Année Universitaire 2010-2011

UE5

Cours du Dr R. GARNOTEL

Les lignées cellulaires : culture de cellules hématopoïétiques

1 – INTRODUCTION

2 – HEMATOPOIESE2.1. Les cellules hématopoïétiques2.2. Régulation de l’hématopoïèse

3 – CULTURES DE CELLULES HEMATOPOIETIQUES3.1. Culture à partir de cellules souches issues de lamoelle osseuse3.2. Culture de cellules dérivées de lignées leucémiques3.3. Différenciation des monocytes ex vivo

4 – APPLICATIONS4.1. Cytométrie en flux4.2. Etudes biochimiques4.3. Implications fonctionnelles

CONCLUSION

1 – INTRODUCTION

Hématopoïèse : ensemble des mécanismes assurant leremplacement continu et régulé des différentes cellulessanguines

Les cellules sanguines comportent 8 lignées différentes :- hématies- polynucléaires neutrophiles- polynucléaires éosinophiles- polynucléaires basophiles- monocytes- lymphocytes B- lymphocytes T- plaquettes

Certaines cellules dans le sang sont en transit de la moellevers les tissus :

- polynucléaires y sont détruits- monocytes macrophages- éosinophiles mastocytes

Malgré des capacités de prolifération nulles ou très faibles, etune durée de vie limitée (hématies : 120 jours, plaquettes :7 jours, polynucléaires neutrophiles : 24 heures), leur nombrereste constant, nécessitant leur remplacement perpétuel

Chaque heure sont ainsi produits 1 X 1010 hématies et 4 X 108

leucocytes

Prolifération rapide à partir de cellules souches

Il y a 3 grands types de culture à partir de cellules sanguines :

- culture à partir de cellules souches issues de la moelleosseuse obtention de différentes lignées

- culture de cellules dérivées de lignées leucémiques :* cellules K562* cellules THP-1

- cas particulier : différenciation de monocytes en cellulesdendritiques

2 – HEMATOPOIESE2.1. Les cellules hématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiques capables de sedifférencier et de s’auto-renouveller, sont présentes dansla moelle

Schématiquement, on peut définir 3 compartiments cellulaires :

-les cellules souches pluripotentes : cellules très primitivesayant un haut pouvoir de prolifération, capables d’auto-renouvellement et de différenciation vers toutes les lignéeshématopoïétiques

- les progéniteurs, capables de proliférer, sans s’auto-renouveller et de se différencierLes cellules sont déjà engagées vers une lignée cellulaire

* CFU-E (Colony Forming Unit) hématies* CFU-Meg plaquettes* CFU-GM polynucléaires, monocytes, lymphocytes

- les précurseurs, cellules déjà reconnaissables morphologi-quement, correspondant à des cellules en cours dematuration avant leur passage dans la circulation sanguine

2.2. Régulation de l’hématopoïèse

Elle doit être parfaitement contrôlée afin que chaque élémentfiguré du sang soit produit en quantité et en temps voulus

Schématiquement, on peut diviser les éléments régulateurs deL’hématopoïèse en 2 grandes catégories :

- les facteurs de croissance- le microenvironnement

Les facteurs de croissanceFacteurs nécessaires au développement de cellules hématopoïétiquesCe sont des glycoprotéines à des concentrations très faibles,de l’ordre de la nanomole ou de la picomoleIls peuvent être divisés en 2 grands groupes principaux :

* les facteurs de régulation positive* les facteurs de régulation négative

- Les facteurs de régulation positive :CSF ‘Colony Stimulating Factor) capables de donner descolonies de cellules hématopoïétiquesCertaines de ces molécules agissent sur des progéniteurs précoces et ne sont pas spécifiques d’une lignée donnée(GM-CSF, IL-3)D’autres ont une action restreinte à une lignée et sontnécessaires à l’acquisition des caractères de différenciationspécifique des cellules matures (érythropoïétine, IL-5)

* IL-3 : toutes lignées* GM-CSF, M-CSF : leucocytes* érythropoïétine (EPO) : hématies* thrombopoïétine : plaquettes* IL-5 : polynucléaires éosinophiles* SCF (Stem Cell Factor) : action synergique avec tousles autres facteurs de croissance hématopoïétiques

- Les facteurs de régulation négative (utilisation in vitro)* TGF-* TNF-

Rôle possible dans l’inhibition de la croissance des cellulesleucémiques

Le microenvironnementIl constitue le cadre dans lequel se développent les celluleshématopoïétiquesIl est formé :- de cellules : fibroblastes, cellules endothéliales, macrophages, adipocytesToutes ces cellules sont capables de sécréter tous lesfacteurs de croissance, mais aussi les inhibiteurs de l’hématopoïèse- d’une matrice extra-cellulaire : réseau de fibres complexeauquel viennent adhérer les cellules hématopoïétiquesCette adhérence est capitale, dans la mesure où la matriceextra-cellulaire constitue un réservoir considérable enfacteurs de croissance

3 – CULTURES DE CELLULES HEMATOPOIETIQUES3.1. Culture à partir de cellules souches issues de lamoelle osseuse

ButEtude des progéniteurs lors de circonstances pathologiquestelles que :

* aplasie* dysmyelopoïèse* leucémies

PrélèvementPrélèvement de moelle osseuse

Principe de la technique

Les cellules hématopoïétiques peuvent survivre, proliférer et se différencier en culture si, et seulement si, on leur fournitdes facteurs de croissance spécifiques ou si on les cultive enprésence de cellules qui produisent ces facteurs Si elles sont privées de ces facteurs, les cellules meurent

- La prolifération à long terme de cellules souches multi-potentes peut être obtenue en cultivant des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse sur une couche decellules stromales médullaires, reconstituant l’environnementde la moelle osseuse Tous les types de cellules myéloïdes

- Les cellules hématopoïétiques dispersées de la moelleosseuse peuvent être cultivées sur une matrice semi-solided’agar ou de méthyl-cellulose, et des facteurs dérivés d’autrescellules peuvent être artificiellement ajoutés au milieu

Parce que les cellules ne peuvent pas migrer dans cette matrice semi-solide, la descendance de chaque cellule précurseurisolée reste groupée pour former une colonie aisémentrepérable

Par exemple, une cellule précurseur déterminée pour engendrer des neutrophiles donnera lieu à un clone contenantdes milliers de neutrophiles

3.2. Culture de cellules dérivées de lignées leucémiques

ButEtudes in vitro

Principe de la techniqueC’est une culture cellulaire en suspensionLes cellules (lignées) sont mises en suspension dans du milieude culture classique (DMEM, RPMI) en présence de 10% de SVF (sérum de veau fœtal)Les cellules se multiplient rapidement (temps de doublementmoyen est de quelques heures)Le milieu contenant les cellules est centrifugé et le culotcellulaire remis en suspension soit pour prolonger lamultiplication soit à fin d’étudesLa différenciation est possible vers différentes lignées enfonction de l’agent stimulant

3.3. Différenciation des monocytes ex vivo

ButApproche thérapeutique de l’utilisation des cellules dendritiques dans le traitement du cancer

Principe de la techniqueLa différenciation des monocytes ex vivo est effectuée parculture d’une semaine environ en milieu défini, en présencede cytokines et de facteurs de croissance spécifiques

Les monocytes sont différenciés en cellules dendritiquesen présence d’IL-3 et de GM-CSF

Les cellules mononuclées du sang périphérique sont collectéspar aphérèse permettant de recueillir 10 milliards de cellulescontenant 10 à 20% de monocytesLes monocytes sont séparés par élutriation avec une viabilitéet une pureté de l’ordre de 95%

Le différenciation en cellules dendritiques pendant 7 jours enprésence d’IL-13 et de GN-CSF est suivie d’une activation

La maturation des cellules dendritiques stimulant des lymphocytes T et secrétant de l’IL-12 est induite demanière irréversible après 6 heures de culture en présenced’IFN- et de liposaccharide de synthèseDurant cette période de maturation, les cellules dendritiquessont chargées par des antigènes spécifiques des tumeurs

L’ensemble du processus, depuis l’aphérèse jusqu’à l’injectionau patient, se fait stérilement en circuit fermé

4 – APPLICATIONS4.1. Cytométrie en fluxVérifier la différenciation cellulaire

4.2. Etudes biochimiques- Adhésion sur la matrice extra-cellulaire- Activation cellulaire- Transduction du signal

4.3. Implications fonctionnelles- Inflammation- Infection- Athérosclérose

CONCLUSION

Trois types de cultures avec trois buts différents :

- diagnostic

- études cellulaires

- thérapeutique