ankara Ünİverİstesİ fen bİlİmlerİ enstİtÜsÜ yÜksek

75
ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ ÇİĞ SÜTTE Bacillus cereus SAYILMASI İÇİN YÖNTEM MODİFİKASYONLARI ÜZERİNE ÇALIŞMALAR Selin KALKAN GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2006 Her hakkı saklıdır

Upload: duongnhu

Post on 25-Jan-2017

254 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

Page 1: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

ÇİĞ SÜTTE Bacillus cereus SAYILMASI İÇİN YÖNTEM MODİFİKASYONLARI ÜZERİNE ÇALIŞMALAR

Selin KALKAN

GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI

ANKARA 2006

Her hakkı saklıdır

Page 2: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

ÇİĞ SÜTTE Bacillus cereus SAYILMASI İÇİN YÖNTEM MODİFİKASYONLARI ÜZERİNE ÇALIŞMALAR

Selin KALKAN

Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN

Bu çalışma birbirini izleyen 3 aşamada gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada Ankara piyasasından sağlanan 25 adet çiğ süt örneğine mikrobiyolojik analiz yapılmış, toplam aerobik mezofilik bakteri sayısının 6,39-8,33 log kob/mL, selektif agar katkısı olarak Polimiksin B Sülfat (PBS) kullanılan MYP Agar besiyerinde 6,13-7,60 log kob/mL, selektif agar katkısı kullanılmadan hazırlanan MY Agar besiyerinde ise 7,22-8,09 log kob/mL olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca her bir çiğ süt örneği 55 oC'de 10 dakika pastörize edilerek, pastörizasyon sonrası toplam aerobik mezofilik bakteri sayısının 2,28-3,73 log kob/mL, PBS kullanılan MYP Agar besiyerinde 2,34-2,40 log kob/mL, selektif agar katkısı kullanılmadan hazırlanan MY Agar besiyerinde ise 2,78-3,40 log kob/mL olduğu tespit edilmiştir. Çiğ süt örneklerindeki hakim flora belirlenerek, refakatçi florada Bacillus türlerinin dominant flora olduğu tespit edilmiştir. İkinci aşamada belirlenen refakatçi floranın ısıl işlem ile inaktivasyonu amaçlanmış ve düşük sıcaklıkta pastörizasyon (55 oC'de 10 dakika) uygulaması ve PBS kullanımının refakatçi floraya ve B. cereus' a etkileri gözlemlenmiştir. Düşük sıcaklıkta pastörizasyon ve antibiyotik kullanımı B. cereus'un MYP Agar'da koloni gelişimi göstermemesine neden olmuştur. Son aşamada farklı selektif agar katkısı kullanımın B. cereus ve refakatçi flora üzerine etkileri gözlemlenmiştir. MYP Agar besiyeri hazırlanmasında kullanılan PBS miktarının tam olarak refakatçi flora inhibisyonunda yeterli gelmediği tespit edilmiştir. Bu nedenle artan miktarlarda PBS kullanımının etkileri araştırılmış ve normal miktardan (100 IU/mL) daha yüksek miktarlarda (150, 200 IU/mL) PBS kullanımının B. cereus gelişimini olumsuz etkilediği anlaşılmıştır. Bu nedenle B. cereus 'un daha az, refakatçi floranın daha fazla hassasiyet gösterdiği diğer bir antibiyotik olan Penisilin G Potasyumun (PGP) artan miktarlarda (1000, 2000, 3000 IU/mL) selektif agar katkısı olarak kullanımı denenmiş ve etkileri gözlemlenmiştir. Buna göre 1000 IU/mL miktarlarda PGP kullanımı, PBS kullanımından daha etkin sonuç vermiştir. Buna göre B. cereus 'u en az, refakatçi florayı en fazla etkileyen antibiyotik konsantrasyonu olarak 1000 IU/mL PGP olduğu belirlenmiştir. Yalnız hem düşük sıcaklıkta pastörizasyon uygulaması (55 oC'de 10 dakika) hem de antibiyotik kullanımının kombine olarak uygulandığı durumlarda B. cereus hiç gelişemediği tespit edilmiştir. 2006, 59 sayfa Anahtar Kelimeler: Çiğ süt, B. cereus, MYP Agar, antibiyotik, modifikasyon

i

Page 3: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

ABSTRACT

Master Thesis

STUDY OF METHOD MODIFICATIONS FOR ENUMERATION OF Bacillus cereus IN RAW MILK

Selin KALKAN

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering

Supervisor: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN

This study was performed in 3 sequent stages. In the first stage, 25 raw milk samples collected from Ankara market were microbiologically analised, number of total aerobic mesophilic bacteria was determined as 6,39-8,33 log cfu/mL, as 6,13-7,60 log cfu/mL in the MYP Agar medium in which Polymyxin B Sulphate (PBS) was used as selective agar additive, and as 7,22-8,09 log cfu/mL in the MY Agar medium prepared without using any additives. Furthermore, each the raw milk samples was pasteurized at 55ºC for 10 minutes, and the number of total aerobic mesophilic bacteria after pasteurization was determined as 2,28-3,73 log cfu/mL, as 2,34-2,40 log cfu/mL in PBS used MYP Agar medium, and as 2,78-3,40 log cfu/mL in MY Agar medium prepared without using any selective agar additive. The dominant flora in the raw milk samples were designated, and it was determined that Bacillus species were dominant in the companion flora. In the second stage, inactivation of the determined companion flora by thermal process was aimed, and the effects of pasteurization at low temperature (10 min at 55 ºC) and PBS usage on companion flora and B. cereus was observed. Pasteurization at low temperature and antibiotics usage caused B. cereus not to grow colony on MYP Agar. At the last stage the effects of use of various selective agar additives on B. cereus and companion flora was observed. It is determined that, amount of PBS used in preparing MYP Agar medium was not adequate to inhibite the companion flora precisely. For this reason, the effects of increasing amounts of PBS usage was searched and it was ascertained that using PBS at higher dosages (150, 200 IU/mL) than normal dosage (100 IU/mL) effected the B. cereus growth adversely. Therefore, use of an another antibiotics, Penicillin G Potasium (PGP)-to which B. cereus shows less sensitivity and companion flora more-as selective agar additive in increasing amounts (1000, 2000, 3000 IU/mL ) was experimented end the effects was observed. According to that, use of PGP at dosage of 1000 IU/mL gave a more effective result than use of PBS. In respect, the antibiotics concentration to effect B. cereus the least, and the companion flora the most was determined as 1000 IU/mL of PGP. However, it was determined that at conditions where the pasteurization at low temperature (10 min at 55ºC) and antibiotics usage is combined B. cereus did not grow at all. 2006, 59 pages Key Words: Raw milk, B. cereus, MYP Agar, antibiotic, modification

ii

Page 4: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK
Page 5: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

TEŞEKKÜR

Çalışmalarımı yönlendiren, araştırmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını

esirgemeyerek akademik ortamda engin fikirleriyle gelişmeme katkıda bulunan

danışman hocam sayın Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN’a, çalışmalarım süresince

manevi desteklerini esirgemeyerek önemli katkılarda bulunan Araş. Gör. Gökçe

POLAT ve Ziraat Yük. Müh. Deniz KOÇAN ile laboratuvarda birlikte çalıştığım tüm

arkadaşlarıma ve yardımlarını gördüğüm tüm bölüm elemanlarına, birçok fedakarlıklar

göstererek beni maddi manevi destekleyen aileme en derin duygularımla teşekkür

ederim.

Selin KALKAN

Ankara, Temmuz 2006

iii

Page 6: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

İÇİNDEKİLER

ÖZET................................................................................................................................i

ABSTRACT....................................................................................................................ii

TEŞEKKÜR...................................................................................................................iii

SİMGELER DİZİNİ.......................................................................................................v

ŞEKİLLER DİZİNİ.......................................................................................................vi

ÇİZELGELER DİZİNİ................................................................................................vii

1.GİRİŞ.............................................................................................................................1

2. KURAMSAL TEMELLER........................................................................................4

2.1 Bacillus Cinsi Bakterilerin ve B. cereus ’un Genel Özellikleri..............................4

2.1.1 Bacillus cinsi bakterilerin genel özellikleri..........................................................4

2.1.2 Bacillus cereus ’un genel özellikleri......................................................................7

2.2 Bacillus cereus ’un İçme Sütünde Oluşturduğu Sorunlar..................................10

2.2.1 Ekstraselüler enzim aktivitesi.............................................................................11

2.2.2 Isıl işlemin enzim aktivitesi üzerine etkisi.........................................................13

2.3 Bacillus cereus ’un Standart Analiz Yöntemi.......................................................18

2.3.1 Selektif besiyerine ekim ve izolasyon..................................................................18

2.3.2 Biyokimyasal identifikasyon................................................................................19

2.4 Hızlı Analiz Yöntemleri...........................................................................................21

2.5 B. cereus Sayımına yönelik Yapılan Çalışmalar ve Kullanılan Besiyerleri.......22

2.6 B. cereus ’un Antibiyotiklere Duyarlılığı...............................................................24

3. MATERYAL VE YÖNTEM....................................................................................26

3.1 Materyal...................................................................................................................26

3.1.1 Mikroorganizmalar..............................................................................................26

3.1.2 Süt..........................................................................................................................26

3.1.3 Antibiyotik denemelerinde kullanılan materyal................................................26

3.2Yöntem.......................................................................................................................27

3.2.1 Çiğ sütten bakteri izolasyonu ve tanımlama......................................................27

3.2.2 Mevcut floranın ısıl işlem ile inhibisyonu..........................................................31

3.2.3 Besiyeri modifikasyonu denemeleri...................................................................32

3.2.4 Piyasa taraması....................................................................................................35

4. BULGULAR VE TARTIŞMA.................................................................................37

Page 7: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

4.1 Durum Değerlendirmesi.........................................................................................37

4.2 Refakatçi Floranın Isıl İşlem Yoluyla İnhibisyonu Çalışmalarının

Değerlendirilmesi....................................................................................................40

4.3 Besiyeri Modifikasyonu Denemeleri Sonuçları.....................................................42

4.3.1 PBS kullanımının refakatçi flora ve B. cereus üzerindeki etkisi......................42

4.3.2 Selektif agar katkısı olarak PGP kullanımının refakatçi flora ve

B. cereus üzerine etkisinin değerlendirilmesi....................................................44

4.4 Piyasa Taraması Sonuçları.....................................................................................47

5. SONUÇ.......................................................................................................................50

KAYNAKLAR...............................................................................................................52

EKLER...........................................................................................................................57

EK 1 MYP Agar besiyerinde çiğ sütten gelen Refakatçi flora.................................57

EK 2 Çiğ süt örneklerinde gram negatif bakterilerin tanımlanması.......................58

ÖZGEÇMİŞ...................................................................................................................59

iv

Page 8: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK
Page 9: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

SİMGELER DİZİNİ

IU International Unit

MR Metil Red Testi

MYP Agar Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar

MY Agar Mannitol Egg Yolk Agar

O/F Oksidasyon/Fermantasyon Testi

PGP Penisilin G Potasyum

PBS Polimiksin B Sülfat

TMAB Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri

VP Voges-Proskauer Testi

v

Page 10: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK
Page 11: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1. B. cereus ’un MYP Agar besiyerindeki görünümü.........................................21

Şekil 3.1. B. cereus ’un antibiyogram test sonucu...........................................................35

vi

Page 12: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1 8 oC'de depolanan sütün spor sayımında değişiklikler…………………….14

Çizelge 2.2 8 oC'de 6 gün depolanmış sütte proteolizis ve lipolizis üzerine

termizasyonun etkisi……………………………………………………...14

Çizelge 2.3 HTST pastörizasyon sonrası sütte psikrofilik bakteri kaynaklı

artık enzim aktivitesi……………………………………………………...15

Çizelge 2.4 Ekstraselüler enzimlerin düşük sıcaklık inaktivasyonu…………………...16

Çizelge 2.5 Bacillus cereus 'un biyokimyasal test sonuçları…………………………...20

Çizelge 2.6 B. cereus izolasyonunda kullanılan besiyerleri ve

selektif-tanımlayıcı sistemleri…………………………………………….22

Çizelge 2.7 B. cereus 'un çeşitli antibiyotiklere karşı duyarlılığı……………………...25

Çizelge 4.1 Çiğ sütte bulunan mikroorganizma yükü…………………………………37

Çizelge 4.2 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (55 oC'de 10 dak.)

karışım için MYP Agar'da B. cereus, TMAB ve diğer izolatların

sayım sonuçları…………………………………………………………...43

Çizelge 4.3 PGP için antibiyogram test sonuçları……………………………………..45

Çizelge 4.4 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (55 oC'de 10 dak.)

karışım için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar'da gelişme

gösteren B. cereus, TMAB ve diğer izolatlar için sayım

sonuçları…………………………………………………………………46

Çizelge 4.5 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (80 oC'de 5 dak.)

çiğ süt örnekleri için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar'da

gelişme gösteren B. cereus, TMAB sayım sonuçları……………………..47

Çizelge 4.6 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (80 oC'de 5 dak.) çiğ süt örnekleri

için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar'da gelişme gösteren

B. cereus, TMAB yükünün değerlendirilmesi…………………………….49

vii

Page 13: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK
Page 14: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

1

1. GİRİŞ

Çiğ süt, bir veya daha fazla sağmal hayvanın (inek, keçi, koyun ve mandanın)

sağılmasıyla elde edilen, 40 oC'nin üzerine ısıtılmamış veya eşdeğer etkiye sahip

herhangi bir işlem görmemiş kolostrum dışındaki meme bezi salgısıdır (Anonim 2000).

Süt teknolojisinde ise çiğ süt denildiği zaman, süt hayvanının memesinden muntazam

aralıklarla ve tam olarak sağılan, sonra soğutulan, içerisinden herhangi bir bileşeni

alınmayan veya içerisine herhangi bir madde ilave edilmeyen, işlenmek üzere süt

fabrikalarına kabul edilen ve önceden herhangi bir işlem uygulanmamış süt

anlaşılmaktadır (Metin 1998).

Süt ve süt ürünleri mikroorganizmaların gelişmesi açısından ideal bir ortam olarak

çeşitli hastalıkların ortaya çıkmasında potansiyel bir kaynak oluşturur. Hayvanın sağlık

durumundan, ürün haline dönüşünceye kadar geçirdiği her aşamada çeşitli faktörler

sütün hijyenik kalitesini etkilemektedir.

İnsan beslenmesinde çok önemli bir yere sahip olan süt, hijyenik koşullarda

üretilmediği, saklanmadığı, işlenmediği gerekli kontrollerin yapılmadığı durumlarda

insan sağlığı açısından zararlı olabilmektedir. Çiğ süt az sayıda bakteri içerse bile

sağımdan sonra çevreden çeşitli yollarla bulaşan mikroorganizmaların etkisiyle oldukça

kısa sürede bozulur ve insanlarda hastalıklara yol açan birçok patojenin potansiyel

kaynağını oluşturur. Bu nedenle çiğ süt, insan gıdası olarak doğrudan tüketime uygun

değildir.

Çiftliklerde sütlerin uzun süre soğukta depolanması, mezofilik mikrofloranın gelişmesi

ile ilgili problemleri en aza indirgemektir. Bununla beraber, çiğ sütün düşük sıcaklıkta

depolanması nedeniyle psikrofilik bakterilerin neden olduğu yeni problemler ortaya

çıkmaktadır (Burdova et al. 2002).

Page 15: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

2

Griffiths ve Phillips'e göre (1988), pastörize süt ürünlerinin dayanıklılığının azalışındaki

en önemli kritik faktör, çiğ sütün depolanma sıcaklığıdır. Çiğ sütteki gerçek psikrofilik

mikrofloranın sayısı ve çiğ sütün soğutulma hızı da diğer önemli faktörler arasında

sayılmaktadır. Psikrofilik, lipolitik ve proteolitik bakterilerin enzim üretimleri ile sütte

meydana gelen değişiklikler, pastörizasyon öncesi çiğ sütün uzun süre depolanmasının

sonuçlarıdır. Bu nedenlerle sütün işlenmesi sırasında ve süt ürünlerin kalitesinin

korunmasında problemler yaşanması beklenir (Burdova et al. 2002).

Son yıllarda özellikle Bacillus cereus ile kontamine olan süt ve ürünlerinin halk sağlığı

açısından risk taşıdığı, kontamine süt ve ürünlerinin soğukta muhafazası sırasında

psikrotrof serotiplerin üreyerek toksin oluşturdukları bildirilmiştir (Özdemir 2003).

Azot kaynağı, karbon kaynağı, oksijen düzeyi, süt bileşenleri gibi etkenler ile sütün

işlenmesi sırasındaki pH ve sıcaklık B. cereus gelişimi üzerine etkili faktörlerdir. B.

cereus spor oluşturabilen bir bakteri olduğundan, pastörize sütlerin oda sıcaklığında

bozulmasına yol açabilmektedir.

Sağım aletleri ve depolama tankları, çiğ sütlerin mikroorganizma ile kontaminasyonları

açısından önemli bir kaynaktır. Sağım aletlerinin ve depolama tanklarının temizliğine

dikkat edilerek mikroorganizma kontaminasyonu ve üremesi kontrol altına alınabilir.

Çiğ sütte bazı mikroorganizmaların bulunması, çevresel kaynaklı kontaminasyonlardan

dolayı sanitasyon koşullarının uygulanması gerektiğini göstermektedir. Ayrıca bu

mikroorganizmaların çiğ sütlerde bulunma oranı ve üreme kapasiteleri mevsimsel

olarak da değişiklik göstermektedir (Altun vd. 2002, Slaghuis et al. 1997, Svensson et

al.1999).

Pastörize sütlerde B. cereus ve sporlarının bulunmasının temel nedeni, çiğ sütlerin

sağım ve ahır hijyenindeki yetersizliklerdir. Pastörizasyon sonrası kontaminasyonlar ise

daha az önemlidir. Bu nedenle sağım aletleri ve depolama tanklarının temizliğine dikkat

edilerek Bacillus cereus 'un da dahil olduğu psikrotrof grup bakterilerin üremesi kontrol

altına alınmalıdır (Altun vd. 2002).

Page 16: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

3

Psikrofilik bakterilerden olan B. cereus 'un salgıladığı proteaz enzimleri çiğ sütün

işlenmesi sırasında stabilitelerini korumakta, enzim miktarı ve aktivitesine bağlı olarak

zaman içerisinde işlenmiş süt ürünlerinde pıhtılaşmaya neden olmaktadır. Dolayısıyla

ürünün raf ömrü kısalmakta ve kalite kayıpları yaşanmaktadır. B. cereus 'un çeşitli gıda

örneklerinde sayımı için Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar besiyeri önerilmekle

beraber, sanayiden gelen veriler bu besiyerinin Bacillus cereus selektivitesinin yeterli

olmadığı yönündedir. Çiğ sütlerdeki gerçek Bacillus cereus varlığı ve sayısı doğru tespit

edilerek, işlenmiş süt ürünlerindeki kalite kayıplarının önüne geçilebilir.

Bu çalışmada, çiğ sütten gelen bakteriyel florada yer alan ve işlenmiş süt ürünlerinde

bulunması durumunda kalite kayıpları ile gıda zehirlenmesine neden olabilecek B.

cereus 'un izolasyon ve sayım yöntemlerinin modifikasyonudur.

Page 17: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

4

2. KURAMSAL TEMELLER

Çiğ süt, kendisinden üretilen birçok ürünün hammaddesidir. Bu nedenle, işlenmemiş çiğ

sütün içerdiği başlangıç bakteri yükü oldukça önemlidir. Çiğ süt mikroflorası içinde pek

çok bakteri yer almakta ve sütün kalitesini olumsuz yönde etkilemektedir. Teknolojik

açıdan, yüksek bakteri yoğunluğuna sahip sütlerin işlenmesi güçleşmekte elde edilen

ürünlerin kalitesi de düşmektedir. Sütün elde edildiği hayvanın sağlık durumundan, sütün

ürüne dönüşünceye veya tüketiciye ulaşıncaya kadar her aşamada birçok faktör sütün

hijyenik kalitesini etkilemektedir (Alişarlı vd. 2003).

2.1 Bacillus Cinsi Bakterilerin ve Bacillus cereus 'un Genel Özellikleri

2.1.1 Bacillus cinsi bakterilerin genel özellikleri

Bacillus adı, 1872 yılında Ferdinand Cohn tarafından ilk defa kullanılmıştır (Lin 1997).

Bacillaceae familyasına dâhil olup, Gram pozitif (bazı türleri değişken), aerobik veya

fakültatif anaerobik, spor oluşturan, çubuk şeklinde bakterilerdir. Çoğunlukla mezofilik

olmakla birlikte psikrotrof ve termofilik türleri de vardır (Ayhan 2000). Endospor

oluştururlar. Vejetatif hücreler 0,5x1,2 µm ile 2,5x10 µm çapındadır. Bacillus cinsinin

koloni morfolojisi çeşitlilik gösterir.

Elliye yakın türü bulunan Bacillus 'larda, endosporun hücre içindeki yeri farklıdır. Spor,

hücre merkezinde veya uçta, ayrıca, vejetatif hücreden daha dar olabildiği gibi, daha

geniş de olabilir. Şekerleri fermente ederler ve sonuçta gaz oluşumu görülmeksizin asit

üretirler. Proteinleri ise, amonyak oluşturarak parçalarlar ve böylece kokuşmaya neden

olurlar. DNA'larındaki G+C mol oranı %32-62'dir (Çon ve Gökalp 1997).

Bütün türleri Nutrient Agar, Trypticase Soy Agar, Brain Heart Infusion ve Kanlı Agar

gibi besiyerlerinde oldukça iyi ürer. Karbon kaynağı olarak organik asit, şeker ve alkol

içeren; nitrojen kaynağı olarak da amonyum bulunduran sentetik ortamlarda çok iyi

gelişirler (Kaynar ve Beyatlı 2006).

Page 18: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

5

Birkaç Bacillus türü polipeptit sınıfı antibiyotik üretir. Antibiyotikler, kültürlerde spor

oluşturma aşaması başlandığında gözlenmiştir (Kalaylı ve Beyatlı 2003).

Bacillus spp. sporları, çevrede düzenli olarak bulunmaktadırlar ve genellikle sütün

işlenmesi sürecinde ikincil kontaminasyonu temsil ederler. Bacillus türlerinin bir kısmı

sütün psikrofilik mikroflorasını oluşturur. B. licheniformis ve B. cereus çiğ sütten izole

edilen en yaygın Bacillus türleridir (Janstova et al. 2004).

Bacillus spp. çiğ sütün mikroflorasının oldukça sorunlu bir kısmıdır, sporların ortadan

kaldırılabilirliği, sporların ısıl dirençlerine bağlıdır. Sporların bir kısmı pastörizasyon

sıcaklığında zarar görebilir ama genellikle sterilizasyon ve UHT işlemlerinde

yaşamlarını sürdüremezler. Bacillus spp.'nin en önemli karakteristiği vejetatif

hücrelerinin, çoğalma sonrası üreme ortamında termostabil ekstraselüler enzimler

üretmesi ve bunun yol açtığı proteolitik ve lipolitik aktivitedir (Janstova et al. 2004).

Brown'a göre (2000) Bacillus spp. endüstride önemli ekonomik kayıplara yol açan

mikroorganizmalar arasında yer alır.

Bacillus türlerinin tanımlanması ve türler arasındaki farklılıkların belirlenmesi için spor

ve sporangium morfolojileri temel alınmıştır. Buna göre Bacillus türleri 3 grupta

toplanmıştır (Kalaylı ve Beyatlı 2006).

Birinci grup Bacillus türleri kendi içlerinde A ve B olmak üzere ikiye ayrılır. Her iki

grupta sporangia şişmemiştir. Gram pozitif, sporlar elips veya silindirik şekilli, santral

veya terminal konumludur. A grubu ve B grubu arasındaki fark ise A alt grubunda hücre

genişliği 1 µm'den küçük, B alt grubunda ise 1 µm'den büyüktür. A alt grubuna örnek

olarak B. cereus, B. megaterium, B alt grubuna örnek olarak ise B. licheniformis, B.

subtilis, B. pumilus, B. firmus ve B. coagulans verilebilir.

Page 19: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

6

İkinci grupta yer alan Bacillus türlerinde sporangia şişmiştir. Sporları elips, santral ve

terminaldir. Bu grupta yer alan türlere örnek olarak B. polymyxa, B. macerans, B.

circulans, B. stearothermophilus, B. alvei, B. laterosporus ve B. brevis verilebilir.

Üçüncü grupta yer alan Bacillus türlerinde de sporangia şişmiştir. Sporlar küresel,

subterminal ve terminal konumludur. B. sphaericus bu gruba örnektir.

Birçok türü bulunan Bacillus 'lar toprak, su ve çeşitli gıdalarda bulunurlar. Bacillus

anthracis insan ve hayvanlarda şarbon hastalığına neden olur. B. thuringiensis, B. larvae,

B. lentimorbus, B. popilliae ve B. sphaericus 'un bazı türleri böcek patojenidir ve B.

thuringiensis biyoinsektisit olarak kullanılmaktadır. B. cereus 'un bazı suşları insanlarda

gıda zehirlenmesine neden olur. B. coagulans ve B. stearothermophilus 4,2 gibi oldukça

düşük pH değerlerinde gelişebilirler ve özellikle konserve gıdalarda bozulmalara neden

olurlar. B. stearothermophilus sporları, bakteri sporları arasında sıcaklığa en dirençli

sporlardır. B. coagulans (B. thermoacidurans) sıcaklığa daha az, ancak asitliğe daha

fazla dayanıklıdır. B. subtilis, subtilin adlı bir bakteriyosin üretmektedir. B.

licheniformis basitrasin, B. polymyxa ise polimiksin antibiyotiklerinin üretiminde

kullanılır. B. subtilis, B. amiloliquefaciens ve B. stearothermophilus bakteriyel α-

amilaz enzim üretiminde kullanılmakta olup amilaz ve amilodekstrini dekstrinlere

parçalar (Ayhan 2000). B. stearothermophilus, yeni sınıflamada Geobacillus

stearothermophilus olarak adlandırılmıştır (Anonim 2005).

B. subtilis, B. mesentericus ve B. stearothermophilus ise bakteriyel proteinaz enzimi

üretiminde kullanılmaktadır. Bu enzim ise et ve balık etlerinin tenderize edilmesinde

(yumuşatılması), şarap ve bira endüstrisinde protein bulunıklığının alınmasında stabilize

edici olarak kullanılmakta olup, miso ve soysos üretiminde starter kültür olarak da

yararlanılmakta olduğu bildirilmektedir (Ayhan 2000).

Page 20: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

7

2.1.2 Bacillus cereus 'un genel özellikleri

Bacillaceae familyasının Bacillus cinsine ait bir bakteri olan Bacillus cereus, toprak ve

bitki örtüsü üzerinde yaygın bir şekilde bulunmaktadır. Santral veya subterminal yapıda,

elipsoidal sporlara sahip olan bakteri, peritrik flegellaları sayesinde hareketli ve

aerobiktir. Optimum gelişme sıcaklığı, suşlara göre 28–35 oC arasında değişmekle

birlikte genellikle 30 oC'dir. En yüksek üreme sıcaklığı yine suşlara göre 37–48 oC

arasında değişir. En düşük üreme sıcaklığı da suşa bağlı olarak 10–18 oC arasındadır.

Bazı kaynaklarda en düşük sıcaklık 4–5 oC, en yüksek sıcaklık ise 50 oC olarak

verilmektedir. Spor germinasyonu için gereken optimum sıcaklık 30 oC, minimum -1 oC

ve maksimum 59 oC'dir. Gelişebildiği pH aralığı 4,9–9,3 olup optimum 7,0'dir. Bacillus

cereus; lesitinaz, jelatinaz, proteaz ve amilaz aktivitesine sahip olup nitrat redüksiyonu

pozitif ve polimiksine dirençlidir. Birçok suşu da %7,5 tuzda üreyebilir. Cereus adını

tahıl anlamındaki cereal'dan alır (Sekin ve Karagözlü 1997).

Aerobik spor sayımı ile B. cereus 'un düzeyi mevsimsel olarak değişiklik

göstermektedir. Aerobik spor sayısı kışın daha yüksek orandadır. B. cereus 'un

belirlenmiş en yüksek sayısı yaz sonu ve sonbahardır (Slaghuis et al. 1997).

Yaz aylarında merada beslenen süt ineklerinden elde edilen çiğ sütlerin, kış aylarında

elde edilen sütlere kıyasla, B. cereus ile daha fazla kontamine olduğu bildirilmekte olup,

4 oC'de muhafaza edilen pastörize sütlerde 48. saat sonunda psikrotrof bakterilerin

florada baskın bulunduğu ve B. cereus 'un pastörize sütlerde bulunma düzeyi ile raf

ömrü arasında bir ilişkinin olduğu belirtilmiştir (Özdemir 2003).

Toprak yolu ile kontaminasyonda, su içeriği ile topraktaki B. cereus sayısı arasında

pozitif bir ilişki bulunmaktadır. Yazın harman işlemleriyle atmosfere dağılan toz

parçacıklarının yüksek orandaki spor yükü, bu etkinin doğal bir açıklamasıdır (Slaghuis

et al. 1997).

Page 21: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

8

B. cereus 'un çok sayıda alınması ile bireylerde gıda zehirlenmesi görülebilir. Özellikle

B. cereus ile kontamine olmuş gıdalar pişirildikten sonra yeterince ve hızlı

soğutulmadıklarında veya gıdaların hazırlanması ile tüketimi arasındaki süre

uzadığında, canlı ve ısıya dirençli olan sporların çimlenmesi sonucu mikroorganizma

çoğalıp, gıda zehirlenmesine neden olabilecek düzeyde toksin oluşturabilir. Gıda

zehirlenmeleri, gıdadaki bakteri sayısı ≥106/g olduğunda ortaya çıkmaktadır (Sekin ve

Karagözlü 1997).

B. cereus zehirlenmesinde aracı gıdalar olarak, pişmiş pirinç, makarna, et, kümes

hayvanları, sebze yemekleri, çeşitli çorbalar, pudingler, baharat ve soslar sayılabilir.

Ayrıca toprak kökenli olması nedeniyle tarla ve bahçe ürünlerine rahatlıkla bulaşabilen

B. cereus, sporlu bir bakteri olduğu için et ve süt ürünlerinde de bulunabilir (Kaleli ve

Özkaya 2000).

B. cereus, ilk defa Hauge (1950–1955) tarafından Norveç'te 600 kişiyi etkileyen 4 ayrı

gıda zehirlenmesi vakasında, etiyolojik etmen olarak bildirilmiş ve 4 vakada da

zehirlenmeye neden olan gıdanın, hazırlandıktan sonra bir gün bekletilmiş vanilyalı sos

olduğu saptanmıştır. Bu olaydan sonra diğer birçok Avrupa ülkesinde de B. cereus

vakası tespit edilmiştir. B. cereus kaynaklı 9 gıda zehirlenmesi 1980 yılında, 8 gıda

zehirlenmesi vakası ise 1981 yılında Hastalık Kontrol Merkezine rapor edilmiştir.

Staphylococcus aureus intoksikasyonunun B. cereus kusma tipi sendromuna, C.

perfringens gıda zehirlenmesinin B. cereus diyare tipi sendromuna benzer semptomları

nedeniyle rapor edilmeyen gıda zehirlenmeleri vakaları da bulunmaktadır

(http://www.vm.cfsan.fda.gov, 2004).

Bacillus cereus iki farklı toksin oluşturur. Bunlardan birisi 40 kDa ağırlığında, sıcaklığa

dayanıklı (Stabil Toxin; ST) bir protein olan enterotoksindir. Gıda zehirlenmesine neden

olan bu toksin 126 oC'de 90 dakikada inaktif hale gelir. Diğer toksin ise 5–7 kDa

ağırlıkta, sıcaklığa dayanıksız (Labil Toxin; LT) olan bir peptittir. 60 oC'de birkaç

dakikada tahrip olur (Tunail 2000).

Page 22: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

9

Bacillus cereus türündeki bütün suşların toksin yapmadığı, belli serotiplerin toksin

oluşturduğu bilinmektedir. Bu bakterinin intoksikasyon yoluyla hastalık yaptığına

ilişkin kesin bir şey söylemek mümkün değildir. Bağırsakta gelişerek toksin oluşturduğu

bilinen bakterinin anaerobik koşulda in vitro olarak toksin oluşturduğu da gösterilmiştir

(Tunail 2000).

B. cereus gıda zehirlenmesine neden olan ekstraselüler toksin, ortamdaki bakteri sayısı

belirli bir düzeye ulaştıktan sonra saptanabilir. B. cereus, C. perfringens gibi lesitinaz C

enzimi de salgılamaktadır, ancak toksik aktivitenin aynı molekülde yer almadığı

bildirilmiştir. B. cereus 'un toksin oluşturmasında ortamda bazı besin öğelerinin

varlığına bağlı olduğu bilinmektedir. Organizma toksini logaritmik faz sırasında

sentezler ve salgılar. Yapılan çalışmalarda organizmanın 18–44 oC arasında toksin

sentezlediğini ve 45 oC'de üremesinin durduğu tespit edilmiştir (Sekin ve Karagözlü

1997).

B. cereus toksini ve pronaz enzimlerine duyarlı olup 37 oC'de 60 dakikada bu

enzimlerin % 0,01'lik dozu ile inaktif hale gelmektedir. Toksin, 45 oC'de 30 dakikada

aktivitesini kaybetmez ancak 56 oC'de inaktif hale geçer (Sekin ve Karagözlü 1997).

B. cereus, emetik ve diyarejenik enterotoksin olmak üzere iki farklı tip enterotoksin

sentezler ve dolayısıyla iki farklı tip zehirlenmeye neden olur. Bunlardan biri "akut

başlayan kusma tipi sendrom" olup daha çok pişmiş pirinç ve pirinçli gıdalarda oluşan

toksinle ilişkilidir. Kusturucu toksin olarak isimlendirilen bu toksin sıcaklık ile pH'ın

yanı sıra tripsin ve pepsin enzimlerine de dirençlidir. Diğer hastalık tipi ise "uzun sürede

gelişen diyare tipi sendrom" olarak bilinmektedir ve daha geniş bir gıda grubu ile

ilişkilidir. Bu gıdalar arasında; mısır ve mısır nişastası başta olmak üzere tahıl içeren

gıdalar, patates püresi, sebzeler, kıyma, bazı et ürünleri, puding ve çorbalar sayılabilir.

Diyare yapıcı toksin olarak bilinen bu toksin protein yapısında olup, tripsin ve pronaz

enzimleri ile sıcaklığa karşı duyarlıdır (Kaleli ve Özkaya 2000).

Page 23: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

10

Diyarel tip toksin üzerinde oldukça yoğun çalışmalar yapılmıştır ve bu toksinin tespit

edilmesi için çok sayıda metot geliştirilmiştir. B. cereus toksikoloji çalışmalarında

başarıyla uygulanan ilk metot RIL (ligated rabbit ileal loop) testidir. Son zamanlarda

pasif lâteks aglütinasyon testi (RPLA) ile ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)

enterotoksin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Emetik ve diyarel B.

cereus serotipleri benzer antibiyotik hassasiyete ve yağ asidi kompozisyonuna

sahiptirler. Diyarel toksini tespit edebilecek test kitleri bulunmasına rağmen emetik tip

toksini tespit edebilecek genel bir kit ya da hızlı analiz yoktur (Lin 1997).

Nispeten daha hafif seyreden B. cereus 'un diyare tipi gıda zehirlenmesinde inkübasyon

süresi 8–16 saat arasında değişmekte olup, genelde 12–13 saattir. Hastalık 6–12 saat

sürer ve belirtileri; bulantı (kusma çok seyrektir), kramp şeklinde karın ağrısı ve sulu

ishaldir. Genellikle ateş görülmez. Bu tip B. cereus zehirlenmesi, C. perfringens gıda

zehirlenmesine benzerlik gösterir. Daha ağır seyreden B. cereus 'un emetik tip (kusma

tipi) gıda zehirlenmesinde ise inkübasyon süresi 1–6 saat arasında değişmekte olup,

genel olarak 2–5 saattir. Bu zehirlenme, tipik olarak S. aureus gıda zehirlenmesine

benzerlik gösterir (http://www.vw.cfsan.fda.gov, 2004).

2.2 Bacillus cereus 'un İçme Sütünde Oluşturduğu Sorunlar

B. cereus çiğ sütte genel bir kontaminanttır (Svensson et al. 1999). Isıl işlem sırasında

ve ısıl işlem sonrasındaki kontaminasyonlarla gıda zehirlenmelerine yol açmaktadır

(Robinson 1990). B. cereus 'un psikrotrofik karakteri bazen pastörize sütün 6 oC'nin

altında depolanmasında kalite kriteridir (Svensson et al. 1999). Az sayıda olmakla

birlikte, bakterinin emetik suşları çiğ sütten izole edilmiştir (Robinson 1990).

Pastörize sütteki yüksek orandaki B. cereus kontaminasyonu çok sık bir şekilde

ineklerin sağımı sırasında gerçekleşmektedir. Çiğ sütteki spor oranının artışının başlıca

nedeni meme ucunun topraktan kontaminasyonudur. B. cereus 'un yüksek oranda

pastörize edilmiş sütlerde bulunmasının nedeni büyük olasılıkla mandıra ortamındaki ek

Page 24: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

11

kontaminasyonlardan kaynaklanmaktadır. Mandıralardaki mevcut rekontaminasyon

kaynakları hakkında çok az bilgi vardır (Svensson et al. 1999).

B. cereus sporları hidrofilik olmalarından dolayı kolayca çelik, cam ve lastik yüzeylere

yapışırlar ve yüzeylerdeki kısa temizleme programları bütün sporları elemine

etmeyebilir. Yüzeylere tutunan sporların, eriyik içindeki sporlara kıyasla dezenfektan ile

elemine edilmesi daha zordur. Birçok B. cereus sporu sütte ısıl aktivasyondan sonra

hızlıca çimlenir ve uygun koşullar bulup çoğaldıklarında, çelik, cam ve lastik

yüzeylerde oluşturdukları biyofilm formunda elimine edilmeleri son derece zordur

(Svensson et al. 1999).

Genel olarak, çiğ sütteki patojenler sütün ısıl işlemi sonrasında önemli bir tehlike

yaratmazlar. Buna karşın enzimler, çiğ sütte psikrotrofik flora ile birlikte önemli bir

bozulmaya yol açabilirler (Robinson 1990).

2.2.1 Ekstraselüler enzim aktivitesi

Süt ürünlerinin kalitesi, ısıl işlem öncesi çiğ sütteki psikrotrofik flora tarafından

salgılanan ısıya dirençli enzimlerden ve süt ürünlerinin soğukta depolanması boyunca

gelişen psikrotroflar tarafından üretilen diğer metabolitlerden etkilenir (Sorhaug and

Stepaniak 1997).

Süt ürünlerinin psikrotrof florası, süt öğelerini ayrıştırabilecek mikrobiyel kökenli

proteaz ve lipaz gibi ekstraselüler enzimler üretirler. Genel olarak Gram pozitif

organizmalar az miktarda proteolizis ve sadece kısıtlı miktarda lipolitik aktivite

sergilemektedir. B. cereus ekstraselüler lipolipaz üretmektedir. Bu enzim, üretim

hatalarında başrol oynayan süt yağ globüllerini ayrıştırabilmektedir. Örneğin, B. cereus

bulaşması kaynaklı fosfolipaz C, pastörize sütlerde "bitty cream" yani "parçalı krema"

adlı bozulmaya ve benzer etkilere yol açmaktadır (Robinson 1990).

Page 25: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

12

Mikrobiyel kaynaklı lipaz peynirde ransit hatalara, proteaz ise UHT işlem görmüş sütte

jelleşme ve acı tat oluşumuna yol açabilir. Bunlar ekonomik olarak önemli psikrofilik

bakteriyel enzimlerdir ve etkileri hızlıca ortaya çıkar. Bu enzimlerin belirlenmesi için

hassas analizler, sütlerin rutin kontrolü sırasında yapılması kolay ve yaygın değildir.

Oysa böyle ölçümler üretim kalitesi için bakteriyel sayımdan daha uygundur.

Psikrotrofların farklı türleri ve suşları farklı miktarlara ulaştıkları zaman saptanabilir

proteaz ve lipaz üretirler. Örneğin, bazı türlerde sayı 1,5x106 kob/g'a ulaştıkları zaman

saptanabilir proteaz üretirken, bazılarında bu değer 105 kob/g'dır (Roberts and Skinner

1983). Marth ve Stelle (1998) yaptığı araştırmada UHT sütte hatalara yol açan

mikroorganizma konsantrasyonunu 5x105–107 kob/ml olarak tespit etmişlerdir.

Psikrotrofik bakteriler tarafından proteaz ve lipaz üretiminde gelişme sıcaklığının etkisi

türlere göre spesifik olmaktadır. Ekstraselüler enzim sentezinin maksimum gelişmenin

olduğu optimal sıcaklıkta olduğunu belirtilirken, diğer araştırmacılar daha yüksek

sıcaklıklarda daha yüksek miktarlarda enzim sentezinin meydana geldiğini öne

sürmektedirler. Proteaz ve lipazın ikisinin birden sentezinin psikrotrofik bakteri gelişme

sıcaklığı olan 2 oC'de bastırılmış olduğunu açıkça gösterilmiştir. Bu bulgular, sütün 2 oC'ye kadar soğutulması ile ürün kalitesinde ve raf ömründe iyileşme olacağını

göstermektedir (Robinson 1990, Sorhaug and Stepaniak 1997).

Çiğ sütün depolanma süresine kısıtlayan ana faktör psikrotrof bakteri gelişmesi ve buna

bağlı olan ekstraselüler ayrıştırma enzimlerinin bu mikroorganizmalar tarafından

üretimidir. Sütte psikrotrof bakteri gelişmesinin potansiyel inhibitörleri hakkında birçok

metot araştırılmıştır. Önerilen inhibitör sistemi, kullanılan doğal süt enzim peroksidazını

temel almaktadır. Karbondioksit enjeksiyonuyla gelişmenin yavaşlatılması ise alternatif

bir öneridir. Diğer taraftan, çiğ sütün 2 oC'ye kadar soğutulması, uzun süre

depolanmadan önce en uygun metottur (Robinson 1990, Sorhaug and Stepaniak 1997).

Süt sağımı sırasında hijyenik bakım, devamlı olarak 4 oC veya daha düşük sıcaklıklarda

soğutma, çiğ sütün depolanma süresinin en aza indirgenmesi, devam eden etkili

HACCP sistemleri gibi başlıca ilgili işlemler, süt endüstrisinde kalite güvencesidir. Bu

Page 26: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

13

genel teknikler, mikroflorayı genel olarak elimine etmektedir. Termizasyon,

pastörizasyon, UHT, mikrofiltrasyon ve baktofügasyon, uygulanan bu teknolojik

işlemlerdendir.

2.2.2 Isıl işlemin enzim aktivitesi üzerine etkisi

Termizasyon

Termizasyon, çiğ sütün işlenmeden önce daha uzun süre saklanabilmesini sağlamak ve

sütteki mikroorganizma sayısını azaltmak amacıyla 57–68 oC arasında en az 15 saniye

süre ile ısıtılan ve sütün alkali fosfataz testinde pozitif reaksiyon gösterdiği işlemdir

(Anonim 2000).

Termizasyonun ticari olarak benimsenmesinin nedeni, laboratuvarlarda kapsamlı

çalışmalarla ısı uygulamasının mikrobiyolojisi ile proses şartları arasındaki ilişkinin

araştırılmasıdır. Çalışmalarda raf ömrü olarak, psikrotrof sayısının 106 kob/g'a ulaştığı

süre tanımlanmıştır. Böylelikle bütün psikrotroflar muhtemelen yaşam döngülerinin

logaritmik evrelerinde veya yakınında olmaktadır.

Termizasyon uygulamalarıyla sütün raf ömrü artmaktadır. Çiğ sütün termizasyon öncesi

kalitesi, raf ömrü üzerinde sonradan ortaya çıkan önemli bir etkidir. Termizasyon,

pastörizasyona benzer, sadece sütteki psikrotrofik bakterilerin bir bölümünü öldürür ve

diğerleri yaşamlarını devam ettirir. Düşük başlangıç sayılarında, yaşamını

sürdürebilerek termize sütte hızlı bozulmaya neden olacak sayısı çok düşüktür. Gram

pozitif organizmalar termizasyonla yok edilemeyebilirler. Örneğin termizasyon, B.

cereus sporlarını aktive edebilir. 8 oC'de depolanarak analiz edilen termize sütün spor

sayımında termizasyonun etkisi ve tipik sonuçlar Çizelge 2.1'de gösterilmiştir.

Page 27: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

14

Çizelge 2.1 8 oC'de depolanan sütün spor sayımında değişiklikler (Robinson 1990)

Depolama süresi (gün)

Isıl işlem yok (kob/mL)

50–62,5 oC 15 sn (kob/mL)

65–72 oC 15 sn (kob/mL)

0 300 800 500 2 1000 1100 500 6 1100 900 600

Çizelgede işaret edilen, psikrotrof bakterilerin ayrıştırıcı enzimlerini, sütteki

gelişmelerinin etkin safhasında salgılamalarıdır. Psikrotroflar inhibe edilirse enzim

seviyesi oldukça düşmektedir. Çizelge 2.2'de gösterildiği gibi; termizasyon, lipolizis ve

proteolizisin her ikisini de geciktirir. Bununla birlikte pratik önemin etkisi sadece 62–72 oC ısıtma sıcaklıkları aralığında gösterilmiştir.

Çizelge 2.2 8 oC'de 6 gün depolanmış sütte proteolizis ve lipolizis üzerine

termizasyonun etkisi (Robinson 1990)

Isıl işlem Serbest yağ asidi (µg/mL)

Tirosin değeri (µg/mL)

Kontrol 440 35 50–60 oC 335 31 62–72 oC 60 4

Termizasyonun sütün raf ömrünü güvenli bir şekilde uzatabilmek için güvenilir bir

yöntem olduğu, etkileri kanıtlarla destekli bir seri deney ile gösterilmiştir (Robinson

1990).

Pastörizasyon

Çiğ sütün, 100 oC'nin altında bir sıcaklıkta; patojenlerin tamamını öldürecek, toplam

bakteri sayısında yaklaşık %95–99,9 inhibisyon sağlayacak sürede ısıl işlem

uygulanmasıdır. Pastörizasyonda hedef mikroorganizma Coxiella burnetti 'dir (Metin

1998).

Page 28: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

15

Pastörizasyon iki tipte yapılmaktadır; kesikli pastörizasyon (düşük sıcaklıkta uzun süreli

pastörizasyon) normu; 62–65 oC'de 30 dakika, sürekli pastörizasyon (yüksek sıcaklıkta

kısa süreli pastörizasyon) normu; 71–74 oC'de 40–45 saniyedir (Metin 1998).

Bacillus cereus 'un pastörize sütte bulunması süt endüstrisi için, mikroorganizmanın

diğer süt hataları ile beraber tat kayıpları, tatlı pıhtılaşma ve parçalı krema bozulmalarına

hatta gıda zehirlenmelerine neden olmasından ötürü oldukça önemlidir. Bilindiği gibi

psikrotrofik nitelikleri, buzdolabı sıcaklığında pastörize sütte gelişmelerini ve toksin

oluşturmalarını olanaklı kılmaktadır (Lin et al. 1998).

Te Giffel ve arkadaşları (1997), B. cereus suşlarının %53'ünün 7 oC'de gelişebildiğini

bulmuşlardır. Dufrenne ve arkadaşları (1994) ise psikrofilik B. cereus 'un germinasyon

süresinin 7 oC'de tahminen 8–9 saat olduğunu bildirmişlerdir. Aynı sonuçlar ve Cuperus

(1993) tarafından da bildirilmiştir.

Pastörizasyonun amaçlarından biri de süt kökenli ve mikrobiyel kaynaklı enzimleri

kısmen veya tamamen inaktif hale getirmektir (Metin 1998). Psikrotrof bakteri

çoğunluğunun pastörizasyonla yok edilmesine rağmen sadece bozulmaya yol açan

termodurik flora yaşamaya devam eder ve psikrofilik bakterilerden kaynaklanan

ekstraselüler enzimler faaliyet gösterebilirler. Bakteriyel kökenli proteaz, lipaz ve

fosfolipaz C enzimlerinin HTST pastörizasyonda termostabilitesi Çizelge 2.3'te

özetlenmiştir (Robinson 1990).

Çizelge 2.3 HTST pastörizasyon sonrası sütte psikrofilik bakteri kaynaklı artık enzim

aktivitesi (Robinson 1990)

Enzim tipi HTST pastörizasyon Sonrası aktivite (%)

Proteaz 66 Lipaz 59 Fosfolipaz 30

Page 29: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

16

HTST pastörizasyon, HTST pastörizasyonda kombine ısı uygulaması ve takiben 55 oC'de

1 saat uygulanan ısıl işlem sonrası enzim parçalanması Çizelge 2.4'de kıyaslanmıştır.

Ekstraselüler enzim aktivitesinin ekstra ısıl işlemlerle parçalanması ticari olarak ve pratik

açısından uygulanması zor ve gereksiz bulunmaktadır (Robinson 1990).

Çizelge 2.4 Ekstraselüler enzimlerin düşük sıcaklık inaktivasyonu (Robinson 1990)

Isıl işlem sonrası artık (kalan) aktivite (%) Aktivite 77 oC'de 17 sn 77 oC'de 17 sn + 55 oC'de 1 h Proteaz 66 50 Lipaz 59 27

Sütteki psikrofilik bakterinin ekstraselüler enzimlerinin termostabiliteleri kısa raf ömürlü

ürünler (örneğin pastörize süt ve krema) için daha az önem taşımaktadır. Bu nedenle ısıl

işlem uygulaması ile tüketim arasındaki süre, ürünler soğukta muhafaza edilmek kaydı

ile genellikle 4 veya 5 gündür. Isıya dirençli bakteriyel enzimler açısından uzun raf

ömürlü ürünler kısa raf ömürlü ürünler kadar güvenli değildirler (Robinson 1990).

Bacillus cinsi spor formlu bakteriler pastörizasyon sonrası yaşamını sürdürme yeteneğine

sahip en önemli organizma sınıfıdır. Çiğ sütte Bacillus cinsinin üstünlüğüne göre

Haziran-Ekim aylarında spor formlu bakteri sayısında mevsimsel değişiklikler

olmaktadır ve psikrotrof basiller en yüksek sayıya Nisan ve Eylül ayları arasında

ulaşmaktadır. Bacillus cereus, soğutulmuş ürünlerde hızlı çimlenme yeteneğindedir

(Robinson 1990).

Sterilizasyon ve UHT (Ultra Yüksek Sıcaklık) Uygulaması

Sterilizasyon, oda sıcaklığında saklanabilen ticari olarak steril bir ürün üretmek amacıyla

normal depolama şartlarında bozulmaya neden olacak tüm mikroorganizmaları ve

sporlarını yok eden hermetik ambalajlı ürüne, en az 115 oC'de 13 dakika veya 121 oC'de

3 dakika gibi uygun zaman sıcaklık kombinasyonunda, yüksek sıcaklıkta uzun süreli

uygulanan ısıl işlemdir (Anonim 2000).

Page 30: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

17

Sterilizasyon yöntemlerinden biri olan UHT işleminde ürünün dayanıklı hale getirilmesi

ve soğutma istemeksizin depolanabilmesi için, 138–154 oC arasında 2–8 saniye süre ile

ısıtılma işleminden yararlanılmaktadır. Türkiye standartlarında bu değer 135–150 oC'de

2–6 saniye olarak verilmiştir.

Çiğ sütten UHT süte en belirgin değişme mikroorganizma ve enzim içeriğidir. UHT

sütün mikrobiyel niteliğindeki değişme büyük ölçüde çiğ süte bağlıdır. Gillis ve

arkadaşları 1985 yılında yaptıkları bir araştırmada çiğ süt örneklerini mikroorganizma

içeriklerine göre 4 farklı gruba ayırmışlardır. Birinci grubu 104/mL kadar

mikroorganizma içerenler, ikinci grubu 104−105/mL arasında olanlar, üçüncü grubu

105−106/mL arasında olanlar, dördüncü grubu ise 106/mL'den daha fazla mikroorganizma

içerenler sütler oluşturmuştur. Tüm süt örneklerine 149 oC'de 3 saniye ısıl işlem

uygulanmış ve örnekler 7,1 oC'de depolanarak belli aralıklarla test edilmişlerdir. Elde

ettikleri sonuçlara göre özellikle psikrofilik ve proteolitik bakteri miktarları tamamen çiğ

süt gruplarına bağlı olmuş ve bu gruplama proteoliz miktarını da etkilemiştir. Tüm

örneklerde proteaz aktivitesi azalmıştır (Konar ve Şahan 1989).

UHT sütte depolanmayı sınırlayıcı faktörlerden en önemlisi spor oluşturan bakterilerdir.

Ayrıca psikrofilik mikroorganizma enzimleri, yağ ayrılması ve çökelme diğer

sorunlardır.

Çiğ sütün uzun süre düşük sıcaklıkta bekletilmesi psikrofil bakterilerin üremesine ve

gelişmelerine neden olmaktadır. Taze sütte bulunan psikrotrof bakterilerin salgıladığı

proteazlar sütün bozulması yanında tat ve koku hatalarına da neden olmaktadırlar. Ayrıca

UHT sütte jelleşmeye ve acı tada neden olurlar. Psikrofil mikroorganizmaların büyük bir

kısmı ısıya duyarlıdır ve pastörizasyon sırasında yıkıma uğrarlar fakat oluşan enzimler;

yağ globül membranının (fosfolipazlar), süt yağının (lipazlar) ve süt proteininin

(proteazlar) parçalanmasına neden olurlar. Bu enzimlerin ısıya dirençli olmaları ve

aktivitelerinin UHT işlemine bile dayanabilmeleri UHT sütte sorun olarak karşımıza

çıkar (Konar ve Şahan 1989).

Page 31: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

18

UHT sütlerde proteolizis sonucu meydana gelen değişiklikler kazein hidrolizi ile β-

laktoglobulin-k-kazein kompleksinin ısıl işlem boyunca miselden ayrılmasına neden

olmaktadır veya en azından bu olayı çabuklaştırmaktadır. Serbest kalan kompleks

sonradan bir araya gelerek, sütün jelleşmesine neden olan üç boyutlu çapraz bağlı protein

ağı formunu alır. Plasmin olarak bilinen, doğal süt alkali serin proteinazı UHT sütün

proteolizisi olarak nitelendirilir (Datta and Deeth 2003).

2.3 Bacillus cereus 'un Standart Analiz Yöntemi

2.3.1 Selektif besiyerine ekim ve izolasyon

İşletme laboratuvarlarında B. cereus 'un rutin analizleri için Cereus Selective Agar; MYP

(Mannitol Egg Yolk Polymyxin) Agar ve Bacillus cereus Selective Agar; PEMBA

(Polimiksin Egg Yolk Mannitol Bromtimol Blue Agar) olmak üzere iki ticari besiyeri

yaygın olarak kullanılmaktadır (Tunail 2000).

Çiğ sütlerden genellikle 10–2 ile 10–6 arasında hazırlanan seri dilüsyonlardan MYP Agar

besiyerine ekim yapılarak 30-35 oC'de 18-24 saat inkübasyona bırakılır. MYP Agar

besiyeri, B. cereus 'un lesitinaz aktivitesi ve mannitol fermantasyonu olmak üzere iki

tipik reaksiyonu belirlemek üzere geliştirilmiştir (Sekin ve Karagözlü 1997). Uluslararası

Standartlar Örgütü (ISO), inkübasyon için 30 oC önermektedir (Anonim 2000).

B. cereus sayısının az olduğu tahmin edilen sıvı gıdalarda doğrudan, katı veya yarı katı

gıdalarda ise 10–1 dilüsyonlardan ekim yapılır. Böyle ürünlerde bakteriyi saptama oranını

artırmak için 140 mm çaplı Petri kutularına 1 mL inokülüm aktarılarak da ekim yapılır

(Tunail 2000). 140 mm çaplı Petri kutusu bulunmaması halinde 1 mL inokülüm 3 adet

standart Petri kutusuna eşit miktarlarda dağıtılarak yayma ekim de yapılabilir (Anonim

2005).

Page 32: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

19

B. cereus mannitol negatif olduğu için, MYP Agar besiyerinde pembe koloniler

oluştururken, lesitinaz aktivitesi nedeni ile de koloni, etrafında presipitasyon (çökelme)

halkası oluşumuna neden olur. Ancak bu besiyerinde bazı dezavantajlar da vardır.

İncelenecek gıda maddesinde mannitolü fermente ederek asit oluşturabilen farklı

mikroorganizma grupları mevcut ise, B. cereus kolonilerinin karakteristik pembe renkleri

azalır veya tamamıyla kaybolur. Bazı Bacillus türleri, çok az lesitinaz üretir veya hiç

üretmezler. Bu türlere ait kolonilerin etrafında presipitasyon halkası gözlenmez (Kaleli

ve Özkaya 2000).

En düşük dilüsyondan ekim yapılmış olan Petri kutularındaki karakteristik koloni sayısı

15'ten az olarak tahmin ediliyor ise EMS yöntemi kullanılarak da sayım yapılabilir. Bu

amaçla FDA (Food and Drug Administration) tarafından belirtilen yönteme göre

Tripticase Soy Polimiksin Broth içeren tüplere inokülasyon yapılarak, 30 oC'de 48 saat

inkübasyona bırakılır. B. cereus için tipik olan yoğun gelişme gözlenen pozitif tüplerden

MYP Agar besiyerine alınarak, 30 oC'de 24–48 saat inkübe edilir. Burada oluşan ve B.

cereus olduğu tahmin edilen tipik koloniler B. cereus doğrulaması için yatık Nutrient

Agar besiyerine alınarak biyokimyasal testlere geçilir(http://www.courses.ag.uidaho.edu,

2004).

Refakatçi floranın yoğun olduğu örneklerde pastörizasyon uygulaması ile spor

oluşturmayan ve/veya ısıl işleme dirençsiz mikroorganizmaların inhibisyonu ve bu

şekilde agarlı besiyerinde bunların koloni oluşturmaları önlenir. Pastörizasyon normu çok

değişkendir ve ISO'ya göre 70 oC'de 15 dakika (Anonim 2000), yine ISO'ya göre EMS

yöntemi ile yapılacak sayımda 80 oC'de 10 dakika (Anonymous 2006) şeklindedir. 80 oC'de 5 dakika (Anonim 2005) ve 80 oC'de 12 dakika (Frank and Yousef 2004) ve 80 oC'de 1 dakika (Harrigan 1998) ısıl işlem uygulaması da yaygın olarak önerilmektedir.

2.3.2 Biyokimyasal identifikasyon

İdentifikasyon için her bir MYP Agar besiyerinden B. cereus olduğu tahmin edilen 5

veya daha fazla sayıda pembe renkli, lesitinaz pozitif koloni seçilir. Petri kutusundaki

Page 33: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

20

koloni sayısı 5 adetten az ise, bulunan muhtemel kolonilerin tamamı alınır. Koloniler çok

sayıda ve yığın halinde olup tek koloni seçimi mümkün değilse, MYP Agar besiyerinde

bulunan 5 şüpheli koloniden tek koloni düşürebilmek için sürme yapılarak 30 oC'de 18–

24 saat inkübasyona bırakılır ve ardından muhtemel koloniler seçilir (Kaleli ve Özkaya

2000).

Bacillus cereus identifikasyonunda uygulanan biyokimyasal testler ve bu testlere karşın

Bacillus cereus 'un gösterdiği reaksiyonlar Çizelge 2.5'te özetlenmiştir.

Çizelge 2.5 Bacillus cereus 'un biyokimyasal test sonuçları (Mac Faddin 1999)

Gram reaksiyonu + % 7,5 NaCl G Katalaz + Karbohidratlar Nitrat redüksiyonu + Glikoz + Spor oluşumu Arabinoz − Elipsodial + Mannitol − Toparlak − Ksiloz − Merkezde + Jelatin sıvılaştırma − Terminal veya subterminal − İndol − Β- hemolizis %SBA V*n Lesitinaz + Kapsül − Simmons sitrat + Hareketlilik V* Nişasta hidrolizi + OF Glikoz F Üreaz V Gelişme Voges Proskauer o + Anaerobik G V: Değişken; V*: değişken, genellikle pozitif; G: gelişme; SBA,Sheep Blood Agar; ⁿ: %5 Sheep Blood Agarda, β-hemolizis pozitif B. cereus; ˚: 37˚C da 24 saat inkübasyon B. cereus 'un MYP Agar besiyerindeki görünümü ve koloni gelişimi Şekil 2.1'de gösterilmiştir.

Page 34: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

21

Şekil 2.1 B. cereus 'un MYP Agar besiyerindeki görünümü 2.4 Hızlı Analiz Yöntemleri

Bugün B. cereus için rutin analiz metotlarında, standart plak sayım yöntemine

güvenilmekte, doğrulanmış testleri içeren bu yöntem 4 gün sürmektedir. Bu uygulama ile

özellikle kısa raf ömürlü ürünlerin kontrolünde çok fazla zaman harcanmaktadır (Karmen

and Mozina 2000).

Gıda endüstrisi açısından hızlı yöntemlerin avantajı kısa sürede sonuç alınması ve

böylelikle üretim esnasında gerekli müdahalelerin yapılabilmesidir. Hızlandırılmış

yöntemlerde mikrobiyel gelişme sonucu oluşan bir metabolit, kimyasal bileşik, enzim

veya bir değişikliğin ölçümü esas alınmaktadır (Aran 1997).

Gıdalarda B. cereus varlığı, gıda zehirlenmelerine neden olan toksinlerin de bulunduğunu

gösterir. Bilindiği gibi bu bakteri emetik ve diyare tip olmak üzere iki tip gıda

zehirlenmesine yol açmaktadır. B. cereus enterotoksinlerinin toksititelerini belirleyebilen,

mevcut iki tip immuno analiz yöntemi bulunmaktadır (Karmen and Mozina 2000). B.

cereus aranmasında daha kısa sürede sonuç veren "Bacillus cereus Enterotoksin Test Kiti

(BCET-RPLA)" önerilmektedir. Bu kit gıdalarda ve kültür filtratlarında B. cereus

Page 35: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

22

enterotoksininin pasif lateks aglütinasyon yoluyla belirlenebilmesi için hazırlanmıştır.

RPLA tekniği bakteri toksinleri gibi çözülebilir antijeni belirleyen bir aglütinasyon

tekniğidir (Kaleli ve Özkaya 2000). BCET-RPLA assay, hemolisin BL (HBL) olarak

isimlendirilen hemolitik diyarel toksin L2 komponentini ölçmektedir (Karmen and

Mozina 2000).

Hızlı analizlerde önerilen diğer bir test kiti de "ELISA-VIA Enterotoksin Test Kiti"dir.

Bu test kiti de lateks aglütinasyon yoluyla B. cereus enterotoksinini belirlemektedir

(Pirttijarvi 2000).

Ayrıca Chan ve arkadaşları (2000) tarafından yapılan bir araştırmada B. cereus 'un hızlı

tespit edilebilmesi amacıyla 28,5 kDa hücre yüzeyi antijeni esas alınarak yapılan ELISA

yöntemi denenmiş ve % 99,1 oranında başarı sağlanmıştır.

2.5 B. cereus Sayımına Yönelik Yapılan Çalışmalar ve Kullanılan Besiyerleri

Gıdalardan B. cereus izolasyonu ve sayılması için selektif olan ya da olmayan birçok

besiyeri kullanılmıştır. Bu besiyerleri Çizelge 2.6'da özetlenmiştir.

Çizelge 2.6 B. cereus izolasyonunda kullanılan besiyerleri ve selektif-tanımlayıcı

sistemleri (Netten and Kramer 1992)

Besiyeri Selektif sistem Tanımlayıcı sistem Kaynak Egg Yolk Agar (EYA) − Lesitin aktivitesi Mc Clung et al. (1946)

Bovine/horse Blood Agar (BA) − Kan hemolizi

Koloni morfolojisi

Houge (1955) Gilbert and Taylor (1976) Anon. (1982)

Egg Yolk Mannitol Bromocresol purple Agar (EMB)

− Lesitin aktivitesi

Mannitol/ Bromokresol mor

Hood et al. (1990)

Kendalls Bacillus cereus Medium (BCM)

− Lesitin aktivitesi

Mannitol/ Bromokresol mor

Gilbert and Taylor (1976)

Page 36: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

23

Çizelge 2.6 B. cereus izolasyonunda kullanılan besiyerleri ve selektif-tanımlayıcı sistemleri (Netten and Kramer 1992) (devam)

Citrate-Egg Yolk Polimiksin B-Lithium chloride Agar (CELP)

Polimiksin B (50 IU/mL)

Lityum klorürLesitin aktivitesi Danovan (1985)

Mannitol-Egg Yolk Polimiksin B Agar (MYP)

Polimiksin B (100 IU/mL)

Lesitin aktivitesi Mannitol/Fenol kırmızısı

Mossel et al. (1967)

Columbia Base-Blood Polimiksin B Agar (CBA-P)

Polimiksin B (500 IU/mL)

Kan hemolizi Koloni morfolojisi

Kramer et al. (1982)

Kim&Goepfert Agar (KG-Agar)

Polimiksin B (100 IU/mL)

Lesitin aktivitesi Kim and Goepfert (1971)

Polimiksin B-Egg Yolk Mannitol Blue Agar (PEMBA)

Polimiksin B (100 IU/mL)

Lesitin aktivitesi Mannitol/Bromotimol

mavi

Holbrook and Anderson (1980)

Polimiksin B-Egg Yolk-Mannitol Bromocresol Purple Agar (PEMPA)

Polimiksin B (100 IU/mL)

Lesitin aktivitesi Mannitol/Bromotimol

mor

Szabo et al. (1984)

Mannitol-Egg Yolk Polimiksin B Agar (RVC)

Polimiksin B (50 IU/mL)

Lesitin aktivitesi Rabinovitch and Meria de Vanconcellos (1987)

B. cereus izolasyon besiyerlerinde kullanılan selektif katkılar Polimiksin B veya E ile

Lityum klorür ile sınırlanmıştır.

Polimiksin B bütün B. cereus selektif besiyerlerinde kullanılmıştır. Polimiksin'ler

doğrudan Gram negatif bakterilere; onların sitoplazmik ve dış membranına yapısal ve

işlevsel olarak etki etmektedirler. Polimiksin B, Acinetobacter spp., Escherichia coli,

Enterobacter spp., Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp.ve Shigella

spp.'nin gelişimlerini baskılar. Ancak Pseudomonas spp., Proteus spp. (örneğin mannitol

negatif, lesitin pozitif Proteus vulgaris) ve mannitol negatif, lesitin pozitif Serratia

marcescens gibi dirençli türler de bildirilmektedir. Polimiksin E'nin antibakteriyel

spektrumu polimiksin B ile benzerdir. Fakültatif ve obligat aerobik Gram pozitif

bakteriler (örneğin mannitol pozitif, lesitin pozitif özellik gösteren S. aureus) ile maya ve

küfler, Polimiksin B ve Colistin'e (Polimiksin E) direnç gösterir ve B. cereus selektif

besiyerlerinde gelişebilirler (Netten and Kramer 1992).

Page 37: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

24

Lityum klorür (%0,5 w/v) ve Polimiksin B'nin kombine kullanımı laktik asit bakterilerini

inhibe etmektedir (Netten and Kramer 1992).

Yukarıda bahsedilen besiyerleri dışında Bacillus cereus Selektif Agar Base, B. cereus

Motility Medium, G Medium, Heart Infusion Agar, Lisozym Broth, Organic Medium, S

Broth, Trypticase Soy Polimiksin Broth, Smith, Gordon ve Clark tarafından modifiye

edilmiş VP Broth gibi modifiye besiyerleri de bulunmakta ve B. cereus analizlerinde

kullanılmaktadır (Atlas 1997).

2.6 B. cereus 'un Antibiyotiklere Duyarlılığı

Antibiyotikler, bakteriler ve funguslar tarafından üretilen doğal antimikrobiyel

metabolitlerdir. Bunlar, kendisini üreten mikroorganizma dışındaki ve antibiyotik

üretmeyen etkenlere karşı inhibitör (statik) veya öldürücü (sidal) etkiye sahiptirler. Doğal

antibiyotiklerin, mikroorganizmalar tarafından kolayca inhibe edilmesi nedeniyle semi

sentetik olarak hazırlanmakta ve daha fazla dayanıklı olmaktadır (Arda 2006).

Antibiyotikler mikroorganizmalar üzerinde çok değişik tarzda etkili olmaktadır. Bunlar;

hücre duvarı sentezine mani olanlar, sitoplazmik membranı etkileyenler, protein

sentezine mani olanlar, nükleik asit fonksiyonunu ve sentezini bozanlar olarak

ayrılmaktadır (Arda 2006).

Bir antibiyotiğin antimikrobiyal aktivitesinin saptanması için uygulanan in vitro

işlemlere genel olarak duyarlılık testleri denir. Rutin laboratuvarlarda uygulanan testlerle

genellikle ilaçların inhibitör (bakteriyostatik veya bakterisidal) aktivitesi değerlendirilir.

Bu amaçla uygulanan yöntemler; a) Katı veya sıvı besiyerlerinde seyreltme (dilüsyon)

yöntemleri, b) Disk difüzyon yöntemi, c) Gradiyent difüzyon (Etest) yöntemi ve d)

Antimikrobiyal ajanları inaktive eden enzimlerin saptanması olarak sıralanabilir.

Duyarlılık test sonuçları mutlaka identifikasyon sonuçları ile birlikte

değerlendirilmelidir. Bazı bakteri türleri genetik özellikleri açısından bir antibiyotiğin

hedefi olan yapıyı hiç içermediğinden ya da antibiyotiğin hedefe ulaşmasını engelleyecek

Page 38: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

25

bir yapıyı veya antibiyotiği inaktive edecek enzimleri taşıdığı için o antibiyotiğe

dirençlidir. Buna doğal direnç adı verilmektedir (Gülay 2002).

Ülkemizde antibiyotik duyarlılıkların saptanmasında yaygın olarak National Committee

for Clinical Laboratory Standarts (NCCLS) önerileri uygulanmaktadır (Gülay 2002).

Mousumi ve Sarkar (2003) tarafından, B. cereus 'un 20 farklı antibiyotiğe karşı

hassasiyeti araştırılmış, Çizelge 2.7'de gösterilmiştir.

Çizelge 2.7 B. cereus 'un çeşitli antibiyotiklere karşı duyarlılığı (Mousumi and Sarkar

2003)

B.cereus Antibiyotik (µg disk-1) Hassas Orta hassas Dirençli

Ampisilin 0 0 100 Basitrasin 77 23 0 Karbenisilin 2 1 97 Sephalothin 5 11 84 Kloramphenikol 100 0 0 Siproflokasin 100 0 0 Klokasilin 0 0 100 Eritromisin 10 70 20 Gentamisin 100 0 0 Kanamisin 95 5 0 Metrodinazol 0 0 100 Nalidiksik asit 98 2 0 Norflokasin 100 0 0 Penisilin G 1 0 99 Polimiksin B 8 34 58 Rifampisin 3 30 67 Streptomisin 79 1 20 Tetrasiklin 100 0 0 Trimetroprim 1 26 73 Vankomisin 35 65 0

Bu çizelge sonuçları yorumlanacak olursa B. cereus en yüksek oranda direnci β-

laktamlar, Metrodinazol, Polimiksin B, Rifampisin ve Trimetroprim'e karşı

göstermektedir. B. cereus 'un Penisilin G'ye karşı direnci % 99, Polimiksin B'ye karşı

direnci ise % 58 olarak belirlenmiştir (Mousumi and Sarkar 2003).

Page 39: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

26

Yukarıda Bölüm 2.5'te de bahsedildiği gibi Bacillus cereus analizlerinde genellikle

Polimiksin B kullanılmaktadır. Bu antibiyotik, sitoplazmik membranı etkileyen

antibiyotiklerdendir. B. polymyxa tarafından sentezlenen bu antibiyotik katyonik deterjan

olarak görev yaparak hücre membranında zedelenmeler oluşturur ve fonksiyonu bozar.

Bu antibiyotik, Gram pozitif bakterilere oranla Gram negatiflere daha fazla etkilidir

(Arda 2006).

B. cereus analizlerinde kullanılabilecek olan bir diğer antibiyotik Penisilin G'dir.

Penicillium notatum ve Penicillium crysegenum tarafından sentezlenen doğal bir

antibiyotik olan Penisilinin toksisitesi çok zayıf olduğundan geniş bir kullanım alanı

vardır. Mikroorganizmalar tarafından kolayca ayrıştırıldığından, temel yapısı 6-

amilopenisilanik asit olmak üzere bundaki amino grubuna yan zincirler ilave ederek semi

sentetik ve daha dayanıklı türevleri üretilmiştir. Penisilinin esas aktivitesini yapısında

bulunan β-laktam halkası oluşturur. Penisiline dirençli mikroorganizmaların çoğu β-

laktam halkasındaki bağları ayrıştıran enzimler (β-laktamaz) sentezleyerek, penisilin

etkinliğini ortadan kaldırırlar. Bu antibiyotik daha çok Gram pozitifler üzerine etki

yaparak protoplast oluşumuna yol açar. Bu protoplastlar da uzun süre ortamda kalamaz

ve hemen parçalanır, böylece hücreler lize olurlar. Penisilinin, Gram negatif bakteriler

üzerine etkisi zayıftır. Penisilin antibiyotik etkisini hücre duvarı sentezine mani olarak

göstermektedir (Arda 2006).

Page 40: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

27

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1 Materyal

3.1.1 Mikroorganizmalar

Denemelerde şahit bakteri olarak kullanılan Bacillus cereus, T.C. Sağlık Bakanlığı Refik

Saydam Ulusal Tip Kültür Koleksiyonundan temin edilen 709 RSSK numaralı bakteridir.

Bunun dışında, bu çalışma sürecinde izole edilip tanımlanan bakteriler de materyal olarak

kullanılmıştır.

3.1.2 Süt

Denemelerde kullanılan çiğ süt, Atatürk Orman Çiftliği Süt Fabrikası'ndan temin edilen

karışık tank sütü, Bozova, Acıgöl, Burdur ve Avanos yörelerine ait farklı tarihlerde

alınmış çiğ sütlerdir. Ayrıca Ankara ili ve ilçelerinden temin edilen çiğ sütler de

denemelerde kullanılmıştır. İçinde antibiyotik olmadığı sanılan UHT süt ile antibiyotiksiz

olduğu sertifiye edilen süt tozundan elde edilen süt (Skim Milk; Oxoid) materyal olarak

kullanılmıştır.

3.1.3 Antibiyotik denemelerinde kullanılan materyal

Denemelerde kullanılan Penisilin G Potasyum, enjekte edilebilir bir antibiyotiktir. Her

bir flakon 500.000 IU kristalize Penisilin G Potasyum (tamponlu- 0,84 mEq potasyum)

içermektedir. Antibiyotik, denemelerde belirlenen oranlarda, steril %0,9'lık NaCl

çözeltisi kullanılarak seyreltilmiş ve istenilen IU miktarları elde edilmiştir. Polimiksin B

Sulfat (PBS) ise hazır ticari preparattır (Merck).

Page 41: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

28

3.2 Yöntem

Çalışma birbirini izleyen 3 aşamada gerçekleştirilmiştir. Bunlar sırası ile piyasadan temin

edilen çiğ sütten refakatçi floranın izolasyonu ve tanımlanması, belirlenen refakatçi

floranın ısıl işlem ile inhibisyonu çalışmaları, Mannitol Egg-Yolk (MY) Agar

besiyerinde modifikasyon denemeleri şeklindedir. Son aşamada belirtilen modifikasyon

denemelerinde refakatçi flora özellikleri göz önünde bulundurularak tespit edilen

antibiyotiklerin kullanımı söz konusudur.

3.2.1 Çiğ sütten bakteri izolasyonu ve tanımlama

Bu aşamada 25 farklı çiğ süt örneğinden Toplam Mezofilik Aerob Bakteri (TMAB)

sayımı ile B. cereus analizi yapılmış, izole edilen kolonilere identifikasyon testleri

uygulanmıştır. Böylelikle çiğ süt örneklerindeki hâkim flora belirlenmiştir. B. cereus

analizinde kullanılan MY Agar besiyeri hem Polimiksin B katkısı kullanılarak hem de

katkısı ilave edilmeden hazırlanmış ve iki besiyerinde gelişen farklı koloniler

tanımlanmıştır.

Örneklerin Hazırlanması;

Aseptik koşullarda alınan çiğ süt örnekleri, analizlere uygun olarak seyreltilmişlerdir.

Seyreltme işleminde seyreltiler standart 1 mL örnek + 9 mL seyreltme çözeltisi şeklinde

(1:9 oran ile) ile hazırlanmıştır (Halkman ve Ayhan 2000). Analizlerde seyreltme

çözeltisi olarak Maximum Recovery Diluent (MRD; Merck) seyreltme çözeltisi

kullanılmıştır. Buna göre çiğ süt örneklerinden alınan 1:9 seyreltmeler ile 10 –6'ya kadar

seyreltiler elde edilmiştir.

Ayrıca aseptik koşullarda alınan her çiğ süt örneği düşük sıcaklıkta pastörizasyon

normlarından biri olan 55 oC'de 10 dakika pastörize edilerek, pastörizasyon sonrası 1:9

seyreltmeler ile 10–3’e kadar seyreltiler elde edilmiştir.

Page 42: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

29

Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri Sayımı;

Soğutularak laboratuara getirilmiş olan çiğ sütlerinde bakteriyel floranın belirlenmesi

amacıyla toplam bakteri sayımı yapılmıştır. Çiğ süt örneklerinden hazırlanan 10–4, 10–5

ve 10–6 seyreltilerinden 0,1 mL alınarak Plate Count Agar (Merck) besiyerine aktarılmış,

yayma yöntemi ile ekim yapıldıktan sonra Petri kutuları 30 oC'de 48 saat inkübe

edilmişlerdir. Her seyreltiden 2 Petri kutusuna paralel ekim yapılmış ve sayım sonuçları

standart yöntemle hesaplanıp kob/mL olarak verilmiştir (Doğan ve Tükel 2000, Anonim

2005).

Ayrıca 55 oC'de 10 dakika pastörize edilen çiğ süt örneklerinden hazırlanan 100–10–3

seyreltilerinden yukarıda açıklandığı gibi ekim yapılmıştır ve sonuçlar belirtilen şekilde

değerlendirilmiştir.

Çiğ Sütlerden B. cereus İzolasyonu;

Daha önce açıklandığı şekilde hazırlanan seyreltilerden, 100 mL/L konsantrasyonda

yumurta sarısı emülsiyonu (Merck) ve 1 şişe/500 mL konsantrasyonda olacak şekilde

PBS ilave edilmiş MYP Agar besiyerine ve ayrıca bu katkı ilave edilmeden hazırlanan

MY Agar besiyerine 0,1 mL aktarılarak yayma yöntemi ile paralel ekim yapılmıştır.

Ekim sonrası Petri kutuları, 30 oC'de 24 saat inkübasyona bırakılmışlardır. İnkübasyon

sonrası tipik (yaygın, kuru, pembe menekşe merkezli ve etrafında yoğun bir zon olan)

koloniler, B. cereus doğrulanması için Nutrient Agar besiyerine alınarak biyokimyasal

testlere geçilmiştir (Kaleli ve Özkaya 2000). Glukozun anaerob kullanımı, nitrat, Voges

Proskauer ve MR-VP Broth (Merck) besiyerinde pH ölçümü testleri uygulanmıştır

(Anonymous 1998).

Ayrıca 55 oC'de 10 dakika pastörize edilen çiğ süt örneklerinden hazırlanan 100–10–3

seyreltilerinden de yine MY ve MYP Agar besiyerlerine yukarıda açıklandığı şekilde

ekim yapılmış, belirtilen inkübasyon süresi sonunda B. cereus olduğu tahmin edilen

kolonilere doğrulama için yukarda belirtilen testler uygulanmıştır.

Page 43: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

30

Hâkim Floranın Belirlenmesi;

Toplam Mezofilik Aerobik Bakteri Sayımları ve B. cereus analizi yapıldıktan sonra

hâkim floranın belirlenmesi amacıyla değişik morfolojik özelliklere sahip koloniler MYP

Agar besiyerinden izole edilmiştir. Bu izolatlara Bergey's Manual of Systematic

Bacteriology (Anonymous 1986), Biochemical Tests for Identification of Medical

Bacteria (Mac Faddin 1999) adlı kaynaklara gösterilen morfolojik, fizyolojik ve

biyokimyasal testler uygulanarak tanımlamaları yapılmıştır. Tanımlama için öncelikle

izolatın Gram reaksiyonu, mikroskobik görüntüsü, spor oluşturup oluşturmadığı

incelenmiş ve katalaz testi uygulanmıştır. Gram pozitif, çubuk şeklinde, spor oluşturan ve

katalaz pozitif bakteriler Bacillus olarak tanımlanmıştır.

Bu testlere ilaveten yapılanlarla birlikte her izolata uygulanan test sayısı 13 olmuştur. Bu

testler; Gram reaksiyonu, mikroskobik görüntü (şekil), spor oluşumu, katalaz, hareket,

Metil Red (MR), Voges Proskauer (VP), D-Glukozdan asit oluşumu, D-Glikozdan gaz

oluşumu, sitrat kullanımı, nitratın indirgenmesi, Oksidaz, Oksidasyon/Fermantasyon

testidir. Tüm bu testler, spor oluşumunun belirlenmesi dışında, standart yöntemlere göre

uygulanmıştır (Anonymous 1998).

İzolatların spor oluşturup oluşturmadıklarının belirlenmesi için öncelikle CASO Broth

(Merck) besiyerinde aktifleştirilen kültürlere 80 oC'de 5 dakika ısıl işlem uygulanmıştır.

Isıl işlem sonrası buz banyosunda hızla soğutulan izolatlar, tekrar aktifleştirmek amacıyla

37 oC'de 24 saat inkübasyona bırakılmışlardır. İnkübasyon sonrası gelişme gösteren

izolatların spor oluşturabilme yetenekleri olduğu sonucuna varılmıştır.

Gram negatif bakterilerin belirlenmesinde bu testlere ek olarak VRB Agar’da gelişme,

laktoz, hidrojen sülfür, indol, lisin dekarboksilaz ve üre hidrolizi olmak üzere toplam 6

adet test standart yöntemlere göre uygulanmıştır.

Page 44: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

31

3.2.2 Mevcut floranın ısıl işlem ile inhibisyonu

Yukarıda 3.2.1. bölümde belirtilen yöntemlerle refakatçi flora belirlendikten sonra,

refakatçi floranın inhibisyonu ve böylelikle B. cereus sayımının kolaylaştırılması

amaçlanmıştır. Refakatçi flora, MY Agar besiyerinde gelişen toplam 17 adet bakteriden

oluşmaktadır. Analizlerde, B. cereus 'un davranışının belirlenmesi için bu bakteri de

refakatçi flora ile birlikte analize alınmıştır.

Çalışma, belirlenen 3 farklı yöntemle yürütülmüştür. İlk yöntemde piyasadan temin

edilen UHT süt, 9'ar mL olarak steril tüplere aktarılmıştır.

B. cereus da dahil olmak üzere, refakatçi florada bulunan her bir bakteriden, her bir tüpe

104/mL sayıda bakteri olacak şekilde ekim yapılmıştır. Ekim sonrası bakterilerin süt

ortamına adapte olup gelişme göstermeleri amacıyla tüpler oda sıcaklığında 1 saat inkübe

edilmiştir. Bu işlemin amacı süte kontamine olduğu varsayılan bakterinin herhangi bir

işlem görünceye kadar 1 saat oda sıcaklığında beklediği varsayımıdır.

Bu süre sonunda, bakteri gelişimlerinin gözlenmesi amacıyla, her bir tüpten MYP Agar

besiyerine sürme yapılmıştır.

Ayrıca her bir tüpe 1 saatlik inkübasyon süresi sonunda 80 oC'de 5 dakika pastörizasyon

işlemi uygulanmıştır. Pastörizasyon sonrasında yine bakteri gelişiminin gözlenmesi

amacıyla, aynı besiyerine sürme yöntemi ile ekim yapılmıştır.

Böylelikle pastörizasyon öncesi ve sonrası besiyerinde gelişme gösteren koloni

yoğunluğuna bağlı olarak, pastörizasyon işleminin etkinliğinin ölçülmesi amaçlanmıştır.

Ayrıca UHT sütte antibiyotik kalıntısı olabileceği düşünülmüş ve diğer bir yöntem

olarak, örneklerin hazırlanmasında UHT süt yerine, Skim Milk (%10'luk) besiyeri 121

Page 45: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

32

oC'de 5 dakika sterilize edilerek kullanılmıştır. Uygulanan işlemler UHT sütte olduğu

gibidir.

Pastörizasyon işleminin yaratabileceği olumsuzluğun boyutunun araştırılması amacıyla

piyasadan temin edilen çiğ süt örneği 3 parçaya ayrılmıştır. Birinci kısma pastörizasyon

işlemi uygulanmadan ve seyreltilmeden MYP Agar besiyerine sürme yöntemiyle ekimi

yapılmıştır.

İkinci kısım çiğ süte 70 oC'de 10 dakika ve üçüncü kısım süte 80 oC'de 5 dakika

pastörizasyon uygulanmıştır. Diğer işlemler birinci kısım sütte olduğu gibidir.

3.2.3 Besiyeri modifikasyonu denemeleri

Refakatçi floranın antibiyotik kullanımı ile inhibisyonu çalışmalarında selektif agar

katkısı olarak bölüm 2.6'da özellikleri ve kullanım spektrumları açıklanan PBS ile

Penisilin G Potasyum (PGP) antibiyotikleri kullanılmış ve besiyeri modifikasyon

çalışmaları yapılmıştır.

Selektif agar katkısı olarak kullanılan PBS'nin refakatçi flora ve B. cereus üzerine

etkisinin belirlenmesi için öncelikle B. cereus analizinde kullanılan PBS'nin etkinliği

incelenmiştir. Bu amaçla 3 farklı çiğ süt sütten daha önce açıklandığı şekilde 100–10–4

arasında seyreltiler hazırlanmış ve bu seyreltilerden MY ve MYP Agar besiyerlerine

yayma yöntemiyle ekim yapılmıştır.

Ayrıca her bir çiğ süt örneği, Bacillus cinsi bakterileri öldürmeyeceği kabul edilen fakat

diğer spor oluşturamayan refakatçi florayı inhibe edecek sıcaklık normu olan 55 oC'de 10

dakika pastörize edilmiştir. Pastörizasyon sonrası yine yukarıda açıklanan yöntemlerle

MY ve MYP Agar besiyerlerine aynı şekilde ekim yapılmıştır.

Page 46: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

33

İnkübasyon sonunda tüm çiğ süt örnekleri için değerlendirme yapıldığında en yüksek

seyrelti oranında bile (10–4 seyreltisinde) >7,477 log kob/mL sayım sonucu alınmış ve bu

yoğun bakteriyel gelişmeden dolayı net sayım sonuçlarına ulaşılamamıştır.

Bu nedenden dolayı selektif agar katkısı olarak artan miktarlarda PBS kullanımının

refakatçi flora ve B. cereus üzerine etkisi de araştırılmıştır. MYP Agar’da gelişme

gösteren hâkim flora daha önce belirtilen identifikasyon yöntemleri ile belirlenmiş ve

çalışmalara bu hâkim flora üzerinden devam edilmiştir.

Analiz için UHT süt içerisine tespit edilen refakatçi flora 1/100 oranında eklenerek

bakteri karışımı hazırlanmıştır. Bu karışım içerisine daha belirleyici sonuçlar alınabilmesi

amacıyla mannitol negatif bakteri olarak yalnızca B. cereus katılmıştır. B. cereus

dışındaki diğer mannitol negatif bakteriler için tek tek, yine 1/100 oranında bakteri içeren

süt örnekleri hazırlanmıştır. Bu şekilde hazırlanan örnekler kendi hallerinde oda

sıcaklığında 1 saat inkübasyona bırakılmışlardır.

Bacillus cereus dışındaki mannitol negatif bakteriler; Bacillus 9b, Bacillus 10b ve

Bacillus AP–6 numaralı izolatlardır. Bu izolatlar Ek.1’de gösterilen tabloda yer

almaktadır.

PBS ilave edilerek hazırlanan MYP Agar’da kullanılan katkı miktarı 50.000 IU/500 mL

(100 IU/mL) olacak şekildedir (Anonim 2005).

Oda sıcaklığında 1 saat inkübasyon sonrası süt örnekleri, hem hiçbir ısıl işlem

uygulanmadan hem de 55 oC'de 10 dakika pastörize edildikten sonra 10−4’e kadar daha

önce belirtilen yöntemlerle seyreltileri hazırlanmıştır. 10–2–10–4 seyreltilerinden, 100

IU/mL, 150 IU/mL ve 200 IU/mL olacak şekilde MYP Agar besiyerlerine yayma

yöntemi ile ekim yapılmıştır.

Page 47: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

34

Selektif agar katkısı olarak PGP kullanımının refakatçi flora ve B. cereus üzerine etkisi

de araştırılmıştır. PBS dışında antibiyotik kullanımının B. cereus ve refakatçi flora

üzerindeki etkisini görebilmek üzere B. cereus 'a en az, refakatçi floraya en fazla etki

gösteren antibiyotiklerden biri olan PGP'nin antibiyogram testi yapılmıştır.

Çalışmada yöntem olarak agar disk difüzyon yöntemi uygulanmıştır. Disk difüzyon

yönteminde belirli miktar antibiyotik emdirilmiş kâğıt diskler, test

mikroorganizmasından hazırlanan standart süspansiyon yayıldığı agar plakları yüzeyine

yerleştirilmiştir. Böylelikle, diskteki antibiyotik agar içerisine yayılmış ve bakteriye etkili

olduğu düzeylerde üremeyi engellemiştir. Bunun sonucunda, disk çevresinde bakterilerin

üremediği inhibisyon zonu oluşmuştur. Bu alanın çapı ölçülerek "duyarlı", "orta hassas"

ve "dirençli" olacak şekilde duyarlılık kategorileri belirlenmiştir (Gülay 2002).

Bölüm 2.6'da genel ilkeleri açıklanan çalışmada steril, herhangi bir antibiyotik

emdirilmemiş antibiyotik diskleri, steril swap ile bakteri sürülmüş genel besiyeri

(Nutrient Agar) üzerine yerleştirilmiştir. Antibiyotik diskler üzerine bakteri dirençleri

göz önünde bulundurularak belirlenen miktarlarda PGP aktarılmıştır. İşlemleri

tamamlanan Petri kutuları 37 oC'de 24 saat inkübasyona bırakılmışlardır. Şekil 3.1'de B.

cereus 'un antibiyogram testi sonucu oluşturduğu zonlar gösterilmiştir.

Antibiyogram testi ile B. cereus 'un PGP'ye karşı kısmi bir dirençliliği tespit edildikten

sonra belirlenen konsantrasyonlarda PGP, selektif agar katkısı olarak MY Agar içerisine

katılmıştır.

Analiz için alınan UHT süt içerisine 1/100 oranında daha önce belirtilen yöntemlerle

identifikasyonu yapılan refakatçi flora eklenerek bakteri karışımı hazırlanmıştır. Bu

karışım içerisinde, sayım sonuçlarının daha net olmasını sağlamak amacıyla, mannitol

negatif tek bakterinin B. cereus olması sağlanmıştır. Daha önceki bölümde belirtilen

mannitol negatif diğer bakteriler yine 1/100 oranında olacak şekilde UHT içerisine ayrı

ayrı ilave edilmişlerdir.

Page 48: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

35

Bu şekilde hazırlanan örnekler kendi hallerinde oda sıcaklığında 1 saat inkübasyona

bırakıldıktan sonra 100–10–4 arasında seyreltileri hazırlanmıştır. Hazırlanan 10–2,10–3 ve

10–4 seyreltilerinden, selektif agar katkısı olarak yalnızca 100 IU/mL PBS ile yalnızca

1000 IU/mL, 2000 IU/mL ve 3000/mL IU miktarlarında PGP içeren MY Agar

besiyerlerine yayma yöntemi ile ekim yapılmıştır.

Ayrıca bakteri karışımı ile mannitol negatif diğer bakterilerden hazırlanan süt örnekleri,

düşük sıcaklıkta (55 oC'de 10 dakika) pastörize edilerek hazırlanan 10–2,10–3 ve 10–4

seyreltilerinden aynı miktarlarda antibiyotik içeren MY Agar besiyerlerine yayma

yöntemi ile ekim yapılmıştır.

Şekil 3. 1. B. cereus 'un PGP antibiyogram test sonucu

3.2.4 Piyasa taraması

Yapılan tüm modifikasyon denemeleri sonuçlarına göre piyasa tarama aşamasında 1000,

2000, 3000 IU miktarlarında PGP katılarak hazırlanan MY Agar ile bir anlamda kontrol

olarak 100 IU PBS katılarak hazırlanan MYP Agar kullanılmasına karar verilmiştir.

Ayrıca ısıl işlem ile refakatçi flora inaktivasyonunun sağlanması için 80 oC'de 5 dakika

Page 49: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

36

pastörizasyon uygulamasının kombine olarak uygulanması da analiz planlarına

alınmıştır.

Page 50: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

37

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

4.1 Durum Değerlendirmesi

25 farklı çiğ süt örneği üzerinden yapılan çalışmalar sonucunda, çiğ sütlerdeki toplam

mezofilik aerobik bakteri sayısı, MY ve MYP Agar besiyerlerinde koloni oluşturan

bakteri sayım sonuçları Çizelge 4.1'de verilmiştir. Ayrıca her bir çiğ süt örneğine

uygulanan 55 oC'de 10 dakika pastörizasyon işleminin bakteri sayım sonuçlarına etkileri

de aynı çizelgede gösterilmiştir.

Çizelge 4.1 Çiğ sütte bulunan mikroorganizma yükü (log kob/mL)

Süt tipi MYP MY PCA En düşük 6,13 7,22 6,39 En yüksek 7,60 8,09 8,33

Çiğ süt

Ortalama 6,82±0,51 7,12±0,50 7,42±0,57 En düşük 2,34 2,78 2,28 En yüksek 2,40 3,40 3,73

Pastörize süt

Ortalama 2,37±0,01 3,11±0,19 2,96±0,41 n=25; MYP: Polimiksin B Sülfat selektif agar katkılı Mannitol Egg Yolk Agar besiyeri, MY: Selektif Agar katkısı kullanılmadan hazırlanan Mannitol Egg Yolk Agar besiyeri; PCA: Plate Count Agar Çiğ ve pastörizae süt ürünlerindeki farklı besiyerleri ile elde edilen canlı mezofilik

bakteri sayısının, çiğ sütte 6,39–8,33 log kob/g ve pastörize sütte 2,28–3,73 log kob/g

arasında değiştiği belirlenmiştir. Araştırma sonuçlarına göre 55 oC'de 10 dakika

pastörizasyon uygulaması ile PBS antibiyotiğinin MYP Agar besiyerinde kullanımının

kombine olarak uygulanması refakatçi florada en yüksek inhibisyonun sağlanmasında

etkili olmuştur. Bu kombinasyon uygulaması sonucu belirlenen en düşük bakteri yükü

2,34 log kob/g olarak tespit edilmiştir. Çiğ sütte MY Agar besiyerinde elde edilen

sonuçların MYP Agar besiyerinde elde edilenlerden daha fazla, PCA'da elde edilenlerin

en fazla olması doğaldır. Pastörize sütte MY>PCA>MYP sonuçlarında MY ve PCA

arasındaki fark önemsizdir.

Page 51: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

38

Bu sonuçlara benzer olarak, Kıvanç ve arkadaşları tarafından 1992 yılında yapılan bir

çalışmada Eskişehir ilinde çeşitli semtlerden satılan sokak sütleri Ocak- Ağustos ayları

arasında toplanarak, çiğ sütlerin bakteriyolojik kalitesi saptanmaya çalışılmış ve çiğ

sütlerin içerdiği bakteri sayısının mevsimlere bağlı olarak değişimi araştırılmıştır. Buna

göre yapılan analizler sonucunda, toplam mezofilik aerobik bakteri sayısı (TMAB)

ortalama olarak 1,79×107 kob/mL olup, 7,94×107−2,51×109 kob/mL değerleri arasında

değiştiği tespit edilmiştir. Çiğ süt örneklerinin % 30,5’inde TMAB sayısı 107 kob/mL, %

19,49'unda ise 108 kob/mL ve daha yüksek olarak bulunmuştur. Aynı araştırmada

belirtilen başka bir araştırma sonuçlarına göre ise 250 adet çiğ süt örneğinin %96,38'inde

TMAB sayısı 5×105/mL'in altında, % 3,62'sinin ise 1×106 kob/mL'in üzerinde TMAB

bulunduğu bildirilmiştir. Kıvanç ve arkadaşları (1992) tarafından ayrıca çiğ süt

örneklerinin psikrofilik bakteri sayısı da araştırılmış ve 3,16×103– 4,07×107 kob/mL;

ortalamanın 2,44×105 kob/mL olduğu sonuçlara ulaşılmıştır. Çiğ süt örneklerinin

%41,67'sinde ise psikrofilik mikroorganizma sayısı 105 kob/mL olarak tespit edilmiştir.

Son olarak kış sütleri ile yaz sütlerinde TMAB karşılaştırılmıştır. Buna göre mililitredeki

ortalama TMAB sayısı kış sütlerinde 5,49×106, yaz sütlerinde ise 6,36×106 kob/mL

olarak bulunmuştur. Çiğ sütlerin yüksek sayıda mikroorganizma içeriği sebebiyle, TSE

ve dünya standartlarına göre pastörize edilemeyecek hatta tüketimi sakıncalı sütler

oldukları sonucuna varılmıştır. Yaz mevsimindeki mikroorganizma sayısındaki artış

sütlerin soğukta saklanıp, nakledilmediğinin bir göstergesi olarak açıklanmıştır.

Bazı Avrupa ülkelerinde fabrikalara kabul edilen çiğ sütlerin en fazla 1,0×106 adet /mL

toplam bakteri içermesi istenirken, yüksek kaliteli içme sütü üretimi için toplam canlı

bakteri sayısının 5,0×105 adet/mL'yi geçmemesi istenmektedir. İngiltere, İrlanda,

Hollanda, Federal Almanya gibi ülkelerde çiğ sütün mililitresinde 1,0×105'den az bakteri

bulunması gerekmektedir (Kıvanç vd. 1992). Türk Gıda Kodeksi-Isıl İşlem Görmüş İçme

Sütleri Tebliği'ne göre çiğ sütlerde toplam canlı bakteri sayısı mililitrede 1,0×105 adet ve

ya daha az sayıda olması gerektiği bildirilmiştir. Yine aynı tebliği de 6 oC'de 5 gün

inkübasyondan sonra pastörize sütten yapılan ekimde 5,0×105 adet/mL olarak TMAB

sayısı istenmektedir (Anonim 2000). Verilen değerlere göre Çizelge 4.1'deki TMAB

sayım sonuçları karşılaştırıldığında çiğ sütlerin tebliğde yer alan değerlerden daha yüksek

sayıda mikroorganizma içerdiği sonucuna varılmıştır.

Page 52: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

39

Analiz sonuçlarına göre gerek çiğ gerekse pastörize edilmiş sütlerde bulunan bakteri

yoğunluğu oldukça yüksektir. Alişarlı ve arkadaşlarına (2003) göre bu durum, sütlerin

bakteriler ile sağım sonrası hijyenik kurallara uyulmadığında daha yoğun bir şekilde

kontamine olabileceğini göstermektedir. Bunun yanı sıra sağım esnası ve sonrası hijyenik

koşullara gösterilen özen de oldukça önemlidir.

Bu çalışmada çiğ sütten izole edilen bakteriler genel olarak cins bazında verilmiştir.

Genel olarak hâkim flora bozulma yapan bakterilerden oluşmuştur.

Çiğ Sütte Hâkim Flora;

Çiğ sütten izole edilen bakterilerin 13 test ile elde edilen tanımlama sonuçları Ek 1 ve Ek

2'de verilmiştir. İdentifikasyon sonuçlarına göre hâkim flora Bacillus spp.'dir. B. cereus

ise 25 adet çiğ süt örneğinden yalnızca 2 tanesinden, % 8 oranında izole edilebilmiştir.

Lactobacillus spp. ile Amphibacillus spp. diğer hâkim refakatçi floradır.

Araştırma sonucunda izole edilen 13 adet Bacillus spp. izolatının yalnızca 2 tanesinin (%

15,3) B. cereus olduğu tespit edilmiştir. Benzer bir çalışmada Uraz ve Yücel (1992)

tarafından çiğ süt ve 24 saat buzdolabı koşullarında muhafaza edilen pastörize sütten

izole edilen B. cereus oranı % 8,3 olarak bulunmuştur.

Bu çalışmada da Laksen ve Jorgensen'in (1999) araştırma sonuçlarına benzer olarak B.

cereus, Bacillus spp.'ye oranla daha düşük sayıda izole edilmiştir. Çiğ sütten izole edilen

Bacillus spp. daha çok buzdolabında sıcaklığında gelişmeyen daha dominant türlerden

oluşmaktadır.

Polimiksin B sülfat katkısı kullanılmadan hazırlanan MY Agar besiyerinde gelişen çiğ

sütten gelen refakatçi floranın 6 tanesinin Bacillus spp., 2 tanesinin Enterobacter spp., 1

tanesinin Lactococcus spp., 3 tanesinin Lactobacillus spp., 2 tanesinin Micrococcus spp.,

Page 53: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

40

1 tanesinin Staphylococcus spp. ve 1 tanesinin ise Sporolactobacillus spp.'ye ait olduğu

tespit edilmiştir.

Katkı kullanılarak hazırlanan MYP Agar besiyerinde gelişen çiğ sütten gelen refakatçi

floranın ise 2 tanesinin Amphibacillus spp., 3 tanesinin Bacillus spp., 2 tanesinin

Lactobacillus spp. ve 1 tanesinin ise Sporolactobacillus spp.'ye ait olduğu tespit

edilmiştir.

Katkı kullanılarak hazırlanan MYP Agar besiyerinde gelişen pastörize edilmiş sütten (55 oC'de 10 dakika) gelen refakatçi floranın 1 tanesinin Amphibacillus spp., 4 tanesinin

Bacillus spp., 2 tanesinin Lactobacillus spp. ve 1 tanesinin ise Sporolactobacillus spp.'ye

ait olduğu tespit edilmiştir.

Çalışmalar sonunda izole edilen bakterilerden Gram negatif olanlar Enterobacter cloacae

ve Enterobacter taylorae olarak tanımlanmıştır.

4.2 Refakatçi Floranın Isıl İşlem Yoluyla İnhibisyonu Çalışmalarının

Değerlendirilmesi

Bölüm 3.2.2'de ayrıntılı olarak anlatılan çalışmada hedef, refakatçi florada spor

oluşturmayan bakterilerin ısıl işlem yoluyla inhibisyonudur. Böylelikle MYP Agar’da B.

cereus dışında gelişme gösteren bakteri yoğunluğu azaltılarak B. cereus 'un sayımının

daha kolay hale getirileceği düşünülmüştür.

Buna bağlı olarak B. cereus da dahil olmak üzere Bacillus cinsine ait olan bakterilerin

spor oluşturabilme özelliklerine dayanarak pastörizasyon sonrası koloni gelişimleri

göstermeleri beklenmiştir. Fakat bölüm 3.2.2'de belirtilen esaslarla yapılan ilk deneme

ekimleri sonucunda inkübasyona bırakılan Petri kutularında inkübasyon süresi sonunda,

pastörizasyon işlemi uygulanan sütlerden yapılan ekimlerde, B. cereus dahil hiç bir

Page 54: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

41

koloni gelişim göstermemiştir. Pastörizasyon uygulanmayan sütlerden yapılan ekimlerde

çok yoğun olmamakla birlikte koloni gelişimi gözlenmiştir.

Bu sonuçlara göre 104/mL bakteri sayısının yeterli gelmediği düşünülerek diğer

denemelerde, bakteri sayısı 106/mL olarak değiştirilmiş, ancak elde edilen bulgularda bir

değişiklik olmamıştır.

UHT süt kullanımı yerine, diğer bir yöntem olarak Skim Milk besiyeri kullanılarak

yapılan çalışmada da pastörizasyon uygulanmış kültürlerde 24 saat inkübasyon

sonrasında B. cereus ’un da bulunduğu hiç bir petri kutusunda dikkat çekici oranda

koloni gelişimi gözlenmemiştir. Bunun üzerine Petri kutularının aynı koşullarda 24 saat

daha inkübasyonuna devam edilmiştir. Bu süre sonunda da koloni gelişimi olmaması

üzerine pastörizasyon işleminin yaratabileceği olumsuzluğunun boyutunun

araştırılmasına karar verilmiştir.

Bu araştırma sonucunda inkübasyon sonucu çiğ sütten yapılan ekimlerde yoğun olarak

sarı renkli koloni gelişimi söz konusu iken 70 oC’de 10 dakika pastörize edilen sütte ve

80 oC’de 5 dakika pastörize edilen sütte yok denilecek kadar az sayıda koloni gelişimi

gözlenmiştir.

Bu sonuçlar o an için spor forma geçmeyen bakterilerin gelişim gösteremedikleri ile

açıklanabilir. Nitekim pastörizasyon aşamasında spor formunda olmayan bakterilerin

belirlenemeyeceği açıkça uyarılmaktadır (Anonim 2005).

Ayrıca analiz sonucu değerlendirilirken daha önceki bölümlerde belirtildiği gibi

mevsimsel farklılıklarında bulunduğu göz önünde bulundurulmalıdır. Bilindiği üzere yaz

aylarında merada beslenen süt ineklerinden elde edilen çiğ sütlerin, kış aylarında elde

edilen sütlere kıyasla, B. cereus ile daha fazla kontamine olduğu tespit edilmiştir

(Özdemir 2003). Bu bilgi ışığında analizlerin kış sütleri kullanılarak yapıldığı da

düşünülürse B. cereus 'un ve diğer sporlu bakterilerin pastörizasyon sonucu neden az

sayıda geliştiği daha net açıklanabilecektir.

Page 55: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

42

Bu bulgular, mevsimsel olarak analiz yöntemlerindeki de farklılığı düşündürmektedir.

4.3 Besiyeri Modifikasyonu Denemeleri Sonuçları

4.3.1 PBS kullanımının refakatçi flora ve B. cereus üzerindeki etkisi

B. cereus ve refakatçi flora üzerinde, PBS’ın standart kullanım miktarı ile artan

miktarlarda kullanımı durumunda gösterdiği etkinin incelenmesi amaçlanan çalışmada

antibiyotiksiz olduğu tahmin edilen UHT süt içerisine 1/100 oranında belirlenen

refakatçi flora eklenerek bakteri karışımı hazırlanmıştır. Daha belirgin sonuçlar

alınabilmesi amacıyla mannitol negatif tek bakterinin B. cereus olması sağlanmıştır.

Diğer mannitol negatif bakteriler (Bacillus 9b, Bacillus 10b, Bacillus AP-6 numaralı

izolatlar) yine 1/100 oranında UHT süt içerisine ilave edilmişlerdir. Kendi hallerinde oda

sıcaklığında 1 saat inkübasyona bırakıldıktan sonra, belirlenen seyrelti aralıklarından

farklı miktarlarda PBS içeren MYP Agar besiyerine hem ısıl işlem uygulanmadan hem

de 55 oC’de 10 dakika pastörize edilerek yayma yöntemiyle ekim yapılmıştır.

Daha önce belirtildiği üzere (Bölüm 3.2.3) PBS, Gram negatif bakteriler üzerinde sidal

etkiye sahiptir. Bu etki daha önceki bölümlerde açıklanmıştır. PBS kullanılmadan

hazırlanan MYP Agar’da gelişme gösteren refakatçi flora içerisinde Gram negatif

bakterilerin yer aldığı tespit edilmişken, PBS selektif katkısı kullanılarak hazırlanan

MYP Agar’da gelişme gösteren refakatçi flora yalnızca Gram pozitif bakterilerden

oluşmaktadır.

MYP Agar besiyerinin hazırlanmasında kullanılan selektif agar katkısı PBS 1 şişe/500

mL olacak şekilde besiyeri içerisine katılmaktadır. Bu oran 100 IU/mL PBS anlamına

gelmektedir. PBS bu miktarda B. cereus analizinde, refakatçi floranın çok yoğun olduğu

durumlarda yetersiz gelmektedir ve B. cereus 'un tespit ve sayımını zorlaştırmaktadır.

Page 56: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

43

Bu nedenle önceki bölümlerde de belirtildiği üzere örnekler hazırlanmış ve MYP Agar

için selektif agar katkısı olarak 100, 150 ve 200 IU miktarlarında PBS kullanımının B.

cereus ve refakatçi flora sayımı üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir.

30 oC'de 24 saat inkübasyon süresi sonunda Petri kutularından alınan sayım sonuçları

Çizelgede 4.2’de verilmiştir.

İnkübasyon sonrası mannitol negatif, yayılmacı gelişme gösteren ve etrafında zon

oluşturan koloniler B. cereus olarak kabul edilerek sayılmıştır.

Çizelge 4.2 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (55 oC'de 10 dakika) karışım için

MYP Agar’da B. cereus, TMAB ve diğer izolatların sayım sonuçları (log kob/mL)

Isıl İşlem IU B. cereus TAMB Bacillus AP–6 Bacillus 9b Bacillus 10b100 4,47 7,23 7,62 7,01 7,36 150 4,36 7,05 7,54 6,54 7,21

Yok

200 4,00 6,98 7,35 6,44 6,80 100 <1,17 6,75 6,24 6,37 7,31 150 <1,17 6,73 6,19 6,33 6,46

Var

200 <1,17 6,47 6,04 6,01 6,37 Selektif Agar katkısı olarak PBS kullanımının refakatçi florayı inhibe edici etkisi belirgin

olarak görülmekle birlikte, tam olarak etkin olmadığı tespit edilmiştir. Daha öncede

belirtildiği gibi PBS, Gram negatif bakterileri inhibe etmiş fakat Gram pozitif florada tam

olarak etkin olamamıştır. Bu bilgiler ışığında, PBS kullanımında miktar belli oranlarda artırıldığı zaman MYP

Agar besiyerinde gelişme gösteren B. cereus sayısı giderek azalmaktadır. Yani

antibiyotik miktarının artışı B. cereus gelişimini olumsuz yönde etkilemektedir. Bu

durum çiğ süt içerisinde bulunan gerçek B. cereus sayısının doğru olarak tespit

edilememesine yol açabilecektir.

Page 57: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

44

Ayrıca anlaşıldığı üzere hem düşük sıcaklıkta pastörizasyon işlemi (55 oC'de 10 dakika)

hem de artan miktarlarda antibiyotik uygulanması B. cereus 'un MYP Agar üzerinde hiç

gelişmemesine neden olmaktadır.

Aynı miktarlar elimizde bulunan refakatçi floradan hazırlanan bakteri karışımı için de

bakteri azalışına neden olmaktadır fakat bakteri gelişimi yeterince baskılanamamaktadır.

Düşük sıcaklıkta pastörizasyon işlemi (55 oC'de 10 dakika) ile antibiyotik miktarının

artışı, bakteri karışımının inhibisyonunda daha etkili olmuştur. Ama yine de istenilen

oranlarda inhibisyona ulaşılması için yeterli olmadığı anlaşılmaktadır.

Mannitol negatif özelliklerinden dolayı bakteri karışımı içerisine katılmayıp ayrı olarak

değerlendirilmeye alınan Bacillus AP–6, Bacillus 9b ve Bacillus 10b izolatları için de

bakteri karışımı için yapılan yorumlar geçerli olmaktadır. Bu bakteriler üzerinde de

antibiyotik artışı ile yeterli inhibisyon sağlanamamıştır. Bu durum, bu bakterilerin çiğ süt

içerisinde B. cereus ile yer aldıkları zaman, MYP Agar üzerinde mannitol negatif ve

yayılmacı gelişimlerinden dolayı B. cereus olarak sayılabilecekleri ve sahte pozitif sonuç

alınımına yol açabileceklerini düşündürmektedir.

4.3.2 Selektif agar katkısı olarak PGP kullanımının refakatçi flora ve B. cereus

üzerine etkilerinin değerlendirilmesi

PBS’den farklı antibiyotik kullanımın B. cereus ve refakatçi flora üzerine etkisini

görebilmek amacıyla B. cereus ’a en az, refakatçi floraya en fazla etki gösteren

antibiyotiklerden biri olan PGP’nin Bölüm 3.2.3’de belirtilen yöntemle antibiyogram

testi yapılmıştır.

İnkübasyon sonrası antibiyogram sonuçları Çizelge 4.3’teki gibidir.

Page 58: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

45

Antibiyogram testinde kullanılan PGP miktarları, PBS miktarları göz önünde

bulundurularak tespit edilmiştir. Ayrıca B. cereus 'un PGP (%99) PBS'ye (%58) oranla

daha dirençli olduğu da (Mousumi and Sarkar 2003) antibiyotik miktarlarını belirlerken

etkili olmuştur. Buna göre PGP miktarları 1000 IU/mL, 2000 IU/mL ve 3000 IU/mL

olarak belirlenmiştir.

Çizelge 4.3 PGP için antibiyogram test sonuçları

Zon Çapı (mm) Bakteri 1000 IU 2000 IU 3000 IU Sonuç

Bacillus cereus 11 13 15 Orta hassas Bacillus AP–1 – – – Dirençli Bacillus AP–6 22 25 29 Hassas Bacillus 9b 33 36 37 Hassas Bacillus 10a 35 37 40 Hassas Bacillus 10b 40 41 45 Hassas Lactobacillus 6 25 28 30 Hassas Lactobacillus 8a 25 27 31 Hassas Lactobacillus AP–3 22 25 27 Hassas Lactobacillus AP–5 22 26 28 Hassas Amphibacillus 2 24 26 27 Hassas Amphibacillus 18 22 25 26 Hassas Sporolactobacillus AP–12 24 28 30 Hassas Antibiyogramda 11 mm zon çapından küçük değerler dirençli, 12–21 mm zon çapı

arasındaki değerler orta, 22 mm zon çapından büyük değerler ise hassas olarak

değerlendirilmiştir (Ericsson and Sherris 1971).

Yapılan antibiyogram testi sonucu B. cereus 'un PGP'ye karşı orta düzeyde hassas olduğu

tespit edilmiştir. Refakatçi flora üzerinde belirlenen miktarlarda PGP oldukça etkili olup

yalnızca Bacillus AP-1 izolatına karşı yetersiz kalmıştır.

Önceki bölümlerde açıklandığı üzere antibiyogram sonuçlarına göre B. cereus PGP'ye

karşı orta düzeyde dirençlilik göstermektedir. Bu durum PGP'nin MYP Agar besiyerinde

selektif agar katkısı olarak kullanılabileceğini göstermiştir. PGP'nin B. cereus ve

refakatçi flora üzerine etkisinin tespit edilerek bakteri sayım sonuçlarının alınabilmesi

Page 59: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

46

için daha önce belirtildiği şekilde örnekler hazırlanmış ve farklı miktarlarda (1000, 2000,

3000 IU) PGP ile 100 IU PBS içeren MYP Agar besiyerine yayma yöntemi ile ekim

yapılmıştır. Belirtilen inkübasyon süresi sonunda sayım sonuçları aşağıdaki Çizelge

4.4’te verilmiştir.

Çizelge 4.4 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (55 oC'de 10 dakika) karışım için

PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar’da gelişme gösteren B. cereus, TMAB ve diğer izolatların sayım sonuçları (log kob/mL)

Isıl İşlem IU B. cereus TAMB Bacillus AP–6 Bacillus 9b Bacillus 10bKontrol 4,55 6,77 7,93 6,40 7,08

1000 4,54 6,49 7,66 <1,17 <1,17 2000 4,46 6,31 7,55 <1,17 <1,17

Yok 3000 4,41 5,47 7,53 <1,17 <1,17

Kontrol <1,17 6,74 7,23 6,27 6,32 1000 <1,17 6,42 7,09 <1,17 <1,17 2000 <1,17 5,86 7,09 <1,17 <1,17

Var 3000 <1,17 5,64 7,04 <1,17 <1,17

Kontrol; 100 IU PBS

Bu sonuçlara göre B. cereus gelişim ve sayısı açısından farklı miktarlarda PGP kullanımı

çok büyük farklılık göstermemiştir. Yani miktar artışı B. cereus gelişimini çok

baskılamamıştır. Sayım sonuçları göz önüne alındığında en ideal PGP miktarının 1000

IU/mL olduğu görülmektedir. Bu miktardan sonraki 2000 IU ve 3000 IU miktarları az da

olsa B. cereus sayısında düşüşe neden olmuştur. Bu miktarların besiyerinde kullanımı

sahte negatif sonuç alınabilmesine neden olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır.

1000 IU PGP, bakteri karışımı gelişimini çok fazla baskılayamamakla birlikte 100 IU

PBS kullanımına oranla daha fazla inhibisyon sağlamaktadır. Bu inhibisyon oranı düşük

sıcaklıkta pastörizasyon (55 oC'de 10 dakika) uygulamasıyla artmaktadır.

Mannitol negatif özelliklerinden dolayı bakteri karışımından ayrı olarak değerlendirilen

Bacillus 9b ve Bacillus 10b izolatları, normal koşullarda 100 IU PBS içeren MYP

Agar’da yüksek oranlarda gelişme gösterirlerken, 1000 IU ve diğer miktarlarda PGP

içeren MYP Agar’da gelişim gösterememektedirler.

Page 60: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

47

Bu sonuçlar Bacillus AP–6 kodlu izolatta geçerli olamamıştır. Çünkü bu izolat

antibiyogram sonuçlarının aksine 100 IU PBS ve 1000, 2000, 3000 IU PGP içeren MYP

Agar besiyerinde yüksek sayıda gelişme göstermiştir.

4.4 Piyasa Taraması Sonuçları

Yukarıda bölüm 3.2.4 ve Bölüm 4.3.3'te belirtilen açıklamalar eşiğinde yapılan piyasa

taramasından alınan sonuçlar Çizelge 4.5’te verilmiştir.

Çizelge 4.5 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (80 oC'de 5 dakika) çiğ süt

örnekleri için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar’da gelişme gösteren B. cereus ve TMAB sayım sonuçları (log kob/mL)

1. Süt 2. Süt 3. Süt Isıl İşlem IU B. cereus TAMB B. cereus TAMB B. cereus TAMB Kontrol 5,35 6,36 4,95 6,55 5,22 6,64

1000 4,95 6,40 5,11 6,23 5,17 6,54 2000 4,85 6,28 5,04 6,22 5,08 6,36 Yok

3000 4,44 5,95 4,94 6,17 4,96 6,30 Kontrol <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17

1000 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 2000 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 Var

3000 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 4. Süt 5. Süt 6. Süt

Isıl İşlem IU B. cereus TAMB B. cereus TAMB B. cereus TAMB

Kontrol 5,22 7,18 5,24 6,69 5,11 6,51 1000 5,18 6,49 5,20 6,39 5,07 6,06 2000 5,08 6,43 5,06 6,23 5,01 6,03 Yok

3000 4,88 6,41 4,99 6,10 4,88 5,89 Kontrol <1,17 <1,17 <1,17 1,77 <1,17 1,90

1000 <1,17 <1,17 <1,17 1,69 <1,17 <1,17 2000 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 Var

3000 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 Kontrol; 100 IU PBS; n=10

Page 61: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

48

Çizelge 4.5 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (80 oC'de 5 dakika) çiğ süt örnekleri için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar’da gelişme gösteren B. cereus ve TMAB sayım sonuçları (log kob/mL) (devam)

7. Süt 8. Süt 9. Süt Isıl İşlem IU B. cereus TAMB B. cereus TAMB B. cereus TAMB Kontrol 6,10 7,06 5,85 6,82 5,51 6,65

1000 5,96 6,25 5,82 6,26 5,41 5,96 2000 5,93 6,14 5,73 6,12 5,19 5,85 Yok

3000 5,84 6,13 5,47 6,13 4,99 4,43 Kontrol <1,17 2,41 <1,17 2,47 <1,17 2,00

1000 <1,17 <1,17 <1,17 1,47 <1,17 <1,17 2000 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 Var

3000 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 <1,17 10. Süt Isıl İşlem IU B. cereus TAMB

Kontrol 4,95 6,35 1000 4,87 6,01 2000 4,78 5,56 Yok

3000 4,61 5,51 Kontrol <1,17 <1,17

1000 <1,17 <1,17 2000 <1,17 <1,17 Var

3000 <1,17 <1,17 Kontrol; 100 IU PBS; n=10 Ayrıca piyasa taraması sonuçları Çizelge 4.6’da en düşük, en yüksek ve ortalama

değerleri verilerek de gösterilmiştir.

Page 62: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

49

Çizelge 4.6 Isıl işlem uygulanmamış ve uygulanmış (80 oC'de 5 dakika) çiğ süt örnekleri için PBS ve farklı miktarlarda PGP katılmış MYP Agar’da gelişme gösteren B. cereus ve TMAB yükünün değerlendirilmesi (log kob/mL)

Isıl işlem IU B.cereus TAMB En düşük 4,95 6,35 En yüksek 6,10 7,18 Kontrol Ortalama 5,359±0,37 6,685±0,27 En düşük 4,87 5,96 En yüksek 5,96 6,54 1000 Ortalama 5,279±0,35 6,265±0,19 En düşük 4,78 5,56 En yüksek 5,93 6,43 2000 Ortalama 5,180±0,36 6,126±0,25 En düşük 4,44 4,43 En yüksek 5,84 6,41

Yok

3000 Ortalama 5,000±0,39 5,901±0,57 En düşük <1,17 <1,17 En yüksek <1,17 2,47 Kontrol Ortalama <1,17 1,306±0,41 En düşük <1,17 <1,17 En yüksek <1,17 1,69 1000 Ortalama <1,17 1,228±0,16 En düşük <1,17 <1,17 En yüksek <1,17 <1,17 2000 Ortalama <1,17 <1,17 En düşük <1,17 <1,17 En yüksek <1,17 <1,17

Var

3000 Ortalama <1,17 <1,17

Kontrol; 100IU PBS, n=10 Yukarıda verilen sayım sonuçları ışığında genel olarak, 100 IU PBS içeren MYP Agar

besiyerinde B. cereus sayısı 1000 IU PGP içeren MYP Agar’a göre daha yüksek

sayıdadır. Fakat 1000 IU PGP içeren MYP Agar’da refakatçi flora inhibisyonu 100 IU

PBS kullanımına göre daha yüksek olduğundan 1000 IU PGP içeren MYP Agar

kullanımı tercih edilebilir.

Page 63: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

50

5. SONUÇ

Bu çalışmada elde edilen somut bulgular aşağıda özetlenmiştir.

-Standart analizde MY Agar besiyerinde kullanılan selektif katkının PBS olması

nedeniyle (MYP Agar’da) çiğ sütte hâkim flora genel olarak Gram pozitif bakterilerden

oluşmaktadır.

-B. cereus, MYP Agar besiyerinde çiğ sütten gelen refakatçi floranın baskın olduğu

durumlarda kolaylıkla sayılamamaktadır. Özellikle B. cereus gibi mannitol negatif ve

yayılmacı gelişim gösteren diğer Bacillus türlerinin benzer koloni morfolojisi

göstermesi nedeniyle hatalı sayım sonuçları alınabilmektedir.

-Refakatçi florada yer alan Bacillus türleri ile B. cereus 'un spor oluşturma

yeteneklerinden dolayı, yüksek ve düşük sıcaklıkta pastörizasyon işlemi sonrasında,

gelişme göstermeleri beklenmiştir. Fakat o an için spor forma geçememiş olmaları

nedeniyle bu izolatlar gelişme gösterememişlerdir.

-Besiyerindeki selektif katkı maddesi PBS miktarı, refakatçi floranın baskılanmasında

yetersiz kalmaktadır.

-Artan PBS miktarları B. cereus gelişimini olumsuz etkilemekte, sahte negatif sonuç

alınmasına neden olabilmektedir.

-B. cereus, PGP'ye karşı orta düzeyde direnç göstermektedir.

-MYP Agar’ın standart katkı miktarı olan 100 IU PBS ile 1000, 2000, 3000 IU

konsantrasyonlarda PGP kullanımının B. cereus gelişimi açısından çok büyük

farklılıkları yoktur.

Page 64: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

51

-Hem düşük sıcaklıkta pastörizasyon uygulaması hem de antibiyotik uygulaması B.

cereus 'un hiç gelişmemesine neden olmaktadır.

-1000 IU PGP uygulaması refakatçi flora gelişimini çok fazla baskılamamakla birlikte,

100 IU PBS uygulamasına oranla daha fazla bir inhibisyon sağlamaktadır.

-B. cereus gelişimini azaltmayacak, refakatçi florayı inhibe edecek şekilde B. cereus

sayımını kolaylaştıran besiyeri olarak 1000 IU/mL miktarında selektif agar katkısı

olarak PGP kullanılmış Mannitol Egg Yolk Agar besiyeri olduğu sonucuna varılmıştır.

Ancak bu konuda daha detaylı çalışmalar yapılması ve elde edilen bulgulara göre bir

değerlendirilmeye gidilmesi daha uygun olacaktır.

-Ayrıca denemelerde kullanılan Penisilin G Potasyum piyasadan rahatlıkla temin

edilebilen ve PBS’a göre daha ucuz bir antibiyotiktir. Bu sebepten işletmeler açısından

maliyet azaltıcı bir etken olabilecektir.

Page 65: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

52

KAYNAKLAR Anonim. 2000. Türk Gıda Kodeksi Çiğ Süt ve Isıl İşlem Görmüş İçme Sütleri Tebliği.

Resmi Gazete. 27 s. Anonim 2000. Mikrobiyoloji- Bacillus cereus Sayımı İçin Genel Kurallar-. TS 6404 EN

ISO 7932. Ankara, 14 s. Anonim 2005. Merck Gıda Mikrobiyolojisi Uygulamaları. Ed. A K. Halkman. Başak

Matbaacılık Ltd. Şti., Ankara, 358 s. Anonymous. 1986. Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E. and Holt, J.G. Williams &

Wilkins. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2. Eds, Baltimore. Anonymous. 1998. Bacteriological Analytical Manual. 8th Ed. Revision A. AOAC

International, Gaithersburg, USA. Anonymous 2006. Microbiology of Food and Animal Stuff- Horizontal Method for the

Determination of low Numbers of Presumptive Bacillus cereus- Most Probable Number Technique and Detection Method ISO 21871:2006. 14pp.

Alişarlı, M., Solmaz, H. ve Akaya, L. 2003. Süt İneklerinde Meme Başı Derilerinin

Bazı Mikroorganizmalar ve Çiğ Sütlerinde Mikrobiyolojik Kalite Yönünden İncelenmesi. Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi. 14(1), 35–39.

Altun, B., Besler, T. ve Ünal, S. 2002. Ankara'da Satılan Sütlerin Değerlendirilmesi.

Sürekli Tıp Eğitimi Dergisi. 11(2), 51-56. Aran, N. 1997. Gıdaların Mikrobiyolojik Analiz Yöntemlerinde Son Gelişmeler. Gıda

Teknolojisi Dergisi. 10(2), 55-64. Arda, M. 2006. Mikrobiyel Üremenin Kontrolü. Ankara Üniversitesi Veteriner

Fakültesi. Temel Mikrobiyoloji1. Web sitesi. http://www.mikrobiyoloji.org. Erişim tarihi: 17.02.2006.

Atlas, R. M. 1997. Handbook of Microbiological Media. Second Edition. 137-1530.

USA. CRR Press, Inc. Ayhan, K. 2000. Gıdalarda Bulunan Mikroorganizmalar. Gıda Mikrobiyolojisi ve

Uygulamaları Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölüm Yayını, 43–44. Sim Matbaacılık Ltd. Ankara.

Brown, K. L. 2000. Control of Bacterial Spores. Brit. Med. Bull. 56, 158–171. Burdova, O., Baranova, M., Laukova, A., Rozanska, H. and Rola, J.G. 2002. Hygiene

of Pasteurized Milk Depending on Psyrotrophic Microorganisms. Bull. Vet. Inst. Pulawy. 46, 325–329.

Page 66: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

53

Chan, C. H., Ding, H. C. and Chang, T. C. 2000. Rapid Identification of Bacillus cereus on the Detection of a 28.5-Kilodalton Cell Surface Antigen. Journal of Food Protection. 64(3), 348-354.

Çon, A. H. ve Gökalp, H. Y. 1997. Gıda Mikrobiyolojisi. Pamukkale Üniversitesi

Mühendislik Fakültesi Ders Notları Yayın no: 007, 23 s. Mühendislik Fakültesi Basım Ünitesi. Denizli.

Datta, N. and Deeth, H. C. 2003. Diagnosis, The Cause of Proteolysis in UHT Milk.

Lesensm.-Wiss.U.-Technol. 36, 173–182. Doğan, H. B. ve Tükel, Ç. 2000. Toplam Mezofilik Bakteri. Gıda Mikrobiyolojisi ve

Uygulamaları Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölüm Yayını, 522 s. Sim Matbaacılık Ltd. Ankara.

Dufrenne, J., Soentoro, P., Tatini, S., Day, T., Notermans, S. 1994.Characteristic of

Bacillus cereus Related of Safe Food Production. Int. J. Food. Microbiol. 23, 99–109.

Ericsson, H. M. and Sherris, J. C. 1971. Antibiotic Sensitivity Testing Report Study,

Acta Pathol, Microbiology Scand., Section B, Suppl. 217 p. Frank, J.F. and Yousef, A.E. 2004. Tests for Group of Microorganisms. 2004. Chapter

8. Eds: Wehr, H.M., Frank, J.F. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 17th Edition. American Public Health Assoc., Washington DC, 570 p.

Griffiths, V.M. and Phillips, J.D. 1988. Modeling the Relation Between Bacterial

Growth and Storage Temperature in Pasteurized Milk of Varying Hygienic Quality. Journal Soc. Dairy Techn. 41, 96–102.

Gülay, Z. 2002. Antibiyotik Duyarlılık Testlerinin Yorumu. Toraks Dergisi. 3(1), 75–

80. Halkman, K. ve Ayhan, K. 2000. Gıdaların Mikrobiyolojik Analizi. Mikroorganizma

Sayımı. Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölüm Yayını, 522 s. Sim Matbaacılık Ltd. Ankara.

Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology. Academic Press, California. 532 p.

Janstova, B., Lukasova, J., Prackova, M. and Yarlova, L. 2004. Influence of Bacillus

spp. Enzymes on Ultra High Temperature Treated Milk Proteins. Acta Vet. Brno. 73, 393–400.

Page 67: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

54

Kalaylı, E. ve Beyatlı, Y. 2003. Bacillus cinsi Bakterilerin Antimikrobiyal Aktiviteleri, PHB üretimleri ve Plazmid DNA'ları. Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi. 01(12), 24–35.

Kaleli, D. ve Özkaya, F. 2000. Bacillus cereus. Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları

Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölüm Yayını, 395–401. Sim Matbaacılık Ltd. Ankara.

Konar, A. ve Şahan, N. 1989. UHT Sütte Değişmeler ve Sorunlar. Gıda Teknolojisi

Derneği Yayınları: 611–615. Ankara. Karmen, G. T. and Mozina, S. S. 2000. Differentiation of Bacillus cereus Isolates. Food

Technology – Biotechnology . 38(2), 135-142. Kaynar, P. ve Beyatlı Y. 2006. Balıklardan İzole Edilen Bacillus Cinsi Bakterilerin Bazı

Metabolik Özelliklerinin Belirlenmesi, Plazmid DNA ve Protein Profillerinin İncelenmesi. Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi. 4(3), 1-30.

Kıvanç, M., Kunduhoğlu, B., Ayaz, B. 1992. Eskişehir'de Tüketilen Çiğ Sütlerin

Bakteriyolojik Kalitesinin Halk Sağlığı Yönünden İncelenmesi. Gıda Teknolojisi Derneği Yayın Organı. 17(5), 327-333.

Laksen, H.D. and Jurgensen, K. 1999. Growth of Bacillus cereus in Pasteurized Milk

Products. International Journal of Food Microbiology. 46, 173-176. Langeveld, L.P.M. and Cuperus, F. 1993. Aspects Regarding The Application of a

Predictive Model for Growth of Bacillus cereus in Pasteurized Milk. IDF Bull. 287, 6-10.

Lin, S. 1997. Identification of Contamination Sources of B. cereus in Pasteurized Milk.

A Thesis Presented to Faculty of Graduate Studies of University of Guelph. 109 p. Canada.

Lin, S., Schraft, H., Odumeru, J. A. and Griffiths, M. W. 1998. Identification of

Contamination Source of B. cereus in Pasteurized Milk. International Journal of Food Microbiology. 159-171.

Mac Faddin, J. F. 1999. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Third

Edition. 589 p. Lippincott Williams & Wilkins, N.Y. Marth, E. H. and Steele, J. L. 1998. Applied Dairy Microbiology. Marcel Decker, INC,

New York, 516 p. Metin, M. 1998. Süt Teknolojisi Sütün Bileşimi ve İşlenmesi. Ege Üniversitesi

Mühendislik Fakültesi Yayınları No: 33, 388, 632–654. İzmir.

Page 68: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

55

Mousumi, B. and Sarkar, P. K. 2003. Antibiotic Resistance and Susceptibility to Some Food Preservative Measures of Spoilage and Pathogenic Microorganisms from Spices. Food Microbiology. 355-342.

Netten, P. and Kramer, M. J. 1992. Media for The Detection and Enumeration of B.

cereus in Food: a review. International Journal of Food Microbiology. 85-99. Özdemir, H. 2003. Pastörize Sütlerde B. cereus 'un Varlığı. Gıda Teknolojisi Derneği

Yayınları. 28(6), 611–615. Sekin, Y. ve Karagözlü, N. 1997. Gıda Mikrobiyolojisi Gıda Endüstrisi İçin Temel

Esaslar ve Uygulamalar. 4. Basımdan Çeviri. Literatür Yayıncılık. Dağıtım No: 115. Yazarı Klaus Pichhardt.

Slaghuis, B. A., Te Giffel, M. C., Beumer, R. R. and Andre, G., 1997. Effect of

Pasteuring on the Incidence of Bacillus cereus Spores in Raw Milk. Int. Dairy Journal. 7(3), 201-205.

Pirttijarvi, T. 2000. Contamination Aerobic Sporeforming Bacteria in The

Manufacturing Processes of Food Packing Board and Food. Web sitesi. http://www.ethesis.helsinki.fi. Erişim tarihi: 31.12.2004.

Roberts, F. T. A. and Skinner, F. A.1983. Food Microbiology Advances and Prospects. 140 p. Academic Press Inc. London.

Robinson, R. K. 1990. Dairy Microbiology. 219-233. Elsevier Applied Science.

London. Sorhaug, T. and Sptepaniak, L. 1997. Psychrotrophs and Their Enzymes in Milk and

Dairy Products: Quality Aspects. Trends in Food Science and Technology. 35-39.

Svensson, B. Eneroth, A. Brendehaug, J., Molix, G. and Christiansson, A. 2000.

Involvement of Pasteurizer in The Contamination of Milk by B. cereus in a Commercial Dairy Plant. Journal of Dairy Research. 455 p.

Te Giffel, M.C., Beumer, R.R., Granum, P.E. and Rambouts, F. M. 1997. Isolation and

Characterization of Bacillus cereus from Pasteurized Milk in Household Refrigerators in the Netherlands. Int. Journal Food Microbiol. 34(3), 307-318.

Tunail, N. 2000. Mikrobiyel Enfeksiyonlar ve İntoksikasyonlar. Gıda Mikrobiyolojisi

ve Uygulamaları Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölüm Yayını, 102 s. Sim Matbaacılık Ltd. Ankara.

Uraz, G. ve Yücel, N. 1992. Pastörize Sütlerde Çevre Koşulları ve Saklama Zamanına

Bağlı Değişen Bakteriyel Flora. Gıda Teknolojisi Derneği Yayın Organı. 17(2), 137-142.

Page 69: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

56

U.S.Food &Drug Administration. 2004. Web sitesi. http://www.courses.ag.uhidaho.edu. Erişim tarihi: 17.09.2004.

U. S. Food & Drug Administration. 2004. Web sitesi. http://www.cfsan.fda.gov. Erişim

tarihi: 17.09.2004.

Page 70: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

57

EKLER EK 1. MYP Agar besiyerinde çiğ sütten gelen refakatçi flora

K:kokobasil; Ç:çubuk; k:kok

AYRIM TESTLERİ

İZOLAT NO

Gra

m re

aksi

yonu

Mor

folo

ji

Kat

alaz

Spor

test

i

Har

eket

Glik

ozda

n as

it

Glik

ozda

n ga

z

Sim

mon

s sitr

at

MR

VP

Nitr

at re

düks

iyon

u

Oks

idaz

O/F

SONUÇ

A–1 + K – + + + – – + + – – F A–2 + K − + + + − − − + − − F A–18 + K − + + − + − + − − − F

Amphibacillus spp.

B–1 + Ç + + − + − + − + − + F B–2 + Ç + + + + + + − + − + F B–3 + Ç + + + + + + − + + − F B–4 + Ç + + + + + + + − − − F B–5 + Ç + + + + + + + + − − F B–6 + Ç + + + + + − + − + − F B–7 + Ç + + + + + − + + + − F B-9b + Ç + + + + + − − − − − F B-10a + Ç + + + + − − + − − − F B-10b + Ç + + + + − − + + − − F B-AP,1 + Ç + + + + + − + − − − F B-AP,6 + Ç + + + + + + + + + − F

Bacillus spp.

E–1 − K + − + + + + − + − − F E–2 − K + − + + + + − + − − F

Enterobacter spp.

L–1 + Ç − − − + + − + − − − F L–2 + Ç − − − + − − − − − − F L–3 + Ç − − + + − − − + − − F L–6 + Ç − − + + − − + − − − F L-8a + Ç − − − + − − + − − − F L-AP,3 + Ç − − + + − − + + − − F L-AP,5 + Ç − − + + − − + − − − F

Lactobacillus spp.

Lc–1 + Ç − − − + − − + + − − F Lactococcus spp. M–1 + k + − + + + − + − − + O M–2 + k + − + + − + − + − + O Micrococcus spp.

S–1 + k + − − + − − + + − − F Staphylococcus spp. Spo–1 + Ç − + + + − − + − − − F Spo–2 + Ç − + − + − − + + − − F Spo-AP,12 + Ç − + − + − − − + − − F

Sporolactobacillus spp.

Page 71: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

58

EK 2. Çiğ süt örneklerinde Gram negatif bakterilerin tanımlanması

AYRIM TESTLERİ

İZOLAT NO

VR

B A

gar’

da

tipik

gel

işm

e

Lakt

ozda

n as

it

Hid

roje

n sü

lfür

İndo

l

Lisi

n de

korb

oksi

laz

Üre

hid

roliz

i

SONUÇ

E–1 + + − − − + Enterobacter cloacae

E–2 + − − − − − Enterobacter taylorae

Page 72: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

59

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı: Selin KALKAN

Doğum Yeri: Ankara

Doğum Tarihi: 04.09.1981

Medeni Hali: Bekar

Yabancı Dili: İngilizce

Eğitim Durumu (Kurumu ve Yıl)

Lise : Kocatepe Mimar Kemal Lisesi-1998

Lisans : Pamukkale Üniversitesi Müh. Fak. Gıda Müh. Bölümü-2002

Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği

Anabilim Dalı (2003-2006)

Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl:

Bilintur Catering Centre-2006

Yayınları (SCI ve diğer):

Kalkan, S. ve Halkman, A. K. 2006. Bacillus cereus ’un İçme Sütünde Oluşturduğu

Sorunlar. Orlab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi 4(1):1-11.

www.mikrobiyoloji.org/pdf/702060101.pdf

Kalkan, S. ve Halkman, A. K. 2006. Bacillus cereus ’un Standart Analiz Yöntemi. Orlab

On-Line Mikrobiyoloji Dergisi. 4(3): 31-36. www.mikrobiyoloji.org/pdf/702060302.pdf

Page 73: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

ÇİĞ SÜTTE Bacillus cereus SAYILMASI İÇİN YÖNTEM MODİFİKASYONLARI ÜZERİNE ÇALIŞMALAR

Selin KALKAN

Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN

Bu çalışma birbirini izleyen 3 aşamada gerçekleştirilmiştir. İlk aşamada Ankara piyasasından sağlanan 25 adet çiğ süt örneğine mikrobiyolojik analiz yapılmış, toplam aerobik mezofilik bakteri sayısının 6,39-8,33 log kob/mL, selektif agar katkısı olarak Polimiksin B Sülfat (PBS) kullanılan MYP Agar besiyerinde 6,13-7,60 log kob/mL, selektif agar katkısı kullanılmadan hazırlanan MY Agar besiyerinde ise 7,22-8,09 log kob/mL olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca her bir çiğ süt örneği 55 oC'de 10 dakika pastörize edilerek, pastörizasyon sonrası toplam aerobik mezofilik bakteri sayısının 2,28-3,73 log kob/mL, PBS kullanılan MYP Agar besiyerinde 2,34-2,40 log kob/mL, selektif agar katkısı kullanılmadan hazırlanan MY Agar besiyerinde ise 2,78-3,40 log kob/mL olduğu tespit edilmiştir. Çiğ süt örneklerindeki hakim flora belirlenerek, refakatçi florada Bacillus türlerinin dominant flora olduğu tespit edilmiştir. İkinci aşamada belirlenen refakatçi floranın ısıl işlem ile inaktivasyonu amaçlanmış ve düşük sıcaklıkta pastörizasyon (55 oC'de 10 dakika) uygulaması ve PBS kullanımının refakatçi floraya ve B. cereus' a etkileri gözlemlenmiştir. Düşük sıcaklıkta pastörizasyon ve antibiyotik kullanımı B. cereus'un MYP Agar'da koloni gelişimi göstermemesine neden olmuştur. Son aşamada farklı selektif agar katkısı kullanımın B. cereus ve refakatçi flora üzerine etkileri gözlemlenmiştir. MYP Agar besiyeri hazırlanmasında kullanılan PBS miktarının tam olarak refakatçi flora inhibisyonunda yeterli gelmediği tespit edilmiştir. Bu nedenle artan miktarlarda PBS kullanımının etkileri araştırılmış ve normal miktardan (100 IU/mL) daha yüksek miktarlarda (150, 200 IU/mL) PBS kullanımının B. cereus gelişimini olumsuz etkilediği anlaşılmıştır. Bu nedenle B. cereus 'un daha az, refakatçi floranın daha fazla hassasiyet gösterdiği diğer bir antibiyotik olan Penisilin G Potasyumun (PGP) artan miktarlarda (1000, 2000, 3000 IU/mL) selektif agar katkısı olarak kullanımı denenmiş ve etkileri gözlemlenmiştir. Buna göre 1000 IU/mL miktarlarda PGP kullanımı, PBS kullanımından daha etkin sonuç vermiştir. Buna göre B. cereus 'u en az, refakatçi florayı en fazla etkileyen antibiyotik konsantrasyonu olarak 1000 IU/mL PGP olduğu belirlenmiştir. Yalnız hem düşük sıcaklıkta pastörizasyon uygulaması (55 oC'de 10 dakika) hem de antibiyotik kullanımının kombine olarak uygulandığı durumlarda B. cereus hiç gelişemediği tespit edilmiştir. 2006, 59 sayfa Anahtar Kelimeler: Çiğ süt, B. cereus, MYP Agar, antibiyotik, modifikasyon

i

Page 74: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK

ABSTRACT

Master Thesis

STUDY OF METHOD MODIFICATIONS FOR ENUMERATION OF Bacillus cereus IN RAW MILK

Selin KALKAN

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Food Engineering

Supervisor: Prof. Dr. A. Kadir HALKMAN

This study was performed in 3 sequent stages. In the first stage, 25 raw milk samples collected from Ankara market were microbiologically analised, number of total aerobic mesophilic bacteria was determined as 6,39-8,33 log cfu/mL, as 6,13-7,60 log cfu/mL in the MYP Agar medium in which Polymyxin B Sulphate (PBS) was used as selective agar additive, and as 7,22-8,09 log cfu/mL in the MY Agar medium prepared without using any additives. Furthermore, each the raw milk samples was pasteurized at 55ºC for 10 minutes, and the number of total aerobic mesophilic bacteria after pasteurization was determined as 2,28-3,73 log cfu/mL, as 2,34-2,40 log cfu/mL in PBS used MYP Agar medium, and as 2,78-3,40 log cfu/mL in MY Agar medium prepared without using any selective agar additive. The dominant flora in the raw milk samples were designated, and it was determined that Bacillus species were dominant in the companion flora. In the second stage, inactivation of the determined companion flora by thermal process was aimed, and the effects of pasteurization at low temperature (10 min at 55 ºC) and PBS usage on companion flora and B. cereus was observed. Pasteurization at low temperature and antibiotics usage caused B. cereus not to grow colony on MYP Agar. At the last stage the effects of use of various selective agar additives on B. cereus and companion flora was observed. It is determined that, amount of PBS used in preparing MYP Agar medium was not adequate to inhibite the companion flora precisely. For this reason, the effects of increasing amounts of PBS usage was searched and it was ascertained that using PBS at higher dosages (150, 200 IU/mL) than normal dosage (100 IU/mL) effected the B. cereus growth adversely. Therefore, use of an another antibiotics, Penicillin G Potasium (PGP)-to which B. cereus shows less sensitivity and companion flora more-as selective agar additive in increasing amounts (1000, 2000, 3000 IU/mL ) was experimented end the effects was observed. According to that, use of PGP at dosage of 1000 IU/mL gave a more effective result than use of PBS. In respect, the antibiotics concentration to effect B. cereus the least, and the companion flora the most was determined as 1000 IU/mL of PGP. However, it was determined that at conditions where the pasteurization at low temperature (10 min at 55ºC) and antibiotics usage is combined B. cereus did not grow at all. 2006, 59 pages Key Words: Raw milk, B. cereus, MYP Agar, antibiotic, modification

ii

Page 75: ANKARA ÜNİVERİSTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK