pico por el volumen adicional de la celda del detector;• Respuesta aumentar linealmente con la cantidad de soluto;

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• · No destrucción del soluto;• La seguridad y la comodidad de uso;• La información cualitativa del pico deseado;• Bajo costo.

Todas las características se pueden encontrar en apenas un único detector; Por lo tanto, el detector más apropiadodebe ser elegido de acuerdo a la muestra y que tiene tantas características como sea posible.

Los detectores más utilizados disponibles en el mercado incluyen:

• Detectores de absorbancia (UVVIS) ultravioletas y visibles;• Los detectores de fluorescencia;• detectores electroquímicos;• Los detectores de masas.

Otros detectores:

• Detectores de índice de refracción;• detectores de conductividad eléctrica.

4.3.5.1. Detectores de UVVIS

Estos detectores funcionan basado en la cantidad de luz absorbida byThe soluto cierta característica atalongitud de onda. Pueden ser dividen básicamente en tres tipos:

• Se ha corregido la longitud de onda;• longitud de onda variable;• Diodos arreglo.

4.3.5.1.1. Detectores de longitud de onda fija

El más simple de todos los detectores. No es muy común hoy en día, ya que son sensibles a las variaciones dela composición de la fase móvil, perjudicando así su uso en sistemas de gradiente. Se selecciona la longitud de ondaa través de filtros ópticos de longitud de onda específicas.

4.3.5.1.2. Detectores de longitud de onda variable

Los detectores más utilizados hoy en día, ya que pueden ser utilizados tanto en isocrático y el gradientesistemas. Utilizado por la mayoría de los laboratorios en los que la muestra y su correspondiente longitud de ondason conocidos. La Figura 3 muestra el diagrama esquemático de un detector de longitud de onda variable.

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Red de difracción

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Figura 3. Diagrama esquemático de un detector de longitud de onda variable

4.3.5.1.3. Diodos detectores disposición

Detectores de que tienen la capacidad de generar espectros de absorbancia a una velocidad compatible con el eluyentefluir. Proporciona datos tridimensional: absorbancia x tiempo x longitud de onda. Se utilizan en la investigación ydesarrollo cuando no se conoce la mejor longitud de onda, cuando se desea el espectro defines de caracterización (biblioteca) y para obtener el porcentaje de pureza de los picos.

El diagrama esquemático se muestra en la figura 4.

Figura 4. Diagrama esquemático de un detector de diodos disposición

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Lámpara Célula

Fotodiodo

Red de difracción (fijo)

Lámpara

Célula Diodos disposición

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4.3.5.2. Detector de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia son específicos, ya que el soluto tiene que emitir fluorescencia. Es uno de los más sensiblesentre los detectores más utilizados en HPLC.

La Figura 5 muestra un diagrama esquemático de este tipo de detector.


Fuente de luz Celda de muestra Detector

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Figura 5. Esquema de la detector de fluorescencia

Algunos detectores de fluorescencia en el mercado tienen la capacidad de generar excitación y de emisiónespectros de fluorescencia durante el análisis cromatográfico.

4.3.5.3. Detectores electroquímicos

El más sensible de todos los detectores y también el más delicado de trabajar. Las moléculas seananalizada debe tener características que permiten la oxidación o reducción. La detección se realizó porlos medios de electrodos como se muestra en la figura 6.

Figura 6. Diagrama esquemático de un detector electroquímico

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Absorción

Detector

Emisión

Auxiliarelectrodo

Móvilfase

Trabajoelectrodo

Potenciómetro Grabadora

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Como parte del cromatógrafo, la adquisición de datos y sistema de procesamiento se permitirá al usuarioverificar y documentar los resultados obtenidos.

El sistema básicamente recibir la señal eléctrica enviada por el detector (s), convertirlos en gráficosllamados cromatogramas, integran los picos usando el parametersand predeterminado, a partir de una calibracióncurva, cuantificar las muestras.

Esta gráfica tiempo de retención de la señal x tiene dos características importantes. En primer lugar, el tiempo de retención es característicoy repetitivo para cada sustancia; segundo, el área del pico o la altura es diferente proporcional a laconcentración de la sustancia o masa.Consulte la figura siguiente:


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Un archivo se crea inicialmente y contiene la información necesaria para el análisis del interéssustancias, tales como:

• El texto que describe las condiciones cromatográficas, tales como, la fase móvil y la columna utilizada;• Programación de parámetros de integración cromatogramas.

Cuando el sistema se estabiliza, las normas se inyectan con el fin de revisar la actuación.

Cuando todos los parámetros se establecen y correcta, un estándar que contiene todos los componentes a ser cuantificada esinyectada de manera que se crea una tabla; en esta la tabla, el sistema está "informado" sobre los picos de seranalizado a través de los tiempos de retención correspondientes. Se requiere esta tabla para crear una calibracióncurva.

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Base

Tiempo de retención

Altura de Pico

Área del pico

Acta

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A continuación, las normas para la creación de esta curva se inyectan y se almacenan, poniendo fin a la creación de estearchivo de análisis.

Cuando la inyección de las muestras, se debe tener cuidado para inyectar las normas de control a intervalos regulares,permitiendo así que la verificación de la estabilidad del sistema.

A continuación, los cuatro métodos que se pueden utilizar para fines de calibración serán discutidos:

• Área Porcentaje.• Área de Normalización.• Estándar externa.• Norma Interna.

4.3.6.1. Porcentajes de área

El porcentaje de área es el método de cálculo más simple, ya que se requiere ningún estándar.

Se basa en el principio de que la respuesta del detector es proporcional a la cantidad de sustanciapasando a través de su célula.

Puede ser utilizado para sustancias que tienen la misma respuesta al detector, es decir, si son cantidades igualesinyectado, áreas iguales deben obtenerse para todos los picos. El cálculo de la muestra es:


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Componente A concentración (%) = Componente Un área de 100 x

Σ Áreas de todos los componentes

4.3.6.2. La normalización de la zona

El principio es el mismo de la zona de porcentaje, sin embargo, la respuesta del detector para cada sustanciase corrige utilizando uno de los picos como una referencia de cálculo. Para este método, es necesarioinyectar un estándar para calcular el factor de respuesta de cada pico, como se muestra en la siguiente fórmula:

Componente A = Componente A zona x Concentración del componente de referenciafactor de respuesta Componente A la concentración Área de componente de referencia

Cuando el factor de respuesta de cada componente está disponible, se puede analizar la muestra usando lasiguiente ecuación:

Componente A = Componente A zona x Componente Un factor de respuestaconcentración (%) Σ (Áreas de todos los componentes x Factor de respuesta de todos los componentes)

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4.3.6.3. Patrón externo

El estándar externo es el método de calibración más común.

Consiste en la cuantificación de la muestra mediante la inyección de estándares con concentraciones conocidas.

La zona estándar está correspondió a la concentración y el factor de respuesta se obtiene para cadacompuesto, de acuerdo con la siguiente ecuación:

Componente A = Componente A zonafactor de respuesta Componente A la concentración

Con este factor de respuesta generada después de la inyección de la norma, se inyecta la muestra.El área generada en la muestra se divide por el factor de respuesta generada por el estándar, elconcentración de la muestra se obtiene por la ecuación:

Componente A = Componente A zonaconcentración Componente A factor de respuesta

4.3.6.4. Estándar interno

El estándar interno es el método de calibración más precisa, ya que corrige las fluctuaciones de volumenmediante el uso de un patrón de referencia añadido en la misma cantidad tanto con el estándar y la muestra.

La elección de esta norma de referencia deberá cumplir las siguientes condiciones:

• No debe estar presente en la muestra;• La muestra no debe tener ningún componente con un tiempo de retención muy cerca de la norma;• Debe ser puro, no reactivo y preferiblemente del mismo grupo funcional del componente

que se determine.


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Muchas veces este método no pueden utilizarse como resultado de tales condiciones; Sin embargo, cuando sea posible, estamétodo proporciona resultados muy precisos incluso cuando se utiliza la inyección manual.

El cálculo consiste en determinar el factor de respuesta relativa a cada componente mediante la inyección deel estándar y el uso de la siguiente ecuación:

Componente A = Componente A zona x Concentración del estándar internofactor de respuesta Componente A la concentración Área del estándar interno

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Cuando se calculan los factores de respuesta, la muestra se inyecta con el estándar interno y, conlas áreas así obtenida, la concentración de componente se calcula utilizando la ecuación:

Componente A El componente A = Estándar interno Componente Aconcentración zona x concentración x factor de respuesta

Área del estándar interno

Actualmente existen dos opciones para la adquisición y procesamiento de datos: el integrador y el personalordenador con un software dedicado. Ambos permiten al usuario realizar las mismas tareas. El básicodiferencia entre ellos es el sistema operativo.

Vale la pena subrayar la importancia de la transferencia de datos obtenidos (cromatogramas) de unplataforma a otra; para los propósitos de intercambio entre laboratorios, esto no puede ser un inconveniente para los resultadoscomparación y análisis.


Con el fin de asegurar resultados confiables y reproducibles en el cumplimiento de la cualificación de la instalaciónRequisitos (IQ), las condiciones del lugar de instalación deben ser verificados. Para ello, lasiguientes condiciones se pueden mencionar:

4.4.1. Requisitos de banco

El banco debe dimensionarse para acomodar adecuadamente el equipo HPLC y hacer que el usuariosentirse cómodo durante el trabajo.

El tamaño de la HPLC y el sistema de datos (integrador o computadora), generalmente de dos metros lineales, essuficiente para acomodar el sistema completo.

El equipo de HPLC actual se suele modular, sus módulos restantes sobre la otra formandouna torre; Por lo tanto, la altura total (banco más torre) debe ser seguro para evitar accidentes principalmentecuando el operador se encarga de la fase móvil.

La estructura debe ser capaz de soportar firmemente alrededor de 80 kg sin vibraciones o cambios.

Los fabricantes de equipos proporcionan descripciones detalladas del banco requerido en la


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manuales de preinstalación.

4.4.2. Red eléctrica

La red eléctrica debe estar debidamente conectado a tierra y se estabilizó. El uso de una llave magnética esse recomienda en caso de fallas de suministro de energía eléctrica constante.

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El número de puntos de venta debe ser adecuada y de conformidad con las normas de instalación del sistema.Se requiere una salida para cada módulo, además de los puntos de venta para el integrador. Si un equipose emplea, se requieren puntos de venta para la CPU, monitor y la impresora. Para una HPLC tradicional, que tieneuna bomba, inyector automático, horno, detector y el ordenador, ocho salidas son suficientes. No debe haberuna toma de repuesto para su uso en la asistencia técnica y / o validaciones.

La Figura 7 muestra la salida estándar que se utiliza en equipos de HPLC.

Salida estándar para cromatógrafo líquido

Figura 7. salida estándar para HPLC

El fabricante HPLC debe informar al consumo total de energía, así como el poderconsumo por módulo (expresada en Watts o VA o kVA). Para el dimensionamiento y la distribución de lala capacidad del sistema eléctrico, un profesional eléctrico debe ser contactado.

Equipo de HPLC no tolera las fluctuaciones de la red eléctrica; Por lo tanto, es fundamental para conocer laEstabilidad de voltaje y determinar que la tensión es compatible con las especificaciones requeridas de cadamodelo.

4.4.3. Condiciones ambientales

La temperatura y la humedad son las condiciones ambientales básicas para ser consideradas.

La temperatura de la habitación donde se va a instalar el equipo HPLC debe controlarsesin grandes fluctuaciones durante el uso. La temperatura típica requerida por los fabricantes es 25ºC,se permiten las fluctuaciones de +/ 2ºC.

La humedad debe ser inferior al 95%; no se permite la condensación.


Mantenimiento por el usuario es crítica para el buen funcionamiento y la durabilidad de un cromatógrafo.

Después de usar el equipo, un procedimiento de limpieza debe ser seguido (que será dependiente de latipo de fase móvil utilizada); Esto también es cierto para la columna cromatográfica; como componente principaldel sistema, la columna cromatográfica se debe prestar especial atención.

Para la limpieza de la columna cromatográfica, siga cuidadosamente las instrucciones del manual.


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Sistemas de trabajo con la solución tampón como la fase móvil requieren un cuidado especial. Después de su uso, es esencialutilizar agua (100%) para la eliminación completa de la solución tampón y luego una mezcla, por ejemplo,70% de metanol (o acetonitrilo) y 30% de agua. Esta mezcla se requiere como hongos pueden crecer siel sistema se deja en sólo agua. El usuario debe estar familiarizado con la sustitución de consumiblespartes del sistema. Cualquier intervención de mantenimiento debe ser reportado en un libro de registro.

Las principales partes consumibles para cada módulo son los siguientes:

• Bomba Sellos, pistones, filtros.• Manual del inyector sello del rotor, bucle de muestras, las conexiones.• inyector automático Filtros, septos, sello del rotor, piezas de la unidad de jeringa (si los hay), viales para muestras y

reactivos, aguja, lazo muestra.• Los detectores de UVVisible y fluorescencia Lámparas, lentes, juntas tóricas.• detector electroquímico solución Electrodos, KCl, juntas tóricas.

Además de la operación del equipo, por lo tanto, la formación del usuario debe incluir estos básicosprecauciones. Cualificación profesional Due es crítico para este nivel de aprendizaje.

La lectura de los manuales es también una excelente práctica. Además de proporcionar información detallada sobre lala operación del equipo, el manual aclara varias dudas del usuario. Es importante observar lalas reglas de seguridad al manipular el equipo. El uso de delantal, guantes y gafas evita lesiones gravescomo ceguera o la contaminación de la muestra, por ejemplo, plasma.

El sistema de descontaminación siempre es obligatoria con el fin de proteger la salud de la persona enencargado de mantenimiento.

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5. sistemas de cromatografía RELACIONADOSDETECTORES DE MASA

5.1. Introducción

La cromatografía es una técnica de separación esencial en ciencias de la vida y los campos de la química relacionados.Detectores tradicionales, tales como ultravioletavisible, electroquímica, índice de refracción (HPLC), la llamaionización, la conductividad térmica, etc (GC) son ampliamente utilizados para cuantificar compuestos como bidimensionallos datos se producen (respuesta x tiempo).

Los detectores de masas se caracterizan por la generación de datos tridimensionales (respuesta x tiempo x iónicala muestra), es decir, espectro de masas que puede proporcionar información muy importante sobre la muestrapeso molecular, su estructura molecular, la identidad, cantidad y pureza. Los datos de los espectros de masasañadir especificidad para ambos análisis cuantitativos y cualitativos.

Para la mayoría de los compuestos, los detectores de masas son más sensibles y mucho más específico quedetectores tradicionales. Theycan analizar varios compuestos e identificar los componentes en no separadocromatogramas, reduciendo así la necesidad de una cromatografía perfecto. Los datos espectrales de masa puedecomplementar los datos de otros detectores. Aunque dos compuestos pueden tener UV similares o Misaespectros, como en LCMS, este fenómeno es difícilmente simultánea; por lo tanto, ambos tipos de datosjuntos puede ser utilizado para identificar, confirmar y cuantificar compuestos con resultados altamente correctos.

Algunos espectrómetros de masas tienen la característica de realizar múltiples medidas de espectrometría de masasen una sola muestra. Pueden generar un espectro de masas, seleccione un ion específico y luego generar un nuevoespectro. Algunos de ellos son capaces de repetir este ciclo varias veces hasta que se determina la estructura(MS / MS o MS n).


El espectrómetro de masas opera básicamente a través de la ionización y la fragmentación de las moléculas.Después, los iones resultantes se identificaron de acuerdo con su relación masa / carga. La clave de trescomponentes del proceso incluyen: fuente de iones, un analizador y el detector. El propósito de los ionesfuente es generar iones. Hay varios tipos de fuente de iones en la cromatografía conectadosa los detectores de masas. Cada tipo es específico para una clase dada de compuestos. También hay varios kinasde analizadores para la separación de iones y detectores para la generación de señales medibles.

Cada uno tiene ventajas y desventajas dependiendo del tipo de información buscada. Detallesen relación con las fuentes más comunes, analizadores y detectores se discutirá a continuación:

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MUESTREOSISTEMA

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5.3.1. Fuente de ionización

Las moléculas de ionización y fragmentación se llevarán a cabo en las técnicas de ionización source.Severalestán disponibles, incluyendo: bombardeo Atom FAB, desorción por láser LD, Termonebulización TS, Partículasviga, etc. Sin embargo, las fuentes más utilizadas son:

5.3.1.1. Los electrones de impacto (EI)

El Impacto electrones (EI) de origen utiliza un filamento a cargo de la emisión de electrones con un definidoenergía de 70 eV. Una vez que los electrones energía del haz es mucho más alto que el primer potencial de ionizaciónen la mayoría de los compuestos de la muestra, esta energía se ioniza y luego fragmentado. Este tipo deionización está relacionada con la GC.

5.3.1.2. Ionización química (CI)

La Ionización química (CI) de origen utiliza agentes líquidos o gases a reaccionar con las moléculas. Ionizaciónpor lo general se lleva a cabo bymeans de la transferencia de un protón a la molécula, formando así especímenesllamado seudoiones moleculares. Como esta ionización es mucho "más suave" que el impacto de electrones, la

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IONES FUENTEES

MASAS FILTROMF

DETECTOREM

SISTEMA DE DATOSDS

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espectro producido contiene algunos fragmentos y casi exclusivamente la pseudoion molecular;Por lo tanto, se emplea en la determinación del peso molecular y / o análisis cuantitativos.Este tipo de ionización se relaciona con GC.

5.3.1.3. Electrospray (ES)

La ionización electrospray tiene un gran impacto en el uso de la espectrometría de masas aplicada a biológicainvestiga en los últimos años. Fue el primer método para ampliar la gama de instrumentos masa útilpor encima de 50.000 Da. Sin embargo introducido en su modelo actual en el año 1984, la técnica vuelve a lainvestigaciones de asistencia eléctrica de dispersión líquido en el principio de este siglo. De hecho, ladescubrimiento principal fue casi accidental en 1968 cuando Malcolm Dole y sus colaboradores fueron capaces detraer macromoléculas a la fase de gas a presión atmosférica. Era posible por pulverización de una muestra desolución a un pequeño tubo con un fuerte campo eléctrico en presencia de un flujo de nitrógeno caliente para ayudaren el dissolvation y luego la medición de los iones formados. Experiencias posteriores, innovadoras en este campo


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conducido a la introducción de una fuente de ionización ES. Desde entonces, una amplia gama de biomoléculas erainvestigado por ES. Por lo general La muestra se disuelve en una mezcla de agua y disolvente orgánico,típicamente metanol, isopropanol y acetonitrilo: puede ser infundida directamente o se inyecta en continuoflujo, es decir, contenida en el eluyente de la columna de la columna de HPLC y CE capilar.

La fuente ES es simples, formando un aerosol que ocurre en un campo de alto voltaje como se muestra en la Figura 5. Enun mecanismo propuesto, se cree que la formación de iones es el resultado de una evaporación iónicaproceso, primero propuesto en 1976. gotitas de un aerosol es generado por la dispersión electrostática de lalíquido aplicado por el extremo capilar. Favorecido por un gas caliente (normalmente nitrógeno), las gotitas sondesglosados, perder moléculas de disolvente en el proceso y en ocasiones producir iones individuales. EnOtro mecanismo propuesto, las gotitas dissolvation conducen a una densidad de carga creciente sobre lasuperficie de la gota que provocará una explosión de Coulomb eventualmente producir iones individuales.

Independientemente del mecanismo propuesto, los iones se forman a presión atmosférica y entrar en unaorificio situado en el vórtice de un cono de actuación como la primera barrera a la fase de vacío. Un skimmerrecoge los iones y los guía para el espectrómetro de masas.

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GotaAtmosféricoPresión Gotita Clusters y

especímenes iónicos

Bomba

Bomba

Iones

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La formación de aerosol es la parte más importación de la técnica de EE. Se aconseja generalmente para filtrar todosdisolventes; altas concentraciones de electrolitos deben evitarse ya que pueden causar supresiones de ionizacióny condiciones de operación inestables. Los altos flujos compatibles con los utilizados en HPLC, se pueden utilizar ahoraa través de un gas de nebulización se calienta para ayudar en la producción de la pulverización.

Para macromoléculas, cada ion que normalmente entra en el espectrómetro de masas tiene un número alto cargo.Como los espectrómetros de masas de medir la relación masa / carga en lugar de la masa, es posible quemoléculas de alto peso molecular tienen suficiente carga para caer dentro de la m / z del alcance de una linealcuadrupolo, típicamente m / z 204000. Como se muestra en la Figura 6A, los iones de alta masa molecular a menudo tienen unaamplia distribución de los de nivel de carga. La figura muestra el espectro de masas de mioglobina de caballo (molecularmasa: 16.951,5) a baja resolución habiendo observado cargos de 1221. Esta distribución iónicapermite el cálculo de la masa molecular analito original por medio de vecino iones con m / zvalores m1 y m2, con cargos N1 y N2, respectivamente. Si m1 <m2, y n2 = n11, a continuación,

M = n1 (m1mA) = n2 (m2mA) (1)n2 = (m1mA) / (m2m1) (2)

en la que M representa la masa molecular de la molécula sin carga y mA es la masa de laaducto cargada A (por ejemplo, H +, Na +, NH4 +). Las ecuaciones se pueden resolver a continuación, para producir n2y M. La medida de la distribución de cargas en macromoleules no siempre es fácil o reproducibleuna vez que los cambios, como cambios relativamente pequeños de las condiciones de análisis pueden ocurrir, por ejemplo:


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pH; Además de disolventes o sales; proteína desnaturalización parcial; ruptura de enlaces disulfuro, etc.

La fuente de electrospray se utiliza en relación a todos los analizadores de masas individuales.

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5.3.2. Analizadores de masas

Después de la admisión de las moléculas en la fuente de iones y posterior de ionización, es necesariopara determinar las masas correspondientes de iones formados a fin de obtener el espectro de masas. Lafunción del analizador de masas es separar los iones de acuerdo con sus relaciones de masa / carga y transmitirellos al detector.

Hay varios tipos de analizadores de masas. El más común y ampliamente utilizados son el "cuadrupolo"y analizadores de "Ion Trampas".

El cuadrupolo esté escaneando analizadores, es decir, después de la admisión de una mezcla de iones condiferente masa / relaciones de carga (m / z) y diferentes abundancias, campos eléctricos se aplican; en un momento dadotiempo, sólo los iones con una masa específica puede dejar intacta. Mediante la variación del campo eléctrico aplicado, se puedeseleccionar y grabar diferentes iones.

Los analizadores de "trampa de iones", sin embargo, no son considerados como dispositivos de escaneo puros, como los iones se almacenanantes de la exploración en sí misma.

5.3.2.1. Analizadores de masas de cuadrupolo

El instrumento se basa en cuatro barras paralelas en un área cuadrangular donde se enfoca el haz de ionesen el eje central de estas barras, un potencial fijo eléctrico (DC) y un potencial de frecuencia de radio (RF)se aplican a estas barras diagonales y opuestas. Para una combinación de RF dado y DC, iones de unaintervalo de masa m / z específica haber cambiado su camino desde el eje central. El espectro de masas esobtenido a partir de los componentes de voltaje de CC y RF de una manera sincronizada, es decir, manteniendo elRF relación / DC constante. El φ

opotencial aplicado a los pares de barras opuestas se determina como sigue:

Φ ±o = U + V cos φ t

en la que U es un voltaje DC y V cos φ tla tensión en función del tiempo en el que V la amplitud de RF

y φ la frecuencia de RF.


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Figura 2. Representación esquemática de un analizador de cuadrupolo lineal

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Los iones del haz

Ionesfuente

Detectorsalida

CuadrupoloArquitectura

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La operación de cuadrupolo (así como la trampa de iones a ser discutido más adelante) pueden ser discutidos cualitativamentea través del diagrama de estabilidad correspondiente de la amplitud potencial de CC, la amplitud del potencial de RFcon la ruta de un ion estable (es decir, un ion que puede permanecer intacto después de pasar el cuadrupolo).Esto se representa en las ecuaciones y en el gráfico 1.

La ecuación de movimiento de una partícula cargada se puede expresar como una ecuación de Mathieu en el que la unau

y quparámetros pueden ser definidos.

unu= A

x= a

y= 4zU / m φ2ro2

qu= Q

x= q

y= 2zV / m φ2ro2

en la que m / z es la masa de iones / ración de carga, y roes la mitad de la distancia entre los dos opuesto

bares. No existe ningún parámetro para z, ya que el campo de RF actúa sobre el plano X / Y (z es el eje principal de lacuadrupolo lineal).

Gráfico 1. Diagrama Estabilidad en el analizador

En este caso, el ion m2es el único ion que permanece estable (observar que está dentro de la región de estabilidad de

el gráfico), mientras que m3y m

1no puede alcanzar el detector. El R = 100 2e R = 10 líneas rectas representan

dos combinaciones distintas de la relación DC / RF; cambiando estas relaciones, es posible cambiar elresolución filtro de masa, es decir, la capacidad para diferenciar o filtros de masas muy cerca uno del otro.


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La "A" y los parámetros "q" son respectivamente proporcionales a la DC y los valores de RF.

5.3.2.2. analizadores de masas cuadrupolo "trampa de iones"

Este analizador de masas tiene los mismos principios de funcionamiento matemático de la cuadrupolo convencional,es decir, los iones de estabilidad dentro de una ruta específica.

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Sin embargo, la principal diferencia es que en la trampa de iones de los iones no siguen una única trayectoria hacia eldetector, pero están "atrapados" en órbitas dentro de la estructura de trampa, dando así a elevar el nombre de iones "trampa ".

Mientras que en el cuadrupolo los iones se forman en la fuente de iones y luego expulsado hacia la masaanalizador, en la trampa de iones de los iones se forman iones y la masa analizada en la misma región del espacio.Esta región del espacio donde se encuentran los iones "atrapados" corresponde a aproximadamente el volumen de1 cubo cm de lado.

La siguiente figura muestra una representación esquemática de la trampa de iones analizador.

Figura 3. Representación esquemática del analizador "trampa de iones"

Como los analizadores de cuadrupolo, los analizadores de trampas de iones también utilizan campos eléctricos; Estos campos eléctricos sonla intención de mantener los iones confinados y separar las masas (análisis de masas).

En este tipo de analizador de masas, el campo eléctrico utilizado es puramente RF (frecuencia de radio que consiste en un senode onda con una frecuencia de aproximadamente 1 Mhz) aplicada directamente sobre el electrodo anular central.

Por lo tanto, dependiendo de la amplitud de RF aplicado, los iones pueden permanecer estables dentro de la trampa. Al aumentaresta amplitud, los iones con mayores masas son "expulsado" de la región de confinamiento y despuésllegar al detector.

Otra peculiaridad de los analizadores de trampa de iones es la necesidad de controlar el número de iones dentro de laestructura, con el objetivo de evitar las reacciones de estos iones con moléculas aún presentes. Estas interaccionespuede conducir a un ligero cambio en el espectro de finales de algunos compuestos, por lo tanto, la interpretación /identificación difícil.

Este problema se elimina en los analizadores de cuadrupolo, como los iones son casi de inmediato "arrojados"de la fuente de iones después de la formación y no tienen la oportunidad de interactuar con las moléculaspresente.

Por otro lado, la sensibilidad final en el modo de escaneo total es mayor en la trampa ya que todos los analizadores


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iones formados se detectan necesariamente una vez que están confinados.

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Esta no es la situación para los analizadores de cuadrupolo. Es decir, mientras que el cuadrupolo es el enlatadorango de masas con el objetivo de producir un espectro, los iones inestables conseguir "perdido" y, por lo tanto, no generanuna señal detectable. Es posible, sin embargo, para aumentar significativamente la sensibilidad por cuadrupolola definición de una masa fija (o unas pocas masas) de interés; esta técnica se llama SIM (Single Monitoreo Ion).

5.3.2.3. Tandem espectrometría de masas.

La espectrometría de masas en tándem, MS / MS o MSnen la que n = 2, 3 ..., utiliza dos o más análisis de masaspasos, uno para preseleccionar un ion y los otros para analizar los fragmentos inducidos, por ejemplo,colisión (CID) con un gas inerte, tal como argón o helio. Esto puede ser un tándem en el espacio o tándemanálisis en tiempo.

Tandem en el espacio significa varios analizadores de masas en serie. Varias combinaciones son posibles, elmás comunes incluyen: triple cuadrupolo (Q1qQ2), cuatro sectores e instrumentos híbridos. Q representaun filtro de masa cuadrupolar y qa RF cuadrupolo sólo (cámara de colisión). En el caso de la triplecuadrupolo, un ión de interés generado en la fuente de ionización se selecciona con el primer cuadrupoloQ1, disociado en el q cámara de colisión con energías de hasta 300 eV; los productos de fragmentaciónse analizan con el segundo cuadrupolo Q2.

Por lo tanto, es posible obtener información sobre la secuencia de un péptido mediante la selección del ioncorrespondiente al péptido protoned (llamado ión precursor) y el análisis de los fragmentos de suestructurar utilizando Q2. Este proceso se denomina exploración de iones producto. Varios otros tipos de análisis oexperimentos de análisis se pueden realizar. Por ejemplo, la búsqueda de todos los precursores de A dadofragmento se denomina iones precursores de exploración. Esto se puede llegar al mantener Q2 estable en themass /chargeratio del ion que se trate y el escaneado todos los iones presentes ATQ1, mientras que las disociaciones de colisiónen q tener lugar. En otro modo de escaneo, los iones que pierden un fragmento específico se pueden identificar porescanear Q1 y Q2 simultáneamente, manteniendo la diferencia de masa entre los analizadores de cuadrupoloigual a la masa del fragmento perdido neutral.

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Fuente de ionesGas de colisiónmolécula

Los iones productoformación

Detector

Masa totalespectro

Masaespectropor CID

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Tandemintime se puede obtener utilizando dispositivos "trampa de iones" y espectrómetros de masa ICR (también llamadoFTMS). De hecho, estos dispositivos no se limitan a los experimentos de MS / MS, pero pueden llegar a múltiples etapas(MS / MS / MS ... / MS o MS n). En tales dispositivos, los iones son seleccionados mediante la aplicación de tensión específicalegumbres y disociaciones normalmente se producen por colisiones con otros gases.

5.3.3. Detectores

Después de la selección por el analizador, los iones son guiados hacia el detector donde serán convertidosen un signal.Detectors medibles pueden dividirse en tres grupos. Placas fotosensibles y Faradayjaulas están incluidas en el primer grupo y se correlacionan directamente la señal medida a la cantidad de laion analizado. El segundo grupo incluye a los electrones multiplicadores, fotomultiplicadores y microcanalplacas que amplifican la intensidad de la señal recibida. Estos son los detectores más utilizadosy será discutido en el presente documento. El tercer grupo se utiliza en dispositivos de ICR (FTMS) y consiste en una radiodetector de frecuencia aplicado a los iones atrapados.

5.3.3.1. Electrones multiplicadores

Al llegar a la conversión dinode donde se aplica un potencial negativo, positivo o negativoiones emiten varios electrones secundarios. Estos electrones son acelerados hacia un multiplicador de electronesy golpear las paredes con la energía suficiente para eliminar algunos electrones. Estos electrones se golpeó la otralado de la pared, liberando así más electrones. Este efecto en cascada continúa hasta que un mediblecorriente finalmente crearon a finales del multiplicador de electrones.

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Iones

Electron multiplicador

Secundarioelectrones

Salida de electrones

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5.3.3.2. Placas de microcanal

Las placas de microcanales consisten en una placa que contiene microcanales cilíndricas paralelas. La entrada delado de estos microcanales se mantiene con un potencial negativo de aproximadamente 1 kV cuando se comparaal lado de salida. La multiplicación electrones, comenzó con la colisión de un ion en estos canales,


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se produce a través de un semiconductivesubstance que recubre cada canal y genera electrones secundarios.Canales curvos impiden la aceleración de los iones positivos hacia la entrada. El efecto de cascadadentro de los canales se pueden multiplicar el número de electrones en el orden de 105y el uso de variosplacas acopladas permiten una amplificación que puede alcanzar los 108. A la salida de cada canal, un metalánodo recoge los electrones actual y la señal se transmite al procesador. Otrocaracterística de estos detectores de microcanales ISAN señales extremadamente bajos tiempo multiplicación, haciendoinadecuados para la detección de dispositivos tales como analizador de tiempo de vuelo.

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Electron multiplicadorLos electrones secundarios

Los electronessalidaIon

Entrada de un multiplicador de electrones

Los iones con diferentes raciones de masa / cargaseparados en el espacio

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5.3.3.3. Fotomultiplicador

Este tipo de detector comprende dos dinodes de conversión; una pantalla fosforescente y unafotomultiplicador. Este detector, como el multiplicador de electrones y las placas de microcanales, permite que eldetección de iones positivos y negativos. Tras la detección, los iones se aceleran hacia el dinodeque tiene una polaridad inversa inversa de la del ion; los electrones se liberan y aceleradoshacia la pantalla fosforescente donde se convierten en fotones. Los fotones son entoncesdetectado por el fotomultiplicador. La superficie de la pantalla fosforescente se recubre con una fina conductoracapa de aluminio para evitar la formación de cargas que podrían abstenerse nuevos electrones dellegar a ella. La amplificación alcanza valores de 10 4a 10 5.


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Programas informáticos específicos realizan integralmente adquisición y procesamiento de datos. Estos programasestán a cargo de varias tareas, que van desde el control de tiempo de vigilancia de un ion a laconstrucción de curvas de calibración en las superficies (o alturas) de los picos de la muestra son desconocidosinterpolado, produciendo así la quantitativedatum deseado. Cada fabricante tiene una adquisición de datosy el programa de tratamiento con diferentes recursos y limitaciones. Por lo tanto, la comprensión deestos programas y el futuro de preparación de procedimientos operativos estándar (SOP) son cruciales parala realización de cualquier estudio.

Los detalles sobre el proceso de cuantificación de compuestos se proporcionan en el punto 4.6 de la técnica de HPLC.

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Iones

Iones secundarios

Fotones emitidos

Fotomultiplicador

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El propósito de los requisitos mínimos para la instalación es para asegurar que el ambiente de instalación es debidamenteevaluado y preparado con los consumibles y artículos de suministro necesarios para una instalación perfecta.

Los fabricantes proporcionarán una lista para ser usada antes de la fecha de instalación. Esta lista seráespecífica para el instrumento comprado; Sin embargo, lo que debe tenerse en cuenta por lo general se describe a continuación.

5.4.1. Requisitos de banco

El banco debe ser dimensionado para acomodar adecuadamente el / equipo MS LC y hacer que elusuario se sienta cómodo durante el trabajo.

El tamaño banco debe ser compatible con el LC / MS tamaño más el sistema de datos (ordenador yimpresora). Por lo general, tres metros lineales, es suficiente para dar cabida a todo el sistema.

La estructura debe ser capaz de soportar el peso del equipo de manera segura; por lo tanto, un margen de 20% por encimase debe considerar el peso del equipo. La estructura tiene que ser firme, sin vibraciones ocolumpios.


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Algo de espacio libre detrás de la banca debe ser también permitió (no coloque el banco de tocar la pared)así como para dar cabida a los elementos necesarios para el funcionamiento del equipo, por ejemplo, bombas de vacíoy sistemas de circulación de refrigeración por agua y.

Los fabricantes de equipos proporcionan descripciones detalladas del banco requerido en lamanuales de preinstalación.

5.4.2. Red eléctrica

La red eléctrica debe estar debidamente conectado a tierra y se estabilizó. El uso de una llave magnética esse recomienda en caso de fallas de suministro de energía eléctrica constante.

El número de puntos de venta debe ser adecuada y de conformidad con las normas de instalación del sistema.Además del módulo de LC / MS, salidas para el sistema de HPLC y el sistema de datos, incluyendo elimpresora, deben ser considerados.

La salida estándar para LC / MS dependerá de la tensión de operación requerida. Debido a la altael consumo, estos sistemas requieren generalmente de alimentación 220 VAC con capacidad para 1.5 a 2 KVA (para elMódulo MS solamente). Vale la pena notar que el equipo requiere 220 VAC en una sola fase o de división.

El fabricante LC / MS debe informar al consumo total de energía, así como el poderconsumo por módulo (expresada en Watts o VA o kVA). Para el dimensionamiento y la distribución de lala capacidad del sistema eléctrico, un profesional eléctrico debe ser contactado.

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El equipo no tolera las fluctuaciones de la red eléctrica; Por lo tanto, es fundamental para conocer laEstabilidad de voltaje y determinar que la tensión es compatible con las especificaciones requeridas de cadamodelo.

5.4.3. Condiciones ambientales

Condiciones ambientales para LC / MS sistemas no incluyen la temperatura y la humedad solamente. Estetipo de equipo también requiere de alimentación de gas y algunos de ellos requieren la circulación de enfriadoagua, además de agotamiento.

La temperatura de la habitación donde se instalará la LC / MS debe ser controlado singrandes fluctuaciones durante el uso. La temperatura típica requerida por los fabricantes es 25ºC, confluctuaciones de +/ 2 ° C. Un sistema LC / MS disipa el calor 68008000 BTU; este calor debedeben tenerse en cuenta al dimensionar el acondicionador de aire.

La humedad debe ser inferior al 95%; no se permite la condensación.

Gas (nitrógeno) puede ser alimentado desde los cilindros, los compartimentos de nitrógeno líquido o generadores de nitrógeno (estesiendo este último más indicado). El consumo típico es del orden de 15 L / min y la pureza deben ser99,5% para los cilindros y 98,0% para otras fuentes de nitrógeno. Presión de trabajo debe ser de 80 a 100 psi.

La habitación debe estar también provisto de un sistema de agotamiento con una capacidad mínima de 15 L /min. Este sistema debe estar conectado a la bomba de vacío y la salida de fuente de ionización.


Mantenimiento por el usuario es crítica para el buen funcionamiento y la durabilidad de cualquier equipo.


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Además de las precauciones básicas del sistema HPLC descritos en el capítulo 4, parte esencialelementos deben considerarse para un sistema LC / MS:

5.5.1. Sistema de vacío

Sistemas de alto vacío por lo general tienen tres bombas, una auxiliar (mecánico) y dos turbomolecularbombas.

La bomba mecánica requiere la reposición de líquidos por lo menos cada seis meses, si se utiliza ono. Algunos de ellos también tienen filtros que tienen que ser reemplazados y / o verificarse a intervalos fijados por lafabricante (normalmente de seis meses).

Las bombas turbomoleculares (alto vacío) son más específicos y dependen del modelo yrecomendaciones de cada fabricante. Algunos de ellos tienen lubricación permanente, pero otrosnecesita lubricación a intervalos regulares. Algunos otros, sin embargo, requieren de los cojinetes a ser sustituidos enintervalos predeterminados. Por lo tanto, es crítico que las instrucciones de mantenimiento se obtienen a partir

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el proveedor y que el proceso se documenta y se siguió, ya que un fallo de tales sistemas puedendefinitivamente poner en peligro el equipo como un conjunto.

El vacío (pre y alto vacío) deben leerse diariamente y sus valores registraron semanalmente en un libro de registro.

5.5.2. Fuente de iones

La fuente de iones es una parte de los equipos más sujeto a la suciedad y contaminación ya que recibela fase móvil con la muestra a la presión atmosférica y los convierte en iones para lasistema de vacío.

Mantenimiento y limpieza deben hacerse con base en el uso de fondo de cada equipo ydependerá del tipo, concentración y número de muestras inyectado. Una vez establecido, elintervalo de limpieza debe ser seguido y documentado.

El usuario debe estar familiarizado con la sustitución de las piezas consumibles del sistema. Cualquierintervención de mantenimiento debe ser reportado en un libro de registro.

5.5.3. Sistema de nitrógeno

El sistema de nitrógeno debe ser revisado a intervalos predeterminados. Un generador de nitrógeno es normalmenteelegido debido a la relación costo / beneficio. Tales dispositivos están provistos de filtros, compresores, etc., quetambién requieren un mantenimiento periódico.

5.5.4. Formación precauciones básicas

Además de la operación del equipo, por lo tanto, la formación del usuario debe incluir estos básicosprecauciones. Cualificación profesional Due es crítico para este nivel de aprendizaje.

Es importante observar las normas de seguridad al manipular el equipo. El uso de delantal, guantes ygafas evita lesiones graves como la ceguera o la contaminación de la muestra, por ejemplo, plasma.

El sistema de descontaminación siempre es obligatoria con el fin de proteger la salud de la persona enencargado de mantenimiento.

5.5.5. Archivos Autotune


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El LC / MS sistemas disponen de programas de autoajuste para llevar a cabo a intervalos regulares.Estos programas generan informes que deben ser presentados por el buen funcionamiento y el fondo deayudar con las intervenciones de reparación.

Precauciones equipos básicos, como la comprobación de rendimiento, van desde un equipo a otro.Así, los mejores procedimientos para llevar a cabo dichas tareas son los sugeridos por el fabricante. Estosprocedimientos deben ser leídos y un procedimiento operativo estándar (SOP) creados para definir la frecuenciay el tipo de tarea a realizar. Cualquier incumplimiento de esta SOP debe ser documentado yjustificada.

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6. INSTRUMENTOS DE ANÁLISIS Verificando el funcionamiento

6.1. Introducción

A mediados del decenio de 1990, el rendimiento de los instrumentos de comprobación comenzó a ser tener una gran importanciay la primera atención se centró en los sistemas de HPLC como resultado de su amplio uso en la industria farmacéutica;sin embargo, esta preocupación cubre todos los tipos de instrumentos utilizados en un laboratorio.

Al igual que en los sistemas de gestión de datos, estos servicios se ofrecen en general por instrumento analíticofabricantes. Existen diferentes terminologías entre ellos a veces se refieren a la mismaservicios prestados. Por ejemplo, la comprobación del rendimiento de un instrumento analítico puede ser tambiénllamado Calificación, Operación Cualificación (OQ) o recertificación.

Es importante señalar que, independientemente de las bymanufacturers terminologyused, debe corresponderpara la comprobación del rendimiento del sistema de instrumentación analítica siguiendo un procedimiento documentadoa fin de satisfacer los requisitos de un sistema de calidad y en el cumplimiento de la GLP (Good LaboratorioPrácticas) a intervalos adecuados, definidos para cada laboratorio de acuerdo con el uso y / o trabajorealizado.

Las empresas de instrumentación recomiendan esta comprobación en períodos regulares cada 6 meses o 1año y cada vez que el instrumento está sujeto a servicio o reparación que pueda interferir directamente con surendimiento.

Existe la terminología de validación durante mucho tiempo y tiene algunas variaciones según el paísy compañía. La mejor definición para la validación es: el conjunto de actividades documentadas y / oinformación que demuestre un alto grado de seguridad del proceso / sistema empleado, el cumplimiento de laespecificaciones predeterminadas con los atributos de calidad adecuados. Por lo tanto, la validación no es unacomprobación de rendimiento, capacitación, calificación de la operación (OQ) o proceso de recertificación solamente,sino un proceso que debe incluir las siguientes fases:

• DQ Calificación de Diseño;• IQ Cualificación de la instalación;• OQ Cualificación Operación;• PQ Calificación del Desempeño.

6.1.1. DQ Calificación de Diseño

Dentro de la calificación del diseño de instrumentos, el acceso se debe permitir que el desarrollo de instrumentos


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detalles, tales como:

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• El uso de métodos de especificaciones estrictas y diseño durante el desarrollo del sistema.• La documentación completa de los procedimientos de garantía de calidad y control de calidad.• El uso de personal experimentado y cualificado.• plan de pruebas instrumento integral.• Datos de control, informes de errores y procedimientos correctivos aplicados durante el desarrollo del sistema

y la producción.• fondo el desarrollo del sistema.

Dicha información debe ser proporcionada por los fabricantes de instrumentos, sin embargo, con el objetivo de verificarel pliego de condiciones y uso propuesto adecuación.

6.1.2. IQ Cualificación de la instalación

La calificación de la instalación significa: control toda la documentación e información para la instalación delinstrumentos y software de acuerdo a las especificaciones del sistema que se describen en la instalaciónrequisitos y regulaciones locales. El IQ define que el instrumento se recibe como se especifica,correctamente instalado y en condiciones de funcionamiento. Esta actividad debe incluir:

• Comprobación de los artículos recibidos de acuerdo con la documentación apropiada.• Presentación de todos los detalles de descripción e identificación de los componentes del sistema, incluyendo la

diagramas de conexión de instrumentos.• Las copias de certificado de prueba del usuario y declaración de conformidad.

La calificación de instalación (IQ) se ha discutido en todas las técnicas de instrumentación analíticade este capítulo como requisitos de instalación mínimos.

6.1.3. OQ Operación Calificación

La Operación de clasificación debe ser documentado, la comprobación de que el sistema cumple con la operaciónespecificaciones. Un sistema de seguimiento debe ser utilizado para verificar que:

• Entrenamiento operativo se da después de la instalación y antes de iniciar la operación de rutina de undeterminado instrumento.

• El compromiso del usuario seguir todos los pasos necesarios.• Las pruebas de rendimiento se llevan a cabo de acuerdo con el fabricante del instrumento con el fin de asegurar

el instrumento está en condiciones de funcionamiento apropiadas.

6.1.4. PQ Rendimiento Calificación

El PQ consiste en la realización de actividades para certificar que todas las especificaciones del instrumento están de acuerdoa los requisitos de uso. Esta calificación debe ser estricto y hacer participar a las pruebas necesarias parademostrar la funcionalidad del instrumento. Debe incluir detalles como:

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• Las pruebas específicas de los componentes individuales o el sistema como un todo.• Lista de las pruebas.• Frecuencia de las pruebas.• Resultados esperados.• Criterio de aceptación.• ¿Cómo se documentan pruebas.• Calificación de requiere de un operador.• Acciones a tomar en caso de falla de la prueba.

Para algunas técnicas de instrumentación analítica, hay rutinas definidas en internacionalmente acreditadaliteratura, tales como la EP / BP (Farmacopea Europea), USP (Farmacopea de Estados Unidos) yotros, el establecimiento de parámetros que determinarán para validar un sistema de análisis para ser utilizado por el usuario.Son muchas veces realizadas por los instrumentos analíticos fabricantes.

Cubrimos procedimientos normalmente utilizados para el control de la actuación de la principal analíticaTécnicas de instrumentación y, en su caso, la calificación de desempeño principal (PQ) rutinasdescrito en la literatura internacional.

6.2. Ultravioleta visible espectrofotometría (UVVIS)

Al comprobar el rendimiento (Operación de clasificación) de un instrumento analítico, la primerapaso a dar es un mantenimiento preventivo con el objetivo de comprobar el estado de funcionamiento del instrumento enavanzar, prevenir y reparar cualquier posible fallo.

6.2.1. El mantenimiento preventivo

Mantenimiento preventivo de un espectrofotómetro UVVis es crucial para la vida del instrumento y debellevará a cabo en intervalos de 6 meses. Este mantenimiento tiene que incluir actividades específicas llevadas a cabo porun experto. Una rutina de mantenimiento preventivo debe incluir:

• Comprobación de los elementos de seguridad del instrumento.La inspección de los compartimentos de la muestra.Comprobación de las tapas y los sensores de protección.

• Comprobación del sistema óptico.Comprobación y limpieza de la óptica externa.Realización de pruebas de rendimiento: precisión de longitud de onda y la precisión, corrección de línea de base yruido fotométrico.Verificación de las condiciones lámparas y alineación.

• Comprobación electrónico.Comprobación de los diagnósticos internos del instrumento.La alimentación de la fuente y la comprobación de la red eléctrica.Comprobación de cables y conectores.Limpieza de circuitos electrónicos y el uso, la corrosión y fallas.

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• Comprobación de las piezas mecánicas.Motores de prueba dentro del instrumento.Comprobación del funcionamiento y la comunicación con los accesorios.


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6.2.2. Operación Cualificación (OQ)

El OQ de un espectrofotómetro ultravioletavisible que consiste en la comprobación de los siguientes:

• Precisión de longitud de onda;• Precisión de longitud de onda;• Desviación de línea de base;• ruido fotométrico.

6.2.3. Calificación del Desempeño (PQ)

Algunas de las rutinas de PQ que se pueden utilizar con los espectrofotómetros UVVis y se definen en la EPy USP se describen a continuación.

6.2.3.1. Farmacopea europea

Las pruebas a continuación se enumeran en la Farmacopea Europea y la Farmacopea Británica (EP / BP) parael proceso de validación de instrumentos, que se divide en:

• Las longitudes de onda de precisión. Las pruebas con el objetivo de comprobar la precisión de posicionamiento de longitud de onda con el fin deasegurar baja desviación de la posición del sistema óptico. EP / BP recomienda dos rutinas paracomprobar este artículo:El deuterio, el xenón y el método de emisión de mercurioline.Método de perclorato de holmio.

• Resolución monocromador. Prueba para verificar si los separa monocromador instrumentola luz de espectro y envía una pequeña cantidad de esta luz a través de los compartimentos de muestra.Esta prueba se lleva a cabo utilizando el método de tolueno / hexano.

• Straylight. Straylight se define como la cantidad de luz que llega al detector de longitud de onda cuando no hayha sido seleccionado. La luz parásita provoca desviaciones en la Ley de BeerLambert, reduciendo así lalinealidad del sistema. Esta prueba se realiza bymeasuring la transmitancia pasa a través de una solución;A continuación, la misma lectura se realiza con la fuente de apagado. El método utilizado es KCl a 200 nm.

• precisión fotométrica. La precisión fotométrica se determina midiendo la absorbancia conocidavalores y calculando la diferencia entre el valor esperado y el valor real medidopor el instrumento. El método utilizado es el dicromato de potasio.

6.2.3.2. Farmacopea de Estados Unidos

Las pruebas a continuación se enumeran en la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para el proceso de validación deinstrumentos, que se dividen en:

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• Las pruebas con el objetivo de comprobar la precisión de posicionamiento de longitud de onda con el fin de asegurar la baja desviación deel posicionamiento sistema óptico. USP recomienda dos rutinas para el control de este artículo:El deuterio, el xenón y el método de emisión de mercurioline.Método de perclorato de holmio.

• precisión fotométrica. La precisión fotométrica se determina midiendo la absorbancia conocidavalores y calculando la diferencia entre el valor esperado y el valor real medidopor el instrumento. Los métodos utilizados incluyen:Método de dicromato de potasio.Método de filtro NIST.


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6.3. La cromatografía de gases GC

6.3.1. GC mantenimiento preventivo

Antes de la etapa de operación de calificación (OQ) de un GC, es necesario seguir el PreventivoLos procedimientos de mantenimiento recomendado por el fabricante.

En una Cromatografía Gas System, la rutina de mantenimiento preventivo incluyen:

• Limpieza y revisión de fugas del sistema neumático;• Los circuitos electrónicos de limpieza y verificación de las tensiones utilizadas;• Sistemas de ventilación de limpieza y verificación funcionalidad;• Inyector (s) y el detector (s) de limpieza, control de fugas y voltajes utilizados;• Detectores de respuesta que controla la prueba.

6.3.2. Operación calificación

La Operación Cualificación de un sistema de cromatografía de gases que consiste en la verificación de los siguientes:

• Control de gas portador y los flujos de gas y auxiliares;• Control de la temperatura del inyector (s), Detector (s) y horno de columna;• Detector (s) de repetición de la señal;• repetibilidad automático de muestras, en su caso;• Los cálculos realizados por el sistema de datos.

6.3.2.1. Flujos de control

El propósito de esta comprobación es la repetibilidad de los tiempos de retención compuestos analizados,repetibilidad del volumen de la muestra introducida en la columna cromatográfica, en caso de "split"inyectores y la repetibilidad de la respuesta del detector. Por lo general, cromatógrafos se pueden proporcionarcon controladores electrónicos de flujo (EFC) o controladores manuales.

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Los materiales necesarios para esta verificación en ambos casos incluyen:

• Medidor de flujo digital calibrado;• Referencia o columna de cromatografíaprueba específica.

Además del flujo de gas portador que pasa a través de la columna, la comprobación de control de flujo debetambién incluir el tabique purgar los flujos, la tasa de división en el caso de un "split / splitless" inyector, laFlujo "maquillaje" y los flujos auxiliares del detector, el hidrógeno y el aire en caso de un detector FID.Estas pruebas se realizan normalmente bajo ciertas condiciones definidas previamente en documentadoprocedimientos.

6.3.2.2. Control de las temperaturas

El horno de columnas es la parte más importante e interfiere con un análisis cromatográfico; pequeñofluctuaciones de la temperatura del horno puede resultar en variaciones significativas del tiempo de retención y,como consecuencia, afectar a la repetibilidad analítica.

Los materiales necesarios para esta verificación incluyen:


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• calibradas Metros Temperatura:• Referencia o columna de cromatografíaprueba específica;• muestra estándar de referencia.

El inyector (s) y el detector (s) temperaturas de funcionamiento se comprueban utilizando medidores de temperatura; enAdemás de la comprobación de la temperatura, las columnas horno están sujetos a la retención de tiempo de repeticiónpruebas bajo condiciones establecidas previamente y muestra de referencia.

6.3.2.3. Detector (s) precisión de la señal

Esta comprobación tiene como objetivo evaluar la repetibilidad detector; Sin embargo, en la mayoría de los procedimientos seguidos,esto puede ser usado como la comprobación de la repetibilidad del sistema como un todo.

Los materiales necesarios para esta verificación incluyen:

• Referencia o columna de cromatografíaprueba específica;• muestra estándar de referencia.

Esta comprobación suele tener lugar bajo una cierta condición analítica mediante consecutivoinyecciones de una muestra patrón de referencia. El objetivo es calcular la desviación estándar relativacomo porcentaje de estas áreas de muestreo estándar.

6.3.2.4. Precisión automática sampler

Muestreadores automáticos se comprueban en las mismas condiciones de los detectores de señal repetibilidadcomprobación; Por lo tanto, los resultados obtenidos como RSD% de los valores de área se utilizan dos veces.

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6.3.2.5. Cálculos realizados por el sistema de datos

Comprobaciones hechas generalmente en sistemas de datos se refieren a los cálculos utilizados en la estación de trabajo e incluir:

Cálculo • Tiempos de retención;• Áreas cuenta cálculo;• Cálculo Time Events;• Cálculo de las curvas de calibración Coeficientes para Externo y Normalización Interna;• Se ha corregido el cálculo del área Normalizaciones.

Estas comprobaciones se hacen generalmente por los archivos protegidos suministrados por el fabricante del sistema de datos;cuando se utilizan, estos archivos permiten comprobar si los cálculos están en conformidad con los resultados definidosen los archivos de referencia.

Una vez que la operación de clasificación de un sistema de cromatografía de gases se completa, todos los registrosdebe ser almacenado en un lugar de fácil acceso.

Los fabricantes suelen proporcionar manuales con toda la documentación de cumplimiento de lachromatographysystem, incluyendo la información para el diseño y desarrollo del sistema de clasificación(DQ), cualificación de la instalación (IQ) que debe contener información sobre qué sistema se instalóy la Operación de Calificación (OQ), incluyendo todos los procedimientos a seguir y el almacenamiento derevisión de los registros. Por lo tanto, todas las intervenciones deben ser evidenciadas en este Manual, que se utiliza como un sistemade fondo.

6.4. Cromatografía de líquidos HPLC


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6.4.1. HPLC Mantenimiento preventivo

Antes de iniciar el proceso de sistema HPLC calificación de operación (OQ), es necesario seguirlos procedimientos de mantenimiento preventivo recomendado por el fabricante.

En un sistema de HPLC, la rutina de mantenimiento preventivo incluyen:

Electrónica: la limpieza de las partes electrónicas y comprobación de alimentación y tensiones internas, comprobar elfuncionalidad y lámparas Detectores 'evaluar su vida.

Hidráulica: La limpieza de las tuberías y componentes de sistemas neumáticos, comprobar y eliminar cualquierposible la microfiltración y el reemplazo ocasional de las juntas y los filtros de la fase móvil ybomba, compruebe la funcionalidad transductor de presión y el sistema de pulsos de amortiguación en su caso,limpieza y comprobación de la funcionalidad del sistema de introducción de muestras.

Mecánica: Limpieza y lubricación de las piezas mecánicas del sistema de bombeo muestreador automático.

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El proceso de calificación de operación mostró a continuación se representa esquemáticamente en la Figura 1:

Figura 1. Vista esquemática del procedimiento de comprobación de rendimiento de un sistema de HPLC.


A Detector Precisión de longitud de onda; Precisión de longitud de onda; Nivel de ruido y desviación de línea de base; Detector de linealidad (opcional); Detector de señal de precisión (opcional).

B Calificación de la bomba Precisión de flujo; Rampa y prueba de caída de presión; Mezcla de degradado Precisión; Linealidad Mezcla de degradado (opcional).

C Columnas Horno de Cualificación Precisión de la temperatura

D Automático Inyector Calificación Precisión Volumen de inyección; Volumen de inyección de precisión (opcional); La linealidad de la inyección (opcional).

E Datos del Sistema de Clasificación Cálculo de la retención veces, áreas

contar y curvas de calibración coeficientes.

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Como sistema HPLC se hace generalmente de varios módulos, cada módulo debe estar sujeto a laOperación de clasificación. De esta manera, se completará el proceso de validación cuando el rendimientoSe lleva a cabo de Calificación (PQ). PQ debe siempre llevó a cabo utilizando el sistema HPLC completaen las actividades que confirma que todas las especificaciones de instrumentos cumplen con los requisitos de uso.

6.4.2.1. Cualificación Detector

Los parámetros más importantes que deben verificarse en un detector de absorbancia son:

• Precisión de longitud de onda;• El propósito de esta prueba es comprobar la exactitud la hora de seleccionar una longitud de onda a fin de asegurar

lowpositioning desviación de la red de difracción sistema óptico;• Precisión de longitud de onda;• El método de emisión de deuterio o de xenónline se puede utilizar (tanto considerarse como la norma natural)

y el uso de un estándar sustancia cromofórico certificada;• Nivel de ruido y desviación de línea de base;• Este ensayo tiene por objeto asegurar la especificación de la sensibilidad del detector, ya que estos factores están directamente

relacionada con esta medida. El método de supervisión de línea de base y la medición se puede utilizar enintervalos de tiempo establecidos y la verificación de los valores estándar.

6.4.2.2. Calificación de la bomba

6.4.2.2.1. Exactitud flujo de la fase móvil

Este ensayo tiene por objeto asegurar que el flujo programado es el flujo de operación de la bomba real. Puededeterminarse midiendo (volumétricamente) el flujo bombeado en un cierto período de tiempo.

6.4.2.2.2. Prueba de rampa y la caída de presión

El ensayo de la rampa comprueba las válvulas de entrada y de salida, fugas de conexión y la capacidad de la bomba deoperar a alta presión.

6.4.2.2.3. Exactitud mezcla Gradiente

El propósito de esta prueba es comprobar la exactitud de la composición estática y dinámica de móvilmezclas de fase durante un análisis en sistemas de gradiente.

La prueba de bombeo de dos fases móviles en diferentes proporciones a través de tempo se puede utilizar y verificaciónla composición real establecida.


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6.4.2.3. Columnas de calificación horno

6.4.2.3.1. Precisión de la temperatura del horno

Con el fin de comprobar la exactitud de la temperatura del horno, se puede utilizar el método dela programación de una temperatura del horno y medir utilizando un termómetro electrónico calibradoque tiene una punta flexible que puede ser adaptada a la longitud interior del horno.

6.4.2.4. La clasificación automática de muestras

6.4.2.4.1. Precisión automática sampler

A fin de asegurar la precisión especificada del muestreador automático, se puede usar la prueba de inyectarmuestras sucesivas de una solución estándar, obteniendo así la RSD% entre las áreas de los picos; unSe recomienda valor por debajo de 1%.

6.4.2.5. Sistema de datos

El Sistema de Clasificación de Datos para HPLC debe llevarse a cabo de acuerdo con los mismos procedimientos de GC.

Una vez que la operación de clasificación de un sistema de cromatografía de gases se completa, todos los registrosdebería tiendas en un lugar fácilmente accesible.

6.5. Sistemas de cromatografía conectados a detectores de masas

6.5.1. Sistemas de detección de masas de mantenimiento preventivo

A medida que los sistemas anteriores, el mantenimiento preventivo de los sistemas detectores de masas debe ser hecho antesel proceso de calificación de operación (OQ).

Cada fabricante ofrece una lista de comprobación del equipo en cuestión. Esta lista de control debería sersolicitado y terminado en todas las intervenciones de mantenimiento preventivo.

Los elementos que se comprobarán en un mantenimiento preventivo se dividen básicamente en tres módulos:

• Sistema de vacío;• detector de masas;• Chromatographer.

6.5.1.1. Los sistemas de vacío

El sistema de vacío es crítico para el buen funcionamiento de cualquier sistema de espectrometría de masas y, por lo tanto,se requieren mantenimientos regulares. Estos mantenimientos se deben registrar en el equipofondo operación.

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Los elementos seleccionados en un sistema de vacío son:

• Comprobación y sustitución de los fluidos lubricantes bombas (bombas de vacío auxiliar y alto);• Las mangueras de cheques y de las conexiones de vacío;• Medición y registro de lecturas de alto vacío y prevacío sobre una base regular.

6.5.1.2. Detector de masas

Los detectores de masas cuentan con un programa de sintonización automática o autocalibración que se utilizará parala evaluación de las condiciones de operación del equipo. Este programa suele producir un informó (a serpresentada); este informe se utilizará para el seguimiento del rendimiento, así como identificar las fallas prematuramente,por ejemplo, la necesidad de la limpieza de la fuente de iones. Se recomienda que estos informes se presentan enmenos una vez por semana, se mantuvo durante el período de la comprobación de rendimiento.

Los elementos observados en este informe son: precisión en masa, resolución picos y la respuesta en función de lala masa.

La fuente de iones se debe limpiar siempre que sea necesario; Sin embargo, una frecuencia de limpieza mínimodeben adoptarse y dependerá de cómo se está utilizando el equipo (tipo de muestra, número demuestras, etc).

6.5.1.3. Chromatographer

El mantenimiento preventivo cromatógrafo debe ser simultánea con el detector de masas. Esteprocedimiento se describe en los capítulos correspondientes (GC o HPLC).


La Operación de clasificación es fundamental para asegurar el equipo está operando de acuerdo con laespecificaciones del fabricante y, por lo tanto, a intervalos regulares. Los fabricantes recomiendan elcalificación de operación por lo menos una vez al año o después de una gran intervención de reparación. El experto encargadode que la intervención tendrá medios para recomendar si una calificación de la operación después de laSe requiere reparación. Esta evaluación debe ser documentado.

Los ítems evaluados en una calificación de la operación incluyen:

• Precisión del inyector;• linealidad del inyector;• Prueba de contaminación de una muestra a (carryover);• linealidad del detector (opcional);• Precisión de la misa;• Sensibilidad.

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6.5.2.1. Precisión Inyector


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Esta prueba se lleva a cabo mediante la inyección de varias partes alícuotas de un estándar conocido y mediante la verificación de la zonareproducibilidad y / o altura. De seis a diez mediciones son realizadas y la desviación estándar relativacalculada (debe estar dentro de los estándares predeterminados).

6.5.2.2. Linealidad del inyector

Durante esta prueba, se inyecta varias alícuotas de un estándar con una concentración conocida; lavolumen inyectado también se varió. Entonces, la linealidad como una función del volumen inyectado seráanalizados utilizando una curva de calibración. Un factor de correlación se utiliza para evaluar la prueba. Los resultados sona continuación, en comparación con los valores de aceptación predeterminado.

6.5.2.3. Continuar

El "arrastre" de prueba o contaminación de muestra a muestra se lleva a cabo mediante la inyección de un altoestándar de concentración y el resultado only.The entonces solvente es óptimo cuando no queden residuos de la anteriormentese detecta estándar inyectado durante la inyección de disolvente. Los límites se establecen generalmente como más bajoo igual a una cierta área o altura.

6.5.2.4. Linealidad del detector

Un detector de masas se convierte en no lineal cuando el aumento de concentración de la muestra no conduce a unaaumento proporcional en la formación y detección de iones.

La prueba se lleva a cabo mediante la elaboración diferentes concentraciones y trazar el resultado en una calibracióncurva. El factor de correlación es evaluado por comparación con los resultados de aceptación predeterminado.

6.5.2.5. Exactitud Misa

La exactitud de la masa se evalúa mediante la inyección de un estándar conocido, ya sea usando la autocalibraciónsistema o el inyector de muestras.

Los resultados se evalúan mediante la comparación de la masa obtenida utilizando el equipo a la seleccionadavalor teórico estándar. Cada fabricante ha recomendado normas y criterios de aceptaciónpara esta prueba.

6.5.2.6. Sensibilidad

La prueba se lleva a cabo mediante la inyección de un estándar conocido y el control de la relación señalruido del picoespecificada en el cromatograma obtenida. Cada equipo tiene diferentes valores de aprobación de estaprueba.

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anvisa 2 bioequivalencia

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