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Anomalies cytogénétiques et génétiques. Mutations « driver » et
évolution clonale. Pr Florence Nguyen-Khac
Hôpital Pitié-Salpêtrière, Paris 6 DES Hématologie Clinique, LLC
Paris, 25/09/2015
A Groupe
C Francophone de
L Cytogénétique
F Hématologique
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I.1. Rappel ADN -> ARN -> protéines
I. « Commencer chaque cours par quelques diapos de base »
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Acides aminés
Transcrits
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Cytogénétique conventionnelle
Biologie moléculaire
Cytogénétique moléculaire
I.2. Les domaines d’analyse du génome
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Les domaines d’analyse selon la résolution
1 bp
1-20 kb
100-500 kb
10 Mégabases
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Cycle cellulaire : 2 temps principaux
Interphase : composée des phases G1, S et G2 : réplication de l’ADN, préparation
de la cellule à la mitose
Mitose : condensation de la chromatine, formation des chromosomes puis
répartition des chromosomes dans les deux cellules filles
I.3.Les chromosomes métaphasiques
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La mitose
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/Mitose/55schema24.htm#
Blocage des mitoses en métaphase : poison des fuseaux : colchicine
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1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 X Y
23 paires de chromosomes : caryotype
Autosomes
Chromosomes sexuels X et Y
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Classement des chromosomes
En fonction
1. de la taille
2. de la position du centromère...
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Bandes G Bandes R Marquage réciproque
3. et des bandes
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Nomenclature
Expression des résultats : formule chromosomique (nomenclature internationale)
Formule normale en onco-hématologie : 46,XX[20] ou 46,XY[20]
-il faut lire 20 mitoses normales pour dire qu’un caryotype hématologique est normal
-si pas d’anomalie mais nombre de mitoses < 20 : échec
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I.4. Autre technique utilisée en routine : hybridation in situ fluorescente (FISH)
• Détection in situ de séquences d’acides nucléiques sur
– métaphases
– noyaux interphasiques
• Ré-association moléculaire spécifique ADN-ADN :
– cible = ADN chromosomique
– sonde = ADN complémentaire marquée avec un fluorochrome
5’ 3’
Interphase Métaphase Sonde (séquence ADN) marquée
Hybridation moléculaire
Lavage Détection des sites hybridés
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Indications de la FISH
• Diagnostic
– anomalie cryptique (non vue au caryotype)
– détection d’une anomalie récurrente essentielle au diagnostic en cas d’échec du caryotype
– précision ou confirmation d’anomalies observées au caryotype
• Suivi
– maladie résiduelle (anomalies non détectables par biologie moléculaire)
– allogreffe de moelle (sexe)
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I.5. Anomalies chromosomiques en onco-hématologie
Acquises : présentes seulement dans les cellules tumorales Clonales
quand au moins 2 mitoses / 20 avec un même gain chromosomique ou
une même anomalie de structure
quand au moins 3 mitoses / 20 avec une même perte
Anomalies primaires : au diagnostic, présentes dans le clone tumoral initial /
Anomalies secondaires : apparition avec l’évolution de la maladie
Anomalies primaires :
clonales
Anomalies secondaires : sous-clonales
Absence d’anomalies
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Trisomie
Monosomie
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A A B B
Translocation
A B
Délétion Duplication
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I.6. Anomalies chromosomiques :
Conséquences au niveau des gènes
Activation d'oncogènes
Inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs
- Trisomie, tétrasomie… : 3 ou 4 copies de gènes
- Monosomie, délétion : perte d’une copie d’un (ou des) gène(s)
inactivation d’une copie : haplo-insuffisance
inactivation des 2 copies (ex : délétion/mutation) : suppresseur de tumeur
- Translocation
- Création d’un gène de fusion
- Activation transcriptionnelle
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II. Anomalies cytogénétiques dans la LLC
II.1. Caryotype cellules de LLC peu proliférantes in vitro Stimulation par CpG-ODN + IL2, 72 heures Anomalies dans 80-90% des cas Mauvais pronostic Caryotype complexe : > 3 anomalies Présence de translocations chromosomiques Evolution clonale : anomalies additionnelles
Mayr, Blood, 2006
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Anomalies chromosomiques Caryotypes complexes
• Caryotype complexe associé à des facteurs de mauvais pronostic 1, 2
– IGHV non muté
– Expression du CD38
– Délétion TP53
– Délétion ATM
• Caryotype complexe : associé à un délai jusqu’au premier traitement raccourci 2 et à une survie plus courte 3, 4
– Y compris chez les cas avec délétion 13q isolée en FISH (OS diminuée) 2
– Y compris chez les cas avec IGHV muté (TTFT diminué) 2
1. Haferlach et al., Leukemia 2007 2. Baliakas et al., AJH, 2013 3. Haferlach et al., Genes Chrom & Cancer, 2010 4. Jaglowski et al., Br J Haematol, 2012
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• Premières publications de l’ère du CpG/IL2 : translocations associées à un pronostic péjoratif, indépendamment du nombre d’anomalies (Mayr et al.,
Blood, 2006)
• Dernières études : les translocations ont un impact pronostique uniquement si déséquilibrées ou au sein d’un caryotype complexe (Baliakas et al., AJH, 2013)
• Translocations IGH : rares (~5%), signification pronostique dépend du gène partenaire – BCL2 : bon - BCL3, MYC : mauvais
Anomalies chromosomiques Translocations
Nguyen-Khac et al., AJBR, 2011
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II.2. FISH
Döhner, NEJM, 2000
Classification hiérarchique pronostique (FISH) - délétion 13q isolée : très bon pronostic - Absence d’anomalie - Trisomie 12 : pronostic intermédiaire - Délétion 11q : mauvais pronostic - Délétion 17p : mauvais pronostic
4 sondes FISH (médiane : 1 anomalie / patient)
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TFS
OS
Avantages de la FISH
- FISH interphasique
- Bonne sensibilité (env 5%) : détection des sous-clones
- Facilité et rapidité technique
Apport du caryotype dans les LLC
- Mise en évidence des caryotypes complexes
- LLC avec FISH 4 sondes normale
• Caryotype anormal dans env. 30% des cas
• Associé à un délai jusqu’au premier traitement et à une survie globale plus courtes
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Anomalies dans plus de 80% des cas Non spécifiques Anomalies « classiques » • Délétion 13q14 : 55% • Trisomie 12 : 10-15% • Délétion 11q : 6% (Stades A) ; 20% (Stades B/C) • Délétion 17p : 5-8% Anomalies moins connues mais fréquentes • Délétion 6q : 6% • Gain 2p : 7-16%
Anomalies rares mais récurrentes (< 5%) Trisomie 18, trisomie 19, gain 8q24, t(14;18), t(14;19), t(8;14), del(14q), del(8p)
Anomalies chromosomiques dans la LLC
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LPL
+++
Syndromes lymphoprolifératifs B matures
MM
+/-
++++
Hyper/Hypo
+++
++
LZM
++
t(11;18) +3q,7q-,+18q,8p
++
+
++
Délétion 6q
Trisomie 4
14q32/IGH
Autres
Trisomie 12
Délétion 13q14
Délétion TP53
Trisomie 18
Délétion ATM
LLC
+
+/-
++
++++
+
+/-
++
MW
++++
++
+/-
+
++
++
++
+/-
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13
der(13)
der(13)
13q14
13q34
Délétion mono-allélique
13
13 der(13)
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Délétion bi-allélique
der(13)
der(13)
13q34
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Trisomie 12
12
12
12
12 12
Sonde centromérique du 12
12
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17 der(17)
17 17
Sonde contrôle verte
TP53
11 11
11 der(11)
Sonde contrôle rouge
ATM
Délétion (11q) (ATM)
Délétion (17p) (TP53)
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III. Anomalies génétiques dans la LLC III.1. Peu de gènes / miARN impliqués dans les anomalies chromosomiques del(17)(p13) : gène TP53 Mutation de l’autre allèle : 80% des cas del(11)(q22) : -gène ATM (« ataxie telangiectasia mutated gene ») Mutation de l’autre allèle : 30% des cas -gène BIRC3 del(13)(q14) : miR-15a, miR-16-1 Délétion Dleu2/miR-15a/miR-16-1 : syndrome lymphoprolifératif B (souris) (Calin et al., PNAS 2002 ; Klein et al., Cancer Cell 2010)
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III.2. Trisomie 12 • 10 à 15% des cas • Pronostic intermédiaire • Atypique : morphologie, scores de Matutes • Zone minimale de duplication : 12q13-q15 • Gènes impliqués ? • Mutuellement exclusive avec del(17p)
• Associée à d’autres anomalies :
Bon pronostic, IGHV muté
trisomies 18, 19 (Ibbotson et al., Leukemia 2012 ; Baliakas et al., Am J Hematol 2013)
t(14;18)/variantes (BCL2) (Put et al., Leukemia 2009 ; Nguyen-Khac et al., Am J Blood Res
2011)
Mauvais pronostic, IGHV non muté t(14;19) (BCL3) (Martin-Subero et al., Leukemia 2007 ; Chapiro et al., Leukemia 2008)
t(8;14) (MYC) (Put et al., GFCH, Ann Hematol 2012)
del(14q) (Reindl, BJH 2010 ; Pospisilova, Leukemia 2012 ; Cosson et al., poster ASH 2013)
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Les mutations géniques
Séquençage à haut débit : ≈ 3000 gènes mutés (Wang et al., N Eng J Med 2011; Puente et al., Nature 2011; Quesada et al., Nat Genetics 2011; Schuh et al., Blood 2012)
Mutations acquises non-passagères (« driver »)
Aucun événement unique
Fréquence de mutations < 20%
Les plus fréquentes : SF3B1, NOTCH1, TP53
Précoces et/ou tardives
Landau et al., Cell 2013
III.3. Mutations récurrentes découvertes par « whole exome sequencing » : séquences codantes
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Whole Exome Sequencing
• Combinaisons de mutations différentes d’un patient à l’autre • Une même mutation peut être clonale chez un patient, et sous-clonale chez un autre patient
Damm et al, Cancer Discovery 2014
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36
Impact pronostique
Association (coopération oncogénique ?)
anomalies cytogénétiques/mutations
Mutations entre elles
Guieze et al., Blood 2015
Rossi et al., Blood 2013
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Fréquence de mutation élevée pour les gènes NFKBIE (10,7%) et EGR2 (8,3%)
EGR2 muté associé à des facteurs de mauvais pronostic
Expression CD38 (p=0,009)
TFS plus courte (p=0,0006)
OS sur 5 ans plus courte (p=0,04)
Damm et al, Cancer Discovery 2014
Séquençage Sanger de 168 patients LLC stades Binet B/C non-traités précédemment (protocole autoLLC, Sutton et al., Blood 2011)
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Puente et al. (2011), Quesada et al. (2011), Wang et al. (2011), Fabbri et al. (2011), Rossi et al. (2011), Rossi et al. (2012), Oscier et al. (2013), Jeromin et al. (2013)
Gène Fonction Prévalence (%)
Association avec
Type de mutation
Pronostic
TP53 Apoptose, cycle cellulaire après dommages à l’ADN
4-12% Del 17p Inactivation Mauvais
ATM Apoptose, cycle cellulaire après dommages à l’ADN
~12% Del 11q Inactivation Mauvais
NOTCH1 Différenciation lymphoïde, prolifération,
apopotose
~10% Trisomie 12 Activation Mauvais
SF3B1 Composant du spliceosome
5-10% Del11q ? Inactivation ?
Mauvais
BIRC3 Régulateur négatif de la voie NFKB
~4% Del 11q Inactivation Mauvais
MYD88 Activateur de la voie NFKB
3-5% Del 13q Activation Bon
III.4. Mutations dans des régions non-codantes (WGS) (Puente et al., Nature 2015)
Region 3’ de NOTCH1 (stabilité et activité )
Enhancer de PAX5 (diminution de l’expression)
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IV. Evolution clonale
Puente, Nat Genet, 2013
L Sutton & R Rosenquist, Haematologica, 2014
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Mutations TP53 : Ultra-deep sequencing révèle que la présence de sous-clones TP53 mutés, même ultra-minoritaires (0,3%) a le même impact clinique péjoratif que les mutations clonales les mutations deviennent majoritaires à la rechute. Leur présence au diagnostic permet d’anticiper le développement de la chimio-résistance (Rossi et al., Blood, 2014)
Landau et al., Cell 2013
• 5 anomalies « driver » : del(13q), tri12, del(11q), del(17p), del(8p) • trisomie 12, del(13q) : « early » événements, clonal dans 80 à 100% des
cellules • del(11q)/ATM, del(17p)/TP53 : plus souvent sous-clonal, événements plus
tardifs, progression de la maladie, rechute
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Origine de la LLC : développement à partir de cellules progénitrices ayant acquis des
mutations : nouveau concept
Développement de molécules ciblant également les cellules pré-leucémiques ?
2 3 4 1
Mutation(s) acquises non passagères dans de progéniteurs
Progéniteurs capables de se différencier dans les lignées lymphoïdes et myéloïdes
La LLC se développe à partir de cellules progénitrices
Damm et al, Cancer Discovery 2014
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Recommandations
Société Française d’Hématologie 2009 Obligatoire : del(11q) and del(17p) par FISH avant traitement Recommandé : protocoles : caryotype, del(11q), del(17p), autres sondes Pospisilova et al., European Research Initiative on CLL (ERIC). Leukemia, 2012
del(17p) (and TP53mutation) before treatment Stilgenbauer et al. Blood, 2014
del(11q) and del(17p): independent prognostic factors on progression free survival del(17p): independent prognostic factor on overall survival 2015 Nouvelles mutations : choix des gènes ? Nouvelles technologies : mutations, gains et pertes ?